Sabe-se que a hemoglobina é uma rica fonte de peptídeos antimicrobianos (hemocidinas). A primeira hemocidina derivada da hemoglobina bovina caracterizada em carrapatos foi o peptídeo Hb33-61, que é ativo contra bactérias gram-positivas e fungos. Acredita-se que tais hemocidinas sejam geradas proteoliticamente no intestino do carrapato. Neste trabalho nós caracterizamos bioquimicamente uma catepsina D, designada BmAP. A análise da expressão gênica por qPCR mostrou que ela é expressa predominantemente no intestino. Através de LC-MS/MS, determinamos a especificidade de clivagem da BmAP utilizando Hb bovina, e verificamos que resíduos hidrofóbicos foram preferencialmente clivados nos subsítios P1 e P1. Também investigamos a especificidade de clivagem da catepsina L intestinal BmCL1, utilizando uma biblioteca combinatória de tetrapeptídeos e através de hemoglobinólise in vitro. A BmCL1 preferiu resíduos alifáticos no P2 e polares no P1 e P1. Além disso, hidrolisou a cadeia da Hb bovina entre A63/A64, gerando peptídeos com estrutura primária similar ao Hb 33-61. A hemoglobinólise com a BmAP e/ou BmCL1 resultou na formação de algumas hemocidinas, corroborando a hipótese do seu envolvimento na geração endógena de peptídeos antimicrobianos. / It is known that hemoglobin is a rich source of antimicrobial peptides (hemocidins). The first hemoglobin-derived hemocidin characterized in ticks was the peptide Hb33-61, which is active against Gram-positive bacteria and fungi. It is believed that hemocidins are endogenously generated in the tick gut. In this work we biochemically characterized a cathepsin D, designated BmAP. Expression analysis by qRT-PCR showed that it is expressed predominantly in the gut. Through LC-MS/MS, we determined the cleavage specificity of BmAP using bovine hemoglobin, and we verified that hydrophobic residues were preferentially cleaved at the subsites P1 and P1. We also investigated the cleavage specificity of the intestinal cathepsin L BmCL1, using a positional scanning synthetic combinatorial library and through in vitro hemoglobinolysis. BmCL1 preferred aliphatic residues at P2 and polar residues at P1 and P1. Also, it hydrolysed the subunit of bovine hemoglobin at A63/A64, generating peptides with a primary structure similar to Hb 33-61. Hemoglobinolysis with BmAP and/or BmCL1 resulted in the formation of some hemocidins, corroborating the hypothesis that these proteinases are involved in the endogenous generation of antimicrobial peptides

Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da N-acetil-L-cisteína (NAC), adicionada ao diluente composto de leite em pó desnatado, sobre a viabilidade espermática e o estresse oxidativo do sêmen equino resfriado a 5°C. Ejaculados de 8 pôneis da raça Brasileira foram coletados em triplicata resultando em 24 ejaculados. O sêmen foi distribuído em 4 grupos: Equidil® + 0,00 mM (controle), 0,5 mM, 1,0 mM ou 2,5 mM de NAC. As amostras foram armazenadas em tubos de 15mL e mantidas em caixas de transporte de sêmen BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP, Brasil). Parâmetros como motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), vigor, pH, resposta ao teste hiposmótico (HOST) e atividade mitocondrial (MTT) foram avaliados nas 24 e 48 h, bem como no sêmen fresco, após a diluição. O vigor, MT e MP foram também avaliados após teste de termorresistência (TTR), na ausência e presença de peróxido. A MT, a MP, o vigor espermático e a MTT foram similares (P > 0.05) entre as concentrações de NAC, nas 24 e 48 h. A resposta ao HOST foi semelhante entre as concentrações de NAC (P > 0,05) nas 24 h de resfriamento, porém nas 48 h ocorreu diminuição da funcionalidade da membrana no grupo NAC 2,5 mM em comparação ao grupo EQUIDIL, sem adição de NAC. A MT, a MP e vigor, das amostras resfriadas por 24 h e submetidas ao TTR, diferiu entre sem e com peróxido (P < 0,05) nos grupos Equidil, 0,5 mM e 1,0 mM, mas foi similar na concentração de 2,5 mM de NAC. Quando o sêmen foi resfriado por 48 h, houve diferença no vigor e MT entre amostras com e sem peróxido (P < 0,05), em todos os grupos testados, mas a MP foi similar entre amostras com e sem peróxido, na concentração 2,5 mM. O pH do diluente Equidil® foi o maior e os grupos Equidil + 0,5 mM e 1,0 mM tiveram valores intermediários, enquanto a concentração de 2,5 mM de NAC gerou valores mais baixos, nos três momentos avaliados (P < 0,05). Não houve variação significativa de pH entre os momentos 0 e 24 h (P= 0,7075) e entre 0 e 48 h (P= 0,4617), em todos os grupos testados. As concentrações de NAC testadas não melhoraram a motilidade, integridade da membrana plasmática, atividade mitocondrial e resposta ao HOST de espermatozoides equinos resfriados a 5°C e armazenados por 48 h. Após TTR, as concentrações de NAC testadas não evitaram a diminuição da motilidade e vigor espermático, na presença de peróxido. / The aim of this study was to evaluate the effect of N-acetyl-L-cysteine (NAC) based on skim milk powder extender on sperm viability and oxidative stress of equine semen cooled to 5°C. Ejaculate of 8 ponies of the Brazilian breed were collected in triplicate, resulting in 24 ejaculates, distributed in 4 groups: Equidil® extender + 0.00mm (control), 0.5mM, 1.0mM and 2.5mM of NAC with the semen samples were The samples were stored in 15mL tubes and kept in BotuFLEX® semen transport boxes (Botupharm, Botucatu/SP/Brazil). Parameters, such as motility, vigor, pH, osmolarity, HOST, and MTT were evaluated at 24 and 48 h of cooling also in fresh semen. Vigor, total (TM) and progressive motility (PM) were also evaluated after thermoresistance test (TTR), in the absence and presence of peroxide. TM, PM, sperm vigor and MTT were similar (P > 0.05) between NAC concentrations at 24 and 48 h. The response to HOST was similar between NAC concentrations (P > 0.05) at 24 h cooling, but at 48 h there was a decreased in membrane functionality in 2.5mM NAC group compared to the EQUIDIL group. TM, PM, and vigor of the samples cooled by 24 h and submitted to TTR differed between without and with peroxide (P< 0.05) in the EQUIDIL, 0.5mM and 1.0mM groups, but was similar in 2.5mM NAC. After cooling for 48 h, there was difference in vigor and TM between samples with and without peroxide (P < 0.05) in all groups tested, but the PM was similar between samples with and without peroxide at concentration 2.5mM of NAC. The pH of the EQUIDIL extender was higher and the EQUIDIL + 0.5mM and 1.0mM groups had intermediate values, while the 2.5mM NAC concentration generated lower values in the three evaluated periods (P < 0.05). There was no significant variation of pH between 0 and 24 h (P=0.7075) and between 0 and 48 h (P=0.4617) in all groups tested. The concentrations of NAC tested did not improve motility, plasma membrane integrity, mitochondrial activity and response to HOST equine spermatozoa cooled to 5°C and stored for 48 h. After TTR, the concentrations of NAC tested did not prevent the decrease of motility and sperm vigor in the presence of peroxide.

O processo de criopreservação promove danos celulares que podem comprometer a qualidade espermática em termos de motilidade e dos índices de fertilidade, principalmente, devido ao estresse oxidativo. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de cisteína e glutamina na motilidade, morfologia, integridade da membrana, danos no DNA e índices de estresse oxidativo no sêmen de jundiá (Rhamdia quelen) pós-descongelamento. O sêmen de 5 machos (369,6 ± 71,75 g), com motilidade espermática superior a 80%, foi criopreservado em solução crioprotetora (frutose 50 g / L, leite em pó 50 g / L e metanol 100 mL / L) contendo diferentes concentrações de cisteína (0, 2,5, 5, 10 e 20 mM) e/ou glutamina (2,5 e 5,0 mM). O pool de sêmen foi diluído na proporção de 1:3, armazenado em palhetas de 0,25 mL, congelado em vapor de nitrogênio e mergulhado em nitrogênio líquido. Após o descongelamento (25°C por 10s) foram avaliados: motilidade (motilidade total, 0-100%), morfologia (Rosa de Bengala), fertilização, integridade da membrana (Eosina-Nigrosina), dano ao DNA (teste cometa), peroxidação lipídica (TBARS), atividade das enzimas SOD, CAT, GST e GPx, e a concentração de grupos carbonilas e sulfidrilas. Em relação aos parâmetros de motilidade, fertilização e morfologia espermática, nenhum tratamento apresentou diferença significativa em relação ao controle Na avaliação da integridade de membrana não foi observada diferença entre os tratamentos (P=0,7323). No ensaio do cometa e peroxidação lipídica os tratamentos que apresentaram os piores resultados foram os com maiores concentrações de cisteína e glutamina combinadas (P<0,0001) em relação ao controle. Observou-se uma maior atividade da SOD nos tratamentos 20C, 2,5G e 5G menor atividade no controle (P<0,0001). A atividade da CAT, GST e GPx foi maior no tratamento com as maiores concentrações dos antioxidantes (20C+5G; P<0,0001) e menor no controle. A concentração de grupos carbonilas foi maior no tratamento 20C+5G e menor controle (P<0,0001). Já a concentração de grupos sulfidrilas foi maior no controle e no tratamento 5C+5G (P<0,0001). Os achados deste estudo mostram que cisteína e glutamina, nas concentrações testadas, não apresentaram resultados satisfatórios e sim efeitos prejudiciais à qualidade espermática nos parâmetros de motilidade, morfologia, fertilização, peroxidação lipídica, índice de danos ao DNA e oxidação de proteínas. Portanto, as concentrações testadas não são recomendadas para a suplementação da solução crioprotetora para congelamento de sêmen de Rhamdia quelen. / The cryopreservation process promotes cellular damage that could compromise sperm quality in terms of motility and fertility rates, mainly due to oxidative stress. Thus, aim of this study was to assess the effects of different concentrations of cysteine and glutamine on post-thaw sperm motility, morphology, membrane integrity, fertility, DNA damage and indices of oxidative stress in the South American silver catfish (Rhamdia quelen). Sperm collected from five males (369.6 ± 71.75g), with sperm motility higher than 80%, was cryopreserved in cryoprotectant solution (fructose 50 g/L, powdered milk 50 g/L and methanol 100mL/L) containing different cysteine concentrations (0, 2.5, 5, 10 and 20 mM) and/or glutamine (2.5 and 5.0 mM). The semen pool was diluted 1:3, filled in 0.25 mL straws, frozen in nitrogen vapor, and plunged into liquid nitrogen. After thawing (25°C for 10 s) were measured: motility (total motile, 0-100%), morphology (Bengal Rose Staining), fertilization, membrane integrity (Eosin-Nigrosine), DNA damage (cometa assay), lipid peroxidation (TBARS), the activity of SOD, CAT, GST and GPx enzymes, and the concentration of Carbonyl and Sulfhydril groups. In relation to parameters of motility, fertilization and sperm morphology, no treatment presented a significant difference in relation to the control In the evaluation of membrane integrity, no difference was observed between treatments (P = 0.7323). In the comet and lipid peroxidation assay the treatments with the worst results were those with the highest concentrations of cysteine and glutamine combined (P <0.0001) in relation to the control. A higher activity of SOD was observed in treatments 20C, 2.5G and 5G lower activity in the control (P <0.0001). The activity of CAT, GST and GPx was higher in the treatment with the highest concentrations of antioxidants (20C + 5G; P <0.0001) and lower in the control. The concentration of carbonyl groups was higher in the 20C + 5G treatment and lower control (P <0.0001). The concentration of sulfhydryl groups was higher in control and 5C + 5G treatment (P <0.0001).The findings of this study show that cysteine and glutamine, at the concentrations tested, did not present satisfactory results, but rather, damaging effects on sperm quality in the parameters of motility, morphology, fertilization, lipid peroxidation, DNA damage and protein oxidation. Therefore, the concentrations tested are not recommended for the supplementation of the cryoprotectant solution for freezing semen of Rhamdia quelen.

Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da N-acetil-L-cisteína (NAC), adicionada ao diluente composto de leite em pó desnatado, sobre a viabilidade espermática e o estresse oxidativo do sêmen equino resfriado a 5°C. Ejaculados de 8 pôneis da raça Brasileira foram coletados em triplicata resultando em 24 ejaculados. O sêmen foi distribuído em 4 grupos: Equidil® + 0,00 mM (controle), 0,5 mM, 1,0 mM ou 2,5 mM de NAC. As amostras foram armazenadas em tubos de 15mL e mantidas em caixas de transporte de sêmen BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP, Brasil). Parâmetros como motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), vigor, pH, resposta ao teste hiposmótico (HOST) e atividade mitocondrial (MTT) foram avaliados nas 24 e 48 h, bem como no sêmen fresco, após a diluição. O vigor, MT e MP foram também avaliados após teste de termorresistência (TTR), na ausência e presença de peróxido. A MT, a MP, o vigor espermático e a MTT foram similares (P > 0.05) entre as concentrações de NAC, nas 24 e 48 h. A resposta ao HOST foi semelhante entre as concentrações de NAC (P > 0,05) nas 24 h de resfriamento, porém nas 48 h ocorreu diminuição da funcionalidade da membrana no grupo NAC 2,5 mM em comparação ao grupo EQUIDIL, sem adição de NAC. A MT, a MP e vigor, das amostras resfriadas por 24 h e submetidas ao TTR, diferiu entre sem e com peróxido (P < 0,05) nos grupos Equidil, 0,5 mM e 1,0 mM, mas foi similar na concentração de 2,5 mM de NAC. Quando o sêmen foi resfriado por 48 h, houve diferença no vigor e MT entre amostras com e sem peróxido (P < 0,05), em todos os grupos testados, mas a MP foi similar entre amostras com e sem peróxido, na concentração 2,5 mM. O pH do diluente Equidil® foi o maior e os grupos Equidil + 0,5 mM e 1,0 mM tiveram valores intermediários, enquanto a concentração de 2,5 mM de NAC gerou valores mais baixos, nos três momentos avaliados (P < 0,05). Não houve variação significativa de pH entre os momentos 0 e 24 h (P= 0,7075) e entre 0 e 48 h (P= 0,4617), em todos os grupos testados. As concentrações de NAC testadas não melhoraram a motilidade, integridade da membrana plasmática, atividade mitocondrial e resposta ao HOST de espermatozoides equinos resfriados a 5°C e armazenados por 48 h. Após TTR, as concentrações de NAC testadas não evitaram a diminuição da motilidade e vigor espermático, na presença de peróxido. / The aim of this study was to evaluate the effect of N-acetyl-L-cysteine (NAC) based on skim milk powder extender on sperm viability and oxidative stress of equine semen cooled to 5°C. Ejaculate of 8 ponies of the Brazilian breed were collected in triplicate, resulting in 24 ejaculates, distributed in 4 groups: Equidil® extender + 0.00mm (control), 0.5mM, 1.0mM and 2.5mM of NAC with the semen samples were The samples were stored in 15mL tubes and kept in BotuFLEX® semen transport boxes (Botupharm, Botucatu/SP/Brazil). Parameters, such as motility, vigor, pH, osmolarity, HOST, and MTT were evaluated at 24 and 48 h of cooling also in fresh semen. Vigor, total (TM) and progressive motility (PM) were also evaluated after thermoresistance test (TTR), in the absence and presence of peroxide. TM, PM, sperm vigor and MTT were similar (P > 0.05) between NAC concentrations at 24 and 48 h. The response to HOST was similar between NAC concentrations (P > 0.05) at 24 h cooling, but at 48 h there was a decreased in membrane functionality in 2.5mM NAC group compared to the EQUIDIL group. TM, PM, and vigor of the samples cooled by 24 h and submitted to TTR differed between without and with peroxide (P< 0.05) in the EQUIDIL, 0.5mM and 1.0mM groups, but was similar in 2.5mM NAC. After cooling for 48 h, there was difference in vigor and TM between samples with and without peroxide (P < 0.05) in all groups tested, but the PM was similar between samples with and without peroxide at concentration 2.5mM of NAC. The pH of the EQUIDIL extender was higher and the EQUIDIL + 0.5mM and 1.0mM groups had intermediate values, while the 2.5mM NAC concentration generated lower values in the three evaluated periods (P < 0.05). There was no significant variation of pH between 0 and 24 h (P=0.7075) and between 0 and 48 h (P=0.4617) in all groups tested. The concentrations of NAC tested did not improve motility, plasma membrane integrity, mitochondrial activity and response to HOST equine spermatozoa cooled to 5°C and stored for 48 h. After TTR, the concentrations of NAC tested did not prevent the decrease of motility and sperm vigor in the presence of peroxide.

O processo de criopreservação promove danos celulares que podem comprometer a qualidade espermática em termos de motilidade e dos índices de fertilidade, principalmente, devido ao estresse oxidativo. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de cisteína e glutamina na motilidade, morfologia, integridade da membrana, danos no DNA e índices de estresse oxidativo no sêmen de jundiá (Rhamdia quelen) pós-descongelamento. O sêmen de 5 machos (369,6 ± 71,75 g), com motilidade espermática superior a 80%, foi criopreservado em solução crioprotetora (frutose 50 g / L, leite em pó 50 g / L e metanol 100 mL / L) contendo diferentes concentrações de cisteína (0, 2,5, 5, 10 e 20 mM) e/ou glutamina (2,5 e 5,0 mM). O pool de sêmen foi diluído na proporção de 1:3, armazenado em palhetas de 0,25 mL, congelado em vapor de nitrogênio e mergulhado em nitrogênio líquido. Após o descongelamento (25°C por 10s) foram avaliados: motilidade (motilidade total, 0-100%), morfologia (Rosa de Bengala), fertilização, integridade da membrana (Eosina-Nigrosina), dano ao DNA (teste cometa), peroxidação lipídica (TBARS), atividade das enzimas SOD, CAT, GST e GPx, e a concentração de grupos carbonilas e sulfidrilas. Em relação aos parâmetros de motilidade, fertilização e morfologia espermática, nenhum tratamento apresentou diferença significativa em relação ao controle Na avaliação da integridade de membrana não foi observada diferença entre os tratamentos (P=0,7323). No ensaio do cometa e peroxidação lipídica os tratamentos que apresentaram os piores resultados foram os com maiores concentrações de cisteína e glutamina combinadas (P<0,0001) em relação ao controle. Observou-se uma maior atividade da SOD nos tratamentos 20C, 2,5G e 5G menor atividade no controle (P<0,0001). A atividade da CAT, GST e GPx foi maior no tratamento com as maiores concentrações dos antioxidantes (20C+5G; P<0,0001) e menor no controle. A concentração de grupos carbonilas foi maior no tratamento 20C+5G e menor controle (P<0,0001). Já a concentração de grupos sulfidrilas foi maior no controle e no tratamento 5C+5G (P<0,0001). Os achados deste estudo mostram que cisteína e glutamina, nas concentrações testadas, não apresentaram resultados satisfatórios e sim efeitos prejudiciais à qualidade espermática nos parâmetros de motilidade, morfologia, fertilização, peroxidação lipídica, índice de danos ao DNA e oxidação de proteínas. Portanto, as concentrações testadas não são recomendadas para a suplementação da solução crioprotetora para congelamento de sêmen de Rhamdia quelen. / The cryopreservation process promotes cellular damage that could compromise sperm quality in terms of motility and fertility rates, mainly due to oxidative stress. Thus, aim of this study was to assess the effects of different concentrations of cysteine and glutamine on post-thaw sperm motility, morphology, membrane integrity, fertility, DNA damage and indices of oxidative stress in the South American silver catfish (Rhamdia quelen). Sperm collected from five males (369.6 ± 71.75g), with sperm motility higher than 80%, was cryopreserved in cryoprotectant solution (fructose 50 g/L, powdered milk 50 g/L and methanol 100mL/L) containing different cysteine concentrations (0, 2.5, 5, 10 and 20 mM) and/or glutamine (2.5 and 5.0 mM). The semen pool was diluted 1:3, filled in 0.25 mL straws, frozen in nitrogen vapor, and plunged into liquid nitrogen. After thawing (25°C for 10 s) were measured: motility (total motile, 0-100%), morphology (Bengal Rose Staining), fertilization, membrane integrity (Eosin-Nigrosine), DNA damage (cometa assay), lipid peroxidation (TBARS), the activity of SOD, CAT, GST and GPx enzymes, and the concentration of Carbonyl and Sulfhydril groups. In relation to parameters of motility, fertilization and sperm morphology, no treatment presented a significant difference in relation to the control In the evaluation of membrane integrity, no difference was observed between treatments (P = 0.7323). In the comet and lipid peroxidation assay the treatments with the worst results were those with the highest concentrations of cysteine and glutamine combined (P <0.0001) in relation to the control. A higher activity of SOD was observed in treatments 20C, 2.5G and 5G lower activity in the control (P <0.0001). The activity of CAT, GST and GPx was higher in the treatment with the highest concentrations of antioxidants (20C + 5G; P <0.0001) and lower in the control. The concentration of carbonyl groups was higher in the 20C + 5G treatment and lower control (P <0.0001). The concentration of sulfhydryl groups was higher in control and 5C + 5G treatment (P <0.0001).The findings of this study show that cysteine and glutamine, at the concentrations tested, did not present satisfactory results, but rather, damaging effects on sperm quality in the parameters of motility, morphology, fertilization, lipid peroxidation, DNA damage and protein oxidation. Therefore, the concentrations tested are not recommended for the supplementation of the cryoprotectant solution for freezing semen of Rhamdia quelen.

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo L. O. R. Cunha. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2017. / Nos últimos anos o rol de propriedades biológicas de compostos de selênio e de telúrio tem aumentado e outras atividades, além das bem descritas propriedades antioxidantes, também vêm sendo demonstradas. Neste contexto, a inibição enzimática promovida por espécies hipervalentes de selênio e telúrio (organocalcogenanas) foi relatada para cisteína proteases, tirosina fosfatases e o proteasoma, por exemplo. Esta inibição é resultado da particular reatividade que compostos hipervalentes de telúrio e selênio apresentam com tióis. Como a quantidade de biotióis reativos em sistemas celulares é vasta e nem todos estão disponíveis para ensaios in vitro com as organocalcogenanas, é possível vislumbrar a aplicação desses compostos como ligantes em cromatografia de afinidade para a identificação de proteínas reativas a esses compostos. Para atingir este objetivo foram utilizados organocalcogenetos derivados de benzaldeído. A estrutura dos ligantes é constituída por um grupo fenilcalcogenila ligado a um derivado de poliéter funcionalizado com um grupo amina que é ancorado à uma matriz de agarose. Foram preparadas duas classes de ligantes para a modificação de agarose que diferem na estrutura do espaçador, a primeira contém uma unidade de ácido succínico entre o organocalcogeneto e o derivado de poliéter (ligantes de Classe I) e a outra, isenta dessa unidade de ácido succínico, possui um grupo amino ionizável (ligantes catiônicos de Classe II). A rota de preparação dos ligantes de classe I envolveu uma sequencia sintética de seis etapas com rendimentos globais de 26% e 19% e os ligantes de Classe II foram preparados em uma sequencia de duas etapas com rendimentos globais de 43% e 22%, para os selenetos e teluretos, respectivamente. A oxido-redução do ligante de telúrio da classe II se mostrou rápido e satisfatório nos estudos preliminares, dando bons indícios para aplicação como ligante na cromatografia de afinidade. Por fim, os ligantes foram imobilizados na agarose funcionalizada com brometo de cianogênio e avaliados com papaína, utilizada como modelo de biotiol nesse trabalho. Notadamente os ligantes de telúrio apresentaram um comportamento distinto do que os de selênio quanto à eluição da papaína da matriz sólida, requerendo maior volume de solução com agente redutor para a eluição da proteína. Coletivamente os resultados apresentados nesse trabalho demonstram que matrizes sólidas funcionalizadas com organocalcogenetos são funcionais para a retenção e liberação de biomoléculas tioladas (funcionalidade "catch & release"), abrindo perspectivas para o estudo mais aprofundado da interação entre calcogenetos com tióis e, ainda para produção, caracterização e estudo de aplicações de diversas matrizes funcionalizadas com organocalcogenetos. / In recent years the role of biological properties of selenium compounds and tellurium compounds has increased, and other activities besides the well-described antioxidant properties have also been demonstrated. In this context, enzymatic inhibition promoted by hypervalent species of selenium and tellurium have been reported for cysteine proteases and tyrosine phosphatases. This activity is due to the particular reactivity of thiols with the chalcogenides atom in their hypervalent state. Apart from these enzymes, one can envisage a plenty of other potential reactive thiols in cellular systems that are prone to react with organocalcogenuranes which are still unknown. As the identification of these unknown targets would be helpful to understand therapeutical and toxicological aspects of these compounds, efforts in this direction are required. One strategy for this purpose consists in using the affinity purification technique using organochalcogenides as ligands, this is proposed in the present work. To achieve this goal, the use of organochalcogenides derived from benzylamines as ligands in affinity chromatography. The structure of this ligands contains a phenylchalcogenide moiety, a polyether spacer group functionalized with an amino group to attach it to an agarose substrate. Two different spacer classes were prepared, the first has a succinic acid spacer between the organochalcogenide and the polyether (Class I ligand); the second class has the polyether moiety directly linked to the phenylchalcogenide group and has an ionizable secondary amine (Class II cationic ligand). The preparation route of the class I ligands involved a six-step synthetic sequence in overall yields of 26% and 19%, and the Class II ligands were prepared in a two-step sequence in global yields of 43% and 22% of the selenides and tellurides, respectively. The studied oxidation and reduction reactions of Class II tellurium ligands revealed fast processes, suitable for a practical application of these novel organochalcogenides in affinity chromatography. Finally, ligands were immobilized in cyanogen bromide activated agarose and the modified matrices evaluated with papain as a model biothiol. Noteworthy, the selenide ligands released papain promptly by washing the matrix with dithiothreitol solution whereas telluride ligands showed the opposite behavior. Collectively, the results presented in this work demonstrate that organochalcogenide-modified agarose is a new class of functional materials for the retention and release of biothiols presenting a "catch & release" functionality. This work brings new perspectives for a more detailed study of the interaction between chalcogenides with thiols and also to the production, characterization and the study of novel applications of organochalcogenide-modified solid matrices.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Rodrigo Arruda de Oliveira - ciencia animal.pdf: 240323 bytes, checksum: 9271974d672bf2ee948422285040bd20 (MD5) Previous issue date: 2011-04-18 / In the equine world is increasing the use of frozen semen and cooled due to the recent release of its use for most of breeders' associations. However, the fertility of frozen semen is still low and this hinders their widespread use. The objective was to evaluate the effect In vitro addition of glutathione on sperm concentrations in five of 12 stallions in different protocols of freezing, and I Experiment (EI): automated freezing immediately after harvest and Experiment II (EII): automated freezing (MRI) and manual (RG) after passive cooling 24 h at 16 ° C. The variables assessed were total and progressive motility, vigor, plasma membrane integrity and acrosomal. The addition of glutathione in concentration of 2.5 mM in the midst of freezing preserves the total motility, significantly increases the motility and integrity of plasma membrane, both for semen frozen immediately after harvesting and for the refrigerated and frozen manually. Concentrations exceeding 2.5 mM were deleterious to sperm in different freezing protocols, with or without passive cooling. In chapter 3 aimed to evaluate the in vitro effect of the addition of cysteine &#8203;&#8203;and glutathione in seven treatments on sperm from 12 stallions in protocol passive cooling to 16 ° C for 36h. The variables assessed were total motility and progressive force and plasma membrane integrity and acrosomal in seven different times (0, 6, 12, 18, &#8203;&#8203;24, 30 and 36h). For discussion of data were taken into account only the values &#8203;&#8203;of the moments 1, 3, 5 and 7 (0, 12, 24 and 36h). The concentration of 1.0 mM cysteine &#8203;&#8203;was more effective in protection of sperm cells in the trading system of the passive cooling 16 º C for 36h, with higher values &#8203;&#8203;of motility and membrane integrity. / Na equinocultura mundial é cada vez maior a utilização do sêmen congelado e refrigerado devido a recente liberação do seu uso por grande parte das associações de criadores. Entretanto, a fertilidade do sêmen congelado ainda é baixa e isto dificulta a sua utilização em larga escala. Objetivou-se avaliar o efeito in vitro da adição de glutationa em cinco concentrações sobre espermatozóides de 12 garanhões em diferentes protocolos de congelamento, sendo Experimento I (EI): congelamento automatizado imediatamente pós-colheita e Experimento II (EII): congelamento automatizado (RM) e manual (RG) após refrigeração passiva por 24h a 16ºC. As variáveis avaliadas foram motilidade total e progressiva, vigor, integridade das membranas plasmática e acrossomal. A adição de glutationa na concentração de 2,5mM ao meio de congelamento preserva a motilidade total, incrementa significativamente a motilidade progressiva e a integridade de membrana plasmática, tanto para sêmen congelado imediatamente pós-colheita quanto para o refrigerado e congelado de forma manual. Concentrações superiores a 2,5mM foram deletérias aos espermatozóides nos diferentes protocolos de congelamento, com ou sem refrigeração passiva. No capítulo 3 objetivou-se avaliar o efeito in vitro da adição de cisteína e glutationa em sete tratamentos, sobre espermatozóides de 12 garanhões em protocolo de refrigeração passiva a 16ºC por 36h. As variáveis avaliadas foram motilidade total e progressiva, vigor e integridade das membranas plasmática e acrossomal em sete momentos diferentes (0, 6, 12, 18, 24, 30 e 36h). Para discussão dos dados foram levados em consideração somente os valores dos momentos 1, 3, 5 e 7 (0, 12, 24 e 36h). A concentração de cisteína 1,0mM mostrou-se mais eficiente para proteção da célula espermática no sistema comercial de refrigeração passiva a 16ºC por 36h, com valores maiores de motilidade e integridade de membrana.

Submitted by Gabriela Lopes (gmachadolopesufpel@gmail.com) on 2016-10-10T17:31:26Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese - Cláudia Militz da Costa.pdf.pdf: 2514954 bytes, checksum: 6ff53df6aea30c61f0946c80d9ddf869 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2016-10-11T20:51:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Cláudia Militz da Costa.pdf.pdf: 2514954 bytes, checksum: 6ff53df6aea30c61f0946c80d9ddf869 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-11T20:51:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Cláudia Militz da Costa.pdf.pdf: 2514954 bytes, checksum: 6ff53df6aea30c61f0946c80d9ddf869 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-12-18 / Sem bolsa / Em grãos de arroz de duas cultivares híbridas e duas variedades, beneficiadas logo após a colheita e após 6 meses de armazenamento dos grãos em casca na temperatura de 20ºC, foram analisados teores de 18 aminoácidos, proteínas totais, amilose, umidade, temperatura de gelatinização (estimativa), mais os parâmetros de qualidade industrial, de cocção, de textura, de viscosidade e sensorial, preferência e aceitação. Os resultados permitiram concluir que: (a) o aumento do tempo de armazenamento provoca reduções no conteúdo e alterações no perfil de aminoácidos, não havendo diferenças de comportamento entre variedades e híbridos; (b) o conteúdo de proteínas totais do endosperma não define o grau soltabilidade (ou de empapamento) dos grãos e nem está relacionado com a preferência do consumidor pelo arroz após a cocção; (c) a elevação do conteúdo de cisteína provoca aumento na soltabilidade do arroz cozido ao longo do armazenamento; (d) os parâmetros de avaliações texturométricas e reológicas refletem os resultados da análise sensorial e da aceitação do arroz após a cocção; e, (e) o aumento do tempo de armazenamento provoca aumento inicial no rendimento industrial e reduções na brancura e no grau de polimento, mas não altera a transparência do arroz. / In rice grains from two hybrids cultivars and two varieties, milled immediately after harvest and after 6 months of storage of grains with husk at the temperature of 20°C, were analyzed levels of 18 amino acids, total protein, amylose, moisture, gelatinization temperature (estimation), plus the parameters of industrial quality, cooking, texture, viscosity and sensory attributes, also preference and acceptance. The results allowed to conclude that: (a) the increase of storage time causes reductions in the amino acid content and changes in amino acid profile, with no significant differences among varieties and hybrids; (b) total protein content from endosperm does not define the degree of loose cooked grains (or of grain stickiness) and it is not associated with the consumer preference for the rice after cooking, (c) elevation in cysteine content causes an increase in loose cooked grain (reduction of stickiness) during storage; (d) parameters of texturometric and rheological evaluations reflect the results from sensory analysis and acceptance of the rice after cooking; and (e) the increase of storage time causes an initial increasing in industrial yield and leads to reductions in whiteness and polishing degree (milling degree), but does not change the transparency of rice .

Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da N-acetil-L-cisteína (NAC), adicionada ao diluente composto de leite em pó desnatado, sobre a viabilidade espermática e o estresse oxidativo do sêmen equino resfriado a 5°C. Ejaculados de 8 pôneis da raça Brasileira foram coletados em triplicata resultando em 24 ejaculados. O sêmen foi distribuído em 4 grupos: Equidil® + 0,00 mM (controle), 0,5 mM, 1,0 mM ou 2,5 mM de NAC. As amostras foram armazenadas em tubos de 15mL e mantidas em caixas de transporte de sêmen BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP, Brasil). Parâmetros como motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), vigor, pH, resposta ao teste hiposmótico (HOST) e atividade mitocondrial (MTT) foram avaliados nas 24 e 48 h, bem como no sêmen fresco, após a diluição. O vigor, MT e MP foram também avaliados após teste de termorresistência (TTR), na ausência e presença de peróxido. A MT, a MP, o vigor espermático e a MTT foram similares (P > 0.05) entre as concentrações de NAC, nas 24 e 48 h. A resposta ao HOST foi semelhante entre as concentrações de NAC (P > 0,05) nas 24 h de resfriamento, porém nas 48 h ocorreu diminuição da funcionalidade da membrana no grupo NAC 2,5 mM em comparação ao grupo EQUIDIL, sem adição de NAC. A MT, a MP e vigor, das amostras resfriadas por 24 h e submetidas ao TTR, diferiu entre sem e com peróxido (P < 0,05) nos grupos Equidil, 0,5 mM e 1,0 mM, mas foi similar na concentração de 2,5 mM de NAC. Quando o sêmen foi resfriado por 48 h, houve diferença no vigor e MT entre amostras com e sem peróxido (P < 0,05), em todos os grupos testados, mas a MP foi similar entre amostras com e sem peróxido, na concentração 2,5 mM. O pH do diluente Equidil® foi o maior e os grupos Equidil + 0,5 mM e 1,0 mM tiveram valores intermediários, enquanto a concentração de 2,5 mM de NAC gerou valores mais baixos, nos três momentos avaliados (P < 0,05). Não houve variação significativa de pH entre os momentos 0 e 24 h (P= 0,7075) e entre 0 e 48 h (P= 0,4617), em todos os grupos testados. As concentrações de NAC testadas não melhoraram a motilidade, integridade da membrana plasmática, atividade mitocondrial e resposta ao HOST de espermatozoides equinos resfriados a 5°C e armazenados por 48 h. Após TTR, as concentrações de NAC testadas não evitaram a diminuição da motilidade e vigor espermático, na presença de peróxido. / The aim of this study was to evaluate the effect of N-acetyl-L-cysteine (NAC) based on skim milk powder extender on sperm viability and oxidative stress of equine semen cooled to 5°C. Ejaculate of 8 ponies of the Brazilian breed were collected in triplicate, resulting in 24 ejaculates, distributed in 4 groups: Equidil® extender + 0.00mm (control), 0.5mM, 1.0mM and 2.5mM of NAC with the semen samples were The samples were stored in 15mL tubes and kept in BotuFLEX® semen transport boxes (Botupharm, Botucatu/SP/Brazil). Parameters, such as motility, vigor, pH, osmolarity, HOST, and MTT were evaluated at 24 and 48 h of cooling also in fresh semen. Vigor, total (TM) and progressive motility (PM) were also evaluated after thermoresistance test (TTR), in the absence and presence of peroxide. TM, PM, sperm vigor and MTT were similar (P > 0.05) between NAC concentrations at 24 and 48 h. The response to HOST was similar between NAC concentrations (P > 0.05) at 24 h cooling, but at 48 h there was a decreased in membrane functionality in 2.5mM NAC group compared to the EQUIDIL group. TM, PM, and vigor of the samples cooled by 24 h and submitted to TTR differed between without and with peroxide (P< 0.05) in the EQUIDIL, 0.5mM and 1.0mM groups, but was similar in 2.5mM NAC. After cooling for 48 h, there was difference in vigor and TM between samples with and without peroxide (P < 0.05) in all groups tested, but the PM was similar between samples with and without peroxide at concentration 2.5mM of NAC. The pH of the EQUIDIL extender was higher and the EQUIDIL + 0.5mM and 1.0mM groups had intermediate values, while the 2.5mM NAC concentration generated lower values in the three evaluated periods (P < 0.05). There was no significant variation of pH between 0 and 24 h (P=0.7075) and between 0 and 48 h (P=0.4617) in all groups tested. The concentrations of NAC tested did not improve motility, plasma membrane integrity, mitochondrial activity and response to HOST equine spermatozoa cooled to 5°C and stored for 48 h. After TTR, the concentrations of NAC tested did not prevent the decrease of motility and sperm vigor in the presence of peroxide.

Os hidróxidos duplos lamelares (HDLs) compreendem uma extensa classe de materiais naturais e sintéticos, cujas estruturas e propriedades são frequentemente comparadas com as do mineral hidrotalcita. O estudo da intercalação de espécies de interesse farmacológico em HDLs tem ganhado a atenção da comunidade científica. O objetivo desta Dissertação foi o estudo da intercalação e liberação da espécie antioxidante N-acetil-L-cisteína (NAC) em HDLs de zinco-alumínio (Zn2Al-NAC) e magnésio-alumínio (Mg2Al-NAC). Espécies antioxidantes de modo geral apresentam características como baixa estabilidade química frente à luz e ao calor, sensibilidade ao valor do pH do meio e, algumas, baixa solubilidade. HDLs podem ser utilizados como carregadores de espécies antioxidantes para contornar as características indesejadas supracitadas. Os HDLs foram sintetizados através do método de coprecipitação, utilizando diferentes condições experimentais. Os materiais obtidos foram caracterizados por técnicas estruturais, espectroscópicas, térmicas, texturais e de análise química elementar. A liberação foi estudada através de experimentos in vitro de NAC intercalada ou imobilizada em HDL, empregando meio biológico simulado, nos métodos dinâmico e estático. Os difratrogramas de raios X das amostras de HDL de zinco mostram que a síntese realizada a 55&#176;C conduz à formação de material de alta cristalinidade e reflexão (003) igual a 16,3 &#197;. O material possui partículas planas e com baixo grau de agregação. Os resultados de espectroscopia vibracional e 13C-RMN confirmam a manutenção da integridade estrutural da NAC após intercalação e, ainda, sugerem que ocorreu a desprotonação dos grupos carboxílico e tiol. As lamelas possuem sítios distintos de alumínio hexacordenado, segundo o espectro de 27Al-RMN. O conjunto de técnicas de caracterização indicam a substituição de parte dos íons hidroxila das lamelas pelo oxigênio do grupo carboxilato da NAC. Os ensaios de liberação in vitro sugerem um processo modificado (prolongado) da NAC, visto que no método dinâmico foi liberado 35% dessa espécie em 96 horas, enquanto no método estático ocorreu a liberação de 20%. As análises estratigráficas após o ensaio comprovam que ocorreu a liberação apenas das regiões mais externas do comprimido. Os resultados das sínteses do HDL de magnésio não indicam a intercalação da NAC para essa matriz, mesmo empregando diferentes parâmetros experimentais. A espectroscopia Raman sugere que ocorreu a oxidação parcial dos ânions de NAC devido ao aparecimento da banda de estiramento &#957;S-S (508 cm-1). O espectro de 13C-RMN concorda com o resultado da espectroscopia Raman. Os dados de liberação in vitro corroboram a proposta de que a NAC está apenas imobilizada na superfície do HDL, visto que no método estático levou-se 12 horas para liberar 90% da NAC, sugerindo uma liberação rápida. As análises estratigráficas dos materiais após os testes de liberação dos dois métodos comprovam liberação total da NAC. / Layered double hydroxides (LDHs) comprise an extensive class of natural and synthetic materials, which structures and properties are often compared to those of hydrotalcite mineral. The study about intercalation of species of pharmacological interest into LDHs has gained the attention of the scientific community. The aim of this Dissertation was to investigate the intercalation and release of the antioxidant N-acetyl-L-cysteine (NAC) into LDHs of zinc-aluminum (Zn2Al-NAC) and magnesium-aluminum (Mg2Al-NAC) composition. Antioxidant species generally exhibit characteristics such as low chemical stability towards light and heat, sensitivity to the pH value of the medium and, some of them, low solubility. LDHs can be used as carriers of antioxidant species to circumvent the undesirable properties. LDHs were synthesized using the coprecipitation method and exploiting different experimental conditions. The obtained materials were characterized by structural, spectroscopic, thermal, textural and elemental chemical analysis techniques. The release of intercalated or immobilized NAC was studied by in vitro experiments in simulated biological medium, using the dynamic and static methods. The X-ray diffractograms of LDH samples of zinc show that the synthesis performed at 55&#176;C leads to a high crystalline material and the (003) reflection equal to 16.3 &#197;. The material has flat particles and a low degree of aggregation. The results of vibrational spectroscopy and 13C-NMR confirm the structural integrity of NAC after intercalation, and also suggest that the deprotonation of the carboxylic and thiol groups occurred. The LDH layer has distinct sites of hexacoordinate aluminum, according to the 27Al-NMR spectroscopy. The set of characterization techniques indicates the partial substitution of hydroxide ions in the layers by the oxygen of NAC carboxylate group. The in vitro assays of NAC release suggest a modified (prolonged) process, since 35% of this species was released in 96 h in the dynamic method while occurred 20% of release in the static method. Stratigraphic analyzes of the LDH-NAC tablet after the release test demonstrate that only the species of the outermost regions of the tablet were delivered. The results of magnesium-LDH syntheses do not indicate the intercalation of NAC into the matrix, even using different experimental parameters. Raman spectroscopy suggests that partial oxidation of NAC anions occurred due to the appearance of the band assigned to &#957;S-S (508 cm-1). The 13C-NMR spectrum of Mg2Al-NAC agrees with the result of Raman spectroscopy. In vitro release data corroborate the proposition that NAC is only immobilized on the LDH surface, since it took 12 h to release 90% of NAC in the static method, suggesting a rapid process. The stratigraphic analyzes of the material after the release tests by the two methods confirm the total release of NAC.