Orientador : Profª. Drª. Iara Jose de Messias-Reason / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa : Curitiba, 22/03/2016 / Inclui referências : f. 65-68 / Resumo: A Doença de Chagas (DC) é uma doença infecciosa causada pelo parasito Trypanosoma cruzi, descoberto em 1909 pelo brasileiro Carlos Chagas. A DC é caracterizada por dois estágios: agudo e crônico. Estima-se que a doença acometa em torno de 6-8 milhões de pessoas no mundo, dos quais 30-40% irão desenvolver cardiomiopatia, alterações digestivas ou ambas manifestações. Programas exaustivos de controle do vetor, foram iniciados há décadas e conseguiram reduzir drasticamente a transmissão vetorial. Atualmente devido à intensa migração da população de áreas endêmicas, a doença chegou a países que não possuem o vetor da doença, incluindo Espanha e outros países da Europa e da América do Norte, onde representa um problema emergente de saúde pública. A forma indeterminada da DC, se caracteriza pela ausência de sintomas, assim como exames radiológicos do coração, esôfago, cólon e eletrocardiograma normais, sendo a positividade para a doença somente verificada por exames sorológicos. Até o presente, não existe marcador laboratorial capaz de indicar quais pacientes irão evoluir da forma indeterminada para as formas sintomáticas da DC. Este estudo teve como objetivo relacionar a presença de achados clínicos e laboratoriais com a progressão clínica da forma indeterminada para as formas sintomáticas da DC. Neste trabalho realizou-se uma coorte prospectiva dos pacientes com DC crônica atendidos no Ambulatório de Atenção ao paciente chagásico do Hospital de Clínicas da UFPR (Curitiba, Paraná), no período de 2005 a 2015. A população foi composta por 89 pacientes com a forma indeterminada da DC, sendo 81 (91%) euro-brasileiros e 8 (9%) afrodescendentes, sendo 59 (66,3%) mulheres e 30 homens (33,7%), com idade média de 54 (34-77) anos. Os resultados demonstraram uma taxa de progressão geral de 29% nos 11 anos e anual de 2,3%. Nos pacientes que progrediram, a prevalência das formas clínicas foi: 77% forma cardíaca, 19% forma digestiva e 4% forma cardio-digestiva. A medida do diâmetro ventricular esquerdo (VE) apresentou associação significativa com a progressão da doença em ambos os períodos analisados (2005 e 2015), com p=0,004 e p=0,016, respectivamente. Analisando os dados obtidos em 2005, verificamos que acima do percentil 75 do VE (VE?50mm para IND; e ?55mm para PROG), o Risco Relativo para a progressão foi de 3,712 com p=0,0015. As concentrações séricas de HDL se mostraram associadas com proteção contra a progressão da forma indeterminada (p=0,04). Os resultados obtidos neste estudo sinalizam a necessidade de outros estudos de acompanhamento do paciente indeterminado, a fim de confirmar esses relevantes achados. Palavras-chave: Doença de Chagas. Cardiomiopatia Chagásica. Trypanosoma cruzi. / Abstract: Chagas disease (CD) is an infectious disease caused by the parasite Trypanosoma cruzi, discovered in 1909 by the Brazilian Carlos Chagas. CD is characterized by two stages: acute and chronic. It is estimated that the disease affects about 6-8 million people worldwide, with 30-40% of them developing cardiomyopathy, digestive disorders or both. Vector control comprehensive programs were started decades ago and managed to reduce dramatically the vector transmission. Currently due to the intense migration of the population from endemic areas, the disease has reached countries which do not have the vector of the disease, including Spain and other countries of Europe and North America. Thus, CD has become an emerging public health problem worldwide. The indeterminate form of CD, characterized by the absence of symptoms, as well as normal radiological examinations of the heart, esophagus, colon as well as electrocardiogram, the disease is only confirmed by serological tests. To date, there is no biomarker able to indicate which patients will progress from indeterminate form to the symptomatic forms of CD. This study correlated the presence of clinical and laboratory findings with clinical progression of indeterminate to symptomatic forms of CD. In this work we performed a prospective cohort study of patients with chronic CD attending the Chagas Disease Ambulatory of the Clinical Hospital, Federal University of Paraná (Curitiba, Parana - Brazil), from 2005 to 2015. The population consisted of 89 patients with the form undetermined CD, and 81 (91%) of them were Euro-Brazilian and 8 (9%) African descents, 59 (66.3%) were women and 30 men (33.7%) with mean age of 54 (34-77) years. The results demonstrated an overall progression rate of 29% in 11 years and 2.3% per year. In patients who progressed, the prevalence of the clinical forms was: 77% cardiac form, 19% digestive form and 4% cardio-digestive form. The measurement of left ventricular diameter (LV) showed significant association with disease progression in both periods analyzed (2005 and 2015), with p=0.004 and p=0.016, respectively. Analyzing the data obtained in 2005, we found that above the 75th percentile LV (LV?50mm for indeterminate form, and ?55mm for symptomatic form), the Relative Risk for progression was 3.712 with p=0.0015. Serum concentrations of HDL were associated with protection against the progression of indeterminate form (p=0.04). The results of this study points out the need for further follow-up studies with patients having the indeterminate form in order to confirm these relevant findings. Key-words: Chagas Disease. Chagas Cardiomyopathy. Trypanosoma cruzi.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-09-24T15:32:27Z No. of bitstreams: 1 2012_AlessandroOliveiraSousa.pdf: 3231529 bytes, checksum: 4d358e0ed623c1ab62cbc13a22bbaf57 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-09-27T11:11:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AlessandroOliveiraSousa.pdf: 3231529 bytes, checksum: 4d358e0ed623c1ab62cbc13a22bbaf57 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-27T11:11:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AlessandroOliveiraSousa.pdf: 3231529 bytes, checksum: 4d358e0ed623c1ab62cbc13a22bbaf57 (MD5) / As publicações de pesquisadores do Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa em Doença de Chagas, na Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília, sugerem que a patogênese da doença de Chagas pode ser explicada pela auto-imunidade de origem genética (Nitz e cols, 2004; Hecht e cols, 2010; Teixeira e cols, 2011). A hipótese que levou as investigações sobre transferência de DNA do Trypanosoma cruzi para o genoma do hospedeiro mamífero foi feita depois que se observou que coelhos tratados com a droga tripanocida benzonidazol desenvolveram lesões destrutivas no coração com intensidade semelhante àquela encontrada nos coelhos chagásicos que não tinham recebido a droga. Entretanto, pesquisadores de outros centros consideram que o tratamento das infecções pelo T. cruzi com o nitroderivado benzonidazol é eficaz nos casos agudos da doença. Ademais, há os que tratam chagásicos com a infecção crônica, na expectativa de aliviar sintomas e melhorar o prognóstico do caso. Não obstante, vários autores sugerem que o tratamento com o nitroderivado não elimina a infecção pelo T, cruzi e não melhora o quadro da doença clínica. Esta polêmica tem mais que importância semântica, pois, se a quimioterapia da doença de Chagas fosse satisfatória poderia esclarecer os papéis das infecções persistentes e da autoimunidade na patogênese da doença. Os estudos prévios de Nitz e cols., 2004; Hecht e cols, 2010; Teixeira e cols, 2011, mostram que sequências de minicírculo de DNA mitocondrial de T. cruzi (kDNA) integram frequentemente em retrotransposons LINE-1 no genoma hospedeiro, e sugerem que clones de linfócitos geneticamente modificados atacam e destroem o coração chagásico. Este estudo foi iniciado com o propósito de tentar falsear a teoria da origem genética da autoimunidade na doença de Chagas. Para isto, empregaram-se vários esquemas terapêuticos pelos quais grupos de camundongos com as infecções recentes pelo T. cruzi eram tratados com o nitroderivado benzonidazol, em dose quatro vezes acima (43 mg/kg) daquela usada para tratar a doença em humanos, e que era utilizado, alternativamente, em combinação com zidovudina (AZT) e ciprofloxacino (CIPRO), respectivamente, inibidores da transcriptase reversa e da Topoisomerase II. Essas enzimas bloqueiam vias metabólicas essenciais na integração do kDNA do T. cruzi no genoma (Rosa, 2005). Os resultados da investigação mostraram que os grupos de animais chagásicos tratados apenas com benzonidazol, ou em combinação com os inibidores, tiveram diminuição da quantidade de tripomastigotas de T.cruzi no sangue. Entretanto, jamais se observou cura parasitológica e imunológica (ausência de anticorpos específicos) nos animais submetidos aos diferentes esquemas terapêuticos. Ademais, todos os animais nos grupos tratados obtiveram positividade nos exames PCR específicos para identificação de DNA nuclear (nDNA) e de (kDNA) do protozoário. Diante desses resultados, foram conduzidos experimentos para avaliar se os esquemas terapêuticos empregados tinham bloqueado a integração do kDNA no genoma dos camundongos, infectados e infectados-tratados. Os resultados desses experimentos mostraram integrações de kDNA em retrotransposons LINE-1 do genoma de animais chagásicos que foram submetidos aos vários esquemas de tratamento, com frequências similares aquelas documentadas nos genomas dos camundongos controle positivos, infectados com T. cruzi e deixados sem tratamento. As populações de linfócitos T citotóxicos CD8+, γδ, e β (Vβ e Vβ1) atacam e destroem o coração chagásico. O conjunto de resultados desses experimentos mostra que não foi possível refutar (negar) a teoria auto-imune da patogênese da doença de Chagas. Lamentavelmente, confirmou-se que o tratamento das infecções pelo T. cruzi com o nitroderivado é insatisfatório. / The investigations conducted at the Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory at the Faculty of Medicine of the University of Brasilia suggest that the origin of the pathogenesis of Chagas Disease may be explained by the genetically driven autoimmune rejection of the target host tissues. Early experiments had shown that chagasic rabbits treated with the anti-Trypanosoma cruzi nitroderivative benznidazole developed destructive lesions in the heart similar to those found in chagasic, but untreated animals. This observation led to the hypothesis that the parasite DNA retained in the body could call out autoimmune mechanisms in Chagas disease. This hypothesis spurted further investigations on the transfer of T. cruzi DNA to the host's genome. Inasmuch some researchers continue to believe that the treatment of the T. cruzi infections with the nitroderivative benzonidazole cure the Chagas disease, and others argue that the treatment should benefit those with the acute T. cruzi infections; prescriptions of the nitroderivative to treat the chronic infections aim at the prevention of disease outcome, aleviation of symptoms, and improvement of prognostics are recommended. Nevertheless, experimental and clinical investigations have shown that the treatment with the nitroderivative does not eradicate the T. cruzi infections and, therefore, the prognosis of the disease remains unchanged. This study subject bears practical importance, because it can show whether or not the chemotherapy of Chagas disease is satisfactory. Furthermore, its investigation in a suitable animal model may demonstrate any role played by the parasite persistence in the pathogenesis of the disease. Previous studies (Nitz e cols, 2004; Hecht e cols, 2010; Teixeira e cols, 2011) showed that the mitochondrial DNA minicircle sequence of T. cruzi integrates frequently into LINE-1 of the host's genome, and they suggest that clones of cytotoxic T lymphocytes, undergoing genotype modifications, attack and destroy the chagasic heart. This study was undertaken with the aim of falsifying the theory of the genetically driven autoimmune rejection of the heart in Chagas disease. We used several groups of mice with the T. cruzi infections, which were treated with the nitroderivative benznidazole four fold (43 mg/kg) above the dose used to treat human Chagas disease. Also, groups of chagasic mice were treated with benznidazole (43mg/ml) combined with either zidovudine (AZT) or ciprofloxacino (CIPRO), or with both, inhibitors of reverse transcriptase and of topoisomerase II,respectively. These enzymes were used to halt metabolic pathways for the integration of kDNA minicircle sequences into the host cell genome (Rosa, 2005). The results of these investigations showed that animals treated with benznidazole alone, or in combination with AZT, CIPRO, or with both inhibitors, diminished the number of T.cruzi trypomastigotes in the blood. However, the parasitologic cure was never achieved, for specif anti-parasite antibodies remained in tissues,regardless of the therapeutic regime used. Moreover, treated mice yielded positive PCR exams that identify the T. cruzi nuclear DNA (nDNA) and kDNA. Accordingly, further experiments were carried on to finding out whether the therapeutic regimes used had prevented the kDNA integration into the chagasic mice genome. These results revealed that the kDNA minicircle sequences integrated into retrotransposons LINE-1 of mice, which had received the therapeutic regimes, in a frequence not different from that observed in the positive control group of T. cruzi-infected mice, which did not receive any therapeutic regime. It was further shown that subsets of cytotoxic T lymphocytes CD8+, γδ, and β (Vβ and Vβ1) attacked and destroyed the chagasic heart. The results of these experiments reveal that it was not possible to falsify (deny) the genetically driven auto-immune theory that explains the pathogenesis of Chagas disease. Unfortunately, it was confirmed that the treatment of the T. cruzi infections with the nitroderivative benznidazole is unsatisfactory.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Priscilla Brito Oliveira (priscilla.b.oliveira@gmail.com) on 2009-10-02T18:04:46Z No. of bitstreams: 1 Dissert_Fabio de Araujo Schwartz Coelho.pdf: 872357 bytes, checksum: 5285c7a5e3660e358c93749e9061b2e2 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2010-02-13T00:38:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_Fabio de Araujo Schwartz Coelho.pdf: 872357 bytes, checksum: 5285c7a5e3660e358c93749e9061b2e2 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-02-13T00:38:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_Fabio de Araujo Schwartz Coelho.pdf: 872357 bytes, checksum: 5285c7a5e3660e358c93749e9061b2e2 (MD5) Previous issue date: 2007-11 / Análises proteômicas foram realizadas a fim de se verificar a ocorrência de modificações na expressão protéica em corações de Gallus gallus (galo doméstico) submetidos a integração em seu genoma de DNA cinetoplástico (kDNA) de Trypanosoma cruzi. Foram utilizados galos, que são aves naturalmente refratárias à infecção por células de T. cruzi, contendo o kDNA integrado em seu genoma através da inoculação do parasito nos estágios iniciais do desenvolvimento. O controle negativo foram aves sem nenhum contato com o protozoário. Extratos de tecidos de corações nessas duas condições (kDNA positivo e kDNA negativo) foram comparados por eletroforese bidimensional em busca de proteínas condição-específicas ou diferencialmente expressas. Foram selecionadas quatro manchas para identificação, sendo duas exclusivas da amostra de galo com integração positiva e duas presentes em ambas condições, como controle positivo da técnica. Através da impressão digital do mapa peptídico (PMF), foram identificadas três manchas: proteína C-reativa, cadeia leve 3 de miosina e actina cardíaca. A primeira desempenha um importante papel no sistema imune hospedeiro, sendo, inclusive, relacionada com inflamação e cardiomiopatias. A quarta mancha protéica não rendeu identificação conclusiva. Não foi possível ainda relacionar diretamente a diferença de expressão protéica com a integração do kDNA no genoma hospedeiro. A continuidade deste estudo com ampliação do grupo amostral e utilização de seqüenciamento por espectrometria de massa, permitirá identificar as demais proteínas diferencialmente expressas, assim como mapear quaisquer modificações em suas seqüências relacionadas a proteínas quiméricas. / Proteomic analyses were carried out in order to verify the occurrence of modifications in the protein expression in hearts of Gallus gallus (domestic rooster), submitted to genomic integration of kinetoplast DNA (kDNA) of Trypanosoma cruzi. The present work utilized roosters, which are refractory to the infection by T. cruzi cells, containing the kDNA integrated in their genome through the inoculation of the parasite early in the embryonic developmental process. Negative control birds were utilized without any contact with the protozoan. Heart tissue extracts in those two conditions (kDNA positive and kDNA negative) were compared by two-dimensional electrophoresis for investigation of the existence of condition-specific or differentially expressed proteins. Two exclusive spots in the kDNA positive rooster sample were selected for identification, as well as two spots present in both conditions, which were taken as positive control for the validation of the technique. Through the use of peptide mass fingerprinting (PMF), three spots were identified: c-reactive protein, slow skeletal ventricular myosin alkali light chain 3 and cardiac actin. The first one performs an important role in the host immune system, being related with inflammation and cardiomyopathies. The fourth protein spot did not yield conclusive identification. It was not possible yet to directly relate the difference of protein expression with the integration of the kDNA into the host genome. The continuity of this work by expanding the sample group and utilization of mass spectrometry sequencing techniques will permit us to identify the further differentially expressed proteins, as well as to map any modifications in its sequences related to chimeric proteins.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-11-01T17:27:42Z No. of bitstreams: 1 2006_David Neves.pdf: 1665803 bytes, checksum: 120b8a159902f36958452567ba6c8f3a (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-11-10T12:59:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_David Neves.pdf: 1665803 bytes, checksum: 120b8a159902f36958452567ba6c8f3a (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-10T12:59:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_David Neves.pdf: 1665803 bytes, checksum: 120b8a159902f36958452567ba6c8f3a (MD5) Previous issue date: 2006 / Esta tese descreve a identificação do gene mtaf (metiltioadenosina fosforilase) de T. cruzi, o qual contém uma fase aberta de leitura de 921 pb, sendo que sua a seqüência traduzida exibe a assinatura da família 2 das purina nucleosídeo fosforilase/MTAP. A seqüência da TcMTAF é 59% e 58% idêntica às seqüências MTAF do Trypanosoma brucei and Leishmania major, respectivamente, mas apresentando apenas 35% de identidade com a seqüência da MTAF humana. Além disso, o gene está representado como cópia única por genoma haplóide do parasita. A TcMTAF recombinante migra como um monômero de 33 kDa em gel de “SDS-PAGE” sob condições redutoras, mas se associa em oligômeros na ausência de agentes redutores. A MTAF nativa é expressa pelas três formas de desenvolvimento do T. cruzi. Apesar da enzima ser ativa em uma ampla faixa de pH e temperatura, ela exibe atividade máxima à 50 °C e um pH ótimo na faixa neutra. Ao contrário da MTAF humana, que degrada apenas MTA, a TcMTAF catalisa a clivagem de MTA, adenosina, deoxiadenosina e guanosina. Devido ao fato da TcMTAF e da MTAF humana possuírem diferentes parâmetros cinéticos e especificidade a substratos, a TcMTAF pode ser explorada como um novo alvo para o desenvolvimento de quimioterapia tripanocída. A rTcMTAP foi submetida a caracterização fisicoquímica. A enzima foi submetida à desnaturação térmica, visualizada por dicroísmo circular, em uma ampla faixa de pH, contudo não se observou uma relação entre a estabilidade da proteína e as condições de ionização do meio. A enzima demonstrou uma considerável resistência à desnaturação térmica, desdobrando-se em temperaturas acima de 79 °C. O conteúdo de estruturas secundárias da enzima é significativamente composto por α-hélices. Contudo, mesmo após a desnaturação térmica, a percentagem das α-hélices exibe pouca variação, principalmente no pH 7.4 e 9.0. Desnaturação química, induzida por hidrocloreto de guanidina e uréia, foi monitorada tanto por dicroísmo circular como por espectroscopia de fluorescência. A enzima suportou concentrações de até 3.6 M de hidrocloreto de guanidina e até 8 M de uréia sem alterar sua estrutura terciária. Os parâmetros termodinâmicos calculados a partir dos experimentos de desnaturação química e térmica demonstraram estar em harmonia. Em pH 6.0 e na presença de CTAB a enzima demonstrou uma resistência ainda maior à desnaturação térmica.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-31T17:28:44Z No. of bitstreams: 1 2006_Danielle Lacerda Pires.pdf: 4562953 bytes, checksum: 1c871e5bdd732392ec55d433358b37b4 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-01-19T13:28:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Danielle Lacerda Pires.pdf: 4562953 bytes, checksum: 1c871e5bdd732392ec55d433358b37b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-01-19T13:28:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Danielle Lacerda Pires.pdf: 4562953 bytes, checksum: 1c871e5bdd732392ec55d433358b37b4 (MD5) Previous issue date: 2006 / Os artrópodes hematófagos são capazes de neutralizar defesas do hospedeiro durante repasto, devido à presença de ampla variedade de fatores anti-hemostáticos presentes em suas salivas como vasodilatadores, fatores antiplaquetários e anticoagulantes. O principal mecanismo de transmissão da Doença de Chagas é a contaminação do hospedeiro por excretas de triatomíneos infectados. O Triatoma infestans Klug, 1834, o principal vetor do mal de Chagas no Brasil, possui várias apirases em sua saliva que inibem a agregação plaquetária do hospedeiro. Neste estudo, nós mostramos que as apirases de 88, 82 e 79 kDa desse inseto são antigenicamente distintas e localizam-se na unidade D2 de sua glândula salivar. O conteúdo de uma unidade D2, e não os das outras, foi capaz de inibir a agregação de plaquetas, induzida por ADP, presentes em 1 mL de sangue. Em adição, identificamos pela primeira vez atividades apirásicas nos conteúdos de glândulas salivares de Rhodnius brethesi Matta, 1919; Rhodnius milesi Carcavallo, Rocha, Galvão, Jurberg & Valente 2001; Rhodnius pictipes Stal, 1872 e Rhodnius robustus Larrousse, 1927 por meio de testes enzimáticos utilizando ATP e ADP como substratos. Os ensaios enzimáticos, realizados a 37 °C e pH 8,3, revelaram que as atividades apirásicas são dependentes de cálcio. As atividades apirásicas das glândulas salivares de R. brethesi e R. pictipes foram parcialmente purificadas em coluna de Oligo dT Celulose. Para identificação de proteínas relacionadas com essa atividade, extratos glandulares e frações eluídas da coluna de Oligo dT, não fervidos e não reduzidos, foram submetidos à enzimografia após separação em SDS-PAGE. Este experimento revelou bandas de proteínas com atividades ATPásicas e ADPásicas de aproximadamente 44-45 kDa. Adicionalmente, experimentos de agregação plaquetária realizados in vitro demonstraram que 0,5 par de glândula salivar de R. brethesi, R. milesi, R. pictipes e R. robustus inibiram totalmente a agregação plaquetária induzida por ADP. Diferentemente das apirases de T. infestans, as de Rhodnius spp. são de baixa massa molecular e não fazem parte da família das 5´nucleotidases. A ampla distribuição das apirases nas salivas dos vetores da doença de Chagas e de outros artrópodes indica que estas enzimas têm importância fundamental na hematofagia. / Blood-feeding arthropods are able to constraints barriers imposed by host defenses, due to the presence of a wide range of antihemostatic factors in their saliva, including vasodilators, antiplatelet factors and anticoagulant. The main Chagas disease transmission mechanism is contamination of a host by faeces from triatominae infected. Triatoma infestans Klug, 1834, the main vector of Chagas disease in Brazil, expresses several apyrases in its saliva that inhibit the vertebrate host platelet aggregation. We show in this report that the 88, 82 E 79 kDa apyrases of the insect are antigenically different and localize within the salivary gland D2 unit. The content of one D2 unit, and not that of the others, was able to mediate fully inhibition of platelet aggregation induced by ADP, from 1 mL of human blood. In addition, we identified for the first time apyrase activities in the saliva of Rhodnius brethesi Matta, 1919; Rhodnius milesi Carcavallo, Rocha, Galvão, Jurberg & Valente 2001; Rhodnius pictipes Stal, 1872 e Rhodnius robustus Larrousse, 1927. The tests, which were accomplished at 37 °C and pH 8,3, revealed that these apyrase activities are dependent upon Ca+2 . The apyrase activities present in the salivary glands of R. brethesi e R. pictipes were then partially purified on an Oligo dT Cellulose® column. To identify proteins related to apyrase activity, salivary gland content and eluted fractions from the Oligo dT column were submitted to SDS-PAGE enzimography without previous boiling or reduction of the samples. This experiment allowed the identification of 44-45 kDa protein bands displaying both ATPase and ADPase activities. In vitro platelet aggregation assays showed that the content of 0,5 salivary gland pair R. brethesi, R. milesi, R. pictipes e R. robustus completely abolished platelets aggregation induced by ADP. Differently fromf T. infestans apirases, Rhodnius spp. express apyrases of low molecular masses that aren’t members of the 5´nucleotidase family. The wide distribution of apyrases in the saliva of Chagas disease vectors and other arthropods indicate that these enzymes play an important role during the hematophagous process.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-12-08T17:28:16Z No. of bitstreams: 1 2007_DanielFrancaVasconcelos.PDF: 1699785 bytes, checksum: b28e70030f30f52c64711e4e97d8a94a (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-01-07T00:23:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_DanielFrancaVasconcelos.PDF: 1699785 bytes, checksum: b28e70030f30f52c64711e4e97d8a94a (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-07T00:23:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_DanielFrancaVasconcelos.PDF: 1699785 bytes, checksum: b28e70030f30f52c64711e4e97d8a94a (MD5) Previous issue date: 2007 / Justificativa: A doença de Chagas, apesar do controle, persiste como sério problema de saúde pública nos países em desenvolvimento, acometendo entre 15 e 20 milhões de indivíduos. Vários estudos sobre a função autonômica na doença de Chagas têm sido realizados. Na forma indeterminada, os estudos são escassos e com resultados conflitantes. O real papel da disfunção autonômica na evolução da doença não está bem estabelecido. Objetivos: Os objetivos do presente estudo foram: a) avaliar a função autonômica cardíaca por meio da variabilidade da freqüência cardíaca e as variáveis morfofuncionais ecocardiográficas em indivíduos portadores de cardiopatia chagásica e naqueles com a forma indeterminada da doença comparando-os entre si e com indivíduos saudáveis; b) correlacionar as variáveis morfofuncionais ecocardiográficas com as variáveis da função autonômica. Indivíduos e métodos: Foram avaliados 45 indivíduos, sendo 17 portadores da forma indeterminada (5 homens) com idade mediana de 39anos (variação interquartil 35-45,5), 13 portadores da forma cardíaca (7 homens) com idade mediana de 44 anos (35,5-49,5) e 15 indivíduos saudáveis (9 homens) com idade mediana de 43 anos (40-46). Os grupos foram semelhantes estatisticamente quanto à idade e ao gênero. Todos os indivíduos foram submetidos ao estudo da variabilidade da freqüência cardíaca (VFC) em registro eletrocardiográfico de 5 minutos na posição supina e 5 minutos na posição ortostática ativa com a obtenção de índices temporais e espectrais da variabilidade da freqüência cardíaca. Em seguida, os indivíduos foram submetidos ao ecocardiograma em repouso, durante o esforço isométrico com 30% da capacidade voluntária máxima, e 3 minutos após o esforço. Os grupos foram comparados pelo Teste de Kruaskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn. A análise correlativa entre as variáveis ecocardiográficas e os índices da função autonômica cardíaca foi feita pelo teste de Spearman. Resultados: Na análise dos resultados, os índices temporais da VFC (SDNN, CV, pNN50 e r-MSSD) se mostraram significativamente (0,0003<p<0,01) deprimidos nos chagásicos cardiopatas em comparação com o grupo controle, tanto na posição supina quanto na ortostática. A VFC também esteve deprimida nos indivíduos com a forma indeterminada na posição supina (SDNN, CV, pNN50 e r-MSSD) e na posição ortostática (CV) com nível de significância estatística entre 0,01 e 0,05. Com relação aos índices espectrais, os resultados foram a redução da AT, AabBF, AabAF, tanto na forma cardíaca , quanto na indeterminada e nas posições supina e ortostática (0,0001<p<0,004). A ArBF foi significativamente (p=0,01) menor nos chagásicos (IND) na posição supina e nos cardiopatas na posição ortostática (p=0,02). Não houve diferenças morfológicas da amostra do ponto de vista ecocardiográfico na situação de repouso e após o esforço. O DDVE foi maior nos cardiopatas durante o esforço isométrico (p=0,04), assim como a ESPP que foi maior nos dois grupos chagásicos em comparação ao controle (p=0,006). Os parâmetros de avaliação da função diastólica foram semelhantes entre os grupos em repouso, bem como o IPM. Entretanto durante o esforço o IPM foi maior nos cardiopatas (p=0,02). A análise correlativa entre as variáveis ecocardiográficas e a função autonômica mostrou correlação significativa e inversa entre a rampa E-F do fluxo mitral com r-MSSD e AabAF na posição supina (rs=-0,57; p=0,02) na forma indeterminada. A relação E/A apresentou correlação positiva com a AnAF (rs=0,59; p=0,01) e inversa com a razão BF/AF (rs=-0,59; p=0,01). O Doppler tecidual do anel septal da valva mitral teve correlação positiva com AnAF (rs=0,50; p=0,04) e inversa com a razão BF/AF (rs=-0,48; p=0,05). No grupo cardiopata, a correlação foi significativa entre o DDVE e r-MSSD (rs=- 0,56; p=0,05). O DSVE apresentou correlação com MiRR (rs=-0,59; p=0,03), SDNN (rs=- 0,73; p=0,005), CV (rs=-0,58; p=0,04), r-MSSD (rs=-0,77; p=0,002), AT (rs=-0,68; p=0,01), AabBF (rs=-0,71; p=0,007) e AabAF (rs=-0,68; p=0,01). O átrio esquerdo teve correlação significativa com a AnBF (rs=0,57; p=0,04), com a AnAF (rs=-0,57; p=0,04) e com a razão BF/AF (rs=-0,57; p=0,04). A relação VDF/m se correlacionou com a r-MSSD (rs=-0,55; p=0,05) e com a AabAF (rs=-0,56; p=0,05). Entre os parâmetros de função sistólica, houve correlação positiva entre a FE e o ∆d%a AT (rs=0,57; p=0,04) e AabBF (rs=0,62; p=0,02). Entre a Vcf e AabBF (rs=0,63; p=0,02) e AabAF (rs=0,64; p=0,02). Na função diastólica houve correlação entre E/A e AnBF (rs=0,66; p=0,01), AnAF (rs=-0,66; p=0,01) e razão BF/AF (rs=0,68; p=0,01). Entre a rampa E – F e AnBF (rs=-0,57; p=0,04), AnAF (rs=0,57; p=0,04) e razão BF/AF (rs=-0,57; p=0,04). A relação E/e’ teve correlação com a AnBF (rs=0,62; p=0,02), com a AnAF (rs=-0,62; p=0,02) e com a razão BF/AF (rs=0,62; p=0,03). Com relação ao IPM a correlação foi entre a AnBF (rs=-0,62; p=0,02), AnAF (rs=0,62; p=0,02) e a razão BF/AF (rs=-0,62; p=0,02). Conclusões: Na amostra estudada a doença de Chagas apresentou depressão da função autonômica cardíaca total, tanto simpática, como parassimpático, tanto na forma cardíaca, quanto na forma indeterminada, mesmo na ausência de disfunção mecânica. Os resultados fortalecem a hipótese que a disfunção autonômica precede a disfunção mecânica. Existe correlação entre as funções cardíacas sistólica e diastólica avaliadas pela ecocardiografia e a função autonômica, sem que haja necessariamente relação de causa e efeito, porém, é provável que a disfunção autonômica tenha colaborar para a evolução da doença. / Background: Chagas’ disease, until ours days, persist as a public health challenge, with about 15 to 20 million subjects infected in developing countries of Latin America. Several studies about autonomic dysfunction in Chagas’ disease have been done. However, studies involving the indeterminate form of the disease are scarce and the results are apparently conflicting. The real meaning of autonomic impairment in pathogenesis and evolution of Chagas’ disease still persist. Objectives: The objectives of the present study are: a) evaluate the cardiac autonomic function by five minutes heart rate variability and the morphologic and functional parameters using echocardiographic register; b) to correlate the morphological and functional echocardiographic parameters with temporal and spectral heart rate variability indexes. Methods: Time- and frequency-domain of 5-minute heart interval rate series variability in supine and standing position, and Doppler echocardiographic left systolic and diastolic morph-functional parameters were obtained at rest, during handgrip at 30% of maximal voluntary capacity and after 3 minutes of recovery. Variables were comparatively evaluated in 17 chagasic with indeterminate form, 13 with heart disease and in 15 control healthy subjects using the Kruskal-Wallis Test followed by the Dunn’s multiple comparative test at a significance level of p<0.05. For correlative analyses between morph-functional echocardiographic and autonomic indexes the Spearman correlation coefficient were applied. Results: In the supine position, reduced time-domain (SDNN, CV, pNN50, r-MSSD) (p=0.0002-0.0005) and absolute frequency-domain (total power, low- and high-frequency power) (p=0.0001-0.003) indexes were observed in both chagasic groups. In standing position, time-domain indexes were reduced only in heart disease group (p=0.009-0.01), while frequency-domain indexes in both chagasic groups (p=0.002-0.004). Sympathovagal balance (normalized low- and high-frequency power, low-to-high-frequency power ratio) remained comparable in chagasic and control groups in both postures (p=0.21-0.78). No significant differences between the three groups were observed for any achocardiographic variable (p=0.07-0.77). In indeterminate form the results of correlative analyses shows a inverse and significative correlation between mitral flow E-F slope and r-MSSD (rs=-0.57; p=0.02) and absolute High Frequency spectral area (HF) (rs=-0.57; p=0.02). Between E/A ratio and LF/HF ratio (rs=-0.59; p=0.01), e’/a’ ratio and LF/HF (rs=-0.48; p=0.05). The correlation was positive between E/A and e’/a’ ratio and normalized HF area (rs=0.59; p=0.01 and 0.50; p=0.04). In cardiac form, the correlation was positive and significative between both EF and ∆d% with MiRR sup (rs=0.64; p=0.02), r-MSSD (rs=0.63; p=0.02), Total Power ort (rs=0.57; p=0.04), absolute LF ort (rs=0.62; p=0.02). The Vcf agaisnt MiRR sup (rs=0.64; p=0.02), ort (rs=0.56; p=0.05), r-MSSD ort (rs=0.76; p=0.002), absolute LF ort (rs=0.64; p=0.02). In variables of diastolic function the correlative analyses was positive and significative between E/A and normalized LF area sup (rs=0.66; p=0.01) and LF/HF ratio sup (rs=0.68; p=0.01), between E-F slope and normalized HF area ort (rs=0.57; p=0.04), E/e’ and normalized LF area sup (rs=0.62; p=0.02) and LF/HF ratio sup (rs=0.62; p=0.03). The correlative analyses was positive and inverse between E/A and normalized HF sup (rs=-0.66; p=0.01), between E-F slope and normalized LF area ort (rs=- 0.57; p=0.04) and LF/HF ratio (rs=-0.57; p=0.04) and E/e’ ratio with normalized HF area sup (rs=-0.62; p=0.02). The Tei index had a positive and significative correlation with normalized HF area sup (rs=0.62; p=0.02) in cardiac form. This index was inverse with normalized LF area sup (rs=-0.62; p=0.02) and LF/HF ratio sup (rs=-0.62; p=0.02). There was not a significativa correlation between Tei index and echocardiographic parameters in indeterminate forma of Chagas’ disease. Conclusions: In this study, the Chagas’ disease presents with depressed absolute short- term heart interval variability, without a impaired sympathovagal balance in cardiac and indeterminate forms, more severe but not significant in the first. There are no differences in morph-functional variables by echocardiography between chagasic with oligo or no symptoms and control groups. The correlative analyses suggest that the autonomic impairment and has a significativa correlation with echocardiographic systolic and diastolic parameters in cardiac and indeterminate form of Chagas’ disease, without a necessary straight relationship of cause and effect.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Thaíza da Silva Santos (thaiza28@hotmail.com) on 2011-02-12T17:38:22Z No. of bitstreams: 1 2007_JairRodriguesAlves.pdf: 1238223 bytes, checksum: abcac04939d5f30d77cf4fbafa25cf44 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-03-23T15:47:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_JairRodriguesAlves.pdf: 1238223 bytes, checksum: abcac04939d5f30d77cf4fbafa25cf44 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-03-23T15:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_JairRodriguesAlves.pdf: 1238223 bytes, checksum: abcac04939d5f30d77cf4fbafa25cf44 (MD5) / A doença de Chagas causada pelo Trypanosoma cruzi é transmitida ao homem através de fezes contaminadas durante o repasto sanguíneo de insetos hemípteros, subfamília Triatominae. É crescente o surgimento de populações de triatomíneos resistentes aos inseticidas disponíveis, além do aparecimento de novas espécies com potencial vetorial, como Rhodnius milesi na Amazônia. Diante da diversidade química das plantas como fonte de novas moléculas ativas, este estudo avaliou a atividade inseticida e a capacidade de atrasar o ciclo de desenvolvimento do inseto de extratos de plantas do Cerrado sobre ninfas de 4° estádio (N4) de R. milesi e acompanhou o ciclo biológico do inseto em condições de laboratório. Entre os 67 extratos testados, 15 causaram entre 12,5 a 42,5% de mortes dos insetos. A partição em sistema líquido-líquido de nove desses extratos ativos permitiu selecionar a fase hexânica do extrato etanólico da folha de Siparuna guianensis, que foi fracionada em coluna aberta de sílica gel e as frações reunidas em grupos (G), segundo perfil cromatográfico em CCD. O grupo G6 apresentou propriedades triatomicida e toxicológicas sobre as ninfas de 4º estádio de R. milesi. Foi observada uma taxa de eclosão de 94,2% dos ovos em ninfas de 1º estádio, com incubação média de 15 dias. O período médio em dias de desenvolvimento pósembrionário foi para ninfas de 1º estádio de 17,2; 2º estádio 18,2; 3º estádio 17,3; 4º estádio 20,5 e 5º estádio 32,5 dias, com 1 a 1,5 repastos sanguíneos em cada estádio. O período médio transcorrido da eclosão da ninfa ao inseto adulto de R. milesi foi de 105,7 dias. O percentual de mortalidade total foi de 11,5%, sendo 4,9% para N1; 3,2% para N2; 2,7% para N3; 0,7% para N5 e nenhuma morte em N4, resultados que corroboram com a utilização de ninfas N4 em ensaios de atividade inseticida. Foi observado o período médio de jejum em ninfa de 5º estádio de 333,5 dias. O presente trabalho registra pela primeira vez a atividade triatomicida de S. guianensis e descreve o ciclo de vida, inédito, da biologia reprodutiva de R. milesi em condições de laboratório. / Chagas’ disease is transmitted to humans through feces of hemoptrous insects, subfamily Triatominae, contaminated during blood feeding. The increase in Triatominae populations resistant to available insecticides, and the appearance of new potential vector species, such as Rhodnius milesi in the Amazon region, are two pressing concerns. Given the uncharted chemical diversity of Cerrado plants as sources of new active molecules, this study assessed the insecticidal properties and the insect development retarding capacities of Cerrado plant extracts on 4th stage (N4) R. milesi nymphs, through the monitoring of the insect’s biological cycle under laboratory conditions. Of the 67 plant extracts tested, 15 caused insect mortalities between 12.5 and 42.5%. Nine of the 15 active extracts were partitioned in a liquid-liquid system allowing the selection of the hexanic phase of the ethanolic extract of the Siparuna guianensis leaf, which was fractioned in an open silicon gel column. The fractions were grouped (G) according to their chromatographic CCD profiles. Group G6 manifested triatomicidal and toxicological activity on 4th instar R. milesi nymphs. An overall ecclosion rate of 94.2% was observed for eggs of the 1st instar nymphs, incubated for an average of 15 days. The average pos-embrionary development period was 17.2 days for 1st instar nymphs, 18.2 for 2nd instar nymphs, 17.3 for 3rd instar, 20.5 for 4th instar, and 32.5 days for 5th instar nymphs, with 1 to 1.5 blood feedings in each stage. The average period between the ecclosion of the nymphs and the adult R. milesi was 105.7 days. The total mortality percentage was 11.5%; 4.9% for N1; 3.2% for N2; 2.7% for N3; and 0.7% for N5. However, no deaths were registered for N4, which corroborates the use of N4 nymphs in insecticidal activity studies. The average period of resistance to starvation for 5th instar nymphs was 333.5 days. This study is an initial investigation of the triatomicidal activity of S. guianensis, and is the first description of the reproductive cycle of R. milesi under laboratory conditions.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2011. / Submitted by Matheus Denezine (matheusdenezine@yahoo.com.br) on 2011-06-20T14:02:41Z No. of bitstreams: 1 2011_PaulaBeatrizdeMedeirosSantiago.pdf: 11948167 bytes, checksum: 2c8b46d29088a72eb877776e2587dc84 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-20T18:48:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_PaulaBeatrizdeMedeirosSantiago.pdf: 11948167 bytes, checksum: 2c8b46d29088a72eb877776e2587dc84 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-20T18:48:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_PaulaBeatrizdeMedeirosSantiago.pdf: 11948167 bytes, checksum: 2c8b46d29088a72eb877776e2587dc84 (MD5) / A pesquisa em doença de Chagas acumula bons resultados no que se refere à transmissão do Trypanosoma cruzi. Contudo, fatores devem ser considerados: a ocupação humana de áreas naturalmente habitadas por esses insetos e a presença constante do T. cruzi em populações animais aumentam o risco de novas transmissões ao homem. Esse cenário é similar ao encontrado na região sul da Baixa Califórnia, México, onde a invasão do ambiente do triatomíneo da espécie Dipetalogaster maxima pelo homem mostrou a versatilidade alimentar do vetor, que além do sangue de lagartos, passou a se alimentar do sangue humano. O fluxo sanguíneo deve ser constante para o sucesso do repasto e para contrapor a hemostasia do hospedeiro os triatomíneos hematófagos apresentam uma fonte complexa de proteínas em sua saliva, como vasodilatadores, anti-agregadores plaquetários e anti-coagulantes. O trabalho aqui realizado demonstrou que a saliva do triatomíneo D. maxima contém proteínas anti-hemostáticas já descritas na saliva de outros triatomíneos como Rhodnius prolixus, Triatoma infestans e Triatoma pallidipennis. A análise proteômica revelou as três maiores famílias de proteínas salivares encontradas em outros triatomíneos: lipocalina, antígeno-5 e apirase. A atividade apirásica salivar detectada em D. maxima apresenta características similares àquelas encontradas na saliva de T. infestans. Além disso, a análise molecular revelou que as apirases de ambos triatomíneos pertencem à família 5’nucleotidase e são enzimas oligoméricas. A pesquisa dos compostos salivares de hematófagos estimula o desenvolvimento de novos fármacos usados em desordens de origem circulatória. / The research on Chagas disease accumulates good results with regard to the control of Trypanosoma cruzi transmission. However, some factors should be considered: the human occupation of areas naturally inhabited by these insects and the constant presence of T. cruzi in animal population increasing the risk of new transmissions to humans. This scenario is similar to that found in southern Baja California, Mexico, where the invasion of the triatomine species Dipetalogaster maxima environment by man showed the versatility of the feeding vector, that besides the blood of lizards, started to feed on human blood. Blood flow must be constant for the success of the meal and to counteract host hemostasis, hematophagous triatomines emply a complex source of proteins and other molecules, present in their saliva, as vasodilators, anti-platelet aggregators and anti-coagulants. The work conducted here demonstrated that the salive of triatomine D. maxima comprises anti-hemostatic proteins that had been already described in the saliva of other triatomines such as Rhodnius prolixus, Triatoma infestans, and Triatoma pallidipennis. Proteome analysis showed the three major salivary families of proteins found in other triatomines: lipocalin, antigen-5 and apyrase. The detected salivary apyrase activity of D. maxima displays features of that found in the saliva of T. infestans. Furthermore, molecular analysis revealed that apyrases of both insects belong to the 5’ nucleotidase family and are oligomeric enzymes. The research on salivary compounds of hematophagous insects stimulates the development of new drugs to be used in disorders of circulatory origin.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by Jadiana Paiva Dantas (jadi@bce.unb.br) on 2011-06-29T22:14:57Z No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaDiasMagalhaes.pdf: 5174613 bytes, checksum: d240e42d60c95e87fc2a87623906127a (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-14T18:59:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaDiasMagalhaes.pdf: 5174613 bytes, checksum: d240e42d60c95e87fc2a87623906127a (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-14T18:59:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaDiasMagalhaes.pdf: 5174613 bytes, checksum: d240e42d60c95e87fc2a87623906127a (MD5) / O agente etiológico da doença de Chagas é o protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. A regulação da expressão gênica em T. cruzi dá-se principalmente ao nível pós-transcricional o que dificulta a correlação direta entre os níveis de mRNA e proteínas e torna atrativa a abordagem proteômica. Estudos teóricos anteriores predisseram uma distribuição bimodal entre as faixas ácidas e básicas de géis bidimensionais virtuais de tripanossomatídeos. Contudo, trabalhos experimentais com T. cruzi tem gerado perfis 2-DE com uma distribuição assimétrica e poucos spots protéicos na região alcalina. Com o objetivo de verificar se as diferenças entre os perfis reais e virtuais eram resultado de limitações técnicas das metodologias atuais de 2-DE em faixas básicas de pH, foram feitas análises proteômicas das formas de vida do T. cruzi utilizando-se condições otimizadas para a faixa de pH 6-11. Assim, os subproteomas alcalinos das formas tripomastigota e epimastigota foram comparados usando-se a metodologia de “gel dois-em-um” (“two-in one gel”) a qual, por minimizar as variações inerentes a 2-DE, facilitou a análise computacional de imagens. Um segundo estudo, concentrou-se na comparação das formas tripomastigota e amastigota, também utilizando uma estratégia de 2-DE-MS. Os resultados revelaram diferenças na expressão de proteínas entre as formas adaptativas do parasito, de acordo com suas características biológicas e corroboraram estudos proteômicos anteriores. Por exemplo, as enzimas relacionadas ao metabolismo de aminoácidos e desidrogenases foram mais abundantes na forma epimastigota, enquanto que trans-sialidases e proteínas paraflagelares foram encontradas especificamente na forma tripomastigota Sabendo-se que o fenômeno de fosforilação/desfosforilação de proteínas está implicado na diferenciação do T. cruzi, procedeu-se o estudo da variação do fosfoproteoma do parasito durante a amastigogênese pela detecção direta das proteínas fosforiladas em géis 2-DE. Assim, verificou-se que várias proteínas apresentaram variação de fosforilação ao longo da amastigogênese, principalmente aquelas associadas ao citoesqueleto, envolvidas no enovelamento protéico e com funções metabólicas. / The etiological agent of Chagas disease is the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. The fact that T. cruzi gene expression regulation occurs mainly at post transcriptional level prevents the direct correlation between mRNA and protein levels, and makes the proteomic approach very attractive. Previous theoretical studies predicted a bimodal distribution among acid and alkaline pH ranges in virtual 2-DE gels of trypanosomatides. On the other hand, 2-DE experiments on T. cruzi have generated assimetric profiles with very few spots on the alkaline region of the gel. Aiming at verifying whether the differences between real and virtual profiles were due to the technical imitations of current 2-DE methodologies in the basic pH range, we carried out proteome analysis of T. cruzi life stages using conditions optimized for the 6-11 pH range. Therefore, trypomastigote and epimastigote alkaline subproteomes were compared using the “two-inone gel” methodology which, by minimizing inherent 2-DE limitations, facilitated computational image analysis. A separate study focused on the comparison between trypomastigote and amastigote life stages also using a 2-DE-MS approach. Overall, the results revealed differences in protein expression between the adaptative forms of the parasite, in agreement with their biological traits, as well as corroborated previous proteomic studies. For instance, enzymes related with aminoacid metabolism and dehydrogenases were more abundant in the epimastigote stages while trans-sialidases and paraflagellar proteins were specifically found in trypomastigote 2-DE profiles. Since phosphorylation/dephosphorylation is implicated in T. cruzi differentiation, we followed variations of T. cruzi phosphoproteome during amastigogenesis through direct phosphoprotein detection in 2-DE gels. Thus, we verified that several proteins presented variation in phosphorylation profiles during amastigogenesis, specially those proteins associated wih cytoskeleton, involved in protein folding and those with metabolic functions.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Ruthléa Nascimento (ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2014-05-20T12:37:28Z No. of bitstreams: 1 2014_AgenordeCastroMoreiradosSantosJunior.pdf: 2582950 bytes, checksum: b1ada59cf3e421cbc9fe13c04ade54a9 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-21T11:48:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AgenordeCastroMoreiradosSantosJunior.pdf: 2582950 bytes, checksum: b1ada59cf3e421cbc9fe13c04ade54a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-21T11:48:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AgenordeCastroMoreiradosSantosJunior.pdf: 2582950 bytes, checksum: b1ada59cf3e421cbc9fe13c04ade54a9 (MD5) / O Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas, uma parasitose de grande relevância na América Latina. A divisão celular do T. cruzi possui características incomuns à maioria dos eucariotos, dado que durante o processo não ocorre o desaparecimento da membrana nuclear e condensação de seus cromossomos. O objetivo deste trabalho foi o estudo do conjunto de proteínas (proteoma) presentes no núcleo da forma epimastigota do T. cruzi. Para tanto, lisados celulares do parasito foram submetidos a um fracionamento celular por ultracentrifugação em gradiente de sacarose. O enriquecimento nuclear foi validado por microscopia de fluorescência com marcação para DNA e as imagens comparadas com a microscopia de campo claro, mostrando que a fração nuclear foi obtida com alto grau de pureza. A análise por SDS-PAGE mostrou diferenças evidentes de perfil proteico entre o extrato nuclear e extratos das demais frações obtidas durante o fracionamento. As proteínas do subproteoma nuclear foram posteriormente analisadas por eletroforese bidimensional (2-DE) e por digestão tríptica seguida de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). Usando esta última abordagem foi identificadas mais de 800 proteínas sendo quase 30% hipotéticas. Dentre os principais processos biológicos encontrados para as proteínas identificadas estão processos catabólicos, biossintéticos, geração de metabólitos e energia, processo metabólicos nucleares e tradução. As proteínas encontradas poderão ser alvos de futuros estudos para a elucidação de processos como divisão celular, transcrição gênica e formação de cromossomos, que hoje ainda não são bem elucidados. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Trypanosoma cruzi is a protozoan that causes Chagas´ disease, a disease of great relevance in Latin America. The replication process of the T. cruzi possesses unusual features, when compared to other eukaryotes; given that during this process, the nuclear membrane does not disappear and there is not chromosome condensation. The goal of this project was to study the set of proteins (proteome) that are present in the nucleus of the T. cruzi epimastigote life form. To this end, the parasite cell lysates were subjected to cell fractionation by sucrose gradient ultracentrifugation. As a way to validate these purity of the isolated cell fractions, we used optical microscopy methods including bright field analysis and fluorescence microscopy after DNA labeling. The images demonstrated that the nuclear fractions were obtained with high purity. Furthermore, SDS-PAGE analysis showed differences in protein profiles between the nuclear extracts and extracts of other fractions obtained during the fractionation. The proteins of the nuclear subproteome were subsequently analyzed by two-dimensional electrophoresis (2-DE) and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Using the latter approach, we identified more than 800 proteins with almost 30 % being hypothetical. Among these proteins many are involved in important biological processes such as catabolic and biosynthetic pathway, metabolites and energy generation, nuclear metabolites and translation. Hence, the proteins describe in this work may be use in future studies to elucidate processes such as cell division, transcription and chromosomes packaging, which are not fully well understood.