Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-22T17:38:21Z No. of bitstreams: 1 2015_HialyCristinaCamargosPoli.pdf: 1606339 bytes, checksum: ad09dfd2eb11ded44e751e88caf91e5a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-06-24T21:11:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_HialyCristinaCamargosPoli.pdf: 1606339 bytes, checksum: ad09dfd2eb11ded44e751e88caf91e5a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-24T21:11:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_HialyCristinaCamargosPoli.pdf: 1606339 bytes, checksum: ad09dfd2eb11ded44e751e88caf91e5a (MD5) / A Doença de Chagas é considerada uma doença negligenciada, endêmica na América Latina. e com tratamento ainda ineficaz. Estima-se que existam atualmente entre 6 e 7 milhões de pessoas infectadas pelo Trypanosoma cruzi (agente causador da doença) em todo o mundo. Esforços têm sido feitos na busca da produção de medicamentos efetivos e seguros além da necessidade na produção de uma vacina, tendo em vista a dificuldade do diagnóstico. Durante a transmissão vetorial, mais comum em regiões endêmicas Triatomíneos liberam formas tripomastigotas na corrente sanguínea que logo após contato com vários tipos celulares, inicia um processo de interação e infecção celular. Essa fase inicial é fundamental para a continuidade do ciclo biológico do parasito e instalação da doença. Dada a importância dessa fase, e pouco conhecimento sobre a modulação da célula hospedeira, o presente estudo realizou uma análise da célula hospedeira após interação inicial, utilizando para isso uma abordagem proteômica. Para essa investigação foi realizada análise comparativa por LC-MS/MS do extrato proteico de células HeLa (não fagocíticas) controle com extrato proteico de células HeLa após uma hora em contato com formas tripomastigotas (forma infectiva). Nossos resultados mostraram alteração em proteínas já conhecidas como por exemplo, proteínas de ligação ao cálcio e ao citoesqueleto. Ao se observar de forma detalhada proteínas com diminuição na abundância, foram encontradas proteínas constituintes do fator de histocompatibilidade de classe 1 (MHC1), subunidades importantes na montagem e função catalítica do proteassoma. Foram encontradas proteínas até então não descritas na literatura como moduladas pelo T. cruzi. Uma delas foi o aumento da Rpn11, uma subunidade do proteassoma com função de desubiquitinase, e a diminuição da cullina associada a NEDD8, uma proteína envolvida na identificação e ubiquitinação de proteínas que devem ser degradas. O processo de interação do T. cruzi com células HeLa também propiciou a modulação de proteínas participantes de outros processos celulares, como metabolismo, ligação ao DNA e chaperonas. / Chagas disease is regarded as a neglected illness endemic from Latin Americ and, furthermore, available drugs have limited efficacy and high toxicity. It is estimated that 6 to 7 milion people worldwide are infected by Trypanosoma cruzi (the etiologic agent of the disease). Nonetheless, efforts toward more effective treatment have been made as well as a vaccine is being pursued. In the vectorial transmission of the parasite, the most common in endemic regions, triatominean bugs release trypomastigotes in the lood stream. The parasites through the contact with several host cell types initiate biochemical processes for cell interaction and infection. This early stage is Given its importance, and the limited information available regarding the modulation of the host cell, this study analyzed the T. cruzi infection effects in mammalian host cells at the early stages of the process through high-throughput proteomic approach. Therefore, a comparative quantitative proteome analysis by means of LCMS/ MS was carried out between Hela cells which were incubated or not with trypomastigote forms (the main infective life form) The resulting list of regulated proteins showed known proteins, e.g calcium and cytoskeleton binding proteins. Regarding proteins with decreased expression, there were Major Histocompatibility Complex I proteins and subunits of the proteasome machinery important to its assembly and catalytic functions. This also corroborates with recent studies demonstrating its relevance on escaping the immune system’s surveillance by jeopardizing the host cell antigen presentation. Also there were proteins related to the ubiquitination process. And among those with no expression modulation reported so far, here we observed an increase in Rpn11, a proteasome subunit with deubiquitinase function, and decrease in cullin associated to NEDD8, a protein involved recognition and ubiquitination of proteins to be degraded. The interaction process between T. cruzi and HeLa cells also caused the modulation of proteins involved in metabolism, DNA binding and chaperones. This work underlines the need for further studies on processes of ubiquitination , degradation and targeting of T. cruzi proteins to MHC1 by host cells , which may be used by the immune system for the elimination of the parasite.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-08-15T20:36:09Z No. of bitstreams: 1 2016_AnaLuisaPereiraMarques.pdf: 5793977 bytes, checksum: a015d6912df7b0099292e7fdc10328ec (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-02T13:51:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AnaLuisaPereiraMarques.pdf: 5793977 bytes, checksum: a015d6912df7b0099292e7fdc10328ec (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T13:51:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AnaLuisaPereiraMarques.pdf: 5793977 bytes, checksum: a015d6912df7b0099292e7fdc10328ec (MD5) / As infecções pelo Trypanosoma cruzi são um sério problema de saúde pública na América Latina, com alta morbidade e mortalidade. Cerca de oito a dez milhões de pessoas estão infectadas pelo parasito em todo o mundo e um terço irá desenvolver os sintomas da doença de Chagas. Para o diagnóstico dessa infecção, são usados principalmente métodos sorológicos que se baseiam em anticorpos específicos contra o parasito. Esses exames apresentam resultados duvidosos ou falsos positivos devido à reação cruzada com antígenos de outros microorganismos. A evolução na área da biologia molecular vem modificando e aperfeiçoando o diagnóstico da doença de Chagas, representando uma boa alternativa para complementar ou estabelecer o diagnóstico das infecções pelo T. cruzi. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi realizar uma investigação teórica-experimental de protocolos de qPCR utilizados para o diagnóstico de infecções pelo T. cruzi. A revisão sistemática da literatura permitiu a identificação das condições experimentais (métodos de extração, iniciadores, enzimas amplificadoras, entre outros) mais utilizadas nos artigos científicos selecionados e a observação de que ainda não existe um procedimento padrão estabelecido. Assim, diferentes protocolos de qPCR para identificação do T. cruzi foram avaliados experimentalmente. Foram utilizados marcadores específicos para DNA nuclear (nDNA) e para minicírculos e maxicírculos de kDNA de T. cruzi. A população do estudo foi separada em três categorias - grupos positivo, negativo e duvidoso - de acordo com os testes sorológicos apresentados pelos indivíduos. Os resultados comparativos dos métodos sorológicos e moleculares apresentaram discordâncias peculiares, notadamente quando se utilizou marcadores para minicírculos de kDNA, fato que pode estar associado à integração dessas moléculas no genoma hospedeiro. Estabeleceu-se que a melhor escolha diagnóstica para identificação de infeção ativa pelo T. cruzi se dá com marcadores moleculares específicos para nDNA, o qual foi capaz de determinar a infecção em casos inconclusivos na análise sorológica. Os achados deste estudo reforçam a necessidade de um diagnóstico mais efetivo que possa ser utilizado como padrão-ouro para identificação das infecções pelo T. cruzi. / Trypanosoma cruzi infection is a serious public health problem in Latin America, with high morbidity and mortality. About eight to ten million people are infected with the parasite worldwide and one-third will develop the symptoms of Chagas disease. Its diagnosis is mainly based on serological methods that recognize specific antibodies against the parasite. Often, these tests have inconclusive results or false positives due to cross-reaction with antigens from other microorganisms. Development in molecular biology has been changing and improving the diagnosis of Chagas' disease, representing a good alternative to supplement or establish the diagnosis of T. cruzi infection. Thereby, the objective of the current study was to evaluate theoretically and experimentally qPCR protocols used for Chagas disease diagnosis. A systematic review of the literature allowed the identification of experimental conditions (extraction methods, primers, amplifying enzymes, etc) commonly used in scientific articles and the observation that there is no standard procedure established. Thus, different qPCR protocols for T. cruzi identification were experimentally assessed. Specific primers were used for nuclear DNA (nDNA), and mitochondrial DNA (minicircles and maxicircles). The study population was divided into three categories - positive, negative and doubtful groups - according to the serologic tests. Comparison between serologic and molecular results showed peculiar disagreements, especially when using primers for kDNA minicircle, which may be associated with the integration of these molecules into the host genome. It was established that the best choice for diagnosis T. cruzi active infection is by specific molecular markers to nDNA, which was able to establish infection in inconclusive serological analysis. Our findings reinforce the need of an effective diagnosis that can be used as the gold standard for identification of T. cruzi infection.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-08-17T20:14:00Z No. of bitstreams: 1 2016_YannaReisPraça.pdf: 8951084 bytes, checksum: 723a2e6a0e521ef29a7ba1303584bf80 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-20T18:44:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_YannaReisPraça.pdf: 8951084 bytes, checksum: 723a2e6a0e521ef29a7ba1303584bf80 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-20T18:44:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_YannaReisPraça.pdf: 8951084 bytes, checksum: 723a2e6a0e521ef29a7ba1303584bf80 (MD5) / Os triatomíneos são artrópodes hematófagos durante todo o seu ciclo de vida e para garantir o sucesso de seu repasto, desenvolveram estratégias adaptativas que contrapõem o sistema hemostático e imune do hospedeiro, injetando moléculas farmacologicamente ativas durante esse processo. Por possuirem diversas moléculas com interesse farmacológico, a saliva desses artrópodes hematófagos passou a ser alvo de pesquisas. Para ampliar o conhecimento sobre essas moléculas, esse trabalho teve como objetivos: 1) investigar a expressão protéica na saliva de Triatoma dimidiata em diferentes tempos após a alimentação sanguínea, por meio da análise proteômica comparativa por LC-MS/MS, eletroforese bidimensional e análises in silico, e 2) caracterizar in silico a sequência aminoacídica do antígeno 5 salivar de Rhodnius neglectus (RNAV), além da expressão dessa molécula em Escherichia coli. A análise proteômica comparativa da saliva de T. dimidiata levou à identificação de 362 proteínas, das quais 65 eram específicas da amostra de cinco dias após a alimentação sanguínea (dpa) e 79 específicas da amostra de 10 dpa, além de contribuir para validar dados do transcritoma dessa espécie disponível na literatura. A análise in silico do RNAV sugere que a molécula é secretada pela via clássica, que modificações pós-traducionais como fosforilação e glicosilação devem ocorrer na proteína, e que existem aproximadamente 25 resíduos de aminoácidos que podem estar presentes em epítopos lineares para células B. Não foi possível obter o RNAV recombinante. O conhecimento das proteínas salivares do T. dimidiata e sua comparação com as de outras espécies de artrópodes hematófagos pode ser útil para entender processos biológicos fundamentais como sobrevivência, adaptação e as interações desses vetores com seus hospedeiros e com os agentes infecciosos que eles são capazes de transmitir. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Triatomine are bloodsucking arthropods throughout their life cycle and to ensure the success of their meal, they have developed adaptive strategies that counteract the hemostatic and immune system of the host, injecting pharmacologically active molecules during this process. By owning several molecules with pharmacological interest, bloodsucking arthropods saliva has become the subject of various research. To enhance our knowledge about these molecules, this study aimed 1) to investigate the protein expression in Triatoma dimidiata saliva at different times after the blood feeding through comparative proteomic analysis using LC-MS/MS, 2-DE electrophoresis and bioinformatics, and 2) to characterize in silico the salivary antigen 5 of Rhodnius neglectus (RNAV), beyond its expressin in Escherichia coli. The comparative proteomic analysis of T. dimidiata saliva revealed 362 proteins, 65 specific of the sample collected 5 days after feeding and 79 specific of the sample collected 10 days after feeding, and aided to validate available data from T. dimidiata transcriptome. RNAV in silico analysis revealed this protein may be secreted by the classical pathway, phosphorilation and glycosilation sites, and the existence of 25 amino acid residues that may be present in linear epitopes to B cells. Our attempt failed to produce recombinant RNAV. Knowing T. dimidiata salivary proteins and comparison with those from other species of hematophagous arthropods may help to understand fundamental biological processes such as survival, adaptation, vector-host and vector-pathogens interactions.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2009. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-01-26T17:01:17Z No. of bitstreams: 1 2009_EufranioNunesDaSilvaJunior.pdf: 36628683 bytes, checksum: 853a09e92d5415a1cb5303133c45f294 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2017-01-29T10:59:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_EufranioNunesDaSilvaJunior.pdf: 36628683 bytes, checksum: 853a09e92d5415a1cb5303133c45f294 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-29T10:59:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_EufranioNunesDaSilvaJunior.pdf: 36628683 bytes, checksum: 853a09e92d5415a1cb5303133c45f294 (MD5) / Diversas nor-p-lapachonas 3-arilamino e 3-alcóxi-substituídas e p- lapachonas 1,2,3-triazólicas foram sintetizadas e apresentaram potente atividade citotóxica contra quatro linhagens de células tumorais: HL-60 (leucemia), MDAMB-435 (mama), HCT-8 (cólon) e SF-295 (sistema nervoso central) com valores de IC50 abaixo de 1 pg/mL. A citotoxidade das substâncias descritas foi comparada com doxorrubicina, fármaco utilizado como controle positivo, e os precursores sintéticos p-lapachona e nor-p-lapachona. A atividade das substâncias em relação às células normais, avaliada em Células Mononucleares Periféricas do Sangue, mostrou que alguns derivados apresentam seletividade contra linhagens de células tumorais. Nor-p-lapachonas 3-arilamino e 3-alcóxi- substituídas e p-lapachonas 1,2,3-triazólicas também foram avaliadas contra o parasito Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de Chagas. Todos os derivados foram mais ativos do que as quinonas originais, P-lapachona e nor-p- lapachona e várias substâncias foram mais ativas do que o fármaco, benznidazol, utilizado como controle positivo. Várias substâncias descritas emergem como potenciais protótipos a serem utilizados na terapêutica da doença de Chagas e contra tumores malignos. Estudos visando à obtenção de novos heterocíclicos e a completa elucidação estrutural do ‘peróxido lapachol’ de Hooker, por espectroscopia de RMN e por cristalografia de raios X, foram realizados. / Several 3-arylamino and 3-alkoxy derivatives of nor-|3-lapachone and (3- lapachone-based 1,2,3-triazoles were synthesized and found to show very potent cytotoxicity against four neoplastic cancer cells: SF-295 (central nervous system), HCT-8 (colon), MDAMB-435 (breast) and HL-60 (leukaemia), with IC50 below 1 pg/mL. Their cytotoxicities were compared to doxorubicin and with their synthetic precursors, p-lapachone and nor-p-lapachone. The activity against normal peripheral blood mononucluear cells (PBMC) showed that some of the compounds were selective against cancer cells. 3-arylamino and 3-alkoxy derivatives of nor-|3- lapachone and 0-lapachone-based 1,2,3-triazoles were assayed against the infective bloodstream trypomastigote form of Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas’ disease. All the derivatives were more active than the original quinones and some compounds were more active than benznidazole, used as positive control. Several substances described herein emerge as interesting new lead compounds in drug development for Chagas’ disease and for cancer. Studies towards the obtention of new heterocycles and the complete elucidation of the ‘Hooker peroxide’ by NMR spectroscopy and X-ray diffraction were accomplished.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-02-14T18:42:15Z No. of bitstreams: 1 2016_RafaelRochadeAndrade.pdf: 2696423 bytes, checksum: 51029fe9cdf947ddbd961f4a6a5a2830 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-03-28T17:55:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_RafaelRochadeAndrade.pdf: 2696423 bytes, checksum: 51029fe9cdf947ddbd961f4a6a5a2830 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T17:55:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_RafaelRochadeAndrade.pdf: 2696423 bytes, checksum: 51029fe9cdf947ddbd961f4a6a5a2830 (MD5) / A doença de Chagas subsequente à infecção pelo Trypanosoma cruzi (T. cruzi) é endêmica na América do Sul. O tratamento disponível para a doença clinicamente manifesta é insatisfatório. Neste estudo foram conduzidos experimentos independentes em grupos formados por cinco aves nascidas de ovos inoculados ou não com T. cruzi. A integração de minicírculos de kDNA de T. cruzi no genoma das aves singênicas e a herança do kDNA integrado nas progênies foram anteriormente descritas, e a correlação das alterações genômicas com a doença autoimune do coração foi demonstrada. O presente estudo documenta a cardiomiopatia autoimune de origem genética nas aves kDNA+ a partir de exames de ecocardiograma e aponta a evolução desta patologia nas aves após receberem o transplante de medula óssea. As aves com o genoma modificado pela presença de mutações de kDNA (kDNA+), tiveram a medula óssea destruída com drogas, e receberam, dois dias após, transplante de medula óssea de ave controle (kDNA-) da mesma linhagem. Os resultados demonstram que as aves que tiveram seu genoma modificado pela integração das mutações de kDNA apresentaram a miocardiopatia inflamatória de natureza autoimune. Por outro lado, as aves inicialmente sadias que receberam medula óssea proveniente de aves kDNA+ (grupo de indução da patologia), apresentou substancial decréscimo da fração de ejeção e também na fração de encurtamento. No grupo das aves kDNA+ que receberam medula óssea de animais kDNA- (grupo inibição da patologia) não houve melhora significativa dos principais parâmetros de função miocárdica (fração de ejeção, fração de encurtamento e diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole) logo nos 3 primeiros meses. Porém, houve uma tendência de melhora da função miocárdica na análise aos 10 meses pós-transplante, indicando uma recuperação de parâmetros da função miocárdica das aves deste grupo tratado com medula óssea sadia. Outros estudos de monitoramento cardíaco mais prolongados são necessários, e devem ser realizados para esclarecer o prognóstico das aves após o tratamento com transplante de medula óssea. / Chagas disease caused by Trypanosoma cruzi infection is endemic in South America. The treatment available for the clinically manifested disease is considered unsatisfactory. In this study, we carried out groups of five chickens hatched from the T. cruzi inoculated eggs. The integration of the kDNA minicircle sequences in the chicken genome and their inheritance by progeny was documented and the role played by these genome alterations in the disease pathogenesis was demonstrated. The present study showed the autoimmune cardyopathy in chickens with the T. cruzi (kDNA+) mutations, which were monitored by the echocardiogram. The chickens with the genome altered by the kDNA mutations (kDNA+) had the bone marrow destroyed with antimetabolic and cytostatic. The transplantation of chicken control bone marrow, without kDNA mutations (kDNA-), was carried out two days thereafter. The results translated the changes of the cardiophathy after bone-marrow transplantation. It was shown that the control healthy chickens (kDNA-) that received bone-marrow from kDNA+ mutated sick chickens (induction of pathology group), showed significant decrease of shortening and ejection fraction. In the group of kDNA+ chickens that received bone-marrow from healthy (kDNA-) chickens (inhibition of pathology group), there where a significant decrease of the heart function parameters, such as reduction of shortening and ejection fraction of the left ventricle during three months after transplantation. However, it was noticed a sustainable improvement of these heart function parameters (shortening fraction, ejection fraction and internal diameter of left ventricle) in the following ten monts after bone-marrow transplantation. This finding suggest a recovery of the heart function in the kDNA+ chickens that had the bone- marrrow destroyed with drugs and that received healthy (kDNA-) bone-marrow transplantation.Further long run studies of cardiac function monitoring are required to determine the prognosis of the sick kDNA+ chickens after the healthy bone-marrow transplantation.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-06-29T16:56:24Z No. of bitstreams: 1 2015_AndersonRodriguesAraujoVieira_Parcial.pdf: 1220203 bytes, checksum: 626e7d5292fa357bfb78c37564af99bc (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-07-20T13:22:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_AndersonRodriguesAraujoVieira_Parcial.pdf: 1220203 bytes, checksum: 626e7d5292fa357bfb78c37564af99bc (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-20T13:22:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_AndersonRodriguesAraujoVieira_Parcial.pdf: 1220203 bytes, checksum: 626e7d5292fa357bfb78c37564af99bc (MD5) / A tripanossomíase americana ou doença de Chagas (DC) é uma doença que afeta principalmente a população pobre de países latino americanos. Estima-se que 7-8 milhões de pessoas estão infectadas com Trypanosoma cruzi na América Latina, sendo que cerca de 2 a 3 milhões de pessoas são portadoras da forma crônica no Brasil. Apesar da realização do controle da transmissão vetorial da DC em regiões endêmicas, formas alternativas de transmissão tornaram-se evidentes como a transmissão oral. A transmissão oral ocorre principalmente pela ingestão acidental de triatomíneos infectados ou de alimentos contaminados com dejetos desses triatomíneos ou secreções de animais silvestres infectados com T.cruzi. O suco do açaí produzido artesanalmente é tido hoje como o principal responsável por surtos da DC no Norte do Brasil, pequenos surtos da DC já foram registrados após grupo de pessoas ingerirem a bebida contaminada com T.cruzi nos estados do Amapá, Amazonas e Pará. O objetivo desse trabalho é desenvolver e validar uma metodologia para detectar contaminação por T. cruzi em pasta e bebida de açaí (Euterpe oleracea). Para isto, 10 mL de polpa de açaí foram inoculados com 107 células de formas epimastigotas ou tripomastigotas de T.cruzi, que foram posteriormente isoladas por flutuação em sulfato de zinco, seguido de extração de DNA e análise por PCR. Para a detecção, foram amplificadas as regiões repetitivas do DNA nuclear (TCZ) e o gene ribossomal 28Sα (rDNA 28Sα). Também foram avaliadas a sensibilidade e a especificidade dos primers. A extração de DNA pelo método clorofórmio/álcool isoamílico foi testada após amostras serem isoladas por flutuação em Sulfato de zinco. O limite mínimo de detecção utilizando o gene ribossomal rDNA 28Sα foi observado na ordem de 20 pg de DNA de T. cruzi, enquanto que para as regiões repetitivas nuclear TCZ foi de 20 fg. Os números mínimos detectados de células em 10 mL de polpa de açaí foram: 170.000 tripomastigotas para rDNA 28Sα e 1,7 tripomastigotas para o TCZ. O limite de detecção para a amplificação do gene rDNA 28Sα foi de 400 fg em PCR em tempo real (qPCR) e o número de células detectadas foram 10.000. A metodologia de isolamento de T. cruzi pela flutuação em sulfato de zinco, juntamente com a amplificação de regiões repetitivas do DNA nuclear (TCZ) e do gene ribossomal (rDNA 28Sα) por PCR qualitativa e qPCR, demonstraram ser uma ferramenta aplicável para a detecção de açaí contaminado com T. cruzi. A utilização desta metodologia pode ser apropriada em casos de surtos de transmissão de doença de Chagas por via oral. / The American trypanosomiasis or disease of Wounds (DC) is a disease that affects mainly the poor population of Latin American countries. It is estimated that 7-8 million persons are infected with Trypanosoma cruzi in the Latin America and around 2 to 3 million persons have the chronic form in Brazil. Despite the accomplishment of the control of the vector transmission for DC in endemic regions, the alternative forms of transmission became evident like the oral transmission. The oral transmission occurs by accidental ingestion of infected triatomines, foods contaminated with feces of these triatomines or secretions of wild animals infected with T. cruzi. The craftily produced açaí (Euterpe oleracea) juice is considered the main responsible for outbreaks of the DC in the North of Brazil. Small outbreaks of the DC were already registered after groups of persons ingested the juice contaminated with T. cruzi in the states of Amapá, Amazon and Pará. The main objective of this work is to develop and to validate a methodology to detect T. cruzi contaminations in açaí-based foods and beverages. For this, 10 mL of açaí pulp were inoculated with 107 T. cruzi epimastigote or trypomastigote cells, which were subsequently isolated by flotation in zinc sulfate. Next, the extraction of DNA and PCR analysis were conducted. For PCR detection, the repetitive regions of the nuclear DNA (TCZ) and the ribosomal gene 28S α (rDNA 28S α) were amplified. Moreover, the especificity and sensibility of the primers were determined. The method using chloroform/isoamyl alcohol was chosen for T. cruzi DNA extraction from açaí samples. The minimum detection limit for the ribosomal gene rDNA 28Sα was observed in the order of 20 pg of T. cruzi DNA, while for the nuclear repetitive regions TCZ it was 20 fg. The minimum number of cells detected in 10 mL of açaí pulp were 170,000 trypomastigotes for rDNA 28Sα and 1.7 trypomastigotes for TCZ. The detection limit for the amplification of the rDNA 28Sα gene was 400 fg by real time PCR (qPCR) and the number of detected cells were 10,000. The methodology of T. cruzi isolation by flotation in zinc sulfate followed by the amplification of repetitive regions of the nuclear DNA (TCZ) and the ribosomal gene (rDNA 28S α) by qualitative PCR and qPCR, demonstrated to be an applicable strategy to detect T. cruzi contaminations in açaí-based foods and beverages. The application of this methodology can be appropriated in cases of outbreaks of Chagas disease transmission by oral route.

Orientador : João Aristeu da Rosa / Banca: Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira / Banca: José Clóvis do Prado Júnior / Banca: Marcos Takashi Obara / Banca: Carlos Eduardo de Almeida / Resumo: A subfamila Triatominae compreende 146 espécies, agrupadas em 18 gêneros e cinco tribos. O gênero Triatoma é o mais representativo da subfamília com 80 espécies descritas, as quais estão agrupadas em oito complexos e oito subcomplexos, sendo essa classificação baseada principalmente em características morfológicas. Triatoma rubravaria é considerado um importante vetor na transmissão da doença de Chagas no Estado do Rio Grande do Sul, uma vez que houve um aumento de sua captura e encontros de colônias intradomiciliares após o programa de combate ao T. infestans. Possui hábitos rupestres e é encontrado em buracos e fendas de locais pedregosos, juntamente com T. carcavalloi, T. circummaculata e T.klugi, os quais mostram semelhanças morfológicas. Marcadores moleculares pertencentes ao DNA nuclear, como os espaçadores internos transcritos (ITS) apresentam uma evolução mais rápida, permitindo estabelecer relações recentes ao passo que a grande subunidade ribossomal 28S (D2), por ser bem conservado, permite estabelecer relação entre organismos distantemente relacionados. Marcadores mitocondriais (Citocromo B - CytB e Citocromo Oxidase I - COI) apresentam taxa de mudança dez vezes mais rápida que aquelas apresentadas pelo DNA nuclear, sendo, portanto, úteis para estabelecer relações filogenéticas entre organismos que divergiram recentemente. A análise Bayesiana por meio de sequencias pertecentes ao mtDNA (CytB e COI) reafirmam o posicionamento de espécies no subcomplexo rubrovaria e indica T. carcavalloi como espécie irmã do grupo formado por T. klugi + T. rubrovaria + T. circummaculata. A análise bayesiana de seis populações de T. rubrovaria mostrou a população coletada em Canguçu isolada das demais, sugerindo que se trata de espécie críptica. / Abstract: The subfamily Triatominae comprises 146 species grouped in 18 genera and five tribes. The genus Triatoma is the most representative subfamily with 80 described species, which are grouped into eight complex and eight subcomplexes and this classification being based primarily on morphological characteristics. Triatoma rubravaria is considered an important vector in the transmission of Chagas disease in the state of Rio Grande do Sul since it was detected an increase of their capture and meetings colonies household after the program to combat of T. infestans. T. rubrovaria is found in groves and crevices of rocky areas within T. carcavalloi, T. circummaculata and T.klugi, which show morphological similarities. Molecular markers belonging to the nuclear DNA, as the internal transcribed spacers (ITS) have more rapid evolution, establishing recent relationships while the large ribosomal subunit 28S (D2), being well maintained, allows establishing the relationship between distantly related organisms. Mitochondrial markers (Cytochrome B - CytB and Cytochrome Oxidase I - COI) present a rate of change ten times faster than those presented by nuclear DNA, and are therefore useful for establishing phylogenetic relationships between organisms that diverged recently. A Bayesian analysis using mtDNA sequences belonging to (CytB and COI) reaffirmed the positioning of the species and indicates subcomplex rubrovaria and indicates T. carcavalloi as sister species from the group of T. klugi + T. rubrovaria + T. circummaculata. A Bayesian analysis of six populations of T. rubrovaria showed the population collected in Canguçu isolated from the others, suggesting that they are cryptic species. / Doutor

Resumo: A doença de Chagas e toxoplasmose são problemas de saúde pública no Brasil e entender com detalhes a biologia dos agentes causais, T. cruzi e T. gondii respectivamente, pode ser um ponto crucial para gerar informações relevantes voltadas para o desenvolvimento de tratamento efetivo no combate a estas doenças. No entanto, a busca de novos alvos para quimioterapia de algumas doenças parasitárias esbarra, por exemplo, na ausência de ferramentas que possibilitem o estudo da função de genes essenciais para a sobrevivência do organismo. Dentro desta problemática, o objetivo central deste estudo é a identificação de proteínas envolvidas no transporte nucleocitoplasmático de RNAs, mais especificamente a exportação de mRNAs, com a utilização de ferramentas de genética reversa para análise de proteínas essenciais envolvidas nestas vias em T. cruzi e T. gondii. Além disso, T. gondii tem sido o modelo de estudo escolhido por diversos grupos, uma vez que dispõe de várias ferramentas de genética reversa consideradas inviáveis ou laboriosas em outros parasitas (como Plasmodium ou Trypanosoma). A escolha do tema foi baseada em dois fatos principais: a) dentro do contexto de eventos moleculares essenciais, o transporte de RNA mensageiro (mRNA) ao local de tradução é uma etapa essencial e crucial na seleção de genes a serem expressos em uma célula eucariótica; b) escassez de publicações envolvendo diversos grupos de parasitas, demonstrando ser um tema da pesquisa básica em parasitologia que necessita ser explorado. Os dados gerados neste estudo permitiram identificar que a maioria das proteínas relacionadas com a exportação de mRNAs não são tão conservadas ao longo da filogenia de eucariotos, principalmente em relação aos protozoários que divergiram na base da árvore filogenética. A exceção encontrada foi Sub2/UAP56, uma proteína relacionada com exportação de mRNAs em fungos e humanos, respectivamente, que se encontra altamente conservada ao longo da filogenia de eucariotos. Em T. cruzi foi observado que TcSub2 é uma proteína nuclear, relacionada com alguns sítios de transcrição por RNA Polimerase II e essencial, não sendo possível obter o nocaute duplo do respectivo gene. Em T. brucei e T. gondii foi observado que a diminuição gradual das proteínas em questão, TbSub2 e TgUAP56 respectivamente, resulta em acúmulo de mRNAs poliadenilados nos núcleos afetando a exportação dos mRNAs e resultando em morte celular. A partir da observação da participação de proteínas ortólogas de Sub2 na exportação de mRNAs em parasitas, a outra parte deste estudo foi identificar proteínas associadas a TcSub2 para iniciar o entendimento sobre esta via bem como verificar a presença de proteínas específicas e provavelmente essenciais de parasitas para futuros estudos funcionais.

Resumo: Chagas. disease or American Trypanosomiasis has the protozoan Trypanosoma cruzi as the etiologic agent. The disease is present in most Latin American countries and its control relies mainly on the fight against triatomine vectors. Among the triatomine species found in Brazil, Panstrongylus megistus shows a high degree of adaptability to the domestic environment and is considered of great epidemiological importance since Triatoma infestans elimination. This work had as the main objective, through the sequencing of nuclear ribosomal DNA markers, the molecular characterization of specimens and populations of Panstrongylus megistus from Parana state. Specimens from other states were also included in this study. From all of the 37 specimens submitted to DNA extraction and sequencing, 32 sequences could be analyzed for two selected markers in question - the first and second internal transcribed spacer (ITS-1 and ITS-2) of nuclear ribosomal DNA. Overall, 24 different haplotypes were identified among the analyzed specimens of Panstrongylus megistus, when studied molecular markers ITS-1 and ITS-2 together. The intergenic region length varied between 1357 and 1366 base pairs, with an average of 1361.1 base pairs. The overall length of the alignment for all haplotypes was described with 1366 bp, including insertions/deletions. ITS-1 showed a greater length in its base pairs, as well a greater diversity of haplotypes mainly due to numerous insertions/deletions. Because of this, ITS-2 fragment landed more information for the haplotypes distribution analysis. It was detected a greater number of haplotypes in insects from the first plateau of Parana. This greater diversity supports the origin and dispersion hypothesis of Panstrongylus megistus from .Mata Atlantica. coastal. At the second plateau was observed only 2 haplotypes, which are coincident with the first plateau. At the third plateau was attended of 4 haplotypes, 3 of them different from others, and only 1 haplotype not found in other states. The CH-2 haplotype was found in all studied Parana regions, as well as the states of Rio Grande do Sul and Sergipe. This can be appointed, until this moment, as the haplotype that probably began spreading the specie, at Parana state, from the endemism center. The increase of insects. numbers studied and the use of new molecular markers may get relevant information to reinforce the specie origin and dispersal theory and provide data to assist in epidemiological monitoring of these vectors.

Orientador: João Aristeu da Rosa / Banca: Mara Cristina Pinto / Banca: Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira / Resumo: Os membros da subfamília Triatominae são vetores do protozoário Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas. Eles compreendem 144 espécies agrupadas em 18 gêneros e são encontrados principalmente nas Américas, desde o sul dos Estados Unidos ao sul da Argentina e Chile. Essencialmente a identificação desses insetos tem sido baseada na descrição comparativa da morfologia de indivíduos adultos incluindo as estruturas da genitália masculina e feminina, aspectos gerais do corpo como cabeça, tórax, antena e coloração, entre outros. Entretanto a distinção por critérios morfológicos apresenta limitações para caracterização de espécies do gênero Rhodnius devido às semelhança entre elas, especialmente entre R. prolixus, R. domesticus, R. robustus, R. neglectus, and R. nasutus, espécies conhecidas como "grupo prolixus". Nesse estudo as técnicas de biologia molecular, sequenciamento do gene 16S e PCR-RFLP, foram utilizados para caracterização de sete espécies de Rhodnius. Os produtos do sequenciamento do gene 16S das espécies R. brethesi; R. nasutus, R. nasutus, R. neglectus, R. pictipes; R. prolixus, R. robustus, e R. sp geraram alinhamento de 380 pares de bases com 48 sítios polimórficos. A visualização das bandas geradas pelas enzimas de restrição BstUI, HhaI, RsaI and Mbol com as sete amostras de Rhodnius possibilitou distingui-las com exceção de R. prolixus, R. neglectus e R.robustus. Os dois métodos feitos para as mesmas amostras confirmaram a validade da utilização do método PCR-RFLP para identificação de R. brethesi, R. nasutus, R. pictipes e R. sp, uma vez que o gene 16S já é um marcador estabelecido para as espécies de Rhodnius e as duas metodologias apresentaram os mesmos resultados, confirmaram também o trabalho realizado por Naegele et al. 2006 em que a técnica de PCR-RFLP distinguiu R. stale, R. pictipes, R. Prolixus and R. domesticus / Abstract: The members of the subfamily Triatominae are vectors of the protozoan Trypanosoma cruzi, which is the etiologic agent of Chagas disease. They consist of 144 species grouped into 18 genera and are found mainly in the Americas, from the southern United States to southern Argentina and Chile. Essentialy, the identification of these insects has been based on the comparative description of the morphology of adult specimens, including the structures of both the male and female genitalia, general body features like head, thorax, antennae and color, among others. However, this method is not particularly useful in the characterization of species belonging to the genus Rhodnius because they are very similar morphologically, specially R. prolixus, R. domesticus, R. robustus, R. neglectus, and R. nasutus, which are known as "prolixus complex". In this study molecular biology techniques, such as sequencing of 16S gene and PCR-RFLP, was used to contribute to the characterization of seven species of Rhodnius. The products of the sequencing of the 16S species R. brethesi; R. nasutus, R. nasutus, R. neglectus, R. pictipes; R. prolixus, R. robustus, and R. sp generated a alingment of 380bp with 48 polymorphic sites. The visualization of the bands arising from the use of restriction enzymes BstUI, HhaI, RsaI and Mbol with samples of seven species of Rhodnius possible to distinguish them except for R. prolixus, R. neglectus and R.robustus. The two methods performed in parallel for the same samples confirmed the validity of using the enzymatic method for specific identification of R. brethesi, R. nasutus, R. pictipes e R. sp, since the 16S gene is already an established marker for it and the two methods showed the same results, confirmed too the work performed by Naegele et al.2006 that the PCR-RFLP technic distinguished R. stale, R. pictipes, R. Prolixus and R. domesticus / Mestre