Le moment, la qualité et la quantité de sommeil dépendent de l'interaction fine entre l'horloge circadienne et la machinerie homéostatique (Borbely A. et al., 1982, Daan S. et al., 1984, Borbely et Achermann, 1999). Au cours des dernières années, l'utilisation de divers organismes modèles a fourni de nouvelles perspectives sur les mécanismes neuronaux et moléculaires de la régulation du sommeil (Miyazaki S. et al., 2017). Cependant, les bases moléculaires de l'homéostasie du sommeil et les circuits neuronaux sous-jacents à son interaction avec le réseau circadien n'ont pas été établis en détail.Dans ce travail de thèse, j'ai utilisé la mouche Drosophile melanogaster comme système modèle pour étudier la fonction d'un sous-ensemble de neurones d'horloge, les DN1ps, dans la mise en place du sommeil. Des études antérieures ont suggéré un rôle de ces neurones circadiens dans la régulation du sommeil (Kunst et al., 2014, Guo et al 2016, Lamaze et al., 2017, Guo et al., 2017). J’ai ainsi démontré que les cellules d'horloge DN1ps DH31 (+) CRY (+) sont impliquées dans la suppression du sommeil. Par ailleurs, j’ai mis en évidence un circuit en aval des DN1ps, qui comprend le groupe dopaminergique postérieur apparié latéral 1 (PPL1) et les neurones dorsaux en forme d’éventail (dFSB), un centre homéostatique récemment décrit pour la régulation du sommeil chez la drosophile (Donlea JM et al., 2011, Liu S. et al., 2012, Ueno et al., 2012, Donlea JM et al., 2014, Pimentel et al., 2016, Qian et al., 2017, Donlea JM. et al., 2018). Nos résultats indiquent que la suppression du sommeil nocturne nécessite la signalisation DH31-R2 dans une sous-population des neurones dopaminergiques PPL1, qui projette au dFSB. Fait intéressant, la perte de sommeil de jour et de nuit médiée par les DN1ps dépend de l'inhibition du dFSB. Néanmoins, nous suggérons que les neurones DN1ps CRY (-) favoriseraient le sommeil, en concordance avec d'autres travaux (Guo et al., 2016; Guo et al., 2017).Ces résultats fournissent de nouvelles données sur le lien entre l'horloge circadienne et l'homéostasie du sommeil, impliqué dans la régulation du comportement sommeil-éveil chez Drosophile melanogaster. / The timing, quality and quantity of sleep depend on the fine interaction between circadian clock and homeostatic machinery (Borbely A. et al., 1982; Daan S. et al., 1984; Borbely and Achermann, 1999). In the recent years, the employment of various model organisms has provided new insights into the neuronal and molecular mechanisms of sleep regulation (Miyazaki S. et al., 2017). However, the molecular basis of the sleep homeostat and the neuronal circuitry underlying its interaction with the circadian network haven’t been established in details.In this work, I use the fruit fly Drosophila melanogaster as a model system to investigate the sleep function of a subset of clock neurons, the DN1ps. Previous studies have already suggested a sleep-regulating role for these circadian neurons (Kunst et al. 2014, Guo et al. 2016; Lamaze et al., 2017; Guo et al. 2017). Here, we report the DH31-positive CRY-positive DN1ps as sleep suppressing clock cells. Furthermore, we identify a sleep-relevant circuit downstream of the DN1ps which includes the paired posterior lateral 1 (PPL1) dopaminergic cluster and the dorsal Fan-shaped body projecting (dFSB) neurons, a recently described homeostatic center for sleep regulation in Drosophila (Donlea JM. et al., 2011; Liu S. et al., 2012; Ueno et al., 2012; Donlea JM. et al., 2014; Pimentel et al., 2016; Qian et al., 2017; Donlea JM. et al., 2018). Our results indicate that the night-time sleep suppression requires DH31-R2 signaling in the PPL1-to-dFSB dopaminergic neurons. Interestingly, both day and night-time DN1ps-mediated sleep loss rely on the inhibition of the dFSB. Nevertheless, we suggest the CRY-negative DN1ps as sleep promoting clock neurons, in concordance with other works (Guo et al. 2016; Guo et al. 2017).These findings provide a novel link between circadian clock and sleep homeostat, in the regulation of sleep-wake behavior in Drosophila melanogaster.

Every fall, Northeastern America monarch butterflies (Danaus plexippus) undergo an extraordinary migration to their overwintering site in Central Mexico. During their long migration, monarch migrants use sun compass to navigate. To maintain a southward flying direction, monarch migrants compensate for the continuously changing position of the sun by providing timing information to the compass using their circadian clock. Animal circadian clocks depend primarily on a negative transcriptional feedback loop to track time. I started my work to re-construct the monarch butterfly circadian clock negative feedback loop in cell culture, focusing on homologs of Drosophila clock genes. It turned out that in addition to a Drosophila-like cryptochrome (cry1) gene, a second mammalian-like cry2 gene exists in monarch butterflies and many other insects, except in Drosophila. The two CRYs showed distinct functions in our initial assays in cultured Drosophila Schneider 2 (S2) cells. CRY2 functions as a potent transcriptional repressor, while CRY1 is light sensitive but shows no obvious transcriptional activity. The existence of two cry genes in insects changed the Drosophila-centric view of insect circadian clock. During the course of my study, our lab obtained a monarch cell line called DpN1 cells. These cells possess a light-driven clock and contributed tremendously to the research on monarch circadian clock. Using this cell line, I provided strong evidence supporting monarch CRY2’s role as a major circadian clock repressor and identified a protein-protein protective interaction cascade underlying the CRY1-mediated resetting of the molecular oscillator in DpN1 cells. I continued my work trying to understand how insect CRY2 inhibits transcription. I provided evidence suggesting the involvement of monarch PER in promoting CRY2 nuclear entry in both S2 cells and DpN1 cells. Finally, I mapped CRY2’s transcriptional inhibitory activity onto its N-terminal domain. Collectively, my research helped to change our view of insect clocks from a Drosophila-centric standpoint to a much more diverse picture. My studies also advanced the understanding of monarch circadian clock mechanism, and provides a foundation for further studies.

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Hämoxygenasen (HO) katalysieren unter der Aufnahme von molekularen Sauerstoff und der Freisetzung von Kohlenmonoxid (CO) und Eisen (Fe2+) die Oxidation von Häm zu Biliverdin. HO-1, eine induzierbare Isoform der HO, wird durch ihre Aktivität mit zellschützenden, antiinflammatorischen und antiapoptotischen Eigenschaften in Verbindung gebracht. Dabei gilt insbesondere das CO als Mediator dieser Eigenschaften. Die molekularen Wechselwirkungen und genregulatorischen Funktionen von CO sind allerdings noch weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurden mittels cDNA Microarray-Technologie Gene identifiziert, die in der murinen Leber nach Inhalation von CO oder nach pharmakologischer Induktion von mHO-1 eine differentielle Expression der mRNA aufwiesen. Diese Gene konnten in einen Zusammenhang mit der circadianen Uhr gebracht werden und führten zu der Hypothese, dass CO einen direkten Einfluss auf den molekularen Oszillator der Inneren Uhr hat. Dies konnte in primären Hepatozyten durch eine veränderte circadiane Expression der essentiellen Uhrgene mPer2 und mRev-erba nach CO-Behandlung bestätigt werden. Weiterhin wurde für mHo-1 eine, bisher unbekannte, circadian regulierte Genexpression in primären Hepatozyten und der murinen Leber gezeigt. Es konnte die Funktionalität einer speziesübergreifend, konservierten E-Box im Promotor von mHo-1 nachgewiesen werden, die diese Regulation initiieren kann. Bezüglich der circadianen Oszillation von essentiellen Komponenten der circadianen Uhr zeigten mHo-1 Knockout-Fibroblasten eine veränderte Genexpression. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren eine enge Kopplung des Häm-Metabolismus mit der circadianen Uhr. HO-1 scheint dabei in diesem regulativen Netzwerk eine funktionale Rolle zu spielen. Einerseits könnte diese Verbindung eine weitere Kommunikation der circadianen Uhr mit metabolischen Prozessen darstellen und bietet andererseits eine neue Sichtweise bezüglich der Aufklärung der zellschützenden Eigenschaften von HO-1. / Heme oxygenases (HO) catalyze the oxidation of heme and generate the bile pigment biliverdin, ferric iron and carbon monoxide (CO). Endogenous produced CO, especially due to the activity of the inducible isoform HO-1, has been associated with cytoprotective, anti-inflammatory and –apoptotic functions. CO is a signalling molecule, but the molecular interactions and gene regulatory functions are still unknown. In the present thesis a cDNA microarray identified genes in murine liver which were expressed differentially after inhalation of CO and pharmacological induction of HO-1. Interestingly, the expression of the candidate genes is directly controlled by the molecular circadian clockwork, and led to the hypothesis that CO has an influence on the molecular oscillator of the circadian clock. It was shown, that CO influences the gene expression of essential clock genes in primary hepatocytes. Furthermore, it was demonstrated that the gene expression and activity of mHO-1 is circadian regulated in primary hepatocytes and liver, and is reasonably based on a functional E-box in the promoter of the mHO-1 gene. The deficiency of HO-1 in HO-1 knockout mice displayed differential gene expression profiles in magnitude and amplitude of the circadian oscillations of essential clock and output genes. In this work it was shown, that the heme metabolism is coupled very close to the molecular circadian oscillator. HO-1 plays a functional role in the regulation of this regulatory network, which could provide insights into the understanding of cytoprotective properties of HO-1.

Die zirkadiane Uhr ist ein endogenes Zeitmesssystem, das die Anpassung physiologischer Prozesse an die geophysikalische Zeit ermöglicht. Die zirkadiane Uhr besteht aus einem zentralen Schrittmacher und peripheren Uhren in jeder Zelle. Bei Säugern ist eine bestimmte Anzahl von Uhr-Genen in regulatorischen Schleifen miteinander verbunden, wodurch Oszillationen in der Expression der Uhr-Gene sowie in zahlreichen Zielgenen erzeugt werden. Zielgene der zirkadianen Uhr sind unter anderem an zellulären Prozessen beteiligt, die eine Rolle bei der Tumorentstehung und -progression spielen. Funktionsstörungen der zirkadianen Uhr stehen im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheitsbildern, unter anderem Krebs. Ziel dieses Projekts war es, die Rolle der zirkadianen Uhr bei der Tumorentstehung und entwicklung zu untersuchen. Der Fokus lag dabei auf tumorspezifischen Stoffwechselwegen. Die Rolle einer deregulierten zirkadianen Uhr wurde in einem in vitro Zellmodel untersucht. Die SW480 Zelllinie wurde aus einem Primärtumor isoliert und die SW620 Zelllinie aus einer Lymphknotenmetastase desselben Patienten. Die untersuchten Zelllinien zeigten deutliche Unterschiede in Bezug auf ihre Uhr Phänotypen mit globalen Konsequenzen auf oszillierende Gene und Stoffwechselwege. Die Runterregulation des Uhrgens Bmal1 führte in SW480 Zellen zu einem metastatischen Phänotyp, der stark dem von SW620 Wildtypzellen ähnelte. Darüber hinaus führte die Runterregulation von Bmal1 zu einer Veränderung des metabolischen Phänotyps und zu einer modifizierten Antwort auf die Behandlung mit einem Glykolyseinhibitor. Die in diesem Projekt erzielten Ergebnisse unterstützen die postulierte Rolle von Bmal1 als Tumorsuppressor und verdeutlichen das reziproke Wechselspiel zwischen der zirkadianen Uhr und dem Stoffwechsel von Krebszellen und zeigen mögliche Auswirkungen einer deregulierten Uhr auf den Zellmetabolismus während der Tumorentwicklung. / The circadian clock is an internal timing system that allows the entrainment of physiological and behavioural processes to the geophysical time with a periodicity of about 24 hours. It consists of a central pacemaker and peripheral clocks in every cell. In mammals, a distinct set of genes is interconnected in regulatory feedback loops, thereby generating oscillations in gene expression in the core-clock itself as well as in many target genes. Clock target genes are, among others, involved in cellular processes connected to tumour development and progression, including metabolic pathways, drug response pathways and the cell cycle. Malfunctions of the circadian clock are associated with different pathologies including cancer. The aim of this project was to study the role of the circadian clock in tumour development and progression with a focus on cancer metabolism and treatment response. The role of a deregulated clock was investigated in SW480 cells derived from a primary tumour and SW620 cells derived from a lymph node metastasis of the same patient. The investigated cell lines showed clear differences with respect to their clock phenotypes with consequences on global oscillating gene expression and alterations in metabolic pathways. A knockdown of the core-clock gene Bmal1 in SW480 cells induced a metastatic phenotype similar to SW620 wild type cells, as indicated by faster proliferation, lower apoptosis rate and a highly energetic metabolic phenotype. Furthermore, Bmal1-KD induced metabolic phenotype rewiring as seen by altered glycolytic activity and mitochondrial respiration and modified treatment response to metabolism-targeting anticancer treatment. The results obtained in this project reinforce the postulated role of Bmal1 as a tumour suppressor and elucidate a reciprocal interplay between the circadian clock and cancer metabolism with implications in metabolic phenotype rewiring during tumour progression.

In Übereinstimmung mit dem Tag-Nacht-Zyklus steuert die zirkadiane Uhr wichtige zelluläre Prozesse in Gesundheit und Krankheit. Bei der Krebsbehandlung beeinflusst sie die Pharmakokinetik und -dynamik von Medikamenten, was zu tageszeitabhängigen Nebenwirkungen und Tumorreaktionen führt. Daher verspricht die Chronotherapie, bei der die Medikamentengabe auf den Tagesrhythmus abgestimmt wird, verbesserte Behandlungsergebnisse. Trotz dieses Potenzials bleibt die klinische Umsetzung durch ein unzureichendes Verständnis der Rolle der zirkadianen Uhr bei verschiedenen Krebsarten, der optimalen Behandlungszeiten und zugrunde liegenden zellulären Determinanten begrenzt. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit diesen offenen Fragen, indem sie die zirkadiane Uhr in zahlreichen Brustkrebs-Zellmodellen und ihren Einfluss auf das Behandlungsansprechen charakterisiert. Mit dualen Echtzeit-Reportern für die zirkadiane Uhr konnten wir verschiedene zirkadiane Dynamiken identifizieren, sogar bei aggressiven dreifach-negativen Brustkrebszellen, und neue zirkadiane Subtypen definieren. Darüber hinaus konnten wir Zusammenhänge zwischen zirkadianen Eigenschaften und Medikamentenreaktionen nachweisen und so Wirkstoffe identifizieren, die für chronotherapeutische Anwendungen in Frage kommen. Schließlich haben wir eine Hochdurchsatz-Methode entwickelt, die Live-Imaging mit fortschrittlichen Computeranalysen kombiniert, um zeitabhängige Arzneimittelreaktionen zu erfassen. Dies ermöglicht die Identifizierung optimaler Behandlungszeitpunkte und ansprechender Arzneimittel-Zell-Kombinationen und offenbart zelluläre und genetische Faktoren, die diese zeitabhängigen Effekte beeinflussen. Auch wenn unsere Ergebnisse nicht direkt klinisch anwendbar sind, verdeutlichen sie den Einfluss der zirkadianen Uhr auf die Medikamentenreaktionen in Brustkrebsmodellen und zeigen das Potenzial der Chronotherapie für die Präzisionsbehandlung von Brustkrebs auf. / In alignment with the day-night cycle, the circadian clock governs key cellular processes in health and disease. In cancer treatment, circadian rhythms influence drug pharmacokinetics and pharmacodynamics, creating time-dependent variations in side effects and tumor responses. Hence, circadian-aligned drug treatments, known as chronotherapy, promise to improve treatment outcomes for numerous already existing anti-cancer drugs. Despite this potential, clinical implementation remains limited by insufficient understanding of the circadian clock’s role across cancer types, optimal drug treatment times, and cellular determinants of time-dependent responses. This thesis addresses these standing questions by characterizing the circadian clock across multiple breast cancer cell models and its impact on treatment responses. Using dual real-time circadian reporters, we identified diverse circadian dynamics, even in aggressive triple-negative breast cancer cells. This led us to define novel circadian-based subtypes that challenge conventional classifications. We further demonstrate associations between circadian properties and drug sensitivity across multiple compounds, elucidating drugs that could be investigated for chronotherapeutic applications. Finally, we developed a high-throughput methodology combining live imaging with advanced computational analyses to capture time-dependent drug responses, enabling identification of optimal treatment times and responsive drug-cell combinations in both healthy and cancer cells, and revealing cellular and genetic factors influencing these time-dependent effects. While not immediately applicable clinically, this work illuminates how circadian properties in breast cancer models influence both overall drug sensitivity and time-dependent response dynamics, highlighting timing as a critical factor in treatment efficacy and demonstrating the potential of chronotherapy for advancing precision breast cancer therapy.

Cette thèse est dédiée au développement d’un modèle mathématique multi-échelle pour la régulation du cycle cellulaire par l’horloge circadienne. Ceci est motivé par le fait que plusieurs études ont montré un lien direct entre certains cancers et un dysfonctionnement du mécanisme de l’horloge circadienne. Le but est de comprendre l’effet des rythmes circadiens et leur perturbation sur la prolifération d’une population de cellules / This thesis is dedicated to the development of a multiscale mathematical model that describes the regulation of the cell cycle by the circadian clock. What motivated this work is the fact that several tumorigenic diseases are linked to circadian rhythms disruption. We would like to understand the effect of circadian rhythms on the proliferation of a cell population and hence give plausible explanation for diseases that arise form circadian clock disruption. The mammalian cell cycle and the circadian clock are two molecular processes that operate in a rhythmic manner and exquisite precision. On one hand, the cell cycle is driven by the rhythmic activity of cyclin dependent kinases which dictate the time a cell must engage mitosis and the time it must divide giving birth to two daughter cells. On the other hand, the circadian clock is a system of transcriptional and translational feedback-loops that generates sustained oscillations of different mRNAs and proteins with a period of approximately 24 h. It turns out that several components of the circadian clock regulates various cyclin-dependent kinases at different stages of the cell cycle. This makes the circadian clock a key player of the temporal organization of the cell cycle and makes these two biological processes act as two tightly coupled oscillators. Our modeling approach consists of using a molecular-structured partial differential equation that describes the proliferation of a cell population. Proliferation depends on the coupled cell cycle-circadian clock molecular state of cells. Due to the large number of molecular components involved in the cell cycle-circadian clock system, the problem becomes of high-dimensionality and specific numerical techniques are needed to solve the equation

L’agence internationale de recherche sur le cancer (IARC) a indiqué que le travail posté qui provoquait une disruption circadienne était probablement cancérogène chez l’Homme. Ainsi, une perturbation expérimentale sévère du système circadien accélère-t elle la progression tumorale et pourrait favoriser la cancérogénèse. Durant ma thèse, j’ai démontré que la disruption circadienne résultant d’une mutation ou d’une mise au silence des gènes de l’horloge Per ou Cry accélérait la cancérogénèse hépatique induite par la diéthylnitrosamine, en favorisant l’instabilité génomique, la prolifération cellulaire, et l’inflammation. J’ai montré que l’alimentation programmée ou la dexaméthasone modifiaient la régulation circadienne de ces trois caractéristiques du cancer, suggérant ainsi qu’une intervention thérapeutique ciblant le système circadien pourrait prévenir la cancérogénèse. J’ai ainsi mis en évidence le contrôle circadien de trois mécanismes moléculaires de la cancérogenèse précoce et proposé deux interventions ciblant l’horloge circadienne dans un but de prévention de la cancérogenèse. / The International Agency for Research on Cancer (IARC) concluded that “shift-work that involves circadian disruption is probably carcinogenic to humans”. Severe disruption alteration accelerated tumor progression and enhanced carcinogenesis. During my PhD, I demonstrated that circadian disruption resulting from mutation of Per and Cry clock genes accelerated liver carcinogenesis induced by diethylnitrosamine through promoting genomic instability, cellular proliferation, and inflammation. I showed that meal timing or dexamethasone altered circadian regulation of these three characteristics of cancer, suggesting a therapeutic intervention targeting the circadian system could prevent carcinogenesis. I have thus demonstrated the circadian control of three molecular mechanisms of early carcinogenesis and proposed two interventions targeting the circadian clock for liver carcinogenesis prevention.

La chronothérapie des cancers administre les médicaments anticancéreux à des moments précis de la journée afin d’en optimiser la tolérance et l’efficacité. Cependant le système circadien qui règle sur 24 h la prolifération et le métabolisme cellulaires peut être altéré par un décalage horaire chronique, la mutation d’un gène de l’horloge, ou un traitement, favorisant ainsi la survenue de pathologies métaboliques, comportementales ou malignes. La disparité des profils circadiens de température corporelle des patients cancéreux ainsi que leurs modifications sous chimiothérapie fournit les bases d’une personnalisation de la chronothérapeutique. La capacité d’un cycle thermique à entraîner sur 24 h l’horloge circadienne de cellules d’hépatocarcinome en culture indique que ce biomarqueur est aussi un effecteur de la synchronisation des cellules cancéreuses, et constitue un repère circadien pour la chronothérapeutique in vitro et in vivo. / Chronotherapy delivers anticancer drugs at specific times of the day to optimize tolerability and efficacy. However, the circadian system that controls cell proliferation and metabolism over 24 h, can be altered by a chronic jet lag, a clock gene mutation, or a xeniobiotic treatment, thus favoring the occurrence of metabolic, behavioral or malignancies. The disparity of circadian body temperature patterns of cancer patients as well as its disruption during the treatment provides a clincher for chronotherapy personalization. The ability of a thermal cycle to drive the circadian clock in cultured hepatocarcinoma cells of 24 h indicates that this biomarker is also an effector of the synchronization of cancer cells, as well as a marker for the circadian in vitro and in vivo chronotherapeutic.