An 100 Tumorproben mit HNSCC (head and neck squamous cell carcinoma) von 92 Patienten wurde mit Hilfe des FLAVINO-Assays erstmalig das Adhärenzverhalten von Plattenepithelzellen bei unterschiedlichen Beschichtungen untersucht und anschließend eine Ex-vivo-Chemoresponsetestung durchgeführt. Hierbei kamen als Beschichtungsproteine humanes Laminin [L], humanes Fibronektin [hFN], Kollagen I [K] aus Rattenschwänzen und eine vorteilhafte Mischung aus unterschiedlichen extrazellulären Proteinen [ECM] zur Anwendung. Zusätzlich wurde eine ECM-Platte noch mit 2,2 Gy einmalig bestrahlt. Ziel der Chemo-responsetestung war es, den Einfluss des Integrin-Inhibitor Cilengitide [Cil] auf HNSCC gegenüber den Standardtherapeutika Cisplatin [Cis], Docetaxel [DTX] und Cetuximab [Cetux] zu testen und letztendlich eine optimale Kombination zur Verbesserung der Prognose für HNSCC zu gewinnen. 41% der Tumorproben zeigten ein Koloniewachstum, wobei die höchste Koloniebildung auf der bestrahlten ECM-Beschichtung ausgezählt werde konnte, dicht gefolgt von der Kollagenbeschichtung. 10 µM Cil als Monotherapie konnten bei HNSCC eine Koloniereduktion von 23% erzielen, 66,6 µg/ml Cetux von 53% und beide in Kombination 55%. Cis als potente Monosubstanz in Verwendung 6,667 µM erzielten eine fast vollständige Koloniereduktion von 96%, wohingegen 550 nm DTX nur 66% Reduktion erreichten. In binärer, tertiärer und quartärer Kombination aller vier Chemotherapeutika ist nur eine komplette Koloniereduktion zu erreichen, wenn Cis in der Dosierung 6,667 µM verwendet wird. Cil in Kombination mit DTX, Cetux und Cis konnte nach zusätzlicher Bestrahlung eine 100%ige Koloniereduktion erreichen und kann somit als potenter Radiosensitizer angesehen werden.

An 100 Tumorproben mit HNSCC (head and neck squamous cell carcinoma) von 92 Patienten wurde mit Hilfe des FLAVINO-Assays erstmalig das Adhärenzverhalten von Plattenepithelzellen bei unterschiedlichen Beschichtungen untersucht und anschließend eine Ex-vivo-Chemoresponsetestung durchgeführt. Hierbei kamen als Beschichtungsproteine humanes Laminin [L], humanes Fibronektin [hFN], Kollagen I [K] aus Rattenschwänzen und eine vorteilhafte Mischung aus unterschiedlichen extrazellulären Proteinen [ECM] zur Anwendung. Zusätzlich wurde eine ECM-Platte noch mit 2,2 Gy einmalig bestrahlt. Ziel der Chemo-responsetestung war es, den Einfluss des Integrin-Inhibitor Cilengitide [Cil] auf HNSCC gegenüber den Standardtherapeutika Cisplatin [Cis], Docetaxel [DTX] und Cetuximab [Cetux] zu testen und letztendlich eine optimale Kombination zur Verbesserung der Prognose für HNSCC zu gewinnen. 41% der Tumorproben zeigten ein Koloniewachstum, wobei die höchste Koloniebildung auf der bestrahlten ECM-Beschichtung ausgezählt werde konnte, dicht gefolgt von der Kollagenbeschichtung. 10 µM Cil als Monotherapie konnten bei HNSCC eine Koloniereduktion von 23% erzielen, 66,6 µg/ml Cetux von 53% und beide in Kombination 55%. Cis als potente Monosubstanz in Verwendung 6,667 µM erzielten eine fast vollständige Koloniereduktion von 96%, wohingegen 550 nm DTX nur 66% Reduktion erreichten. In binärer, tertiärer und quartärer Kombination aller vier Chemotherapeutika ist nur eine komplette Koloniereduktion zu erreichen, wenn Cis in der Dosierung 6,667 µM verwendet wird. Cil in Kombination mit DTX, Cetux und Cis konnte nach zusätzlicher Bestrahlung eine 100%ige Koloniereduktion erreichen und kann somit als potenter Radiosensitizer angesehen werden.

Einleitung: Die zielgerichtete Therapie von Plattenepithelkarzinomen der Kopf-Hals-Region (HNSCC) durch simultanes Targeting von EGFR (epidermal growth factor-receptor) mit Cetuximab (E) und αVβ3 und αVβ5-Integrinen mit Cilengitide (Cil) könnte wegen dessen geringen Nebenwirkungen attraktiv sein. Wir analysierten die Koloniebildung epithelialer Zellen (CFec) und die Produktion pro-angiogener and pro-inflammatorischer Zytokine im Kurzzeit-Chemoresponsetest (FLAVINO). Methoden: Kollagenase-IV-verdaute Proben von 43 histopathologisch gesicherter HNSCC wurden in Laminin-beschichtete 96-well-Platten eingesät, die in Triplikaten E, Cil oder CilE in Endkonzentrationen von 66,7 µg/ml, 10 µM, und 66,7 µg/ml+10 µM enthielten. Kulturüberstände (KÜS) wurden nach 3 Tagen entnommen und adhärente Zellen Ethanol-fixiert. 39 HNSCC hatten CFec≥4/well. Interleukin 6 (IL-6), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein 1) und VEGF (vascular endothelial growth factor A) in KÜS wurden mit ELISA quantifiziert. Ergebnisse: CFec auf Laminin wurde durch Cil, E und CilE signifikant unterdrückt. Die Produktion von MCP-1, IL-6 und VEGF wurde ebenfalls vermindert. CilE bewirkte die stärkste Suppression von CFec, MCP-1 und VEGF. Die Wirksamkeit von CilE überstieg dabei diejenige von E oder Cil allein. Der überwiegend additiv gesteigerte aber bei manchen HNSCC ausbleibende Effekt zeigt starke Heterogenität in der Response verschiedener HNSCC auf. Die IL-6-Freisetzung wurde durch E und verstärkt durch CilE, aber nicht durch Cil allein signifikant supprimiert. Schlussfolgerung: Kombiniertes Targeting von EGFR und Integrinen mit CilE erhöht die suppressiven Effekte auf CFec und pro-angiogene und pro-inflammatorische Zytokine, welche potentielle Bedeutung als Biomarker für Response erlangen.:1 Einleitung 3 1.1 Integrine – multifunktionale Transmembranproteine 4 1.1.1 Erkennungsmerkmal RGD-Sequenz 5 1.1.2 Integrine αVβ3 und αVβ5 sowie deren Rolle in Tumorangiogenese und Metastasierung 5 1.2 Cilengitide – ein Integrin-Inhibitor 6 1.3 Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor 8 1.3.1 Die Rolle des EGFR bei Tumoren 9 1.3.2 Cetuximab - ein EGFR-Inhibitor 10 1.4 Tumore der Kopf-Hals-Region und deren Biomarker 11 1.4.1 Therapie von Kopf-Hals-Tumoren 12 1.4.2 Klinische Erprobungen von Cilengitide 12 1.4.3 Targeted Therapie mit Cetuximab bei Kopf-Hals-Tumoren 13 1.4.4 Biomarker bei HNSCC 15 1.4.5 Interleukin 6 16 1.4.6 Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor A – VEGF-A 17 1.4.7 Monozyten-Chemoattraktor Protein 1 – MCP-1 19 1.5 Chemoresponsetestung ex vivo 21 1.5.1 Der koloniebildende Kurzzeit-Chemoresponsetest FLAVINO 22 1.5.2 Flavin-induzierte photodynamische Degeneration 22 1.5.3 Ablauf des FLAVINO-Chemoresponsetests 23 1.6 Aufgabenstellung und neue Erkenntnisse 24 2 Publikationen 26 2.1 Abstract zum Vortrag zur 84. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde und Kopf- und Hals-Chirurgie 27 2.2 Publikation bei Anticancer Research 28 2.3 Abstract zum Beitrag zur 88. Jahrestagung der deutschen Gesellschaft für Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde und Kopf- und Hals-Chirurgie 36 3 Zusammenfassung 37 4 Literaturverzeichnis 41 5 Anlagen 49 5.1 Erklärung über die eigenständige Verfassung der Arbeit 49 5.2 Darstellung des Eigenanteils 50 5.3 Lebenslauf 52 5.4 Danksagung 53

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Multivalente Wechselwirkungen spielen sowohl in der Natur als auch für die Konstruktion hochaffiner Binder eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit wurde die Grenze der Bivalenz in Bezug auf den Bindungsabstand, die monovalente Interaktionsstärke und die Flexibiltät des Gerüsts untersucht. Die Modifizierung von DNA mit Cucurbit[7]uril und zwei verschiedenen Adamantananaloga (Ad1 und Ad2) sowie die Verwendung verschiedener Template, ermöglichte die Konstruktion diverser bivalenter Modellsysteme. Die Ergebnisse zeigten eine Distanzabhängigkeit des bivalenten Effekts, der mit dem Bindungsabstand abnahm. Im Gegensatz zum schwächeren Binder (Ad2), war der stärkere Binder (Ad1) in der Lage auch noch bei großen Abständen von einer bivalenten Verstärkung zu profitieren. Somit besteht eine Abhängigkeit des bivalenten Effekts von der monovalenten Bindungsstärke. Mit diesem System wurde anschließend untersucht, unter welchen Bedingungen bivalente Systeme multimolekulare Strukturen ausbilden. Es konnte gezeigt werden, dass verbrückende Strukturen nur bei hohen Konzentrationen und bei Abwesenheit eines bivalenten Effekts vorliegen können. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein bispezifischer Binder auf seine Affinität, Selektivität und auf seinen Einfluss auf die Rezeptoraktivität untersucht. Dafür wurden Oligonukleotide mit Cilengitid, welches αvβ3-Integrin binden kann, und mit einem Peptoid, welches VEGFR2 binden kann, modifiziert. Durch Verwendung verschiedener Template konnten bispezifische Binder mit unterschiedlichen Ligandenabständen konstruiert werden. Messungen an HUVEC-Zellen ergaben eine höhere Affinität der bispezifischen Binder im Vergleich zu den monospezifischen. ELISA-Messungen ergaben eine distanzabhängige Aktivierung oder Deaktivierung der Phosphorylierung von VEGFR2. Es konnte somit ein Modellsystem konstruiert werden, mit dem die Rezeptoraktivität gesteuert werden konnte. / Multivalent interactions play an important role in nature and are also used to construct high-affinity binders. In this work the limit of bivalency based on binding distance, flexibility of the system and monovalent binding-strength was investigated. Modification of DNA with Cucurbit[7]uril (CB[7]) and two adamantane-analogues (Ad1 and Ad2), along with the use of different templates, enabled the construction of diverse bivalent model-systems. The results revealed a distance-dependency of the bivalent effect, which decreased with increasing binding distance. The stronger binder (Ad1) was able to benefit from bivalent enhancement at relatively large binding distances compared to the weaker binder (Ad2). This denotes a dependency of the bivalent effect on the monovalent binding strength. The same system was used to investigate the factors leading to crosslinking. The results show that only at high concentrations, and when the system does not have to compete with a bivalent enhancement, can multimolecular structures be formed. The second part of this work deals with a bispecific binder. Binding affinities, selectivity and the impact of the binder on receptor activity were tested. Accordingly, oligonucleotides were modified with cilengitide, which is able to bind αvβ3-Integrin, and with a bivalent peptoid, which binds to VEGFR2. The use of different DNA templates enabled construction of several bispecific binders with different binding distances. Measurements with HUVEC cells revealed higher affinities of the bispecific binders compared to the monospecific ones. ELISA-measurements demonstrated that activation or deactivation of the VEGFR2-phosphorylation was distance dependent. Consequently, a model system was constructed which was able to control receptor activity.