Les nitrosamines constituent une famille de composés posant un risque pour la santé des gens. Depuis la fin des années cinquante, 90% des nitrosamines ont été prouvées ou suspectées cancérogènes pour l'homme. Ces substances peuvent être retrouvées dans l'air, entre autres dans les milieux de travail. Les concentrations les plus importantes de nitrosamines volatiles ont été retrouvées dans les procédés de fabrication du caoutchouc. La valeur d'exposition admissible (VEA) recommandée par l'Institut national de santé publique du Québec (INSPQ) dans une revue de littérature récente est de 1 μg/m3 de nitrosamines. Les faibles concentrations à analyser demandent donc des outils et des méthodes d'analyse hautement spécifiques et sensibles. Depuis 2007, les laboratoires de l'IRSST ont effectué un important développement qui a permis de mettre au point une méthode d'analyse de huit nitrosamines dans l'air par chromatographie gazeuse avec détecteur azote phosphore (CG-DAP). Cependant, cette méthode peut parfois présenter des limitations quant à sa spécificité. Le spectromètre de masse étant très sélectif et sensible à la fois, une méthode couplant la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse (CLHP-MS) a été développée dans le but de doser de basses concentrations de nitrosamines dans l'air. L'échantillonnage s'effectue avec le tube adsorbant développé par l’INRS (France). La méthode de désorption mise au point permet une récupération moyenne de 96,00 ± 0,08 %. Les limites de quantification obtenues lors des validations préliminaires de la méthode d'analyse par CLHP-MS varient de 0,03 μg/m3 à 0,09 μg/m3 selon la nitrosamine. Les valeurs obtenues représentent respectivement 3 % à 9 % de la norme recommandée par l'INSPQ pour 800 L de volume d'air échantillonné (400 minutes d'échantillonnage à 2 L/min). Le domaine d'applicabilité de la méthode est de 0,07 μg/m3 à 1,75 μg/m3 ce qui couvre les concentrations visées par l'INSPQ. Les résultats démontrent une détection spécifique et sensible des nitrosamines. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Nitrosamines, CLHP-MS, Analyse de l'air, Caoutchouc, GC-DAP.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Le séquençage du génome de nombreux organismes, en particulier le génome humain, n'a pas bien élucidé les mécanismes qui relient les génes aux fonctions biologiques et aux divers états pathologiques. Par conséquent, une nouvelle approche en science et en médecine - baptisé analyse protéomique - est émergée pour mieux comprendre la complexité cellulaire, pour la découverte de nouveaux marqueurs des pathologies humaines et pour le développement de nouveaux médicaments. Aujourd'hui, l'analyse protéomique est une discipline scientifique en pleine croissance. La nouvelle tendance à la miniaturisation de l'analyse biologique et des dispositifs associés, constatée depuis environ une décennie, a touché l'analyse protéomique. Cette tendance à la miniaturisation trouve ses justifications dans le gain à attendre en termes de vitesse et de débit d'analyse et en terme d'optimisation des analyses. Un haut débit d'analyse est à espérer du fait de la suppression de manipulation intense pour et entre les différentes étapes et également d'une automatisation des analyses avec l'utilisation d'une interface robotisée qui manipule les systèmes. Par ailleurs, cette miniaturisation s'accompagne d'un gain en sensibilité des analyses. Dans ce contexte général, l'objectif de ce travail de thèse et de développer de nouveaux dispositifs et supports chromatographiques miniatures, basés sur les monolithes à base de monomères méthacrylate pour la préparation des échantillons protéomiques. Cette préparation comporte la digestion, la purification, la séparation et l'enrichissement de certaines espèces, notamment les peptides phosphorylés. / The sequencing of the genome of many organizations, especially the human genome, did not elucidate the mechanisms that Iink genes to biological functions and the various pathological states. Therefore, a new approach to science and medicine-called proteomic analysis - has emerged to better understand the complex cell, for the discovery of new markers of human disease and the development of new drugs. Today, proteomic analysis is a scientific discipline growing. The new trend towards miniaturization of biological analysis and related devices, since nearly a decade, has affect proteomic analysis. This trend towards miniaturization has its justifications in the expected gain in terms of speed and flow analysis and optimization in terms of analysis. A high-speed analysis is to be hoped from the abolition of manipulation and intense for the different stages and also an automated analysis with the use of a robotic interface that handles systems. Moreover, this miniaturization is accompanied by a gain in sensitivity analysis. ln this general context, the objective of this thesis work and develop new devices and materials chromatographic miniatures, based on methacrylate monoliths for the preparation of proteomic samples. This preparation includes digestion, purification, separation and enrichment of certain species, including phosphorylated peptides. This work gives me a chance to participate in the BioChipLab consortium, from the GenHomme program of the Ministry of Economy and Finance assembling teams from Lille and Grenoble. The project is run by the pharmaceutical group Sanofi-Synthélabo

Le but de ce travail consiste à créer un nouveau tag de purification d'affinité permettant la purification de protéines recombinantes sur une matrice DEAESépharose Fast Flow. Dans la nature, certaines protéines de surface de Streptococcus pneumoniae sont liées à la paroi bactérienne par des interactions non convalentes faisant intervenir des molécules de choline présentes sur les acides téichoiques et lipotéichoiques. Ces protéines de surface présentent une organisation modulaire avec le domaine catalytique et le domaine de liaison fonctionnant indépendamment l'un de l'autre. La choline étant un analogue structural du DEAE, l'étude des domaines de liaison à la choline constitue une approche de choix pour concevoir un tag de purification présentant une affinité pour le DEAE-Sépharose. Nous avons plus particulièrement travaillé sur la N-acétyl-L-alanine amidase (LytA) qui dégrade spécifiquement certaines liaisons du peptidoglycan de la paroi de Streptococcus pneumoniae. Son domaine de liaison à la choline C-terminal (ClytA) se compose de six motifs répétés imparfaits, constitué chacun d'une vingtaine de résidus. Deux stratégies ont été développées pour concevoir le tag de purification. D'une part, 126 motifs répétés de 19 domaines de liaison à la choline ont été alignés pour définir une séquence consensus. Cette approche a permis de mettre en évidence les résidus importants conservés parmi les motifs répétés. D'autre part, nous avons construit des protéines de fusion portant des fragments du domaine de liaison ClytA de longueur variable. Des expériences de chromatographies sur matrice DEAESépharose nous ont permis d'isoler un petit fragment de ClytA(L234), présentant toujours une affinité spécifique pour le DEAE Sépharose. Cette affinité est maintenue lorsque le fragment L234 est fusionné à l'extrémité C-terminale d'une autre protéine reporter. Cependant, nos résultats suggèrent que le candidat tag L234 est instable et qu'il conduit à l'insolubilisation de la protéine de fusion lors de la production de celle-ci dans Escherichia coli. Afin d'améliorer la solubilité/stabilité du fragment L234, nous avons développé trois approches bioinformatiques. Cellesci ont permis de définir trois groupes de mutations permettant d'améliorer potentiellement la solubilité et/ou la stabilité du fragment L234. Les tags mutants ont été construits et fusionnés à l'extrémité C terminale de la thiorédoxine. Le premier tag mutant, EDE-L234, est plus soluble que la version non mutante mais présente une perte d'affinité pour le DEAE Sépharose. Le second mutant, NG-L234, ne montre pas d'augmentation de solubilité et perd également une partie de son affinité pour la matrice. Le troisième tag mutant, V1V2V3-L234, présente une augmentation d'affinité pour le DEAE-Sépharose bien que sa solubilité reste inchangée.

Les molécules marquées aux isotopes stables, dont on peut assurer la traçabilité biologique grâce aux progrès récents des techniques analytiques, apportent de nouveaux moyens d’investigation du métabolisme. De nouveaux tests de diagnostics cliniques non invasifs sont, à ce jour, de pratique courante (ex. breath test à l’urée 13C). L’intérêt majeur des isotopes stables est évidemment leur innocuité vis-à-vis de l’organisme humain, contrairement aux produits radioactifs. Pour des raisons éthiques bien compréhensibles, l’usage de ces derniers est actuellement proscrit dans les essais in vivo chez l’homme ; dès lors, le développement de méthodes alternatives d’investigations métaboliques ou de diagnostics s’est révélé pertinent. L’objectif principal de notre étude est la mise au point d’un nouvel outil de suivi du métabolisme thyroïdien basé sur la double dilution de marqueurs isotopiques avec l’emploi de molécules marquées régio-sélectivement au carbone 13 (l’une est la sonde métabolique, la seconde le standard de quantification absolue). Les étapes développées sont les suivantes : 1.Biosynthèse du précurseur : la L-tyrosine contenant de 1 à 9 carbone 13 ; 2.Synthèse des hormones thyroïdiennes servant de traceurs biologiques ou de standards internes d’analyse (la thyroxine : 13C9 et 13C6-T4 ; la 3,3’,5-triiodothyronine : 13C9-T3) : optimisation de la voie de synthèse de façon à minimiser les pertes en réactifs marqués ; 3.Ingestion ou injection du traceur (13C6-T4) par l’animal ou par l’homme et collecte d’échantillons de plasma sur une période de temps donnée ; 4.Ajout du standard interne au plasma (13C9-T4 ou 13C9-T3) ; 5.Extraction par solvants, purification et dérivation des hormones thyroïdiennes (endogène, exogène et standard) du plasma ; 6.Analyse et quantification par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (par suivi des ions spécifiques de chaque entité moléculaire). L’optimisation instrumentale du protocole analytique GC-MS - à savoir la séparation chromatographique et la gestion des ions de masse en mode SIR - a été maîtrisée pour l’analyse de traces de T3 et T4 ; les limites de détection actuelles sont de l’ordre de 20 pg pour chacune des hormones. Une mise en œuvre de tests in vivo de 13C9-T4 comme traceur métabolique a été réalisée sur animaux sous contrôle vétérinaire avec la collaboration du Département de Biochimie Clinique de la « Royal Infirmary » d’Edinbourg. Ils nous ont permis de démontrer la faisabilité de la méthodologie (incorporation de la sonde et son suivi temporel) et la possibilité d’utiliser ces traceurs comme sondes chez l’homme. The principal objective of this thesis is the development of a new tool for the study of the thyroid metabolism based on double isotopic dilution technique with the use of two isotopomers of the same hormone enriched with distinct carbon 13 contents (one as metabolic tracer, the second as internal standard). The successive stages of the methodology are described below: 1.Biosynthesis of the starting material (L-tyrosine) enriched with 1 to 9 carbon 13; 2.Optimized synthesis of the thyroid hormones being used as biological tracers or analytical internal standards (thyroxine : 13C9 and 13C6-T4; 3,3',5-triiodothyronine : 13C9-T3); 3.Incorporation of the tracer (13C6-T4) by the patient and collect of samples of plasma over a given period of time; 4.Internal standard addition to plasma (13C9-T4 or 13C9-T3); 5.Solvent extraction, purification of the thyroid hormones (endogenous, tracer and standard) of the plasma; and derivatization of the thyroid hormones; 6.Analysis and quantification by gas chromatography coupled with mass spectrometry (by follow-up of the specific ions of each isotopomer), monitoring of (m/z) values 970/979 and 976/979 for thyroxine. The instrumental optimization of GC-MS analytical protocol - namely chromatographic separation and management of the ions of mass in SIR mode - was worked out for the analysis of traces of T3 and T4. The limit of detection is 20 pg for each molecule. A first implementation in in vivo tests of 13C9-T4 as a metabolic tracer was carried out under veterinary control on cats and rabbits thanks to the collaboration of the Clinical Department of Biochemistry of Royal Infirmary of Edinburgh. They enabled us to prove the feasibility of the methodology (incorporation of the probe and its temporal follow-up) and the possibility of using these tracers as probes for human beings.

Thèse d'exercice : Pharmacie : Université de Nantes : 2005. / Bibliogr. f. 85-88.

Reproduction de : Thèse doctorat : Physique-Chimie : Reims : 2006. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. f. 158-168.