La hipertensió portal és una síndrome clínica que representa la principal complicació de la cirrosi hepàtica i es caracteritza per un increment patològic de la pressió hidrostàtica del sistema venós portal. Bona part de les complicacions derivades de la cirrosi hepàtica, estan directament relacionades amb la presència d'hipertensió portal clínicament significativa. A causa de la gravetat d'aquestes complicacions, la hipertensió portal representa la primera causa de morbimortalitat en malalts cirròtics.La pressió portal ve determinada per la interrelació entre el flux sanguini portal i la resistència que s'oposa a aquest flux. L'augment de la resistencia vascular intrahepàtica (RVI) constitueix el fenomen fisiopatològic primari de la hipertensió portal.Amb l'objectiu de caracteritzar el component dinàmic de la RVI, s'han estudiat quins són els elements contràctils intrahepàtics i si en la cirrosi existeixen anormalitats en la regulació dels mecanismes de contracció cel·lular. Fins a l'actualitat s'han descrit diversos tipus de cèl·lules hepàtiques amb capacitat contràctil com els miofibroblasts portals i septals i les vènules portals, però majoritàriament s'ha postulat que les principals cèl·lules involucrades en la regulació del to vascular hepàtic són les cèl·lules hepàtiques estrellades.S'han descrit un ampli ventall de molècules amb capacitat vasomotora com a moduladores de la RVI en la cirrosi. Aquestes substàncies poden procedir de la circulació sistèmica (com l'angiotensina II o la vasopressina), poden originar-se a l'endoteli i actuar de forma paracrina (com l'òxid nítric (ON), la prostaciclina (PGI2) o l'endotelina) o tenir un origen neuronal (norepinefrina).El to vascular en condicions normals és el resultat d'un delicat balanç entre diversos mediadors vasoactius. En la circulació hepàtica en la cirrosi existeix un marcat desequilibri en la producció i concentració d'aquests mediadors vasoactius: els nivells de vasoconstrictors es troben elevats (com l'endotelina o el prostanoid derivat de la ciclooxigenasa 1 (COX-1): tromboxà A2) i els nivells de vasodilatadors estan reduïts (principalment l'ON). A més, s'ha demostrat que els fetges cirròtics presenten una hiperresposta als estímuls vasoconstrictors i una hiporesposta als vasodilatadors.S'ha demostrat que en el fetge cirròtic, la biodisponibilitat d'ON es troba disminuïda, la qual cosa es considera un factor fonamental per a promoure l'augment de RVI.Diversos estudis, a través d'estratègies experimentals ben diferents, han aconseguit incrementar la producció hepàtica d'ON reduint així la RVI i la pressió portal de rates amb cirrosi sense modificar la pressió arterial.En els últims anys s'ha posat de manifest el paper de l'estrès oxidatiu i de les ROS en el control del to vascular i en el desenvolupament de disfunció endotelial de diverses malalties vasculars com la hipertensió, l'arteriosclerosi o la diabetes. L'estrès oxidatiu també juga un paper fisiopatològic en la progressió de malalties hepàtiques. Una altra qüestió important de les ROS, concretament de l'anió O2-, és la seva capacitat per a reaccionar amb l'ON, donant lloc a la producció de ONOO-, contribuint així a disminuir la biodisponibilitat d'ON. El paper de l'estrès oxidatiu i la seva capacitat per modular la biodisponibilitat d'ON, així com l'ús terapèutic d'antioxidants en diverses malalties vasculars, ha estat àmpliament avaluat per nombrosos estudis en pacients i en models experimentals. En canvi, en la hipertensió portal en la cirrosi, aquests elements ho han estat avaluats. Els treballs de recerca de la present tesi estan globalment orientats a ampliar el coneixement dels mecanismes moleculars responsables de l'augment del component dinàmic de la RVI en la cirrosi, concretament el paper de l'estrès oxidatiu i la seva implicació en la modulació de la biodisponibilitat d'ON. Articles tesi:1. Increased oxidative stress in cirrhotic rat livers: A potential mechanism contributing to reduce nitric oxide bioavailability.Gracia-Sancho J*, Laviña B*, Rodríguez-Vilarrupla A, García-Calderó H, Fernández M, Bosch J, García-Pagán JC.Hepatology 2008 Apr;47(4):1248-56. 2. Superoxide dismutase gene transfer reduces portal pressure in CCl4 cirrhotic rats with portal hypertensionLaviña B, Gracia-Sancho J, Rodríguez-Vilarrupla A, Chu Y, Hesitad DD, Bosch J, García-Pagán JC. Gut 2009; 58: 118-125. / Increased resistance to portal blood flow is the primary factor in the pathophysiology of portal hypertension, the main complication of cirrhosis. Architectural alterations of the liver parenchyma, but also a dynamic increase in the hepatic vascular tone contribute to the increased resistance to portal blood flow of cirrhotic livers. The increase in hepatic vascular tone is partly due to increased release of cyclooxygenase-1 (COX-1)-derived vasoconstrictive prostanoids and to a reduced bioavailability within the liver of the potent vasodilator nitric oxide (NO). Both mechanisms favouring the contraction of different elements within the cirrhotic liver. Indeed, activated hepatic stellate cells have been shown to contract or relax in response to vasoconstrictive prostanoids or NO respectively.Reduced NO bioavailability has been attributed to decreased endothelial nitric oxide synthase (eNOS) activity secondary to several disturbances in the posttranslational regulation of the enzyme.In several vascular disorders the potential of ROS to bind proteins, break DNA and promote cell damage by reacting with several cellular components has been involved in development of necrosis, inflammation, and apoptosis. In addition, an increase in the reactive oxygen specie superoxide (O2-), by rapidly reacting with NO, promotes a marked reduction in NO bioavailability followed by an increase in vascular tone.An increase in O2- levels due to increased production by xanthine oxidase (XO), NADPH oxidase or COX, among other enzymatic systems, and a reduced O2- scavenging by superoxide dismutase has been suggested to play a pathophysiological role in different liver disorders such as in alcoholic and non-alcoholic liver disease.Gene transfer of SOD has been shown to protect against oxidative stress and to improve endothelium-dependent relaxation in several situations, including myocardial infarction, liver transplantation, hypertension, diabetes , and aging. We hypothesize that in cirrhotic livers increased O2-, by reacting with NO, would contribute to reduce NO bioavailability. As a consequence, removing O2- from the cirrhotic livers could be a new therapeutic strategy to improve intrahepatic NO bioavailability, improve hepatic endothelial dysfunction and reduce portal pressure in rats with cirrhosis and portal hypertension.

ANTECEDENTES: El diagnóstico precoz del carcinoma hepatocelular es la única opción para poder aplicar tratamientos radicales potencialmente curativos. Por este motivo es necesario desarrollar diferentes técnicas que permitan realizar el diagnóstico precoz.HIPÓTESIS: La vascularización predominantemente arterial del CHC determina un patrón vascular específico caracterizado por intensa captación de contraste en fase arterial seguida de lavado de contraste en fase venosa. De acuerdo a unos criterios propuestos por la AASLD y basados en opinión de expertos, es posible realizar el diagnóstico concluyente de CHC sin necesidad de confirmación histológica si se objetiva este patrón vascular mediante técnicas de imagen dinámicas (RM, TC y eco con contraste (US-C)). En el caso de nódulos entre 1 y 2 cm se recomienda demostrar este patrón de forma coincidente en dos pruebas dinámicas. OBJETIVOS: Determinar la capacidad diagnóstica de la RM de última generación y US con contrastes de segunda generación para el diagnóstico de lesiones con un tamaño < 2 cm en pacientes con cirrosis hepática, con especial énfasis en el diagnóstico diferencial con el colangiocarcinoma intrahepático. Asimismo, como segundo objetivo se evaluará el valor de la captación de contraste para determinar la respuesta tumoral tras la aplicación de tratamientos locorregionales.METODOLOGÍA: Estudio observacional prospectivo en el que se incluirán pacientes cirróticos con función hepática conservada y sin historia previa de CHC en los que se detecta un nódulo único de 5-20 mm por ecografía de screening. Se realizará de forma basal una RM dinámica, US-C, determinación de marcadores tumorales y una biopsia, que se repetirá en caso de diagnóstico negativo. En caso de ausencia de malignidad, se realizará un seguimiento mediante US-C/3m y RM/6m; ante la detección de crecimiento o cambio de vascularización se realizará nueva biopsia. En la segunda parte del estudio se evaluará de forma retrospectiva la respuesta tumoral de una cohorte de pacientes afectos de CHC tratados mediante tratamientos locorregionales (ablación percutánea o quimioembolización) teniendo en cuenta criterios convencionales (medición de diámetros; criterios RECIST) o evaluando la extensión de necrosis reconocida como áreas sin captación de contraste.RESULTADOS: El diagnóstico de CHC puede establecerse en nódulos <20 mm sin necesidad de una biopsia positiva si US-C y RM muestran de forma coincidente hipercaptación en fase arterial seguido de lavado en fase venosa. La presencia de lavado de contraste permite el diagnóstico diferencial con el colangiocarcinoma intrahepático (ICC). Los criterios RECIST evalúan erróneamente la eficacia de los tratamientos locorregionales e infraestiman los beneficios de los tratamientos locorregionales.

El endotelio disfuncional presenta, entre otras caracteristicas, alteración en los mecanismos de vasodilatación, complicaciones trombóticas, disminución de la resistencia al estrés oxidativo, aumento de la expresión de moléculas de adhesión y de la secreción de moléculas proinflamatorias. El factor de transcripción endotelial KLF2 juega un importante papel en la regulación del fenotipo protector endotelial y su expresión depende de las fuerza hemodinámicas generadas por el flujo sanguíneo y de la administración exógena de estatinas. La hipertensión portal y el daño hepático por I/R son dos condiciones patológicas asociadas a disfunción endotelial. Los trastornos estructurales característicos de la cirrosis hepática, la mayor causa prevalente de hipertensión portal en nuestro entorno, se acompañan de variaciones en las fuerzas hemodinámicas que pueden modificar la expresión de KLF2 y su programa transcripcional vasoprotector. Asímismo, durante la isquemia asociada a la preservación de injertos hepáticos para transplante, la interrupción de las fuerzas hemodinámicas generadas por el flujo sanguíneo podría resultar en la reducción de los programas endoteliales vasoprotectores, que se debería en parte a la pérdida de expresión de KLF2. Los trabajos de investigación de la presente tesis doctoral amplian el conocimiento de los mecanismos moleculares responsables de la disfunción endotelial hepática, demostrando: 1. Que KLF2 está muy expresado en los hígados cirróticos y que su expresión se induce en las fases tempranas de la progresión de la enfermedad, representando un mecanismo compensador para mejorar los desórdenes vasculares característicos de los hígados cirróticos. 2. Que los hígados preservados en condiciones de transplante muestran un descenso tiempo-dependiente de KLF2, acompañado de daño hepático y aumentada resistencia vascular. Además, demostran que la modulación farmacologica de la expresión de KLF2 puede ser beneficiosa tanto en el tratamiento de la hipertensión portal como en la preservación de los injertos hepáticos para transplante.

Des que es va definir la síndrome hepatorenal (SHR), als anys 60 del segle passat, s’han fet grans progressos en el coneixement d’aquesta entitat. La SHR és una insuficiència renal característica dels pacients amb cirrosi hepàtica (CH) amb molt mal pronòstic a curt plaç. El tractament curatiu és el trasplantament hepàtic perquè elimina la CH que és l’origen del problema. Però no sempre està indicat el trasplantament o no s’arriba a temps de realitzar-lo. Els estudis basats en la fisiopatologia de la SHR han estat la base per investigar sobre tractaments que puguin revertir la insuficiència renal i serveixin de pont cap al trasplantament. Fins al moment de la publicació dels treballs que formen part d’aquesta tesi, s’havien fet alguns estudis amb vasoconstrictors esplàcnics que suggerien que aquests fàrmacs eren els més efectius en la reversió de la SHR. Però no s’havien publicat estudis prospectius i aleatoritzats al respecte i aquesta és l’aportació d’un dels estudis: avaluar l’efecte de la terlipressina junt amb l’albúmina sobre la funció renal i la supervivència en pacients amb CH i SHR. Es van aleatoritzar 46 pacients, 23 en el grup de terlipressina i albúmina i 23 en el grup d’albúmina sola. La milloria de la funció renal es va donar en 10 (43,5%) dels pacients tractats amb terlipressina i albúmina i en 3 (8,7%) dels pacients tractats amb albúmina sola (p=0,017). En l’anàlisi multivariat, els factors independents predictius de milloria de la funció renal van ser el volum urinari basal, la creatinina sèrica, el recompte de leucocits i el tractament amb terlipressina i albúmina. La supervivència a 3 mesos no va ser significativament diferent entre els dos grups de tractament (terlipressina i albúmina 27% vs albúmina sola 19%, p=0,7). En l’anàlisi multivariat, els factors independents predictius de supervivència als 3 mesos van ser el MELD basal i la resposta al tractament. A falta d’altres opcions, la terlipressina junt amb albúmina és l’opció terapèutica més efectiva per revertir la SHR i és el tractament que s’ha d’utilitzar, sobretot en els pacients en lista per a trasplantament hepàtic, com a pont fins a l’arribada de l’organ necessari. D’altra banda, malgrat els progressos realitzats en la SHR, els pacients amb CH poden presentar altres tipus d’insuficiència renal i aquest és un camp poc estudiat. En el segon estudi que forma part d’aquesta tesi, basant-nos en un gran número de pacients hospitalitzats, es van avaluar els diferents tipus d’insuficiència renal que poden presentar els pacients amb CH des del punt de vista de la repercusió en el pronòstic. Es van incloure de forma prospectiva, 562 pacients amb CH i insuficiència renal a l’ingrés o que la van desenvolupar durant el mateix. La causa de la insuficiència renal es va classificar en 4 grups: associada a infeccions, a deplecció de volumen, SHR i nefropatia parenquimatosa. La insuficiència renal associada a infeccions va ser la més freqüent (46%), seguida de l’associada a hipovolèmia (32%), SHR (13%) i nefropatia parenquimatosa (9%). Un 17.6% dels casos presentava combinació de causes. La probabilitat de supervivència als 3 mesos va ser del 73% en la nefropatia parenquimatosa, 46% en la insuficiència renal associada a hipovolèmia, 31% en la insuficiència renal associada a infecciones i 15% en la SHR (p<0.0005). En l’anàlisi multivariat ajustat per factors potencialment confusius, la causa de la insuficiència renal estava independentement associada al pronòstic, junto amb el MELD, el sodi sèric i l’encefalopatia hepàtica en el moment del diagnòstic de la insuficiència renal. Aquesta informació és molt important de cara a avaluar els pacients per a trasplantament hepàtic. / Hepatorenal syndrome (HRS) is a type of renal failure common and specific in patients with advanced cirrhosis. The prognosis of HRS is poor and there are no randomized studies with effective treatment for HRS. In one study of this thesis, 46 patients with cirrhosis and HRS were randomly assigned to receive either terlipressin and albumin (n=23) or albumin alone (n=23) for a maximum of 15 days. Primary outcomes were improvement of renal function and survival at 3 months. Improvement of renal function ocurred in 10 patients (43.5%) treated with terlipressin and albumin compared with 2 patients (8.7%) treated with albumin (P=.017). Independent predictive factors of improvement of renal function were baseline urine volume, serum creatinine, leukocyte count, and treatment with terlipressin and albumin. Survival at 3 months was not significantly different between the 2 groups (terlipressin and albumin 27% vs albumin 19%, P=.7). Independent predictive factors of 3-month survival were baseline MELD score and improvement in renal function. In conclusion, the administration of terlipressin and albumin should be considered for the management of patients with cirrhosis and HRS, particularly in patients who are candidates to liver transplantation. The prognostic value of the different causes of renal failure (RF) in cirrhosis is not well stablished. In the other study of this thesis, 562 consecutive patients with cirrhosis and RF (serum creatinine >1.5mg/dl) were prospectively included. The cause of RF was classified into 4 groups: RF associated with bacterial infections, RF associated with volume deplection, HRS and parenchymal nephropathy. The primary end point was survival at 3 months. The frequency of RF was: RF associated with infections: 213 cases ( 46%),hypovolemia-associated RF: 149 (32%), HRS: 60 (13%), and parenchymal nephropathy: 41 (9%). Three-month probability of survival was73% for parenchymal nephropathy, 46% for hypovolemia-associated RF, 31% for RF associated with infections, and 15% for HRS (P<.0005). In the multivariate analysis, cause of RF was independently associated with prognosis, together with MELD score, serum sodium and hepatic encephalopathy. This information may help in decision making in liver transplantation.

El hígado cirrótico experimenta a lo largo de todo el desarrollo de la enfermedad una serie de cambios estructurales, debidos a la acumulación de matriz extracelular y a la inflamación crónica, que vuelven al tejido hipóxico. La hipoxia tisular provoca la liberación de agentes proangiogénicos, como VEGF-A, que aumentan la irrigación del tejido para compensar la falta de oxígeno. Además, muchas citoquinas sintetizadas por las células inflamatorias o por las células hepáticas estrelladas activadas, también tienen un alto poder angiogénico. Estos nuevos vasos son una puerta de entrada de más infiltrado inflamatorio, estableciéndose así un circuito que se retroalimenta entre angiogénesis e inflamación que lleva a perpetuar la enfermedad. En este contexto, las terapias antiangiogénicas clásicas dirigidas a bloquear VEGF o las vías de los receptores tirosina quinasa, han demostrado ser eficaces en disminuir el grado de angiogénesis, de fibrosis y de inflamación hepática, además de disminuir también la presión portal (Mejias et al., 2009; Tugues et al., 2007). Sin embargo, este tipo de terapias se han visto relacionadas con multitud de efectos adversos, como trombosis o hipertensión, ya que no sólo inhiben la angiogénesis patológica sino que también afectan a la vasculatura sana (Fischer et al., 2007; Wu et al., 2008). De manera que la necesidad de encontrar nuevas dianas terapéuticas más seguras destinadas a modular la angiogénesis en la cirrosis hepática sigue siendo uno de los objetivos de la investigación científica actual. Cuando la cirrosis pasa a ser descompensada, los pacientes cirróticos desarrollan importantes alteraciones en la homeostasis de los líquidos corporales que dan lugar a la acumulación de ascitis. La formación de ascitis es el trastorno más importante que presentan los pacientes cirróticos y constituye un fenómeno extraordinariamente complejo en el que se han descrito la implicación de diversos sistemas neurohormonales y sustancias endógenas capaces de regular el metabolismo renal de sodio y agua o la reactividad vascular (Arroyo and Jiménez, 2000). La probabilidad de fallecimiento a los 2 años en pacientes cirróticos, una vez que desarrollan ascitis, es del 40%. A pesar de la enorme relevancia clínica de este suceso, actualmente aun no se conocen con precisión todos los mecanismos moleculares implicados en la formación y mantenimiento de la ascitis en la cirrosis. El objetivo global de esta tesis doctoral fue el de investigar la implicación de la vasculatura, tanto sanguínea como linfática, en la patogenicidad de la cirrosis hepática. De manera específica, la tesis está dividida en dos estudios dirigidos a: I. Investigar el papel fisiopatológico del factor de crecimiento placentario (PlGF) en la angiogénesis, la inflamación y la fibrosis hepática. II. Caracterizar la funcionalidad y la estructura de la vasculatura linfática en la cirrosis e investigar su contribución a la formación de ascitis. Estudio I: Durante la progresión de gran cantidad de enfermedades hepáticas crónicas tiene lugar un proceso de neoangiogénesis hepática que agrava profundamente dichas patologías. Además, se ha demostrado que diversos factores angiogénicos también son capaces de activar diferentes subpoblaciones de células hepáticas estrelladas, estableciendo así un vínculo entre inflamación, angiogénesis y fibrosis hepáticas (Thabut et al., 2010; Semela et al., 2008). En este contexto, se ha demostrado que la administración de sunitinib y sorafenib a ratas cirróticas, dos inhibidores multidiana de receptores tirosina quinasa que actúan en las vías de señalización de PDGF y VEGF, conseguía disminuir el grado de angiogénesis, de fibrosis y de inflamación hepáticas, además de disminuir también la presión portal (Mejias et al., 2009; Tugues et al., 2007). Sin embargo, este tipo de terapias dirigidas a inhibir VEGF están asociadas a graves efectos adversos, como trombosis, hipertensión o una disminución de la densidad vascular en órganos sanos (Fischer et al., 2007), ya que VEGF también tiene importantes funciones en la angiogénesis fisiológica. Estudios recientes sugieren que las terapias enfocadas a inhibir el PlGF podrían tener un perfil de bioseguridad mucho más óptimo que las terapias antiangiogénicas clásicas (Fischer et al., 2007; Van de Veire et al., 2010). Esto es así porque la acción angiogénica de PlGF se reduce únicamente a situaciones patológicas (Autiero et al., 2003; Van Steenkiste et al., 2009). Resultados I: La cirrosis está asociada a una sobreexpresión de PlGF, tanto en humanos como en modelos experimentales. Cuando se bloquea la actividad de PlGF en cirrosis se consigue disminuir la angiogénesis hepática y en esplácnica, el infiltrado inflamatorio hepático, la fibrosis y la hipertensión portal; todo ello sin efectos adversos. Estudio II: Una de las complicaciones más severas durante la progresión de la cirrosis es la formación de ascitis, que está asociada con un incremento de la morbilidad y la mortalidad (Moore et al., 2003). Algunos de los mecanismos que contribuyen a la aparición y al mantenimiento de la ascitis son: 1) el incremento de la presión hidrostática intravascular, 2) el descenso de la presión oncótica en el plasma, 3) un aumento de la angiogénesis en el territorio esplácnico y 4) la retención renal de sal y agua (Gines et al., 2004; Van Steenkiste et al., 2009; Henriksen et al., 2005). Sin embargo, la función del sistema linfático en la patogénesis de la ascitis no está bien estudiada. En los pacientes cirróticos compensados, el sistema linfático ayuda a prevenir la aparición de ascitis reabsorbiendo el exceso de fluido, tanto en el hígado, como en las demás regiones de la zona esplácnica. Como consecuencia de esto aumenta el flujo linfático (Witte et al., 1969), lo que estimula la aparición de linfangiogénesis hepática (Tugues et al., 2005). A pesar de ello, este mecanismo compensatorio no es capaz de evitar la formación de ascitis en pacientes con cirrosis descompensada y esto hace hipotetizar que existe una disfunción del sistema linfático en los estadíos más avanzados de la enfermedad. Resultados II: En cirrosis, las células endoteliales linfáticas sobreexpresan eNOS y tienen una sobreproducción de NO que lleva a una pérdida de recubrimiento de los vasos linfáticos por células musculares lisas y a una disfunción del sistema linfático. Cuando se bloquea la actividad de eNOS se consigue recuperar el recubrimiento de vasos linfáticos por células musculares lisas, aumenta el drenaje del sistema linfático y disminuye el volumen de ascitis. / Study I: Placental growth factor (PlGF) is associated selectively with pathological angiogenesis, and PlGF blockade does not affect the healthy vasculature. Anti-PlGF is therefore currently being clinically evaluated for the treatment of cancer patients. In cirrhosis, hepatic fibrogenesis is accompanied by extensive angiogenesis. In this study, we evaluated the pathophysiological role of PlGF and the therapeutic potential of anti-PlGF in liver cirrhosis. Results I: PlGF was significantly up-regulated in the CCl4-induced rodent model of liver cirrhosis as well as in cirrhotic patients. Compared with wild-type animals, cirrhotic PlGF -/- mice showed a significant reduction in angiogenesis, arteriogenesis, inflammation, fibrosis, and portal hypertension. Importantly, pharmacological inhibition with anti-PlGF antibodies yielded similar results as genetic loss of PlGF. Notably, PlGF treatment of activated hepatic stellate cells induced sustained extracellular signal-regulated kinase 1/2 phosphorylation, as well as chemotaxis and proliferation, indicating a previously unrecognized profibrogenic role of PlGF. In conclusion, PlGF is a disease-candidate gene in liver cirrhosis, and inhibition of PlGF offers a therapeutic alternative with an attractive safety profile. Study II: The lymphatic network plays a major role in maintaining tissue fluid homoeostasis. Therefore several pathological conditions associated with oedema formation result in deficient lymphatic function. However, the role of the lymphatic system in the pathogenesis of ascites and oedema formation in cirrhosis has not been fully clarified. The aim of this study was to investigate whether the inability of the lymphatic system to drain tissue exudate contributes to the oedema observed in cirrhosis. Results II: The cirrhotic (CH) rats had impaired lymphatic drainage in the splanchnic and peripheral regions compared with the control (CT) rats. LyECs isolated from the CH rats showed a significant increase in eNOS and nitric oxide (NO) production. In addition, the lymphatic vessels of the CH rats showed a significant reduction in smooth muscle cell (SMC) coverage compared with the CT rats. CH rats treated with L-NMMA for 7 days showed a significant improvement in lymphatic drainage and a significant reduction in ascites volume, which were associated with increased plasma volume. This beneficial effect of L-NMMA inhibition was also associated with a significant increase in lymphatic SMC coverage. In conclusion, the upregulation of eNOS in the LyECs of CH rats causes long-term lymphatic remodelling, which is characterised by a loss of SMC lymphatic coverage. The amelioration of this lymphatic abnormality by chronic eNOS inhibition results in improved lymphatic drainage and reduced ascites.