Die Verbindung von genetischen, physikalischen und zytologischen Daten ist entscheidend für die Genom- und Chromosomenanalyse. Obwohl Beta vulgaris (2n = 18) als wichtige Kulturpflanze und Untersuchungsobjekt der Grundlagenforschung eine intensiv analysierte Art darstellt, existiert bisher keine Verknüpfung zwischen Kopplungsgruppen (LG) und Chromosomen. B.-vulgaris-Chromosomen können zudem aufgrund fehlender morphologischer Unterscheidungsmerkmale bisher nicht einzeln identifiziert und klassifiziert werden. Somit sind zytogenetisch gewonnene Ergebnisse nicht ohne weiteres auf genetische Kopplungsgruppen und physikalische Karten übertragbar. Zytogenetische Methoden können zur Analyse struktureller Chromosomenveränderungen, zur Identifizierung und Lokalisierung von repetitiver DNA sowie zur Kartierung schwierig zu positionierender Marker verwendet werden. Ziel dieser Arbeit war es daher, ein FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung)-Verfahren zu etablieren, das die Kopplungsgruppen und Chromosomen der Zuckerrübe korreliert und die mikroskopische Identifizierung aller Chromosomenarme ermöglicht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein FISH-Referenzkaryotyp der Zuckerrübe entwickelt. Durch ein Sondenset aus 18 BACs (bacterial artificial chromosome) sind alle Chromosomenarme der Zuckerrübe identifizierbar und werden mit den nördlichen und südlichen Enden der genetischen Kopplungsgruppen verknüpft. Somit ist eine einheitliche Nummerierung von Kopplungsgruppen und Chromosomen möglich. Durch die gleichzeitige Hybridisierung von chromosomenspezifischen BACs und den Satelliten-DNA-Sonden pAv34 und pBV VI beziehungsweise pEV und pBV wurden die Verteilungsmuster der Sequenzfamilien auf den Chromosomen ermittelt. Die gleichzeitige Hybridisierung aller vier repetitiven Sonden ergab ein chromosomenspezifisches Muster aus subtelomerischen, interkalaren und zentromerischen Signalen. Damit ist die Identifizierung aller B.-vulgaris-Chromosomen in einem einzelnen FISH-Experiment möglich. Zudem wurden dadurch die Chromosomen mit hohem Anteil an tandemartig angeordneten repetitiven Sequenzen identifiziert und die Chromosomenregionen lokalisiert, welche die Sequenzassemblierung behindern können. Sowohl das entwickelte BAC-Set als auch der Sondenpool aus repetitiver DNA unterscheiden die somatischen Metaphasechromosomen erstmals unabhängig von trisomen Linien. Da mit Hilfe der Satelliten-DNA-Sonden alle Chromosomen gleichzeitig markiert werden können, waren die spezifischen physikalischen Längen ermittelbar. Sie wurden mit den genetischen Längen der Kopplungsgruppen in Verbindung gebracht und deckten eine kopplungs-gruppenspezifische Rekombinationshäufigkeit zwischen 0,73 und 1,14 Mb/cM auf. Durch Hybridisierung der BACs und subtelomerischer beziehungsweise telomerischer Sonden auf Pachytänchromosomen wurde der Abstand der BACs sowie der in ihnen enthaltenen genetischen Marker zum physikalischen Chromosomenende abgeschätzt. An fünf Chromo-somenenden wurde ein deutlicher Abstand zwischen den Signalen des BACs und der terminalen Sonden festgestellt. Die zugehörigen Kopplungsgruppen sind demnach erweiterbar. Zudem wurden drei BACs mit nicht detektierbarem Abstand zum Chromosomenende durch FISH an gestreckten Chromatinfasern näher untersucht. Einer der drei BACs wurde eindeutig in unmittelbarer Nähe des Telomers nachgewiesen. Für dieses Ende (Chr 2N) ist die Wahrscheinlichkeit gering, dass die Kopplungsgruppe durch zusätzliche Marker erweitert werden kann; sie wird darum als abgeschlossen angesehen. Für die Enden Chr 4S und Chr 9S war der Abstand zwischen BAC und terminaler Sonde zu groß, um ihn durch Fiber-FISH zu ermitteln. Für sie sind weitere distal zu positionierende Marker wahrscheinlich. Weiterhin wurden bioinformatische Analysen an der verfügbaren B.-vulgaris-Genomsequenz RefBeet 1.0 durchgeführt. Scaffolds, welche die genetischen terminalen Marker enthalten, wurden bioinformatisch identifiziert und auf ihren Gehalt subtelomerischer und telomerischer Sequenzen untersucht. Vorhandene terminale Sequenzen sind ein Nachweis für eine terminale Lokalisierung der in-silico-Chromosomenabschnitte. Für drei Scaffolds mit zuvor ungeklärter Lage wurde dadurch das in-silico-Chromosom ermittelt beziehungsweise die nördliche oder südliche Position auf dem Chromosom dargestellt. Durch die Lokalisierung dieser Bereiche innerhalb der Sequenz in Bezug zum genetischen Marker und unter Berücksichtigung der Ergebnisse der Pachytän-FISH wurde die Strangorientierung von 16 Scaffolds ermittelt. Auf 14 Scaffolds wurden die Abstände der Marker zu den terminalen Sequenzen bestimmt. Der Median betrug etwa 196 kb. Für alle Kopplungsgruppenenden außer dem Norden von LG 2 und LG 4 ist das Vorhandensein weiterer distaler genetischer Marker wahrscheinlich. Satelliten-DNA ist innerhalb einer Art meist homogen, kann jedoch chromosomenspezifische Varianten ausbilden. Auf dem BAC-Marker für Chr 2N wurde durch Southern-Hybridisierung die subtelomerische Sequenzfamilie pAv34 detektiert. Von dem betreffenden BAC wurde eine Subklonbank erstellt. Durch Southern-Hybridisierung wurde der pAv34-Gehalt der Subklone analysiert. Positive Klone wurden sequenziert. Dabei wurden vier verschiedene vollständige pAv34-2N-Monomere detektiert. Im Vergleich mit pAv34-Volllängenmotiven aus der RefBeet 1.0 und dem Datensatz der nicht assemblierten Sequenzen der RefBeet 0.2 bilden die pAv34-2N-Einheiten mit pAv34-Kopien, die verschiedenen in-silico-Chromosomen und Contigs zugeordnet sind, eine Subfamilie. Aus den Sequenzen der Subklone wurden zwei Subklon-Contigs gebildet, die im in-silico-Chromosomenabschnitt von Chr 2N (Bvchr2.un.sca001) positioniert wurden. Dadurch wurden Regionen bisher unbekannter Sequenz entschlüsselt. Abweichungen zwischen den assemblierten Daten und den Subklonsequenzen deuten auf Assemblierungsfehler der Genomsequenz in repetitiven Bereichen hin. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse ermöglichen erstmalig die eindeutige Identifizierung aller B.-vulgaris-Chromosomen unabhängig vom Zellzyklusstadium und im Einklang mit genetischen Informationen. Zytogenetische sind jetzt mit molekularen Daten integrierbar und können verwendet werden, um den chromosomenspezifischen Satelliten-DNA-Gehalt aufzudecken und mögliche chromosomenspezifische Subfamilien zu identifizieren. Sie erlauben, physikalische Abstände zwischen Markern zu ermitteln und die Abdeckung von Kopplungsgruppen im terminalen Bereich zu untersuchen. Die Ergebnisse tragen dazu bei, Marker und nicht zugeordnete Contigs und Scaffolds zu kartieren, Ursachen für Lücken aufzudecken und damit die Sequenzdaten des Zuckerrübengenoms zu einer fortlaufenden, hochqualitativen Sequenz zu assemblieren. Die zytogenetischen Daten bilden zudem die Basis für zukünftige Untersuchungen struktureller Umbauten von Chromosomen, die während der Genomevolution stattfanden. / The correlation of genetic, physical and cytological data is crucial for interdisciplinary genome and chromosome analyses. Beta vulgaris (2n = 18) is an important crop and an object of basic research. Although it is an intensely analysed species, its genetic linkage groups (LG) have not been assigned to chromosomes. Additionally, sugar beet chromosomes lack distinct morphological features and could therefore not be identified and classified individually. Consequently, results generated by cytogenetic methods can not be readily applied to genetic and physical maps. Cytogenetic approaches enable analysing structural chromosomal changes, identifying and localizing repetitive DNA, and mapping of markers which are difficult to place within linkage maps. Therefore, the main objective of this work has been the development of a FISH (fluorescence in situ hybridization) procedure that correlates LGs with chromosomes of sugar beet and that allows the microscopic identification of individual chromosome arms. In this work a FISH reference karyotype for sugar beet has been established. A set of 18 BACs (bacterial artificial chromosome) allows the unequivocal identification of each sugar beet chromosome and assigns them to the southern and northern ends of LGs. Hence, the chromosomes are numbered in accordance with the genetic map. The arm-specific BACs and the satellite DNA families pBV and pBV VI or pEV and pAv34 have been hybridized simultaneously to assign the distribution patterns of the highly abundant sequence families to chromosomes. Simultaneous hybridization of the four repetitive probes revealed a chromosome-specific pattern of subtelomeric, intercalary and centromeric signals. Thus, each of the sugar beet chromosomes can be identified in a single FISH experiment. Furthermore, chromosomes with a high content of repetitive DNA have been identified and chromosomal regions that may hinder the correct sequence assembly have been localized. The BAC set as well as the pooled satellite DNA probes discriminate the somatic chromosomes for the first time independently from trisomic lines. Since the chromosomes are differentially labelled with the satellite DNA probes their physical distances could be determined and correlated with genetic distances of the corresponding LGs. A LG-specific recombination frequency from 0.73 to 1.14 Mb/cM has been disclosed. BACs and subtelomeric or telomeric sequences have been hybridized simultaneously on pachytene chromosomes to estimate distances between BACs plus the markers they contain and the physical chromosome ends. Five BACs showed substantial distances to the physical chromosome ends; the corresponding LGs could thus be extended by additional markers. Furthermore, three BACs showing only minor distances to chromosome ends have been investigated in detail by fiber-FISH. One of these BACs was localized closely adjacent to the telomere. For this chromosome end (Chr 2N) it is unlikely that the LG could be extended distally by additional markers and is therefore considered to be closed. The BACs for the chromosome ends Chr 4S and Chr 9S have been too distant from the terminal probe to be bridged by fiber-FISH. For them it is likely that further markers can be placed distally. Furthermore, the B. vulgaris genomic sequence RefBeet 1.0 has been investigated. Scaffolds containing terminal genetic markers have been identified bioinformatically and analysed for the content of subtelomeric and telomeric sequences. The occurrence of terminal sequences confirms the terminal localization of in silico chromosome segments. Three scaffolds with an initially unknown position could thus be allocated to in silico chromosomes and to the northern or southern position on the chromosome. The strand orientation of 16 scaffolds has been determined based on the localization of terminal sequences in relation to the genetic marker considering the results of FISH on pachytene chromosomes. The distance between markers and terminal sequences has been determined for 14 scaffolds. The median is 196 kb. It is likely that further markers can be placed distally from all LG ends except for the north of LG 2 and LG 4. Satellite DNA is usually homogenous within one species; however, it can form chromosome-specific variants. Southern hybridization revealed that the BAC marker for Chr 2N contains the subtelomeric sequence family pAv34. The BAC has been subcloned and the pAv34 content of the subclones has been analysed by Southern hybridization. Positive clones have been sequenced. Thereby, four pAv34-2N monomeres have been detected. Compared to full-length pAv34 motives derived from the RefBeet 1.0 and from unassembled sequence data of the RefBeet 0.2 the pAv34-2N units form a subfamily together with pAv34 copies assigned to different in silico chromosomes and contigs. The subclone sequences have been assembled to two subclone contigs, which have been positioned within the in silico chromosome segment of Chr 2N (Bvchr2.un.sca001). Thereby, regions of unknown sequence have been decoded and probable misassemblies in repetitive regions within the RefBeet 1.0 have been disclosed. The results obtained in this work enable the identification of all sugar beet chromosomes independently from their stage of cell division and in accordance with genetic information. Cytogenetic data are integrated with molecular data and can be used for identifying the chromosome-specific distribution of repeats and chromosome-specific repeat variants. They enable determining physical distances between markers and investigating the terminal coverage of LGs. The results support the correct mapping of markers and unassigned contigs, uncover reasons for gaps within maps and sequence assemblies, and thus contribute to assembling data into a continuous high quality genome sequence of sugar beet. Moreover, the cytogenetic data represent the basis for future investigations of structural chromosomal changes that took place during evolution.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Des études cliniques ont démontré que certains implants métalliques pouvent déclencher des réactions de carcinogénicité. En effet, il semble que le relargage ionique et la corrosion peuvent initier des néoplasmes. Le noyau semble être le compartiment cellulaire cible de ces ions métalliques. Le développement d'essais quantitatifs in vitro capables d'évaluer cette carcinogénicité potentielle est donc essentiel dans la présélection des biomatériaux métalliques. Cependant à l'échelle ultrastructurale, actuellement il n'existe pas véritablement d'essais capables de localiser et de quantifier à la fois les dommages occasionnés à la molécule d'ADN ainsi qu' à sa réparation. Dans ce travail, il s'agissait d'abord d'adapter, en biocompatibilité, une méthode simple capable de détecter, quantifier et localiser précisément les cassures d'ADN qu'induisent les biomatériaux métalliques à la chromatine cellulaire. Pour ce faire, l'essai «in situ end-labeling » (ISEL) en microscopie électronique a été évalué après avoir utilisé un protocole d'extraction des biomatériaux en conditions semi-physiologiques et exposé des lymphocytes sanguins humains normaux. Cette technique immunocytochimique utilise l'exonucléase III pour sa capacité de digérer et d'amplifier les lésions d'ADN produites. Une polymérisation est ensuite exécutée en présence des quatre nucléotides de l'ADN: la thymidine est toutefois remplacée par une base analogue, soit la biotine-dUTP. Cette dernière est localisée par marquage immunologique à l'or colloïdal comme rapporteur moléculaire. Les particules d'or sont alors détectées en microscopie électronique à transmission; elles correspondent aux cassures simple-brin induites à la molécule d'ADN lors de la culture de cellules en présence de l'extrait à étudier. La quantification a été effectuée avec l'aide du Programme Image du NIH. L'ISEL s'est avéré très utile pour sa rapidité, sa capacité de marquer à la fois la chromatine interphasique et métaphasique, et la possibilité de quantifier les dommages causés à l'ADN. Par ailleurs, il ne nécessite pas l'utilisation de la radioactivité. De plus, il semble capable de détecter des phénomènes de mort cellulaire telle que l apoptose. L'« in situ end-labeling » en microscopie électronique s'avère aussi un instrument intéressant pour la présélection des biomatériaux. En effet, la génocompatibilité du titane (Ti) pur, bien connu pour sa biocompatibilité, a été évaluée afin de valider cet essai. Ensuite, la génotoxicité relative du nickel-titane (NiTi) a été évaluée et comparée à celle du titane pur, du nickel (Ni) pur et de l'acier inoxydable. Le NiTi représente un biomatériau potentiel, cependant sa biocompatibilité est controversée vu son important contenu en nickel soit de 50%. L'évaluation de la carcinogénicité du NiTi représente donc un intérêt important. Un essai d'absorption atomique a aussi été réalisé afin d'évaluer le relargage de nickel et de titane, et afin de mieux comprendre le rôle des ces ions dans la carcinogénicité métallique. L'ISEL a semblé ici tout aussi utile dans l'évaluation de la biocompatibilité du nickel-titane. En effet, grâce à cet essai, des résultats fort encourageants ont été obtenus avec le NiTi. Ce dernier a donné des résultats comparables à ceux du titane pur. Par contre, l'acier inoxydable 316-L peut dans certains cas produire aussi des dommages à la chromatine. Par conséquent, cet essai in vitro de génotoxicité nous permet d'être optimiste quand à l'utilisation éventuelle de NiTi à titre d'implant chirurgical permanent.

Yes / The revolution in Big Data has opened the gate for new research challenges in biomedical science. The aim of this study was to investigate whether germ-line gene mutations are a significant factor in 29 major primary human cancers. Using data obtained from multiple biological databases, we identified 424 genes from 8879 cancer mutation records. By integrating these gene mutation records a human cancer map was constructed from which several key results were obtained. These include the observations that missense/nonsense and regulatory mutations might play central role in connecting cancers/genes, and tend to be distributed in all chromosomes. This suggests that, of all mutation classes missense/nonsense and regulatory mutation classes are over-expressed in human genome and so are likely to have a significant impact on human cancer aetiology and pathomechanism. This offers new insights into how the distribution and interconnections of gene mutations influence the development of cancers.

Polytäne Riesenchromosomen von Drosophila melanogaster bieten ein ideales Modellsystem für die Untersuchung der Mechanismen zur strukturellen Bildung chromosomaler Domänen. Über Manipulation und Rekonstruktion des chromosomalen Bandenmusters polytäner Chromosomen können artifiziell kondensierte als auch dekondensierte Domänen etabliert werden. Diese Eigenschaft habe ich in meiner Arbeit genutzt für die Etablierung eines experimentellen Systems zur Analyse der strukturellen Vorraussetzungen zur Bildung offener Chromatindomänen. Dafür wurde eine transgene kondensierte Chromatindomäne ektopisch innerhalb offenen Chromatins generiert. Diese kondensierte „Modellbande“ bietet einen definierten genetischen Hintergrund für die gezielte Insertion von DNA-Sequenzen unter Ausschluss variabler Positionseffekte und ermöglicht dadurch eine vergleichende Analyse dieser Sequenzen auf ihr Vermögen offenes Chromatin zu bilden. Zu diesem Zweck wurde über Sequenz-spezifische Rekombination die 61C7/8 Interbandensequenz gezielt in die „Modellbande“ eingefügt. Die zytogenetische Untersuchung dieser Insertion zeigt, dass infolge der Insertion offenes Chromatin gebildet wird, was in einer Aufsplittung der kondensierten „Modellbande“ resultiert. Molekulare Analysen weisen darauf hin, dass auch die epigenetischen Charakteristika wie z.B. die Rekrutierung typischer Proteine oder transkriptionelle Eigenschaften zur endogenen Domäne immitiert werden. Über Deletionsanalysen konnte von mir die essentielle DNA-Sequenz zur Bildung offenen Chromatins auf ein ~490bp großes Fragment im proximalen Bereich der 61C7/8 Sequenz kartiert werden. Dieses Fragment überlappt mit Bindungsstellen spezifischer Proteine, welche dafür bekannt sind eine Rolle in der chromosomalen Domänenbildung zu spielen wie z.B. das Chromatin-Protein Chriz, die Histon-Kinase Jil1 oder das Insulator-Protein CP190. Desweiteren überlappt es mit einer Promoterregion, welche zwischen den Genen Rev1 und Med30 lokalisiert ist. / Polytene chromosomes of Drosophila melanogaster provides an ideal model-system for the analysis of the mechanisms needed for chromosomal domain formation. Condensed as well as decondensed chromosomal domains can be formed by manipulating and reconstructing the polytene banding pattern. This possibility i ha-ve used for the establishment of an experimental system to study the structural requirements for open chromatin formation. Therefor i have generated a condensed chromatin domain at ectopic positions. This condensed „model“ domain provides a defined genetic context for the targeted insertion of sequences of interest, excluding any variable position effects. This allows comarative analysis of different sequences in order to identify the structural requirements for open chromatin formation. For this purpose the 61C7/8 interband sequence was targetly integrated into the condensed „model“ domain by site-specific recombination. Thereby i could show that the 61C7/8 interband sequence maintains the capacity to form open chromatin cognizable by the splitting of the condensed „model“ domain. Furthermore the newly formed open chromatin domain also keeps epigenetic characteristica like transcriptional activity or the recruitment of typical proteins. By deletion analysis, i have mapped the essential region needed for open chromatin formation to a ~490bp fragment located in the proximal part of the 61C7/8 interband sequence. This fragment overlaps binding sites for characteristic proteins known to be involved in chromosomal domain formation like the chromatin protein Chriz, the histone kinase Jil1 or the insulator protein CP190. Furthermore the fragment overlaps a promoter region that locates between the Rev1 and Med30 genes.

Sugar beet and its wild relatives share a base chromosome number of nine and similar chromosome morphologies. Yet, interspecific breeding is impeded by chromosome and sequence divergence that is still not fully understood. Since repetitive DNAs are among the fastest evolving parts of the genome, we investigated, if repeatome innovations and losses are linked to chromosomal differentiation and speciation. We traced genome and chromosome-wide evolution across 13 beet species comprising all sections of the genera Beta and Patellifolia. For this, we combined short and long read sequencing, flow cytometry, and cytogenetics to build a comprehensive framework that spans the complete scale from DNA to chromosome to genome. Genome sizes and repeat profiles reflect the separation into three gene pools with contrasting evolutionary patterns. Among all repeats, satellite DNAs harbor most genomic variability, leading to fundamentally different centromere architectures, ranging from chromosomal uniformity in Beta and Patellifolia to the formation of patchwork chromosomes in Corollinae/Nanae. We show that repetitive DNAs are causal for the genome expansions and contractions across the beet genera, providing insights into the genomic underpinnings of beet speciation. Satellite DNAs in particular vary considerably between beet genomes, leading to the evolution of distinct chromosomal setups in the three gene pools, likely contributing to the barriers in beet breeding. Thus, with their isokaryotypic chromosome sets, beet genomes present an ideal system for studying the link between repeats, genomic variability, and chromosomal differentiation and provide a theoretical fundament for understanding barriers in any crop breeding effort.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune du système nerveux central (SNC) qui a une incidence plus élevée chez les femmes mais des résultats de maladie plus sévères chez les hommes. De plus, les cellules Th17 ont été identifiées comme des acteurs clés de l'auto-immunité du SNC. Par conséquent, dans cette thèse, nous avons étudié la dichotomie sexuelle dans la SEP en formulant l'hypothèse que les traits biologiques du sexe influencent la pathogénicité des cellules Th17, conduisant à des résultats de maladie divergents dans la SEP. En nous appuyant sur nos découvertes précédentes, où nous avons démontré que les cellules Th17 des souris 1C6 (qui possèdent un transgène TCR contre l'antigène de la myéline MOG [35-55]) induisent une SEP secondairement progressive (SPMS) chez les souris NOD.Scid dans un modèle de maladie chronique, nous avons observé qu'une proportion plus élevée de cellules Th17 mâles induisent une maladie plus sévère chez les receveurs comparativement aux cellules Th17 femelles (Doss et al. 2021). Pour évaluer le rôle des hormones sexuelles et des chromosomes sexuels sur les résultats divergents de pathogénicité des cellules Th17 dans ce modèle murin, nous avons utilisé le modèle de souris à quatre génotypes de base et l'avons croisé avec des souches de souris 1C6. Nos résultats révèlent des influences opposées des hormones sexuelles et des chromosomes sexuels sur la pathogénicité des cellules Th17. Plus précisément, la signalisation de la voie Wnt médiée par les androgènes a été trouvée pour réduire la pathogénicité des cellules Th17 mâles, tandis que le gène lié à l'X Suv39H1 a réduit la pathogénicité des cellules Th17 XX. De manière intéressante, nous avons découvert des différences de pathogénicité frappantes dans les cellules Th17 dérivées de souris génétiquement identiques avec des pères ayant des arrière-plans génétiques différents. Cela a conduit à l'identification de RunX2 comme un gène critique pour réduire la pathogénicité des cellules Th17 et a mis en évidence les effets possibles d'empreinte différentielle des pères transgéniques. Ensemble, notre thèse identifie les rôles multiformes des traits biologiques du sexe dans l'affectation de la pathogénicité des cellules Th17 dans le SNC. Ces résultats soulignent l'importance d'évaluer séparément les rôles des hormones sexuelles et des chromosomes sexuels dans la médiation des effets du sexe biologique sur les maladies auto-immunes. De plus, RunX2 et Suv39H1 peuvent être considérés comme des cibles médicamenteuses potentielles pour la SPMS, nécessitant une investigation plus approfondie. / : Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) that has a higher incidence in females but more severe disease outcomes in males. Additionally, Th17 cells have been identified as key players in CNS autoimmunity. Therefore, in this thesis, we investigated the sex dichotomy in MS by hypothesizing that biological sex traits influence the pathogenicity of Th17 cells, leading to divergent disease outcomes in MS. Building on our previous findings, where we demonstrated that Th17 cells from 1C6 mice (which have a TCR transgene against the myelin antigen MOG [35-55]) induce secondary progressive MS (SPMS) in NOD.*Scid* mice in a chronic disease model, we observed that a greater proportion of male Th17 cells induce more severe disease in recipients compared to female Th17 cells (Doss et al. 2021). To evaluate the role of sex hormones and sex chromosomes on the divergent pathogenicity outcomes of Th17 cells in this mouse model, we used the four-core genotype mouse model and crossed it with 1C6 mice strains. Our findings reveal opposing influences of sex hormones and sex chromosomes on the pathogenicity of Th17 cells. Specifically, androgen-mediated Wnt pathway signaling was found to reduce the pathogenicity of male Th17 cells, while the X-linked gene Suv39H1 reduced the pathogenicity of XX Th17 cells. Interestingly, we discovered striking pathogenicity differences in Th17 cells derived from genetically identical mice with sires having different genetic backgrounds. This led to the identification of RunX2 as a critical gene in reducing the pathogenicity of Th17 cells and highlighted the possible differential imprinting effects of the transgenic sires. Together, our thesis identifies the multilayered roles of biological sex traits in affecting the pathogenicity of Th17 cells in the CNS. These findings underscore the importance of separately evaluating the roles of sex hormones and sex chromosomes in mediating the effects of biological sex on autoimmune diseases. Additionally, RunX2 and Suv39H1 may be considered putative druggable targets for SPMS, warranting further investigation.

La division cellulaire est un processus fondamental des êtres vivants. À chaque division cellulaire, le matériel génétique d'une cellule mère est dupliqué et ségrégé pour produire deux cellules filles identiques; un processus nommé la mitose. Tout d'abord, la cellule doit condenser le matériel génétique pour être en mesure de séparer mécaniquement et également le matériel génétique. Une erreur dans le niveau de compaction ou dans la dynamique de la mitose occasionne une transmission inégale du matériel génétique. Il est suggéré dans la littérature que ces phénomènes pourraient causé la transformation des cellules cancéreuses. Par contre, le mécanisme moléculaire générant la coordination des changements de haut niveau de la condensation des chromosomes est encore incompris. Dans les dernières décennies, plusieurs approches expérimentales ont identifié quelques protéines conservées dans ce processus. Pour déterminer le rôle de ces facteurs dans la compaction des chromosomes, j'ai effectué un criblage par ARNi couplé à de l'imagerie à haute-résolution en temps réel chez l'embryon de C. elegans. Grâce à cette technique, j'ai découvert sept nouvelles protéines requises pour l'assemblage des chromosomes mitotiques, incluant la Ribonucléotide réductase (RNR) et Topoisomérase II (topo-II). Dans cette thèse, je décrirai le rôle structural de topo-II dans l'assemblage des chromosomes mitotiques et ces mécanismes moléculaires. Lors de la condensation des chromosomes, topo-II agit indépendamment comme un facteur d'assemblage local menant par la suite à la formation d'un axe de condensation tout au long du chromosome. Cette localisation est à l'opposé de la position des autres facteurs connus qui sont impliqués dans la condensation des chromosomes. Ceci représente un nouveau mécanisme pour l'assemblage des chromosomes chez C. elegans. De plus, j'ai découvert un rôle non-enzymatique à la protéine RNR lors de l'assemblage des chromosomes. Lors de ce processus, RNR est impliqué dans la stabilité des nucléosomes et alors, permet la compaction de haut niveau de la chromatine. Dans cette thèse, je rapporte également des résultats préliminaires concernant d'autres nouveaux facteurs découverts lors du criblage ARNi. Le plus important est que mon analyse révèle que la déplétion des nouvelles protéines montre des phénotypes distincts, indiquant la fonction de celles-ci lors de l'assemblage des chromosomes. Somme toute, je conclus que les chromosomes en métaphase sont assemblés par trois protéines ayant des activités différentes d'échafaudage: topoisomérase II, les complexes condensines et les protéines centromériques. En conclusion, ces études prouvent le mécanisme moléculaire de certaines protéines qui contribuent à la formation des chromosomes mitotiques. / Cell division is a fundamental process that continuously happens in all living organisms. In each cell division, genetic material of the parent cell duplicates and segregates to produce genetically identical daughter cells in a process called mitosis. Cells need to condense their genetic material to be able to partition them equally. Any subtle defects, either timing or compaction level, could lead to the unequal inheritance of genetic material, a phenomenon that is believed to be the leading cause of cancerous transformation. However, the precise molecular mechanisms underlying the coordinated changes of higher-order chromosome structure are poorly understood. In the last two decades, various approaches have identified several conserved factors required for chromosome condensation. To define the roles of known and novel factors in this process, I performed an RNAi based screen using high-resolution live imaging of the C. elegans one-cell embryo. Importantly, using an in vivo approach, I discovered seven novel factors required for mitotic chromosome assembly, including Ribonulceotide reducatase (RNR) and DNA topoisomerase II (topo-II). In this thesis, I report a structural role for topo-II in mitotic chromosome assembly and underlying molecular mechanisms. During chromosome condensation process, topo-II acts independently as a local assembly factor leading to global chromosome axis formation, contradicting models that chromosomes organize around preassembled scaffolds, thus representing a novel pathway for chromosome assembly in C. elegans. Furthermore, I also discovered a non-enzymatic role of RNR in the mitotic chromosome assembly process. During this process, RNR is involved in nucleosome stability, and thereby, it allows higher-order chromatin assembly. In this thesis, I also report preliminary data for other novel factors that I discovered in the RNAi based screen for factors involved in chromosome condensation. Importantly, my analyses revealed that the depletion of several proteins results in distinct chromosome condensation phenotypes, indicating that they function in discrete events during mitotic chromosome assembly. In sum, I conclude that metaphase chromosomes are built by the distinct scaffolding activities of three proteins: DNA topoisomerase II, condensin complexes and centromere proteins. Taken together, these studies provide underlying molecular mechanisms contributing to the mitotic chromosome formation.

The development of safe and efficient gene delivery systems in pluripotent human embryonic stem cells (hESc) is essential to realising their full potential for basic and clinical research. The purpose of this study was to develop an efficient, non-integrating gene expression system in pluripotent hESc using human artificial chromosomes (HAC). Similar to endogenous chromosomes, HAC are capable of gene expression, replication and segregation during cell division. Unlike retroviral-mediated gene delivery vectors, HAC do not integrate into the host genome and can encompass large genomic regions for the delivery of multiple genes. Despite the advantages HAC offer, their use has been limited due to laborious cloning procedures and poor transfection efficiencies, and thus only studied in immortalised and tumour-derived human cell lines. In this study, the high transduction efficiency of herpes simplex virus type-1 (HSV-1) amplicons was utilised to overcome the described difficulties and delivered HAC vectors into pluripotent hESc. Analysis of stable hESc clones showed that de novo gene-expressing HAC were present at high frequencies ranging from 10-70% of metaphases analysed, without integrating into the genome. The established HAC contained an active centromere, and were stably maintained without integration or loss in the absence of selection for 90 days. Stable HAC-containing hESc clones retained their pluripotency as demonstrated by neuronal differentiation, in vitro germ layer and teratoma formation assays. HAC gene expression persisted, with some variation, post-differentiation in the various deriving cell types. This is the first report of successful de novo HAC formation in hESc for gene expression studies. These findings show potential for delivering high-capacity genomic constructs safely and efficiently into pluripotent cells for the purpose of genetic manipulation and ultimately patient-specific somatic gene therapy.

Development of safe and efficient approaches for gene delivery in human embryonic stem cells (hESc) and particularly in human induced pluripotent stem (hiPS) cells, which can be derived in a person-specific manner, is considered to be imperative for harnessing their full potential in both the basic and applied research. The aim of this study was to evaluate the potential of human artificial chromosome (HAC) for gene delivery and expression in hESc and hiPS cells. HAC offers many potential advantages including the provision for carrying large genes with corresponding regulatory elements to obtain long-term regulated gene expression. In addition, they can replicate and segregate independently without integration into the host cell genome. To develop HAC in hiPS cells, the first part of the study was aimed at generating hiPS cells utilising the Herpes Simplex Virus (HSV)-1 amplicon system. With the use of EBNA-1/OriP retention elements incorporated into the HSV-1 amplicon vectors, hiPS cells completely free of vector and transgenes sequences were successfully derived from human embryonic fibroblasts. The hiPS cells exhibited proliferation and differentiation potential similar to that of hESc. In the second part of the study, development of HAC in hESc and hiPS cells was assessed by utilising the HSV-1 amplicon system to deliver the HAC DNA. Analysis of the hESc confirmed the presence of functional HAC which replicated the behaviour of the host chromosomes. Additionally, HAC generation did not lead to impairment in the developmental potential and pluripotency of hESc. The hiPS cells supported HAC at low frequency but DNA also integrated into the host chromosomes. The HAC system, therefore, needs further refinements to improve the frequency of HAC formation and reduce the chromosomal integration of HAC constructs in hiPS cells. Overall, these findings provide a simple and safe way of pluripotency induction and genetic modification of pluripotent stem cells using the HSV-1 amplicon system and represent an important advance towards patient specific gene and cell therapy.