Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Farmácia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T12:36:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 210227.pdf: 843615 bytes, checksum: 07c918de573264ba089f2ab656de136a (MD5) / O desequilíbrio entre os mecanismos que causam condições oxidativas e as defesas antioxidantes provoca uma variedade de mudanças fisiológicas, chamadas coletivamente de estresse oxidativo. A cardiopatia chagásica é uma patologia com características de inflamação crônica muito próxima a uma doença auto-imune que tem mecanismo de ação ainda obscuro. O objetivo deste trabalho foi analisar as enzimas antioxidantes nos eritrócitos de pacientes cardiopatas chagásicos crônicos puros, classificados em 4 grupos nomeados de I à IV (cada grupo contendo n=10), variando entre estes grupos o grau de comprometimento cardíaco, segundo classificação de Los Andes modificada. Cada um dos quatro grupos chagásicos foi igualado a indivíduos saudáveis pela idade, formando 4 grupos-controle, e ainda, um grupo V formado por 10 pacientes não chagásicos com insuficiência cardíaca de etiologia orovalvar com sobrecarga de pressão e volume, perfazendo um total de 90 pacientes. Foram examinadas as enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), glutationa S-transferase (GST) e ainda os tióis não proteicos (GSH), (GT) e (GSSG). As atividades da SOD, CAT, GR e os níveis de GT e GSSG essencialmente não apresentaram diferenças entre os grupos chagásicos. A concentração de GSH diminui com a progressão da doença e apresentou aumento em relação aos controles nos grupos I, II e III. As atividades da GST e GPx estiveram aumentadas no grupo III e diminuídas no grupo II e IV, indicando uma diminuição destes antioxidantes com a progressão da doença. O grupo V, exceção às atividades da SOD e da CAT que foram semelhantes, mostrou aumentos das enzimas em relação ao grupo IV, constituindo um comportamento diferenciado neste sentido. Esses resultados sugerem a existência de um quadro de estresse oxidativo com o aumento das condições oxidativas paralelamente à evolução da doença, ou seja, pacientes com grau mais elevado de acometimento cardíaco têm uma capacidade antioxidante diminuída, o que sugere uma perda grande das defesas antioxidantes. Os dados do presente trabalho têm grande importância quanto ao sistema antioxidante relacionado com os mecanismos de agressão do parasita nesta patologia crônica.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. 2011. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-05-15T12:51:21Z No. of bitstreams: 1 2011_DaniellaBarretoSantana.pdf: 3986139 bytes, checksum: 8201a80a7497e3f87638051fcfee595e (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-15T13:47:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_DaniellaBarretoSantana.pdf: 3986139 bytes, checksum: 8201a80a7497e3f87638051fcfee595e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-15T13:47:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_DaniellaBarretoSantana.pdf: 3986139 bytes, checksum: 8201a80a7497e3f87638051fcfee595e (MD5) / Trypanosoma rangeli é um protozoário hemoflagelado parasita de triatomíneos e mamíferos, com a distribuição geográfica em vários países latino-americanos. Neste trabalho abordamos de três formas o estudo sobre o T. rangeli nas diferentes espécies de Rhodnius. Na primeira abordagem, estudamos a suscetibilidade e a competência vetorial das diferentes espécies de Rhodnius à cepa SC-58 de T. rangeli (genótipo KP1-), testando a hipótese de que essas espécies poderiam apresentar diferente susceptibilidade à cepa SC-58 devido a um mecanismo hipotético de co-evolução parasito-vetor; na segunda, analisamos o processo de penetração e adesão do T. rangeli nas glândulas salivares e morfogênese do T. rangeli em R. robustus; e na terceira, analisamos a influência da infecção por T. rangeli na biologia de algumas espécies de Rhodnius, testando a hipótese de que há diferença no ciclo biológico e comportamento alimentar dos espécimes infectados, quando comparados com os insetos não infectados. Na primeira abordagem, analisando-se a evolução da infecção por T. rangeli em 4 espécies de Rhodnius (R. neglectus, R. pictipes, R. robustus, R. nasutus), observou-se que a suscetibilidade (desenvolvimento no intestino, hemolinfa e glândula salivar) e o processo de transmissão deste protozoário foram maiores e mais eficientes em R. pictipes, reforçando a evidência relatada de que esses triatomíneos podem atuar como filtros biológicos na transmissão de populações geneticamente diferentes de T. rangeli. Na segunda abordagem, através das observações realizadas com Microscopia Eletrônica de Varredura e de Transmissão, observou-se que o fenômeno inicial de penetração e invasão nas glândulas salivares se daria por formas tripomastigotas e/ou epimastigotas. As micrografias mostraram várias formas de flagelados nas glândulas salivares – epimastigotas e tripomastigotas espalhadas na luz glandular. Finalmente, na terceira abordagem, comparando-se a duração do ciclo de vida, a taxa de mortalidade e o comportamento alimentar de R. neglectus, R. pictipes e R. robustus, observou-se que alguns parâmetros do comportamento alimentar como número de picadas, detecção do hospedeiro, número de interrupções e dejeções dos triatomíneos infectados foram modificados quando comparados com os espécimes não infectados. / Trypanosoma rangeli is a hemoflagellated protozoan, triatomine and mammals parasite, present in many Latin American countries. In this work we approach the study about T. rangeli and the different species of Rhodnius in three forms. On the first approach, we study the susceptibility and vector competence of different species of Rhodnius to the strain SC-58 of T. rangeli (KP1- genotype), testing the hypothesis that these species could present different susceptibility due to a hypothetical mechanism of co-evolution parasite-vector; on the second approach, we analyze the invasion process (attachment, adhesion) in salivary glands and morphogenesis of T. rangeli in R. robustus; and on the third, we analyze the influence of the infection by T. rangeli in biology of some species of Rhodnius, testing the hypothesis that there are differences on biological cycle and feeding behavior on the infected species, when compared to uninfected insects. On the first approach, analyzing the evolution of the infection by T. rangeli in species of Rhodnius (R. neglectus, R. pictipes, R. robustus, R. nasutus), we observed that susceptibility (thorough the intestine, haemolymph and salivary glands development) and the transmission process of this protozoan were larger and more efficient in R. pictipes, reinforcing the reported evidence that these triatomines may act as biological filters in transmission of genetically different populations of T. rangeli. On the second approach, from observations carry out with Transmission and Scanning Electronic Microscopy, it was observed that the initial phenomenon of attachment and invasion into salivary glands occurred by trypomastigote and/or epimastigote forms. The micrographics showed several forms of flagellated in salivary glands – epimastigotes and trypomastigotes spread on the gland lumen. Finally, on the third approach, comparing the duration of life cycle, mortality rate and feeding behavior of R. neglectus, R. pictipes and R. robustus, it was observed that some parameters of feeding behavior as number of bites, source host detection, number of interruptions and dejecting in the infected triatomines were modified when compared with those uninfected control individuals.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-07-29T13:45:26Z No. of bitstreams: 1 2013_DeboraTorresAlvesFigueiredo.pdf: 6275777 bytes, checksum: 517b44576fd1e1f2de64e008db5d0083 (MD5) / Approved for entry into archive by Leandro Silva Borges(leandroborges@bce.unb.br) on 2013-08-06T20:23:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_DeboraTorresAlvesFigueiredo.pdf: 6275777 bytes, checksum: 517b44576fd1e1f2de64e008db5d0083 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T20:23:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_DeboraTorresAlvesFigueiredo.pdf: 6275777 bytes, checksum: 517b44576fd1e1f2de64e008db5d0083 (MD5) / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanozoma cruzi, é um problema de saúde pública, principalmente na América Latina, e os tratamento; disponíveis são muitas vezes ineficazes, além de causar efeitos colaterais graves. O nosso grupo de pesquisadores tem como objetivo identificar e caracterizar proteases do parasito para a identificação de potenciais novos alvos terapêuticos. Neste trabalho, apresentamos um estudo preliminar sobre a função dos genes da dipepdil-peptidase 8 (dpp8tc) e da otubaina (otutc), uma serino e uma cisteíno protease de T. cruzi, respectivamente. A DPP8 é uma protease da família DPPIV, que é conhecida pela sua importante função de clivar ligações peptídicas com prolina na segunda posição. Estas peptidases são importantes no processamento e degradação de peptideos como hormônios e neuropeptídeos. A OTU pertence a família das enzimas deubiquitinantes, importantes na regulação de alguns genes relatados em vários processos biológicos, como ativação da resposta imune. A DPP8 e a OTU são expressos em T. cruzi e se apresentam em cópia única no genoma deste parasito, o que nos permitiu realizar o estudo, por meio de nocaute físico, da função dessas proteínas na viabilidade e no processo de infecção do protozoário. Assim, cassetes para a realização do nocaute foram construídos com o gene de neomicina-fosfotransferase (neo) flanqueado pelas regiões 5`UTR. e 3`UTR do gene dpp8tc ou otutc. Esses cassetes foram transfectados em parasitos epimastigotas da cepa CL-Brener, produzindo parasitos resistentes a G418. Algumas PC Rs foram realizadas a fim de se verificar a presença dos genes dpp8tc, otutc e neo no genoma dos parasitos nocauteados, assim como no genoma dos parasitos controle não transformados (selvagens), que confirmaram a presença de uma outra cópia no genoma. Além disso, outras PCRs confirmaram a correta inserção do cassete no local do gene de interesse, indicando a ocorrência de nocaute simples (de um único alelo), o que demonstrou a eficácia do protocolo. O efeito do nocaute simples dos genes foi analisado por meio da observação do crescimento in vitro, em que os parasitos simples mutantes para otutc cresceram a uma taxa 22,5% inferior que o selvagem, ao passo que essa taxa nos mutantes simples para dpp8tc foi 25% superior a do selvagem Os parasitos nocauteados foram ainda capazes de se diferenciar em tripomastigotas e desafiados a infectar células L6 de mioblastos de camundongos. Os mutantes para otutc foram capazes de infectar 1.65 e 3 vezes mais células em 3 e 24 horas de infecção, respectivamente, comparado ao selvagem, enquanto nos mutantes para dpp8tc este aumento foi de 1,76 e 1,65 a mais que o selvagem. O teste enzimático in vitro para DPP8 no substrato Gly-Pro-AMC demonstrou haver atividade enzimática de 165% nos mutantes para o gene dessa enzima, sendo esse valor superior ao apresentado pelo selvagem (100%). Os resultados obtidos no presente estudo são preliminares e apontam estratégias futuras de pesquisa, tal como a análise do nocaute duplo (em ambos os alelos) paia os genes dpp8tc e otutc e a infecção in vivo de forma a contribuir com o entendimento da função dessas proteínas no parasito. / Chagas disease, caused by the protozoan Tripanosoma cruzi. is a public health burden, mainly in Latin America since available treatments are often ineffective and cause severe side effects. The aim of our research team is to study parasite proteases as potential new therapeutic targets. In this work. we present a preliminary functional study of dipeptidyl-peptidase 8-like (dpp8tc) and otubain (otutc), a serine and a cysteine protease of T. cruzi. respectively. DPPs are prolyl oligopeptidase family members involved in hormone processing or inactivation in mammalians. Otu belong to the deubiquitylating enzymes (DUBs) family, important in gene regulation and reported in several biological processes such as immune response activation The dpp8tc and otutc are expressed in T. cruzi and is present as a single copy gene in the genome, which allows us to study the genes by knockout (KO), the role of these proteins in the parasite viability and infection process. The KO cassettes were constructed with neomycin phosphotransferase gene (neo) flanked by 5’UTR and 3’UTR of dpp8tc or otutc. They were transfected into epimastigotes (CL-Brener strain) producing G418-resistant parasites. Several PCRs were carried out to verify the presence of dpp8tc otutc. and neo in the KO and wild type (WT) parasite genome. In addition, other PCR confirmed the correct insertion of the cassette in place of the target gene, in a single-allele knockout, demonstrating the efficacy of the protocol. The effect of the single-allele knockout was analyzed by observation of in vitro growth, in which the single mutants for otutc grew at a rate 22.5% lower than the WT, whereas the rate for the dpp8tc single mutants was 25% higher than WT. The mutants could differentiate into trypomastigotes and when challenged to infect L6 cells of mice myoblasts, the otutc mutants were able to infect 165% and 290.57% of cells. 3 and 24 hours after infection, respectively, while WT was able to infect 100%. These values for the dpp8tc mutants were 176.89% and 165.21%. 3 and 24 hours after infection, respectively. The in vitro enzymatic test for DPP8 on the substrate Gly-Pro-AMC demonstrated enzymatic activity of 165% in the mutants for the gene of this enzyme, when compared to wild type, this value being higher than drat presented by the WT (100%). The results obtained in this study are preliminary and suggest future research strategies, such as the analysis of double-allele knockout for the genes dpp8tc and otutc as well as in vivo mice infection in order to contribute to the understanding of the hole of these proteins in T. cruzi.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2016. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Foram disponibilizados Resumo, Discussão e Referências bibliográficas. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-12T15:47:07Z No. of bitstreams: 1 2016_DivaBernardesVargas_Parcial.pdf: 1843805 bytes, checksum: 2be8f425194b61734dac608dc29fcd76 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-11-07T18:20:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DivaBernardesVargas_Parcial.pdf: 1843805 bytes, checksum: 2be8f425194b61734dac608dc29fcd76 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-07T18:20:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_DivaBernardesVargas_Parcial.pdf: 1843805 bytes, checksum: 2be8f425194b61734dac608dc29fcd76 (MD5) / Introdução: Investigou-se possível desenervação parassimpática ocular na doença de Chagas crônica. Sabe-se que muitas manifestações da doença de Chagas são por danos ao sistema nervoso parassimpático cardíaco e mioentérico. Considerando que a inervação efetora pupilar é feita pelo sistema nervoso simpático e parassimpático e que a pressão intraocular é em parte influenciada por eles, realizaram-se medidas pupilares e da pressão intraocular para investigar danos ao sistema colinérgico ocular em pacientes com doença de Chagas. Métodos: Foram constituídos 02 grupos, sendo um grupo com 80 pacientes chagásicos e um grupo comparativo com 76 participantes saudáveis. Realizou-se pupilometria, teste de hipersensibilidade a pilocarpina 0,125% e medida da pressão intraocular (PIO). Mediu-se o diâmetro basal da pupila (DBP), a amplitude de constrição pupilar absoluta (ACA) e relativa (ACR) e o diâmetro pupilar após pilocarpina 0,125%. Pesquisou-se anisocoria e analisou-se a associação dos parâmetros com o tempo de diagnóstico e com a realização ou não do tratamento específico. Resultados: A prevalência de anisocoria foi significativamente (p < 0,01) maior em pacientes chagásicos do que em não chagásicos. Não houve associação entre as medidas pupilares e o tempo de diagnóstico ou realização de tratamento específico. Os pacientes chagásicos apresentaram valor médio do DBP (p < 0,01), valor médio do diâmetro fotópico (p = 0,02) e valor médio da ACA (p < 0,01) significativamente menores do que os não chagásicos. A ACR não difere significativamente nos chagásicos dos não chagásicos (p = 0,39). A hipersensibilidade ocorreu em 10% dos chagásicos no olho direito e em 2,5% no olho esquerdo. O valor médio da PIO teve significância marginal (p = 0,06) entre os pacientes chagásicos e o grupo comparativo. Conclusão: Os dados sugerem que a análise pupilométrica e o teste de sensibilidade à pilocarpina podem ser um marcador para distinguir os pacientes com doença de Chagas com disfunção colinérgica. Tais medidas indicam que danos parassimpáticos em pacientes com doença de Chagas podem ocorrer no coração, no intestino, mas também no olho. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: We investigated possible ocular parasympathetic denervation in chronic Chagas disease. It is known that many Chagas' disease manifestations are due to damage to heart and myenteric parasympathetic nervous system. Whereas the efferent innervation of the pupil is made by sympathetic and parasympathetic, the nervous system and intraocular pressure is largely influenced by this system, we performed pupillary and intraocular pressure measurements to check possible damage to the ocular cholinergic system in Chagas' disease. Methods: We formed 02 groups, one group of 80 patients with Chagas disease and 01 comparison group of 76 healthy participants. Thus, we performed pupillometry, proceeded the hypersensitivity test to pilocarpine 0.125% and measurement of intraocular pressure (IOP) in individuals with and without Chagas' disease. We measured the scotopic pupil diameter (BPD), the absolute (ACA) and relative (ACR) pupillary constriction amplitude, pupil diameter after pilocarpine 0.125% and IOP. We searched for anisocoria and analyzed the association of the parameters with time from diagnosis and the realization or not of specific treatment. Results: The prevalence of anisocoria was significantly (p < 0.01) higher in patients with Chagas' disease than in non-chagasic. There was no association between pupillary measures and disease time from diagnose or anti-trypanosoma treatment duration. Chagasic patients had mean value of BPD (p < 0.01), mean value of photopic diameter (p = 0.02) and ACA mean value (p < 0.01) significantly lower than the non-chagasic individuals. The ACR does not differ significantly from chagasic to non-Chagas (p = 0,39). Hypersensitivity occurred in 10% of Chagas disease in the right eye and 2.5% in the left eye. The mean IOP had marginal significance (p = 0,06) between patients with Chagas disease and the comparative group. Conclusion: pupillometric analysis and pilocarpine hypersensitivity test may be a marker for distinguishing chagasic patients with cholinergic dysfunction. Such measurements indicate that parasympathetic damage in patients with Chagas' disease can occur not only in the heart, in the intestine and peripheral nervous system, but also in the eye.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-02-12T12:31:39Z No. of bitstreams: 1 2015_LennineRodriguesMelo.pdf: 5653985 bytes, checksum: d46fb13724a4ad1d5c6b390a9529fab8 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-02-22T21:56:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_LennineRodriguesMelo.pdf: 5653985 bytes, checksum: d46fb13724a4ad1d5c6b390a9529fab8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-22T21:56:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_LennineRodriguesMelo.pdf: 5653985 bytes, checksum: d46fb13724a4ad1d5c6b390a9529fab8 (MD5) / A busca por compostos que apresentem atividade luminescente (fluorescência) é de extrema importância em razão da alta sensibilidade de detecção desses em técnicas analíticas. Porém, a técnica de espectroscopia de fluorescência molecular não é muito utilizada em decorrência do número limitado de sistemas químicos que atuem com atividade luminescente apreciável. Nessa perspectiva foram sintetizadas e avaliadas onze estruturas de chalconas, partindo-se do 4-(dimetilamino)benzaldeído e do 3,4,5-trimetoxibenzaldeído, já amplamente discutidos na literatura por ser um cromóforo e pela atividade biológica, respectivamente. Os compostos foram devidamente caracterizados e tiveram suas estruturas determinadas por difração de raios-X, quando possível. Suas propriedades fotofísicas e comportamentos solvatocrômicos foram investigados. Observado o amplo espectro de atuação da classe de compostos avaliada, estudos de docagem molecular e testes in vitro foram realizados para a doença de Chagas, reconhecida pela OMS como negligenciada. Visando uma importante aplicação tecnológica, foram produzidas microfibras do acervo sintetizado a partir do polímero polivinilpirrolidona e as caracterizações se deram por MEV. / The search for compounds having luminescent activity (fluorescence) have extreme importance because high sensitivity detection of these in analytical techniques. However, the technique of molecular fluorescence spectroscopy is not widely used due to the limited number of chemical systems which operate with considerable luminescent activity. In this perspective were synthesized and evaluated eleven chalcones structures, starting from the 4-(dimethylamino)benzaldehyde and 3,4,5-trimethoxybenzaldehyde, as well discussed in the literature to be a chromophore and for the biological activity, respectively. The compounds were characterized and have their structures determined by X-ray diffraction, when possible. Their photophysical properties and solvatochromic behaviors were investigated. Noted the broad spectrum of compounds class performance were also evaluated molecular docking studies and in vitro tests were conducted to Chagas disease, by WHO recognized as neglected. Searching for better possibility in technological application were produced microfibers with the polyvinylpyrrolidone polymer and these were characterized for SEM analysis.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-02-18T16:55:17Z No. of bitstreams: 1 2015_CamilaAlvesSantana.pdf: 1674794 bytes, checksum: 8759cdf852cfc0b2c3ae27292328abdf (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-02-28T11:11:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_CamilaAlvesSantana.pdf: 1674794 bytes, checksum: 8759cdf852cfc0b2c3ae27292328abdf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-28T11:11:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_CamilaAlvesSantana.pdf: 1674794 bytes, checksum: 8759cdf852cfc0b2c3ae27292328abdf (MD5) / A doença de Chagas é uma das principais doenças parasitárias na América Latina, atingindo cerca de oito milhões de pessoas. As manifestações da doença afetam o coração, intestinos e sistema nervoso. Seu tratamento é considerado ineficiente, não existindo medicamentos ou vacinas capazes de prevenir o desenvolvimento da patologia. Dessa forma, a maneira mais efetiva de se combater a doença de Chagas é realizando seu diagnóstico precoce e atuando sobre suas diversas vias de transmissão. Este estudo teve como objetivo avaliar a relação entre via de transmissão do Trypanosoma cruzi, o estabelecimento da carga parasitária e produção de anticorpos específicos, parâmetros avaliados para se estabelecer o diagnóstico da infecção. Camundongos BALB/c foram infectados com 103 formas tripomastigotas de T. cruzi pelas vias intraperitoneal, oral e ocular. Infecções pelas vias sexual e congênita ocorreram de maneira natural. As avaliações foram realizadas durante a fase crônica da infecção. A qPCR revelou uma maior carga parasitária em camundongos infectados pela via intraperitoneal, o que também foi acompanhado por uma maior produção de anticorpos. As vias oral e ocular apresentaram mínima carga parasitária e não obtiveram títulos de anticorpos reagentes. O aumento da concentração de T. cruzi inoculada por essas duas vias promoveu um aumento da carga parasitária com consequente produção de anticorpos específicos. As vias sexual e congênita mostraram baixa, porém relevante, carga parasitária, o que as tornou reagentes nos testes sorológicos. Destaca-se que 54,6% dos camundongos infectados pela via congênita apresentaram diagnóstico molecular positivo com testes sorológicos negativos. O desafio desses animais com formas tripomastigotas de T. cruzi resultou em soroconversão em apenas 41,6% dos animais, sugerindo que os demais podem ter sido tolerizados aos antígenos parasitários. A demonstração de que a rota de aquisição do T. cruzi influencia na determinação da carga parasitária de camundongos na fase crônica da doença, bem como no perfil de produção de anticorpos, auxiliará na compreensão da epidemiologia da doença de Chagas em diferentes ecossistemas, onde predominam diferentes vias de transmissão. / Chagas disease is a major parasitic disease in Latin America, affecting about eight million people. The clinical manifestations affect the heart, intestines and nervous system. The treatment is considered ineffective, with no drugs or vaccines able to prevent disease development. The most effective way to fight Chagas disease is thus conducting early diagnosis and acting on its various routes of transmission. This study aimed to evaluate the relationship between T. cruzi transmission route, the establishment of parasite load and specific antibodies production, parameters evaluated to establish the diagnosis of the infection. BALB /c mice were infected with 103 T. cruzi trypomastigotes by intraperitoneal, oral and ocular routes. Sexual and congenital transmissions occurred naturally. Analyses were conducted during Chagas disease chronic phase. qPCR revealed a higher parasite load in mice infected by intraperitoneal route, which was also accompanied by an increased production of antibodies. Oral and ocular pathways had minimal parasite burden and did not obtain positive antibodies titers. A higher concentration of T. cruzi inoculums in these two pathways promoted an increase in parasite load and antibodies production. Sexual and congenital routes showed low but significant parasite load, which made them positive in serological tests. It is noteworthy that 54.6% of congenital infected mice tested positive in qPCR and negative in serological tests. The challenge of these animals with T. cruzi trypomastigotes resulted in serum conversion in only 41.6% animals, suggesting tolerization to parasite antigens. The demonstration T. cruzi acquisition route influences in parasite load of mice in the chronic phase of the disease and antibody production profile will assist in the understanding of Chagas disease epidemiology in different ecosystems.

Banca: Mario Tsunezi Shimizu / Banca: Olga Fichman / Banca: Esther Birman / Banca: Luiz Jacinto da Silva / Banca: Terezinha de Oliveira Nogueira / Resumo: Anticorpos naturais para antígenos próprios e exógenos foram analisados pela técnica de ELISA, em 60 soros de pacientes cronicamente infectados pelo T. cruzi e, em 40 soros de indivíduos sofrendo de uma micose profunda, freqüentemente encontrada na América Latina (Paracoccidioimicose). Cerca de 80% dos indivíduos do primeiro grupo tinham níveis significativamente elevados de anticorpos antilaminina (M=4,75, DP±1,88) quando comparados com os controles saudáveis e, diferentes especificidades de anticorpos estavam associadas com antilaminina nos soros chagásicos. Foram observados anticorpos reativos com as proteínas do citoesqueleto, especialmente com a banda 3 e seus peptídeos, como o de 62 kDa. Por meio de cromatografia, em Proteína-A - Sepharose, mostramos que uma parte significante do antiGal natural pode estar ligada por sua região Fab a outra molécula de imunoglobulina e/ou a sítios alternativos de ligação na Proteína A. O achado de lgG antiGal nos imunocomplexos reforçam a primeira hipótese. Todavia, é possível que algumas lgG aniiGal pertençam ao subgrupo VH111 de imunoglobulinas. Entre os 40 soros de PCM examinados, a maioria tinha níveis normais de anticorpos naturais. Todavia, 30% dos pacientes crônicos apresentavam aumentos de pelo menos uma especificidade de anticorpo natural, tal como antiactina, antimiosina e antiGal. Na forma juvenil os anticorpos antiactina estavam aumentados de 2,4 vezes (1,9 a 5,3 vezes), sugerindo uma associação com a doença disseminada. lmunocomplexos foram pesquisados nos soros de PCM utilizando a técnica de precipitação com polietileno glicol 6000. Nos imunocomplexos Isolados foram encontrados principalmente anticorpos específicos para antígenos solúveis de P. brasiliensis / Abstract: Using ELISA technique, natural antibodies against self and non self antigens were determined in 80 patients chronically intected by T. cruzi and 40 individuals suffering from a deep mycosis frequentely found in Latin Amarica (Paracoccidioidomycosis - PCM). Two forms of PCM were investigated: adult forms and juvenil type of disease. Eighty percent (80%) of the former group had significantly elevated anti-laminin antibody levels (M=4.7,SD±1.8) compared with healthy controls and different specificities of antibody were associated with anti-laminin in pathological sera. A notable binding to cytoskeletal proteins was observed, specially with band 3 and their peptides derivates, such as 62 kDa peptide. By means of Protein A chromatography we were able to show that natural anti-Gal antibodies may be bound by their Fab region to other immunoglobulins and/or to Protein A by alternative sites of binding. The finding of lgG anti-Gal antibodies in circulating immune complexes isolated from chagasic sera supported the first alternative. However, it is possible that some of lgG anti-Gal antibodies, belong to VH111 subgroup of immunoglobulins, that bind directly to Protein A. Among the 40 sera from PCM examined, the majority was considered as not exhibiting a signilicantly higher binding than normal sera to antigens tested. However thirty percent (30%) of the chronic patients had an increased levels of natural antibodies at least for one specificity such as actyn, myosin and Gala1,3Gal epitopes. ln juvenil type of PCM the mean value found for actyn was also increased 2,42 (range 1,0 to 5,3). Utilizing the polyethylene glicol precipitation the presence of circulating immune complexes was investigated in PCM sera. Specific antibodies for soluble antigens from P. brasiliensis and natural antibodies against myoglobin, myosin and Gala1,3 Gal epitopes were characterized

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2006. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-31T16:11:40Z No. of bitstreams: 1 2006_Daniella Barreto Santana.pdf: 1808092 bytes, checksum: 6050e51aee3d99b95f04cb15e837f7f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-07-08T13:00:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Daniella Barreto Santana.pdf: 1808092 bytes, checksum: 6050e51aee3d99b95f04cb15e837f7f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-07-08T13:00:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Daniella Barreto Santana.pdf: 1808092 bytes, checksum: 6050e51aee3d99b95f04cb15e837f7f5 (MD5) Previous issue date: 2006 / Triatomíneos do gênero Rhodnius: R. neglectus e R. robustus, vetores naturais do Trypanosoma rangeli, foram identificados utilizando-se as chaves taxonômicas de Lent & Wygodzinsky, 1979 e a morfometria geométrica das asas. Este último confirmou sua utilidade como parâmetro de identificação taxonômica em triatomíneos do gênero Rhodnius. No estudo comparativo das estatísticas vitais e dos aspectos de comportamento alimentar, os triatomíneos das duas espécies foram observados diariamente para se estabelecer: (i) o período de desenvolvimento dos estádios ninfais; (ii) percentual de mortalidade; (iii) detecção do hospedeiro (tempo de aproximação dos triatomíneos ao hospedeiro vertebrado experimental); (iv) número de tentativas de picadas dos insetos no hospedeiro; (v) tempo total do repasto sanguíneo; (vi) índice de picadas; (vii) lapso entre o final do repasto e a primeira defecação; e (viii) quantidade de sangue ingerido. Comparando-se as duas espécies, R. neglectus apresentou um período ninfal significativamente menor que R. robustus, havendo diferença significativa (p<0,001) para todos os estádios, exceto para Ninfa V. Com relação ao comportamento alimentar, as duas espécies apresentaram os parâmetros bem similares, exceto para o número de picadas onde R. neglectus se apresentou significativamente maior para as Ninfas IV e V, e para a quantidade de sangue ingerido onde R. robustus apresentou uma média de ingestão significativamente maior que R. neglectus. Em R. robustus, registrou-se a presença dos dois pares de glândulas (D1 e D2), característica da espécie estudada. Para verificar o potencial vetorial de T. rangeli nas espécies de triatomíneos, utilizou-se três procedimentos laboratoriais com a cepa SC-58: infecção via alimentação em camundongo infectado, via inoculação intracelômica e via xenodiagnóstico artificial, mas não houve infecção das glândulas salivares. Após diversas tentativas, T. rangeli infectou a hemolinfa em apenas dois triatomíneos, sem progresso de infecção. Com a cepa LP-01, isolada recentemente de R. neglectus naturalmente infectado, realizou-se uma tentativa de infecção via alimentação em camundongo infectado, sem demonstrar invasão hemolinfática. Na infecção in vitro das glândulas salivares, foi utilizada uma glândula controle (sem infecção) e mais quatros glândulas, infectadas por quatro tempos distintos (30 minutos, 1, 3 e 24 horas), que foram processadas e levadas ao Microscópio Eletrônico de Varredura para verificar e documentar o processo inicial de adesão e penetração na membrana basal. Após o processamento, observou se que apenas com 30 minutos e 1 hora de infecção, flagelados encontravam-se aderidos na membrana basal, formando “grumos” com aparência de estar penetrando por orifícios grandes e visíveis. Isto poderia sugerir então que de alguma maneira, os flagelados lesam a membrana basal, com a finalidade de atravessá-la e ganhar passo às células do epitélio glandular. / Rhodnius neglectus and Rhodnius robustus (Hemíptera, Triatominae), two species from the genus Rhodnius, were initially identified using the well known taxonomical keys described by Lent and Wygodzinsky ( 1979) and, in addition, techniques of wings geometric morphometry. Both approaches resulted in good agreement confirming the value of the last one in accurate identification of species of Rhodnius spp .Comparative studies on experimental life tables and feeding behavior of R. neglectus and R. robustus important natural vectors of Trypanosoma rangeli in Brazil, were carried out in order to establish: (i) time instars development (ii) mortality (iii) source host detection (iv) average number of bugs’ bite on host (v) bloodmeal spending time (vi) biting rate (vii) elapsed time between bloodmeal intake and first defecation (viii) total bloodmeal ingested . Main results of such comparison were: R. neglectus have shown a faster development of nymphs than R. robustus during all different stages except nymph V ( p<0,001). Regarding feeding behavior, if on one hand R neglectus demonstrated a higher number of bites in instar IV and V, on the other hand R. robustus have shown higher average of blood uptake . Two pairs of salivary glands (D1 and D2) were recorded in R. robustus and histologically described .The vector potential of the two species under study were pursued with challenges using two strains of T. rangeli (strains SC58 and LP01). Attempts of experimental infection using mouse infected with the flagellate, artificial xenodiagnosis and intracoelomic injections of cultures of the flagellate, were carried out with partial intestinal and haemolymphatic infections. No invasion of salivary glands were obtained in spite of our repeated efforts. Alternatively, salivary glands “in vitro infections” procedures, in different time-point( 30’, 1 hour, 24 hours) were performed. Studies on infected glands by light microscopy and scanning electron microscopy (SME) were done. Striking results were the recording of parasites recognition, adhesion and , probably, initial penetration through holes /orifices apparently produce by the flagellum of T. rangeli trypomastigotes/epimastigotes on the basal membrane surface. Our interpretation is that the parasite somehow open holes through the basal membrane of the salivary glands when they form clusters of flagellum first, to gain entry into the adjacent glandular epithelium.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2010-04-01T20:30:22Z No. of bitstreams: 1 2009_KeylaCarolinedeAlmeida.pdf: 3384486 bytes, checksum: 4504fcf88294c8a5ba06876f2bd4ccda (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-06T19:01:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_KeylaCarolinedeAlmeida.pdf: 3384486 bytes, checksum: 4504fcf88294c8a5ba06876f2bd4ccda (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-06T19:01:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_KeylaCarolinedeAlmeida.pdf: 3384486 bytes, checksum: 4504fcf88294c8a5ba06876f2bd4ccda (MD5) Previous issue date: 2009 / Após um século da descoberta da Doença de Chagas, ainda não existe medicamento efetivo para o seu tratamento, e os chagásicos continuam sucumbindo às manifestações crônicas dessa grave enfermidade. A possibilidade de descobrir uma enzima ou uma via metabólica crucial para o ciclo de vida do parasita não se resume apenas à satisfação da curiosidade humana, mas também é fundamental para o desenvolvimento de fármacos que sirvam para combater as mais diferentes doenças, entre elas, a Doença de Chagas. Essa dissertação de mestrado descreve o estudo de três proteínas de Trypanosoma cruzi: duas proteases classificadas como serino-protease com domínio α/β hidrolase, pertencente ao clan SC e família S9 e S15, respectivamente - Oligopeptidase B símile (OPBsTc) e X-prolil dipeptidil aminopeptidase (X-PDAPTc) e uma proteína da via metabólica redox - a Glutationa sintetase (GSTc). A OPBsTc é uma enzima putativa de 903 aminoácidos com massa molecular esperada de 103,4 kDa sendo altamente conservada entre os cinetoplastídeos e ausente em humanos. A proteína recombinante foi expressa em E. coli BL21 Star (DE3) One Shot e purificada da fração insolúvel para produção de anticorpos em camundongo. Os soros foram utilizados em técnicas de Immunoblotting e imunocitolocalização na tentativa de confirmar a expressão da protease. Infelizmente, não foi possível confirmar a expressão da OPBsTc em nenhuma das três formas do parasita: epimastigota, tripomastigota e amastigosta. Também realizamos uma RT-PCR a partir do RNA da forma epimastigota, mas o resultado foi negativo. A segunda protease foi a X-PDAPTc, esta serino-protease é largamente estudada em Lactococcus lactis e parece ser um fator de virulência em Streptococci. Análises em bancos de dados mostraram que a distribuição da X-PDAPTc é restrita e não apresenta ortólogos em mamífero, além disso, a enzima tem 677 aminoácidos com massa molecular esperada de 76,8 kDa. A enzima foi produzida em E. coli BL21 Star (DE3) One Shot e purificada da fração insolúvel para produção de anticorpos em camundongo. X-PDAPTc é expressa na forma epimatigosta do parasito. A GSTc tem importante participação na biossíntese da glutationa para manutenção do ambiente redox no parasito. Em relação ao seu ortólogo em humanos, foi observada homologia reduzida, o que pode torná-la um alvo promissor para desenvolvimento de drogas, assim como as duas proteases citadas acima. Essa enzima tem 535 resíduos de aminoácidos e massa molecular predita de 58,6 kDa. A GSTc foi expressa e utilizada para testes de imunização. / After a century of the discovery of Chagas’ disease, there is still no effective medicine for its treatment, and patients still succumb to severe manifestations of the chronic disease. The possibility of discovering an enzyme or metabolic pathway crucial to the parasite life cycle is not only to satisfy the human curiosity, but it is also fundamental to the development of drugs used to combat many different diseases, including Chagas’ disease. This master's thesis describes the study of three proteins of Trypanosoma cruzi: two proteases classified as serine-protease with α / β hydrolase domain that belong to SC clan and family S9 and S15, respectively - Oligopeptidase B like (OPBsTc) and X-prolil dipeptidil aminopeptidase (X-PDAPTc) and a redox metabolic pathway enzyme - Glutathione synthetase (GSTc). The OPBsTc is a putative enzyme of 903 amino acids and molecular mass of 103.4 kDa. It is highly conserved among kinetoplastids and it is absent in humans. The recombinant protein was expressed in E. coli BL21 Star (DE3) One Shot and purified from the insoluble fraction for production of antibodies in mice. The sera were used in immunoblotting and immunocytology techniques in an attempt to confirm the expression of the protease. Unfortunately, we could not confirm the expression of OPBsTc in any of the three forms of the parasite: epimastigote, trypomastigote and amastigoste. We also performed a RT-PCR from total epimastigote RNA, but the result was negative. The second protease was X-PDAPTc, this serine-protease is extensively studied in Lactococcus lactis and it seems to be a factor of virulence in Streptococci. Analysis in databases showed that the distribution of X-PDAPTc is limited and it does not have any orthologs in mammalian. In addition, the enzyme has 677 amino acids with molecular mass of 76.8 kDa. The enzyme was produced in E. coli BL21 Star (DE3) One Shot and purified from the insoluble fraction for production of antibodies in mice. X-PDAPTc is expressed in the epimastigote form of the parasite. The GSTc has an important participation in the biosynthesis of glutathione in order to maintain redox environment of the parasite. The human ortholog shows low homology which may make it a promising target for drug development like the two proteases mentioned above. This enzyme has 535 amino acid residues and a predicted molecular mass of 58.6 kDa. The GSTc was expressed and used for immunization tests.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by wiliam de oliveira aguiar (wiliam@bce.unb.br) on 2011-06-30T18:43:41Z No. of bitstreams: 1 2010_ThiagoSantanaGastardelo.pdf: 3617049 bytes, checksum: ba7950b62a74d73fc6c8c0c9c54ba43a (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-07-06T13:41:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_ThiagoSantanaGastardelo.pdf: 3617049 bytes, checksum: ba7950b62a74d73fc6c8c0c9c54ba43a (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-06T13:41:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_ThiagoSantanaGastardelo.pdf: 3617049 bytes, checksum: ba7950b62a74d73fc6c8c0c9c54ba43a (MD5) / Os patógenos dependem de atividades de peptidases para desempenhar muitos processos fisiológicos, tão bem quanto interagir com seus hospedeiros, destacando peptidases de parasitos como fatores de virulência e, então, potenciais alvos de drogas. O sequenciamento do genoma do cinetoplastídeo Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, revelou 28 genes que codificam aminopeptidases putativas, dentre as quais estão três metionina-aminopeptidases, duas aspártico-aminopeptidases, duas aminopeptidases sensíveis a puromicina e três leucil-aminopeptidases da família M17. Neste estudo, uma atividade leucil-aminopeptidolítica principal foi identificada em T. cruzi usando Leu-AMC como substrato. Ela foi isolada de formas epimastigotas do parasito por um procedimento cromatográfico de dois passos e associou-se com uma única proteína hexamérica de 320 kDa como determinado por experimentos de velocidade de sedimentação e de dispersão de luz. Ligações dissulfeto intercadeias não participam da organização oligomérica da peptidase ativa. Espectrometria de massa por Peptide mass fingerprint revelou a identidade molecular da enzima como a aminopeptidase EAN97960 predita de T. cruzi, o produto do gene Tc00.1047053508799.240. Análises enzimáticas e moleculares indicaram que esta leucil-aminopeptidase de T. cruzi (LAPTc) pertence à família M17 de peptidases ou família da leucil-aminopeptidase. LAPTc tem uma forte dependência de pH neutro, é mesofílica e conserva sua forma oligomérica até 80 °C. Ao contrário, sua forma recombinante produzida em E. coli, assim como outras LAPs, é termofílica e requer pH alcalino. A atividade desta metalo-aminopeptidase é inibida por bestatina e quelantes de metais tais como 1,10-fenantrolina, é restabelecida por Zn2+, e potencializada por Mn2+ ou Ca2+. A enzima é expressa por todas as formas do T. cruzi e localiza-se no interior de vesículas no citoplasma do parasito. Uma vez que vias de aminoácidos essenciais, incluindo leucina, estão desprovidas em T. cruzi, a LAPTc poderia ter uma função no suprimento nutricional. Além disso, a atividade da peptidase também poderia ter uma função no processamento de peptídeos e proteínas. Nós postulamos que a LAPTc poderia ser um alvo potencial para o desenvolvimento de novas drogas para tratar a infecção de T. cruzi. / Pathogens depend on peptidase activities to accomplish many physiological processes, as well as to interact with their hosts, highlighting parasitic peptidases as virulence factors and, thus, potential drug targets. The kinetoplastid Trypanosoma cruzi genome sequencing, the aetiological agent of Chagas disease, has revealed 28 genes encoding putative aminopeptidases, among which there are three methionine, two aspartic, two puramycin-sensitive and three leucyl aminopeptidases of the M17 family. In this study, a major leucyl aminopeptidolytic activity was identified in the T. cruzi by using leu-AMC as substrate. It was isolated from epimastigote forms of the parasite by a two-step chromatographic procedure and associated with a single 320-kDa homohexameric protein as determined by sedimentation velocity and light scattering experiments. Interchain disulfide bonds do not take part in the oligomeric assembly of the active peptidase. Peptide mass fingerprinting revealed the molecular identity of the enzyme as the predicted T. cruzi aminopeptidase EAN97960, the product of the Tc00.1047053508799.240 gene. Molecular and enzymatic analysis indicated that this leucyl aminopeptidase of T. cruzi (LAPTc) belongs to the peptidase family M17 or leucyl aminopeptidase family. LAPTc has a strong dependence on neutral pH, is mesophilic and retains its oligomeric form up to 80 °C. Conversely, its recombinant form produced in E. coli, like other LAPs, is thermophilic and requires alkaline pH. The activity of this metalloaminopeptidase is inhibited by bestatin and metal chelants such as 1,10-phenanthroline, is restored by Zn2+, and potentiated by Mn2+ or Ca2+. The enzyme is expressed by all T. cruzi forms and localizes within vesicles in the cytoplasm of the parasite. Since biosynthetic pathways for essential amino acids, including leucine, are lacking in T. cruzi, LAPTc could have a function in nutritional supply. Furthermore, the peptidase activity could also play a role in peptide and protein processing. We postulate that the LAPTc might be a potential target for the development of new drugs to treat T. cruzi infection.