Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) ont la capacité unique de se diviser indéfiniment et de pouvoir se différencier en de multiples types cellulaires. Elles apparaissent donc très prometteuses comme agents thérapeutiques dans les traitements médicaux du futur. Un enjeu majeur de la recherche actuelle consiste à comprendre la contribution des protéines régulatrices de la chromatine à la plasticité et au contrôle de l'expression du génome des cellules. La famille des remodeleurs Chd, qui fait partie de la super famille SNF2, comprend neuf membres, soit le tiers des remodeleurs exprimés dans les cellules ES murines. L'objectif principal de ce projet de thèse a consisté à identifier de manière exhaustive les gènes cibles de chaque facteur pour comprendre comment ils participent à la régulation du génome et se partagent le remodelage de la chromatine. Nous avons entrepris un projet à grande échelle dans lequel chaque gène codant chaque Chd a été fusionné, à son extrémité carboxy-terminale, à une séquence codant une étiquette, par recombinaison homologue en cellules ES. Les cellules ES étiquetées ont ensuite été utilisées pour des expériences d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP-seq). La présence de l'étiquette a permis de standardiser et d'optimiser les méthodes d'immunoprécipitation des protéines. Les fragments d'ADN isolés ont ensuite été séquencés dans le laboratoire d'Ivo Gut (CEA/CNG -Evry- et CNAG -Barcelone-). Nous avons également analysé les transcriptomes des cellules ES où la déplétion de chaque protéine Chd a été réalisée, par hybridation sur puce et RNA-seq. Ces données ont permis de montrer le rôle de NuRD (Chd4, Hdac2) au sein des réseaux de la régulation transcriptionnelle des ES. Les données obtenues pour les facteurs Chd1, Chd8 et Chd4 montrent des rôles différents mais interconnectés pour chaque protéine. Enfin, ces données nous ont permis de proposer des hypothèses pour expliquer comment ces protéines contribuent à la régulation du génome.

Dans ce manuscrit nous abordons les propriétés mécaniques de fibres de chromatine à l'échelle de la molécule unique. La chromatine est la structure nucléoprotéique qui contient le génome des cellules eucaryotes. À ce titre, cette fibre est soumise à de nombreuses contraintes mécaniques, telle la torsion, lors des processus de transcription, de réplication ou bien encore de réparation. Une revue des connaissances concernant la chromatine est présentée dans un premier chapitre. En particulier, nous introduisons l'influence d'une histone, appelée histone de liaison. Cette protéine permet à la fibre d'accéder à un niveau de compaction supérieur. Ensuite nous donnons les outils théoriques et expérimentaux d'étude du substrat chromatinien. Nous détaillons les propriétés topologiques de la chromatine. Le dispositif d'étude que nous avons utilisé, les pinces magnétiques, est décrit. Il permet d'exercer sur une fibre unique des contraintes mécaniques de tension et de torsion controlées. Enfin nous présentons les résultats obtenus sur des fibres de chromatine reconstituées en présence ou non de l'histone de liaison. À l'aide des pinces magnétiques, nous avons pu mettre en évidence le fait que l'histone de liaison ne modifie pas l'élasticité torsionnelle remarquable de la chromatine, même si la fibre est dans un état plus condensé. Sous forte déformation torsionnelle positive, le nucléosome subit une transition chirale qui permet de relâcher la contrainte topologique appliquée à la fibre. Nous avons pu montrer que ce changement conformationnel peut tout à fait se dérouler au sein des fibres contenant l'histone de liaison. Les implications biologiques de ces phénomènes sont examinées. La capacité propre à la chromatine à supporter la contrainte de torsion pourrait avoir un rôle dans le maintien de l'organisation chromatinienne lors du cycle cellulaire.

Il apparait de nos jours évident que les cancers ne peuvent se réduire uniquement à des aberrations génétiques, et qu'un nouveau paramètre est à prendre en considération, l'épigénétique. Au cours de ma thèse je me suis efforcé de caractériser la protéine fusion BRD4-NUT. Cette protéine résulte d'une translocation t(15;19) observée dans les carcinomes de la ligne médiane (NMC), extrêmement agressifs et létaux. La protéine BRD4 possède un double bromodomaine capable de s'associer à la chromatine acétylée, et recrute divers facteurs sur la chromatine. NUT est une protéine de fonction inconnue exprimée exclusivement au cours de la spermatogenèse. J'ai pu démontrer que la protéine fusion BRD4-NUT était suffisante pour induire la tumorigenèse, par un mécanisme de séquestration de la proteine histone acétyltransférase (HAT) CBP/p300. NUT interagit avec CBP/p300 et suractive son activité d'acétylation, créant des foci hyperacétylés de chromatine. BRD4-NUT empêche ainsi CBP/p300 d'aller co-activer la transcription de nombreux gènes, et bloque notamment la réponse apoptotique p53-dépendante. Une inhibition de BRD4-NUT – par siRNA, mutation des bromodomaines ou dérégulation de l'acétylation des foci par des inhibiteurs des histones déacétylases (HDAC) – réenclenche la voie d'apoptose et la mort de ces cellules tumorales. Cette étude est un exemple précis de l'impact qu'une dérégulation épigénétique peut avoir sur l'homéostasie cellulaire et son mécanisme d'induction de la tumorigenèse. Je me suis également interessé à caracteriser la protéine NUT lors de son contexte physiologique, la spermatogenèse, ou lors de son expression illégitime dans des lignées tumorales sans fusion avec BRD4. La protéine NUT est exprimée au niveau des stades de maturation des cellules germinales spermatides, et pourrait participer au remodelage du génome et à l'établissement de l'épigénome final du spermatozoïde. Nut semble également conférer un avantage prolifératif lors de son expression anormale dans au moins trois lignées cellulaires, U2OS, A549 et A7R5. Ainsi, la protéine NUT, seule ou fusionnée avec BRD4, est un facteur Cancer/Testiculaire capable d'influer négativement sur l'homéostasie des cellules somatiques dans lesquelles ses fonctions, normalement restreintes à la spermatogenèse, participent à la tumorigenèse.

Les protéines à " Methyl-CpG-binding domain " (MBD) jouent un rôle important dans l'interprétationde la méthylation de l'ADN conduisant à la répression transcriptionnelle via le recrutement decomplexes remodelant la chromatine. Dans les cancers, MBD2 jouerait un rôle essentiel dans la perted'expression des gènes hyperméthylés. Ainsi, MBD2 serait une cible potentielle pour rétablir, enpartie au moins, leur expression. Caractériser, à l'échelle du génome, la distribution de MBD2 et sesconséquences sur la répression transcriptionnelle au cours de la cancérogenèse est donc une étapeincontournable. (1) L'impact sur l'expression génique de l'inhibition de MBD2 par interférence àl'ARN, a été étudié en utilisant des puces, dans des cellules normales MRC5. La perte de MBD2n'induit pas de surexpression génique globale et la densité en CpG des promoteurs méthylés sembleêtre une composante importante dans la force de répression par MBD2. (2) Les profils de méthylationde l'ADN, de liaisons de MBD2 et de l'ARN polymérase II dans les cellules HeLa ont été analysés parChIP-on-chip avec des puces promoteurs. Ces mêmes approches couplées à l'analyse de l'acétylationdes histones H3 ont été réalisées dans un modèle cellulaire syngénique de progression tumoralemammaire humain. Dans les modèles étudiés, une forte proportion de gènes silencieux et méthylés estliée par MBD2. Les comparaisons entre cellules immortalisées et transformées ne montrent pas dechangements majeurs de la méthylation de l'ADN ou de la répression transcriptionnelle, par contreune redistribution de MBD2 parmi ces sites est observée, suggérant une redondance entre les protéinesliant l'ADN méthylé.

Chez les eucaryotes, la transcription est réalisée en plusieurs étapes. Différents facteurs contrôlent ces étapes en apportant des modifications post-traductionnelles à l'ARN polymérase II, en modulant son activité catalytique ou en modifiant l'état et l'accessibilité de la chromatine. Plusieurs exemples chez la levure et les mammifères montrent que les kinases des voies de signalisation MAP-kinase peuvent contrôler directement les étapes de la transcription en se fixant sur la chromatine. Les étapes de pré-initiation et d'initiation de la transcription ont longtemps été considérées comme les plus importantes pour le contrôle de l'expression des gènes. Mais le contrôle de la pause de l'ARN polymérase II au début de l'élongation est lui aussi primordial. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé aux relations fonctionnelles entre le facteur chromatinien Corto, la MAP kinase ERK et le facteur d'élongation de la transcription Elongin. J'ai montré que ERK, une de ses protéines d'échafaudage MP1 et Corto forment un complexe chromatinien qui régule le développement des tissus de l'aile. Corto interagissant avec des protéines des groupes Polycomb et Trithorax, ce complexe pourrait être impliqué dans un mécanisme de reprogrammation de l'expression de gènes en réponse à l'activation de ERK. Mes travaux ont aussi mis en évidence un rôle du complexe Elongin, en interaction avec Corto, au cours du développement des tissus de l'aile. Corto et Elongin participeraient à la régulation transcriptionnelle de rhomboïd, un gène clé du développement des tissus de l'aile. Enfin, j'ai entrepris l'étude du rôle de l'interaction entre Corto et certains ARN, dont l'ARN codant la protéine MP1.

L'organisation en chromatine permet de compacter l'ADN génomique et de réguler finement l'expression du génome. La particule cœur du nucléosome, composée d'un octamère de protéines histones autour desquelles s'enroule l'ADN, peut être modulée par l'incorporation de variants d'histones. Pour l'histone H3, les variants réplicatifs H3.1 et H3.2 permettent une incorporation lors de la réplication de l'ADN, tandis que le variant H3.3 est incorporé tout au long du cycle cellulaire. Les données dans la littérature établissent un lien entre H3.3 et la transcription. L'incorporation d'H3.3 dépend d'une voie d'assemblage faisant intervenir le chaperon HIRA. Mon projet de recherche visait à déterminer si H3.3 et son incorporation via HIRA possédaient un rôle spécifique. Le développement embryonnaire via une régulation fine de l'expression des gènes représentait une situation idéale pour aborder ces questions. L'utilisation du vertébré Xenopus laevis qui ne possède qu'un variant H3 réplicatif : H3.2, m'a permis d'évaluer la fonction de ces variants au cours du développement. J'ai pu montrer que, malgré leur similarité, les variants H3.2 et H3.3 ne sont pas interchangeables. Une altération d'expression d'H3.3 ou l'interférence dans sa voie d'assemblage via son chaperon HIRA conduisent à des défauts majeurs à la gastrulation. Ce phénotype s'accompagne d'un défaut d'expression de gènes mésodermiques, dont le marqueur Xbra. Une désorganisation globale de la chromatine est également observée chez ces embryons. Ces données mettent en lumière l'importance de l'incorporation du variant d'histone H3.3 dans la chromatine au cours d'une étape clé du développement embryonnaire, la gastrulation

Les modifications post-traductionnelles des protéines de réparation de l'ADN et des facteurs chromatiniens par poly(ADP-ribose)ylation et par phosphorylation sont essentielles pour le maintien de l'intégrité de l'ADN et de la chromatine, en particulier dans la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN induits par radiation ionisantes (RI). Parmi les protéines impliquées dans ces deux processus nous trouvons, respectivement, la poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) et PARP-2, et la kinase dépendante des cyclines Cdk5 : PARP-1 et PARP-2 sont impliqué dans le mécanisme de réparationdes cassures simples brin (CSBs) de l'ADN (Single Strand Break Repair : SSBR ) et la déplétion de Cdk5 a été liée à l'augmentation de la sensibilité des cellules aux inhibiteurs de PARPs. Nous avons montré, en utilisant des cellules HeLa stablement déplété pour Cdk5 ou PARP-2, que ces deux protéines sont impliquées dans les deux sous-voies du SSBR, le short- (SPR) et le long-patch repair (LPR). L'absence de Cdk5 ou PARP-2 entraîne des modifications du fonctionnement du SSBR, notamment en termes de recrutement des protéines de réparation PARP-1 et XRCC1, impliquées dans le SPR, et PCNA, protéine clé du LPR, au site du photo-dommage. PARP-2 et Cdk5 agissent aussi sur la balance du niveau des poly(ADP-ribose) car en absence de Cdk5 une hyper-activation de PARP-1 a été montrée, et en absence de PARP-2 une diminution de l'activité de la protéine poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) a été aussi observée. Cependant, malgré ces changements les deux lignées cellulaires dépourvues de Cdk5 (Cdk5KD) ou de PARP-2 (PARP-2KD) réparent de façon normale les CSBs radio-induites, mais, intéressement et contrairement aux cellules PARP-2KD, les cellules Cdk5KDsont sensibles à l'effet létal des RI. De plus nous avons montré que Cdk5, PARP-2 et PARG sont toutes les trois impliquées dans la régulation du recrutement et de dissociation du facteur chromatinien ALC1 suggérant leur implication dans la régulation de la dynamique de la chromatine en réponse aux photo-dommages de l'ADN. Ces résultats avec l'observation de la diminution du recrutement de PARP-1 dans les cellules Cdk5KD et PARP-2KD, montrent l'apparition d'un réseau complexe de phosphorylation et de poly(ADP-ribose)ylation en réponse aux RI qui implique Cdk5 , PARP-1,PARP-2 and PARG et qui est fort probablement initié par l'activité kinase de Cdk5.

Dans les cellules cancéreuses, des défauts affectant l'organisation d'ADN en chromatine sont fréquemment observés. L'étude de facteurs impliqués dans cette organisation est donc essentielle pour mieux appréhender leur implication dans la tumorigénèse. Un facteur particulièrement intéressant dans ce contexte est le facteur d'assemblage de la chromatine, le complexe CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1). CAF-1 est impliqué dans l'assemblage en chromatine de l'ADN lors de la réplication et la réparation de l'ADN. Deux sous-unités de CAF-1 sont sous-exprimés dans les cellules non-proliférantes (quiescentes) et constituent des marqueurs de prolifération dans le cancer. De plus, CAF-1 a un rôle au niveau des régions de chromatine dense proches des centromères, l'hétérochromatine péricentrique, par son interaction avec les protéines HP1 (Heterochromatin Protein 1). Il existe trois isoformes de HP1 dans les cellules mammaires (HP1α, β et γ), dont HP1α est le plus spécifiquement associé aux régions d'hétérochromatine péricentrique, impliqués dans la répression des gènes et la ségrégation des chromosomes. Pendant ma thèse, je me suis penchée sur deux questions majeures: Premièrement, est- ce que l'expression des isoformes de HP1 est régulée d'une façon dépendante de la prolifération et de la tumorigénèse ? En combinant des modèles de lignées cellulaires et des échantillons de tissu humain, j'ai pu montrer que l'expression de l'isoforme HP1α, mais pas HP1β ou γ, est dépendante de la prolifération. La déplétion de HP1α, spécifiquement, affecte le passage de la mitose. De plus, HP1α, mais pas HP1β ou γ, est surexprimé dans de nombreux types de cancer comparé aux tissus sains correspondants. La surexpression de HP1α dans le cancer du sein est corrélée de façon significative à la survie des patientes et la formation de métastases. Ces résultats révèlent HP1α comme un marqueur pronostique dans le cancer du sein et potentiellement dans d'autres types de cancer. Nous proposons que la surexpression de HP1α présente un avantage sélectif pour les cellules cancéreuses, liée à l'organisation de l'hétérochromatine péricentrique et le passage de la mitose. Ces résultats ont donné lieu à un brevet et à une publication dans EMBO Molecular Medecine. La seconde question à laquelle je me suis intéressée est : comment des cellules quiescentes, qui expriment peu de CAF-1, gèrent l'assemblage de la chromatine couplé à la réparation de l'ADN ? En effet, une capacité de réparation différente entre cellules proliférantes (tumorales) et quiescentes (saines) aura un impact majeur sur l'efficacité et la toxicité des traitements génotoxiques comme la chimio- et la radiothérapie. J'ai pu montrer que, dans les cellules quiescentes, les irradiations aux ultra-violets (UV) n'induisent pas l'expression de CAF-1. De plus, la faible quantité de CAF-1 est recrutée aux sites des lésions d'UV, suggérant que sa fonction dans la réparation est conservée hors du cycle cellulaire. Cependant, en quiescence, nous observons une réparation retardée d'un type spécifique de lésions, qui reflète potentiellement une difficulté des cellules quiescentes à gérer la prise en charge de ces lésions au sein de la chromatine. Ces résultats font l'objet d'un manuscrit actuellement en préparation. Dans ces deux projets majeurs, j'ai mis en avant comment des facteurs de l'organisation de la chromatine peuvent être impliqués dans la prolifération, la tumorigénèse et la réparation d'ADN suite à des traitements génotoxiques. De plus, nous avons pu proposer un nouvel outil d'intérêt médical pour le pronostique des cancer du sein.

La reproduction sexuée implique une différentiation extrême des gamètes qui s'accompagne de profonds remaniements des chromosomes parentaux. Au moment de la fécondation, ces chromosomes doivent être rendus compétents pour la formation du premier noyau zygotique. Au cours de ma thèse, j'ai étudié l'importance fonctionnelle de plusieurs voies moléculaires paternelles et maternelles participant à cette étape chez la drosophile. Le complexe HIRA est impliqué dans l'assemblage de nucléosomes dans le pronoyau mâle à la fécondation. J'ai décrit le rôle de HIRA et de son partenaire Yemanucléine-α dans cette voie. J'ai caractérisé plus finement ce complexe en étudiant son rôle somatique dans l'assemblage des nucléosomes et son implication dans la stabilité de l'hétérochromatine, améliorant notre compréhension des besoins biologiques qui conditionnent sa conservation et son évolution. Je me suis aussi intéressé à diverses situations affectant l'intégrité des chromosomes parentaux à la fécondation. (1) J'ai décrit les conséquences catastrophiques pour la méiose femelle de l'expression naturelle d'un transposon à travers l'étude d'un cas de dysgénésie hybride. (2) J'ai contribué à montrer que la protéine K81 est essentielle pour la protection des télomères dans les chromosomes paternels au cours de la spermatogénèse. (3) J'ai participé à caractériser les conséquences pour les chromosomes paternels de l'incompatibilité cytoplasmique induite par la bactérie Wolbachia. Ensemble, ces travaux soulignent les particularités des chromosomes parentaux à la fécondation et aident à cerner l'importance des voies maternelles et paternelles dans leur intégration dans le premier noyau du zygote

Les eucaryotes expriment des variants d'histones non-alléliques en faible quantité en plus des histones conventionnels. De récentes données ont montré que ces variants d'histones sont impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires dont la réparation de l'ADN, la ségrégation des chromosomes ou encore le contrôle de la transcription. L'objectif de cette étude est d'améliorer la compréhension du rôle biologique des variants d'histones. Les travaux rapportés dans ce manuscrit abordent plus spécifiquement la fonction de deux variants: H2BFWT, qui joue un rôle dans la spermatogenèse chez l'homme; et macroH2A1 qui semble impliqué dans la répression transcriptionnelle.<br />Nous avons montré que malgré sa grande divergence avec H2B, l'incorporation de H2BFWT ne modifie pas la structure globale du nucléosome. Néanmoins, contrairement à l'histone somatique H2B, H2BFWT n'a pas la capacité de recruter les facteurs d'assemblage du chromosome et n'est pas requis pour la condensation du chromosome mitotique. Cette différence de comportement vis-à-vis de l'assemblage des chromosomes suggère que H2BFWT pourrait être impliqué dans l'architecture de structure d'ordre supérieur de la chromatine.<br />Dans le but d'élucider le rôle biologique de macroH2A1 in vivo, nous avons généré une lignée de souris invalidées pour macroH2A1.<br />Malgré l'abondance des investigations portant sur macroH2A1, sa fonction reste inconnue. MacroH2A1 a la particularité d'être trois fois plus grand que H2A, il comporte ainsi une extension C-terminale de fonction inconnue. Initialement macroH2A1 avait été décrit comme principalement localisé sur le chromosome X inactif. La signification biologique de cet enrichissement n'est pas comprise. In vitro, la présence de macroH2A1 interfère avec la transcription. De récentes études ont montré que certaines séquences d'ADN méthylées, incluant les gènes soumis à l'empreinte et les rétrotransposons sont enrichies en nucléosomes contenant macroH2A1. Il a également été démontré que c'est la méthylation de l'ADN, nécessaire pour la répression transcriptionnelle, qui permet le recrutement de macroH2A1 sur les rétrotransposons. Nous émettons l'hypothèse que la méthylation de l'ADN aboutirait à la répression des rétrotransposons via le recrutement de macroH2A1.<br />L'étude du phénotype des souris déficientes en macroH2A1 permet de conclure que contrairement au consensus actuel, macroH2A1 n'est pas nécessaire pour réprimer la transcription des séquences répétées incluant les rétrotransposons.<br />Les examens anatomopathologiques suggèrent que macroH2A1 pourrait être impliqué dans la régulation du métabolisme des acides gras.