Orientadora : Profª. Drª. Anita Nishiyama / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Fisiologia. Defesa: Curitiba, 29/08/2017 / Inclui referências / Resumo: A sepse é uma disfunção orgânica aguda complexa potencialmente fatal consequente de uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica desencadeada por um quadro infeccioso. Os mecanismos subjacentes à fisiopatologia da sepse que envolve processos dinâmicos pró e anti-inflamatórios ainda permanecem mal compreendidos. As células do Natural Killers (NK) desempenham papel crucial na fisiopatologia da sepse, com íntima relação aos processos de inflamação exagerada decorrentes de sua resposta rápida e da produção de citocinas pró-inflamatórias, como o interferon gama (IFN-?). Vários estudos já mostraram que as células NK tem seus níveis reduzidos no plasma de sangue periférico de pacientes portadores de sepse. No entanto, nossa atual compreensão dos mecanismos por trás do seu tráfego celular, assim como, no seu papel no desenvolvimento da doença está restrita aos estudos em modelos animais de sepse. Neste estudo, buscamos comparar os níveis do subconjunto de células NK humanas (CD56bright e CD56dim) no plasma de sangue periférico e fluido de lavado broncoalveolar (LBA) de pacientes portadores de sepse pulmonar. Realizou-se um estudo caso-controle constituído por 10 pacientes saudáveis (controle) e 23 pacientes portadores de sepse pulmonar internados em Unidades de Terapia Intensiva do Hospital Universitário Cajuru da Pontifícia Universidade Católica do Paraná no período de 2013 a 2015. Embora pudéssemos confirmar observações anteriormente descritas de linfopenia do plasma de sangue periférico, não foram detectadas diferenças significativas nos níveis de células NK no LBA desses pacientes. Em geral, esses achados reforçam a evidência de que a redução dos níveis de células NK no plasma de sangue periférico pode estar associada à mecanismos de morte celular e apoptose consequentes da sepse. Palavras-chave: Células Natural Killers; sepse pulmonar; linfopenia; interleucinas; citocinas pró-inflamatórias; CD4; CD8; lavado broncoalveolar. / Abstract: Sepsis is a complex systemic inflammatory syndrome, the most common cause of which is attributed to systemic underlying bacterial infection. The complete mechanisms of the dynamic pro- and anti-inflammatory processes underlying the pathophysiology of sepsis remain poorly understood. Natural killer (NK) cells play a crucial role in the pathophysiology of sepsis, leading to exaggerated inflammation due their rapid response and production of proinflammatory cytokines such as interferon gamma (IFN- ?). Several studies have already shown that NK cells undergo lymphopenia in the peripheral blood of patients with sepsis. However, our understanding of the mechanisms behind its cellular trafficking and its role in disease development is restricted to studies in animal models. In this study, we aimed to compare the human NK cell subset (CD56bright or dim) levels in the peripheral blood and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid of sepsis patients. We conducted a case-control study with a sample size consisting of 10 control patients and 23 sepsis patients enrolled at the Hospital Cajuru (Curitiba/PR, Brazil) from 2013 to 2015. Although we were able to confirm previous observations of peripheral blood lymphopenia, no significant differences were detected in NK cell levels in the BAL fluid of these patients. Overall, these findings strengthened the evidence that peripheral blood lymphopenia is likely to be associated with cell death as a consequence of sepsis. Keywords: natural killer cells; lung sepsis; lymphopenia; bronchoalveolar lavage.

Orientadora : Profª. Drª. Karin Braun Prado / Coorientador : Prof. Dr. Danillo G. Augusto / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 28/03/2017 / Inclui referências : f. 92-102 / Resumo: A familia de genes KIR (do ingles, killer cell immunoglobulin-like receptors) desempenha um papel central na imunidade inata e adaptativa e seu polimorfismo tem sido associado a suscetibilidade diferencial a diversas doencas. Esses genes exibem extensa variabilidade, tanto em termos de ausencia e presenca de genes, quanto em nivel alelico. Os receptores codificados por esses genes sao expressos na superficie das celulas NK e de alguns subtipos de celulas T e podem transduzir sinais ativadores ou inibidores. Pouco se conhece a respeito dos seus niveis de expressao genica diferencial, tampouco dos mecanismos de regulacao. O gene KIR3DL2 codifica um receptor inibidor e e o segundo gene KIR mais polimorfico e polialelico do complexo, com mais de 80 alelos descritos. O objetivo desse trabalho foi analisar se o polimorfismo alelico de KIR3DL2 impacta na sua expressao genica diferencial. Para isso, caracterizamos a diversidade alelica de KIR3DL2 em uma populacao de euro-descendentes de Curitiba e regiao metropolitana (n = 235), atraves de sequenciamento de DNA. As frequencias genotipicas estavam de acordo com as esperadas pelo equilibrio de Hardy-Weinberg, sendo os genotipos mais comuns: 3DL2*001/007 (11,5%), 3DL2*001/002 (6,8%) e 3DL2*002/007 (6,8%). Os alelos mais frequentes encontrados nessa populacao foram 3DL2*007 (21,7%), 3DL2*001 (21,3%) e 3DL2*002 (20%). Um total de 40 individuos com genotipos especificos e comuns na populacao desse estudo foram selecionados para a analise de expressao diferencial por citometria de fluxo. A analise de expressao diferencial foi realizada com os individuos portadores dos alelos mais frequentes encontrados na populacao, sendo eles: 3DL2*001, 3DL2*002, 3DL2*003, 3DL2*005, 3DL2*007, 3DL2*009, 3DL2*010 e 3DL2*011. Verificamos que o polimorfismo alelico de KIR3DL2 esta associado nao somente com niveis de expressao diferencial, mas tambem com diferentes quantidades de celulas NK que exibem KIR3DL2 em sua superficie. O alelo KIR3DL2*002 foi associado ao maior nivel de expressao de KIR3DL2 e ao maior numero de celulas NK 3DL2 positivas. Ja 3DL2*010 foi associado ao menor nivel de expressao e a menor quantidade de celulas NK com KIR3DL2 presente na superficie celular. Alem disso, demonstramos que um polimorfismo na regiao 3' UTR, na posicao 16545A>G (rs1865095) marca os niveis de expressao de KIR3DL2. Sugerimos que esta expressao diferencial possa estar relacionada a ligacao de miRNAs nesta regiao, especificamente o miR-2114-3p. A presenca de ligantes especificos (HLA-A3, -A11 e -B27) nao esta associada a diferentes niveis de expressao de KIR3DL2 (p = 0,5739) nem a diferentes quantidades de celulas NK KIR3DL2 positivas (p = 0,7772). Alem disso, nenhuma correlacao foi encontrada entre a expressao diferencial dos alelos de KIR3DL2 e a expressao diferencial dos alelos de HLA-A. Como perspectivas futuras pretendemos analisar, atraves de co-cultivo celular, a atividade citotoxica das celulas NK de individuos com diferentes genotipos homozigotos, como KIR3DL2*001/KIR3DL2*001, KIR3DL2*002/KIR3DL2*002, KIR3DL2*007/KIR3DL2*007 e KIR3DL2*010/KIR3DL2*010 a fim de corroborar as hipoteses geradas. Palavras-chave: Celulas NK, KIR3DL2, variabilidade alelica, HLA-A3, HLA-A11, HLA-B27, expressao diferencial. / Abstract: The KIR (killer cell immunoglobulin-like receptors) gene family plays a central role in innate and adaptive immunity and has been associated with differential susceptibility to diseases. Besides the uncommon presence and absence polymorphism that occurs in KIR, these genes also exhibit an extensive allelic variation. The receptors encoded by these genes are expressed on the surface of NK cells and on some subset of T cells. They can transduce either activating or inhibiting signals. The differential expression levels and the mechanisms of genetic regulation of these receptors are poorly known. The KIR3DL2 gene encodes an inhibitory receptor and it is one of the most polymorphic and polyallelic KIR, with more than 80 alleles described so far. This study aimed to analyze if there are a profound impact of KIR3DL2 allelic polymorphism on its differential gene expression. Allelic diversity of KIR3DL2 was characterized in an euro-descendant population from Curitiba and metropolitan region, state of PR (n = 235), by sequencing-based typing. Genotype frequencies were in accordance with Hardy-Weinberg equilibrium and the most frequent genotype was 3DL2*001/007 (11.5%), followed by 3DL2*001/002 (6.8%) and 3DL2*002/007 (6.8%). The most frequent alleles in the population were 3DL2*007 (21.7%), 3DL2*001 (21.3%) and 3DL2*002 (20%). A total of 40 individuals with specific and commom genotypes were selected for differential expression analysis by flow citometry. The differential expression analysis was made for the most common alleles found in the population: 3DL2*001, 3DL2*002, 3DL2*003, 3DL2*005, 3DL2*007, 3DL2*009, 3DL2*010 and 3DL2*011. We verified that the allelic polymorphism of KIR3DL2 was associated not only with the differential expression but also with the different amount of NK cells that display KIR3DL2 on their surface. KIR3DL2*002 allele was associated with higher expression of KIR3DL2 and higher number of KIR3DL2 positive NK cells, while KIR3DL2*010 was related to the lowest expression and lowest level of KIR3DL2 positive NK cells. It has also been found that a polymorphism in the 3' UTR, 16545A>G (rs1865095), was associated with KIR3DL2 differential expression level. We suggest that it may be related to miRNAs binding, specifically miR-2114-3p. The presence of specific HLA class I ligands (HLA-A3, -A11 and -B27) was not associated with KIR3DL2 differential expression levels (p = 0.5739) nor with different amount of NK KIR3DL2+ cells (p = 0.7772). In addition, no correlation was found between the differential expression of the KIR3DL2 alleles and the differential expression of the HLA-A alleles. As future perspectives, it is intended to analyze the citotoxic activity of NK cells from individuals with different genotypes like KIR3DL2*001/KIR3DL2*001, KIR3DL2*002/KIR3DL2*002, KIR3DL2*007/KIR3DL2*007 and KIR3DL2*010/KIR3DL2*010 through co-culture to corroborate the hypotheses generated. Key-words: NK cells, KIR3DL2, allelic variability, HLA-A3, HLA-A11, HLA-B27, differential expression.

Resumo: Receptores de células natural killer semelhantes à imunoglobulina (KIR) são expressos por células natural killer (NK) e subtipos de células T. Os genes KIR são altamente polimórficos e este complexo poligênico exibe variação em número de genes ativadores e inibidores, o que regula a atividade de células NK. Moléculas HLA de classe I servem como ligantes para KIR. As interações dos loci de KIR e HLA são importantes para o reconhecimento de alvos pelas células NK. Vários estudos de associação indicam que estes loci estão envolvidos em doenças infecciosas, desordens autoimunes/inflamatórias, câncer e reprodução. Dados funcionais suportam o mecanismo baseado na ação de receptores inibidores e ativadores através de diferentes combinações de genótipos KIR-HLA em doenças. A doença autoimune pênfigo vulgar (PV) é uma desordem bolhosa que afeta a pele em múltiplas camadas, causada por autoanticorpos contra desmogleína 1 e 3, já foi previamente associada com KIR. Neste estudo nós sugerimos que indivíduos KIR3DL2*001+ KIR3DL1+ e baixa frequência de genes ativadores em seu genótipo, exibem uma maior inibição de citotoxicidade quando na presença dos ligantes HLA-A*03/A*11 e HLA-Bw4. Resultados in vitro demonstraram que o cultivo de células NK de diferentes indivíduos com células T CD3 expressando HLA-A*03/A*11 e HLA-Bw4, levou a uma diminuição de citotoxicidade. Isto foi observado em indivíduos saudáveis e pacientes de pênfigo. O bloqueio com anticorpo anti-KIR3DL2 mostrou um aumento da citotoxicidade, corroborando para o potencial efeito inibidor deste gene nesta situação. Além disso, nós verificamos uma maior frequência de células NK (subtipo CD56bright) no sangue periférico de pacientes de PV quando comparado com indivíduos saudáveis. Estes dados em conjunto com a detecção de níveis aumentados de IL-6 e IFN-? nos ensaios de cultivo, contribuem para o entendimento e o papel de células NK na patogênese de pênfigo.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-11-10T03:02:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 336034.pdf: 4097689 bytes, checksum: 4ba26833f45ba72a3130a8a4f6bb7fcd (MD5) Previous issue date: 2014 / Introdução: O câncer de mama possui etiologia variada, sendo influenciada tanto por fatores genéticos quanto por fatores ambientais. Dentro do contexto genético, o papel de genes que codificam moléculas do sistema imunológico tem sido alvo de interesse pela importância que esse sistema possui para o desenvolvimento do processo tumoral. A Interleucina-18 é uma importante citocina pró-inflamatória e que possui indicações como possível alvo-terapêutico. Possui polimorfismos de um único nucleotídeo localizados na região promotora do gene e que possuem atividade funcional. As células Natural Killer (NK) fazem parte da resposta imune inata, sendo a primeira linha de defesa do organismo contra vírus, bactérias e tumores. Estas células induzem a morte da célula-alvo quando não há o reconhecimento das moléculas de antígenos leucocitários humanos (HLA) de classe I, através de seus receptores, chamados Killer cell Immunoglobulin-like. Receptor (KIR) ou os receptores NKG2D. Vários estudos demonstram o envolvimento dos genes que codificam receptores de células NK na patogênese do câncer. Objetivo: Avaliação do papel de polimorfismos em genes envolvidos na regulação da atividade das células NK e o desenvolvimento do câncer de mama em pacientes do Estado de Santa Catarina. Resultados: A presença dos genótipos variantes dos polimorfismos IL18 -607 (C/A) [rs1946518] e IL18 -137 (G/C) [rs187238] no presente estudo apresentou um risco significativo para o desenvolvimento do câncer de mama, sendo que o modelo de herança mais significativo foi o codominante para o IL18 -607 (C/A) [rs1946518] (CC vs AA, P = 0,004, OR = 2,782 95%CI [1,385-5,589]). E o recessivo para IL18 -137 (G/C) [rs187238]. Em relação à análise do polimorfismo do gene NKG2D [rs2255336], não foi encontrada uma diferença significativa na presença do alelo variante entre pacientes e indivíduos do grupo controle. Para os genes KIR foi encontrado um aumento de risco de 5,50 (P = 0,046; [1,02-33,36]) para o desenvolvimento da doença na presença do gene KIR2DL3 e de 5,62 (P ? 0,0001; [2,81- 11,33]) na presença do gene KIR2DL2. A presença desses dois genes em conjunto apresentou um risco de 6,86 (P ?0001; [2,83-13,18]). A presença do gene KIR2DL5 mostrou-se como um fator de proteção em relação ao desenvolvimento do câncer de mama (P = 0,001; [0,06-0,53]). Conclusão: Estes resultados indicam um potencial papel dos polimorfismos dos genes envolvidos na regulação da atividade das células NK na patogênese do câncer de mama, indicando que esses genes do sistema imunológico são possíveis marcadores preditivos de risco para câncer de mama na população estudada.<br> / Abstract : Introduction: Breast cancer has varied etiology, being influenced by both genetic factors and by environmental factors. Within the context of the genetic etiology, the genes that encode immune system molecules have been the target of interest because of the importance of this system in the development of tumor process. Interleukin-18 is an important pro-inflammatory cytokine and has possible indication as a therapeutic target. IL18 gene has some single nucleotide polymorphisms located in the promoter region of the gene that have functional activity on gene transcription. Natural Killer (NK) cells are part of the innate immune response, the first line of defense against viruses, bacteria and tumors. These cells induces death of the target cell when there is no recognition molecules in human leukocyte antigens (HLA) class I, through their receptors, called Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) or NKG2D receptors. Several studies have shown the involvement of the genes encoding receptors of NK cells in the pathogenesis of cancer. Objective: Evaluation of the role of polymorphisms in genes involved in regulating the activity of NK cells and the development of breast cancer patients in the State of Santa Catarina. Results: The presence of genotype variants of IL18 polymorphisms -607 (C / A) [rs1946518] and IL18 -137 (G / C) [rs187238] in the present study showed a significant contribution to the development of breast cancer risk, and the most significant was the codominant inheritance model for the IL18 -607 (C / A) [rs1946518] (CC vs. AA, P = 0.004, OR = 2.782, 95% CI [1.385 to 5.589]). And the recessive model was for IL18 -137 (G / C) [rs187238]. Regarding the analysis of the NKG2D polymorphism (rs2255336) gene, a significant difference was not found in the presence of the variant allele between patients and control subjects. For KIRs genes we detected an increased risk of 5.50 (P = 0.046, 95% CI [1.02 to 33.36]) for the development of the disease in the presence of KIR2DL3 gene and 5.62 (P ? 0.0001; 95% CI [2.81-11.33]) for the presence of KIR2DL2 gene. The presence of both genes together increase the risk about 6.86 (P ?0001; 95% CI [2,83-13,18]). The presence of the KIR2DL5 gene introduced a protective factor in the development of breast cancer (P = 0.001, 95% CI [0.06 to 0.53]). Conclusion: These results indicate a potential role of polymorphisms in genes involved in regulating the activity of NK cells in the pathogenesis of breast cancer, indicating that these genes of the immune system, IL18, KIR2DL2 and KIR2DL3 are possible predictive risk markers for breast cancer in this population.

O exercício aeróbio aumenta o fluxo sanguíneo para o músculo esquelético, diminuindo esse fluxo em outros órgãos como útero e placenta o que pode prejudicar a oxigenação e nutrição do embrião. O estímulo do exercício extenuante pode ser estressor, aumentando a secreção de glicocorticóides através do eixo Hipotálamo-Hipófise-adrenal e que podem causar complicações durante a gestação, como as observadas em outras situações como o estresse alimentar e após infecção. As células Natural Killer uterinas (uNK) correspondem a maior população de leucócitos deciduais de humanos e roedores. As uNK de camundongos têm sido muito estudas por meio da citoquímica de lectina DBA (Dolichos Biflorus Agglutinin), que tem afinidade para N-acetil-D-Galactosamia expressa seletivamente nos grânulos e membrana plasmática destas células. Esta seletividade propiciou a caracterização de quatro subtipos de uNK, relacionados aos estágios de diferenciação destas células. A função mais aceita das uNK é a secreção de INF-y levando a dilatação das artérias espiraladas uterinas para manutenção da decídua e nutrição do embrião. Este estudo teve o objetivo de investigar se o exercício extenuante exerceria efeitos na implantação e integridade embrionária, bem como, no número, diferenciação, distribuição e padrão de reatividade para lectina DBA das uNK. Dez camundongos Swiss fêmeas foram mantidos sedentários (grupo 1). Outros 10 (grupo 2) foram submetidos a natação, do 1º ao 10º dia de gestação (dg), durante 60 minutos diários, dos quais os últimos 20 minutos se procederam com halter com massa de 4% do peso corporal, preso a suas caudas, em dias alternados do 1º ao 5º dg, e de 10% dessa massa do 6º ao 10º dg. Os animais do grupo 3 após prenhez, foram submetidos a natação da mesma maneira que os do grupo 2, porém passaram por um programa de treinamento de 3 semanas anterior a prenhez durante 5 dias/semana, sendo realizado 15 minutos/dia na primeira semana, aumentando gradativamente em 10 minutos/dia até 60 minutos na segunda semana e 60 minutos/dia na terceira semana. Todos os camundongos foram anestesiados e perfundidos com PFA (paraformaldeído) 4% no 10º dg. As taxas de implantação, viabilidade e reabsorção embrionárias foram avaliadas e os sítios de implantação destes animais foram coletados e embebidos em parafina para obtenção de cortes histológicos que foram analisados por lectina DBA e HE (Hematoxilina e Eosina). Foram quantificados os 4 subtipos de células uNK DBA reativos em 3 áreas da região mesometrial dos sítios de implantação. Nossos resultados mostraram que o exercício físico extenuante é capaz de causar diminuição na implantação, viabilidade embrionária e aumento na perda fetal, bem como, aumento em número e na diferenciação das células uNK, sem aparente ativação de sua citotoxicidade. O exercício realizado previamente a prenhez diminuiu estes efeitos, pois restabeleceu as taxas normais de implantação e o número total de uNK, bem como, aumentou a viabilidade e diminuiu a perda embrionária, contudo sem impedir completamente os efeitos deletérios do exercício na gestação. Nossos resultados indicam que esse modelo de estresse poderá ser útil para estudos futuros da investigação dos mecanismos neuroimunoendócrinos, envolvidos com parto prematuro e aborto causado por fatores estressores muitas vezes desconhecidos. / Aerobic exercise increases blood flow to skeletal muscle, decreasing the flow in other organs such as uterus and placenta, which may impair embryo oxygenation and nutrition. Furthermore, the continuous exercise can be stressful, changing the hypothalamic-pituitary-adrenal axis leading to secretion of glucocorticoids that may cause complications during pregnancy, such as those observed in other situations such as dietary and infection-mediated stress . Uterine natural killer cells (uNK) are the largest population of decidual leukocytes from humans and rodents. The mouse uNK have been extensively investigated by the use of DBA lectin cytochemistry, which has affinity for N-acetyl-D-Galactosamia selectively expressed in the granules and plasma membrane of these cells. This selectivity allowed the characterization of four subtypes of uNK related to their stages of differentiation. The most accepted function of uNK is the secretion of IFN-y leading to dilation of the uterine spiral arteries, maintaining the decidua and embryo nutrition. the goal of this study was to investigate whether strenuous exercise has effect in the embryo implantation and integrity, as well as, in the number, differentiation, distribution and DBA lectin reactivity pattern of uNK cells. Ten female Swiss mice were sedentary (group 1). Other 10 (group 2) were submitted to swimming, from 1st to 10th gestation day (gd) for 60 minutes daily, been the last 20 minutes conducted with a steel caudal dumbbell with 4% of their body masses, attached in alternately days from the 1st to 5th gd, and 10% of this mass from the 6th to 10th gd. The animals from group 3 after pregnancy were submitted to swimming in the same way as group 2, but went through a training program for 3 weeks, 5 days a week, being 15 minutes/day in the first week, increasing gradually by 10 minutes a day up to 60 minutes in the second week and 60 minutes a day in the third week. All mice were anesthetized and perfused with 4% PFA at 10°dg. The rates of embryo implantation, viability resorption were evaluated and the implantatio sites of these animals were collected and embedded in paraffin to obtain histological sections that were submitted to DBA lectin and H&E. We quantified the four DBA reactive uNK cells subtypes in three areas of the mesometrial region of the implantation sites. Our results showed that strenuous exercise can cause a decrease in implantation embryo viability and increased fetal loss, as well as increase in number and differentiation of uNK cells, without apparent activation of its cytotoxicity. The exercise performed prior to pregnancy decreased these effects, since restored the normal rates of implantation and the total number of UNK, as well as increased viability and decreased embryonic loss, without completely prevent the deleterious effects of exercise during pregnancy. Our results indicate that this stress model established here may be useful for future studies about the neuroimmunoendocrinology of preterm labor and abortion caused by often unknown stress factors. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES