Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1393738 bytes, checksum: a972ec00e49dcfa2c5d44a8c6f9480a0 (MD5) Previous issue date: 2009-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The plants produce antifungous proteins and specialized antibiotics (phytoanticipins and phytoalexins) in order to defend from phytopathogenic fungus. Only the pathogens able to avoid those defensive plant responses at the initial stages of the infection are able to cause disease. The fungus Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Briosi & Cavara is the etiological agent of the anthracnose in the common bean plant (Phaseolus vulgaris L.), that is an important disease contributing to reduce the productivity of the bean plant crop in Brazil. The genes abcCl1 and cypCl1 were isolated from this phytopathogen and their deduced aminoacid sequences have high similarity with ABC transporters and cytochromes P450, respectively. Those genes are found in unique copy and clustered in genome of the fungus, as revealed by either the sequencing of one DNA 8,4 kb fragment from the genomic library of C. lindemuthianum and the hybridization profile. Those genes also show an increased expression in response to different toxic compounds, mainly when the fungus is grown at the presence of eugenol, hygromycin and pisatin phytoalexin. Therefore, besides their genes to be physically linked, the proteins ABCCl1 and CYPCl1 can also be involved in the same functional process: the fungus resistance to the toxic compounds produced by plants or antagonistic microorganisms. In the functional analysis of the gene abcCl1, the mutants abcCl1− showed reduction in their virulence to the leaf of the common bean plant, compared with the wild line of C. lindemuthianum. Those results indicate the gene abcCl1 to codify an ABC transporter that is necessary to pathogenicity of C. lindemuthianum, probably because providing the fungus with the ability to overcome the defense mechanism of the plant. The cytochrome P450, that is codified by the gene cypCl1, can represent a complementary detoxification mechanism used by this fungus during the establishment of the disease. / Para se defenderem de fungos fitopatogênicos, as plantas produzem proteínas antifúngicas e antibióticos especializados (fitoanticipinas e fitoalexinas). Somente patógenos que conseguem evitar estas respostas defensivas da planta nos estágios iniciais da infecção são capazes de causar doença. O fungo Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Briosi & Cavara é o agente etiológico da antracnose do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.), uma importante doença que contribui para redução da produtividade da cultura do feijoeiro no Brasil. Neste fitopatógeno foram isolados dois genes, abcCl1 e cypCl1, cujas sequências de aminoácidos deduzidas possuem alta similaridade com transportadores ABC e citocromos P450, respectivamente. Estes genes estão presentes em cópia única e agrupados no genoma do fungo, conforme revelado no sequenciamento de um fragmento de DNA de 8,4 kb da biblioteca genômica de C. lindemuthianum, bem como no perfil de hibridização. Estes genes também apresentam aumento de expressão em resposta a diferentes compostos tóxicos, principalmente quando o fungo é crescido na presença de eugenol, higromicina ou fitoalexina pisatina. Assim, além de seus genes estarem ligados fisicamente, as proteínas ABCCl1 e CYPCl1 podem, também, estarem envolvidas em um mesmo processo funcional: a resistência do fungo a compostos tóxicos produzidos por plantas ou microrganismos antagonistas. Na análise funcional do gene abcCl1, foi observado que mutantes abcCl1− apresentam redução na virulência a folhas de feijoeiro comum, em comparação com a linhagem selvagem de C. lindemuthianum. Estes resultados indicam que o gene abcCl1 codifica um transportador ABC, que é necessário para a patogenicidade de C. lindemuthianum, provavelmente por conferir ao fungo a capacidade de superar algum mecanismo de defesa da planta. O citocromo P450, codificado pelo gene cypCl1, pode representar um mecanismo complementar de destoxificação empregado por este fungo durante o estabelecimento da doença.

As técnicas espectroscópicas utilizam a interação entre luz e matéria como forma de obter informações das características moleculares de um sistema. Os diversos níveis de energia manifestam-se em bandas espectrais que ao serem interpretadas fornecem características sobre estrutura, orientação e interações a nível molecular. O presente trabalho explorou as diversas facetas espectroscópicas, aliadas a técnicas biofísicas/bioquímicas, no intuito de compreender melhor dois tipos de biomoléculas importantes para a maquinaria dos seres vivos: proteínas e peptídeos. O citocromo P450 é uma enzima do tipo monooxigenase e constitui uma das maiores superfamílias de proteínas. Essa hemoproteína foi assim nomeada devido à sua característica absorção na região da Banda de Soret (450 nm), sendo esta uma particularidade natural muito utilizada em estudos por espectroscopia. Além disso, existe interesse de estudar esta família de proteínas em virtude de suas variadas funções metabólicas e biossintéticas, nos mais diversos organismos, como catalisação de esteróides, ácidos graxos, fármacos, carcinógenos químicos e metabólitos de plantas. Em especial, para a P450 de Streptomyces clavuligerus (P450CLA), ainda não se sabe ao certo como e com quais moléculas interage, e como funciona o mecanismo utilizado pela proteína para atuar em vias de síntese como a do ácido clavulânico, importante composto terapêutico. Paralelo ao paradigma de interação de uma proteína e potenciais ligantes, o entendimento dos mecanismos de interação entre peptídeos e membranas lipídicas também são de suma importância para uma melhor compreensão dos sistemas biomoleculares. Peptídeos ativos na membrana desempenham funções fundamentais no sistema de defesa de diversos organismos e decifrar os mecanismos de como essas biomoléculas agem quando inseridas em bicamadas lipídicas pode auxiliar, por exemplo, no desenvolvimento de terapias seguras e eficientes contra doenças degenerativas. Desta forma, aproveitamos as características espectroscópicas naturais de ambas as moléculas para serem empregadas em técnicas de absorção UV/vis, Dicroísmo Circular Eletrônico e Magnético, Ressonância Paramagnética Eletrônica e Ressonância Magnética Nuclear, auxiliados por técnicas termodinâmicas e de fluorescência, de modo a explorar a interação da luz com a matéria, sem interferências de sondas externas, dando enfoque às alterações de estrutura e orientação, nas mais variadas formas de interação entre moléculas de sistemas biológicos. / Spectroscopic techniques use the interaction between light and matter as a way for obtaining information about molecular characteristics of a system. The many energy levels manifest themselves in spectral bands, which when are interpreted, it provides characteristics about structure, orientation and interactions at the molecular level. The present study explored the various spectroscopic facets, allied to biophysical/biochemical techniques, in order to understand better two important biomolecules types for living beings machinery: proteins and peptides. Cytochrome P450 is a monooxygenase-like enzyme and it belongs to one of the largest proteins superfamilies. The hemoprotein received this name due its unique spectral absorption in Soret Band region (450 nm), a natural particularity widely used in spectroscopic studies. In addition, there is interest in studying this protein family by virtue of their several metabolic and biosynthetic functions in the most diverse organisms, such as steroids, fatty acids, drugs, chemical carcinogens and plant metabolites. In particular, regarding P450 from Streptomyces clavuligerus (P450CLA), it is still unclear how and which molecules it interacts with, and how the mechanism used by the protein to act in synthesis pathways such as clavulanic acid, an important therapeutic compound. Parallel to the interaction paradigm between proteins and potential ligands, the interaction mechanisms understanding between peptides and lipid membranes are also of paramount importance for a better understanding of the biomolecular systems. Active membrane peptides play key roles in the defense system of various organisms and to decipher the mechanisms how these biomolecules act when inserted into lipid bilayers, for example in the development of safe and efficient therapies against degenerative diseases. This way, we take advantage of the natural spectroscopic characteristics of both molecules to be used in UV/vis absorption techniques, Electronic and Magnetic Circular Dichroism, Electronic Paramagnetic Resonance and Nuclear Magnetic Resonance, aided by thermodynamic and fluorescence techniques, in order to explore the interaction of light with matter, without interference from external probes, focusing on changes in structure and orientation, in the most varied forms of interaction between biological systems molecules.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2015-10-26T10:23:37Z No. of bitstreams: 2 Tese - Stela Ramirez de Oliveira - 2015.pdf: 1513277 bytes, checksum: 674fd5339cc57193fd2c8d8e2c093272 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-26T13:07:40Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Stela Ramirez de Oliveira - 2015.pdf: 1513277 bytes, checksum: 674fd5339cc57193fd2c8d8e2c093272 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-26T13:07:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Stela Ramirez de Oliveira - 2015.pdf: 1513277 bytes, checksum: 674fd5339cc57193fd2c8d8e2c093272 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-03-28 / The objective of this study is to evaluate the inhibitory effects of derivatives of medicinal plants on CYP450 activity in rat liver microsomes by HPLC-PDA (high-performance liquid chromatography - photodiode array detection). Cerrado’s four plants were chosen for the inhibition test, because of the wide popular and traditional use: Stryphnodendron adstringens Mart (barbatimão), Copaifera langsdorffii Desf (copaíba), Lafoensia pacari A.St.-Hil. (pacari) and Pterodon emarginatus Vogel (sucupira), in addition to ten herbal medicines highly commercialized in Brazilian drugstores. To evaluate the inhibition of CYP3A, CYP2D6, CYP2C9, CYP1A2 four analytical methods were developed and validated by HPLC-PDA to quantify the substrates and metabolites. Afterward dried extracts of stem bark of Stryphnodendron adstringens and Lafoensia pacari, Copaifera langsdorffii oleoresin, Pterodon emarginatus essential oil and herbal medicines were incubated for one hour with rats liver microsomes to evaluate CYP3A inhibition (2.23 mg protein / mL liver microsome). All samples were dissolved in DMSO 5% and evaluated in three concentrations (high, medium, low). The analytical methods for quantification of biomarkers was appropriate after the validation for being linear, it did not show residual effect, it showed post-processing stability, and matrix effect within the ranges specified in the brazilian regulations. The method used to prepare the microsomal incubation and the method were suitable to assess the in vitro inhibition of CYP 3A. After analyzing the dried extracts and oil and oleoresin, was observed that they did not inhibit CYP3A. The absence of inhibitory activity of the extracts in oil and oleoresin isoenzyme CYP3A, although in vitro, adds relevant information about possible interference from non-traditional use of these plants on the metabolism of a large amount of drugs biotransformed by it. Among the tested herbal medicines, which showed greater inhibition of CYP3A was Monaless (O. sativa fermented by M. purpureus), which in higher concentration inhibited 31.94%, indicating that this product may lead to a possible interference when co-administered with drugs metabolized by CYP3A and may lead to drug interactions and adverse reactions. / O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos inibitórios de derivados de plantas medicinais sobre a atividade de CYP450 em microssomas de fígado de rato por HPLC-PDA (cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de diodos). Foram escolhidas quatro plantas do Cerrado para realizar o teste de inibição, pela ampla utilização popular e tradicional: Stryphnodendron adstringens Mart (barbatimão), Copaifera langsdorffii Desf (copaíba), Lafoensia pacari A.St.-Hil. (pacari) e Pterodon emarginatus Vogel (sucupira), além de outros dez fitoterápicos bastante comercializados em drogarias brasileiras. Para avaliar a inibição de CYP3A, CYP2D6, CYP2C9, CYP1A2 foram desenvolvidos e validados quatro métodos analíticos por HPLC-PDA para quantificar os substratos (marcador) e seus metabólitos. Posteriormente, extratos secos de cascas dos caules de Stryphnodendron adstringens e Lafoensia pacari, oleorresina de Copaifera langsdorfii, óleo essencial de Pterodon emarginatus e os fitoterápicos foram incubados por uma hora com microssomas hepáticos de ratos para avaliação da inibição de CYP3A (2,23 mg de proteína/mL de lisado). Todas as amostras foram dissolvidas em DMSO 5% e avaliadas em três concentrações (alta, média e baixa). Os métodos analíticos para os biomarcadores de metabolismo se mostraram adequados após a validação por serem lineares, não demonstrarem efeito residual, apresentarem estabilidade pós-processamento e efeito matriz dentro dos limites especificados em regulamentação brasileira. O método utilizado para preparar os microssomas e o método de incubação se mostraram adequados para avaliar a inibição in vitro de CYP3A. Após analisar os extratos secos, oleorresina e o óleo, observou-se que eles não inibiram significativamente a atividade da CYP3A nessas condições. A ausência de atividade inibidora dos extratos, óleo e oleorresina na isoenzima CYP3A, apesar de ser in vitro, acrescenta uma informação relevante acerca de possível não interferência do uso tradicional dessas plantas sobre o metabolismo de uma quantidade elevada de fármacos biotransformados pela mesma. Dos dez fitoterápicos testados, o que apresentou maior percentual inibitório de CYP3A foi um produto denominado Monaless® (O. sativa fermentado por M. purpureus), que na maior concentração inibiu 31,94%, indicando que que esse produto pode levar a uma possível interferência quando co-administrado com fármacos metabolizados por CYP3A, podendo levar a interações medicamentosas e reações adversas.

A (-)- grandisina (GRA) é um produto natural da classe das lignanas e é encontrada em muitas espécies de plantas das regiões Norte e Nordeste do Brasil. Por apresentar diversas propriedades biológicas, como atividade tripanocida, anti-inflamatória, antinociceptiva, e principalmente atividade antileucêmica e antitumoral contra tumores de Ehrlich, a GRA pode ser considerada um potencial candidato a fármaco. Porém, para que a GRA se torne um fármaco são necessárias diversas etapas de estudos, incluindo estudos pré-clínicos de interações medicamentosas (DDI). As DDI ocorrem principalmente devido a inibições diretas e tempo-dependentes das enzimas do citocromo P450 (CYP450), uma superfamília de enzimas responsável por metabolizar cerca de 75% dos fármacos em uso. Os estudos pré-clínicos de DDI envolvem o conhecimento do potencial inibitório do candidato a fármaco sobre essas enzimas e esses estudos podem ser realizados empregando diversos modelos in vitro, como, por exemplo, microssomas hepáticos de humanos (HLM). Assim, nesse estudo foi avaliado o efeito inibitório da GRA sobre a atividade das principais isoformas do CYP450 e também foram determinadas as isoformas que contribuem para a formação dos metabólitos da GRA. Os resultados demonstraram que múltiplas isoformas participam da formação dos metabólitos da GRA, com destaque para a CYP2C9, que participa da formação de todos os metabólitos. Em relação aos estudos de inibição, foi possível concluir que a GRA é um inibidor fraco da CYP1A2 e CYP2D6, com valores de IC50 maiores do que 200 µM e 100 µM, respectivamente, e um inibidor moderado e competitivo da CYP2C9, com IC50 igual a 40,85 µM e Ki igual a 50,60 µM. Para a CYP3A4 o potencial inibitório da GRA foi avaliado utilizando dois substratos distintos. A GRA demonstrou ser tanto um inibidor dose-dependente moderado e competitivo dessa isoforma, quanto um inibidor tempo-dependente baseado em mecanismo com potencial de inativação equiparável ao do irinotecano, inibidor baseado em mecanismo clinicamente significativo. Utilizando a nifedipina como substrato os valores de IC50 e Ki foram 78,09 µM e 48,71 µM, respectivamente. Já os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 6,40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5,78 mL min-1 µmol-1. Para os ensaios empregando o midazolam os valores de IC50 e Ki foram 48,87 µM e 31,25 µM, respectivamente, e os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 31,53 µM, kinact= 0,049 min-1 e Clinact= 1,55 mL min-1 µmol-1. Com relação a CYP2E1, por sua vez, foi possível observar que a GRA tem capacidade de aumentar a atividade dessa isoforma significativamente a partir da concentração de 4 µM. Portanto, conclui-se que não há risco da GRA apresentar interações medicamentosas com fármacos metabolizados pela CYP1A2 e CYP2D6, enquanto que para a CYP2C9, apesar da GRA ser um inibidor moderado dessa isoforma, o risco é baixo. Já para medicamentos metabolizados pela CYP2E1 e CYP3A4 o risco de DDI existe e isso deve ser cuidadosamente monitorado in vivo, principalmente porque a CYP3A4 é a isoforma responsável por catalisar o metabolismo da maioria dos fármacos. / (-)-grandisin (GRA) is a lignanic natural product found in many species of plants from North and Northeast of Brazil. This compound has several biological properties, such as trypanocide, anti-inflammatory, antinociceptive, antileukemia activity and antitumor activity against Ehrlich tumor. Because of these biological properties, GRA is considered a potential drug candidate, however, before becoming a new drug, GRA has to undergo various tests, including preclinical drug-drug interactions (DDI) studies. Most of the times, DDI occur because of direct and time-dependent inhibitions of cytochrome P450 (CYP450) enzymes, an enzyme superfamily responsible for metabolizing the vast majority of drugs administered. Preclinical drug-drug interactions studies involve the evaluation of the potential of a drug candidate to inhibit this superfamily of enzymes and these studies can be conducted using in vitro models, such as human liver microsomes (HLM). Therefore, in this project, the inhibitory effect of GRA on the activity of some CYP450 isoforms was evaluated and the isoforms that catalyze the formation of GRA\'s metabolites were also determined. Results showed that multiple CYP450 isoforms participate in the GRA\'s metabolites formation, highlighting CYP2C9, which catalyzes the formation of all metabolites. The inhibition studies showed that GRA is a weak inhibitor of CYP1A2 and CYP2D6, with IC50 values greater than 200 µM and 100 µM, respectively, and a moderate and competitive inhibitor of CYP2C9, with IC50 value equal to 40.85 µM and Ki value equal to 50.60 µM. The capability of GRA to inhibit CYP3A4 was evaluated using two different substrates. GRA showed to be a moderate and competitive dose- dependent inhibitor of this isoform and also a mechanism-based time-dependent inhibitor with potential of inactivation comparable to irinotecan, a clinically significant mechanism-based inhibitor. IC50 and Ki values obtained using nifedipine as substrate were 78.09 µM and 48.71 µM, respectively, and inactivation kinetics parameters were KI= 6.40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5.78 mL min-1 µmol-1. On the other hand, IC50 and Ki values using midazolam as substrate were 48.87 µM and 31.25 µM, respectively, and the values of inactivation kinetics parameters were KI= 31.53 µM, kinact= 0,049 min-1 and Clinact= 1.55 mL min-1 µmol-1. With respect to CYP2E1, it was observed that GRA increases its activity significantly from a concentration of 4 µM. Therefore, it is possible to conclude that there is no risk of DDI between GRA and drugs metabolized by CYP1A2 and CYP2D6, while for CYP2C9, although GRA is a moderate inhibitor of this isoform, the risk is low. Finally, for drugs metabolized by CYP3A4 and CYP2E1 there is risk of DDI and this should be carefully monitored in humans, mainly because CYP3A4 is an isoform responsible for catalyzing the metabolism of most drugs in use.

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Fernanda Caroline Soardi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T09:56:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lusa_AnaLeticiaGori_D.pdf: 4582728 bytes, checksum: a14d0d0453e90b4a59cb02532b21d83b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A Hiperplasia congênita da Adrenal (HCA) é uma das doenças mais comuns com herança autossômica recessiva. Uma das causas é a deficiência da 21-hidroxilase que surge por mutações no gene CYP21A2. O desequilíbrio na síntese de cortisol causa um estímulo excessivo das glândulas adrenais pelo hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) e, consequentemente, à hiperplasia da glândula e ao aumento na síntese de andrógenos. O presente trabalho teve por objetivo clonar e expressar variantes do gene CYP21A2 e, avaliar as variantes enzimáticas da 21-hidroxilase quanto à atividade residual, comparando suas formas nativa e mutantes. Foi também realizado o estudo in silico para se comparar as estruturas das enzimas 21-hidroxilase e 3?-hidroxiesteróide desidrogenase tipo 2 (HSD3B2) avaliando o impacto das alterações provocadas por mutações sobre a estrutura da proteína nativa. Para a enzima 21-hidroxilase, as mutações analisadas quanto à atividade foram: p.Ser113Phe, p.Pro267Leu, p.Val358Ile, p.Arg426Cis e, as combinações p.Ile172Asn+p.Val358Ile e p.Val281Leu+p.Arg426Cis. Nos testes de atividade enzimática, as enzimas com as mutações p.Val358Ile e as combinações p.Ile172Asn+p.Val358Ile e p.Val281Leu+p.Arg426Cis apresentaram valores de atividade residual compatíveis com a forma perdedora de sal. Por outro lado, a enzima com a mutação p.Pro267Leu apresentou atividade residual maior que 50%, compatível com mutações da forma não clássica. As mutações p.Ser113Phe e p.Arg426Cis, por sua vez, apresentaram atividade residual entre 2 e 7% que, em relação aos controles utilizados, foram correspondentes à forma clássica virilizante simples. Os modelos estruturais gerados para as enzimas 21-hidroxilase portadoras da deleção p.(Gln389_Ala391del) e das mutações individuais ou combinadas acima citadas foram comparados ao da enzima nativa. Estudo similar foi realizado com enzimas HSD3B2 nativa e portadoras de duas mutações, p.Pro222Gln e p.Pro222Thr, relacionadas à forma perdedora de sal da deficiência de HSD3B2. Esse estudo demonstrou boa correlação das mutações encontradas nos pacientes com os seus fenótipos tanto no que diz respeito à atividade enzimática quanto às alterações estruturais. Assim, ficou demonstrado que este tipo de abordagem é eficaz para a avaliação dos aspectos funcionais de mutações inéditas / Abstract: Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is one of the most common hereditary autosomal recessive diseases. 21-hydroxylase deficiency is one important cause of the disease and results from mutations in CYP21A2 gene. The unbalance in cortisol synthesis leads to excessive stimulation of adrenal glands by adrenocorticotropic hormone (ACTH), consequently, to adrenal hyperplasia and excessive androgen synthesis. The present study aimed to obtain and express CYP21A2 clones carrying sequence variations and to evaluate 21-hydroxylase enzymatic residual activities of variant enzymes in comparision to the wild-type. In silico studies were also performed to compare the structure of 21-hydroxylase and 3?-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (HSDB2) evaluating the impact of mutations upon the native structure of the enzymes. Residual activity analyses for 21-hydroxylase enzyme comprised the mutations p.Ser113Phe, p.Pro267Leu, p.Val358Ile and the combined mutations p.Ile172Asn+p.Val358Ile and p.Val281Leu+p.Arg426Cys. The assays indicated that p.Val358Ile and p.Ile172Asn+p.Val358Ile and p.Val281Leu+p.Arg426Cys reduced CYP21A2 activity to levels corresponding to the salt wasting form. Whereas the enzyme bearing p.Pro267Leu mutation showed residual activity higher than 50% indicating a nonclassic mutation. Conversely, p.Ser113Phe and p.Arg426Cys mutations showed residual activities that varied between 2% and 7% that, compared to controls, corresponded to simple virilizing form. Structural models generated for 21-hydroxylase enzyme with p.(Gln389_Ala391del) and each individual or combined mutations cited above have been compared to the native enzime. Similar study was performed with HSD3B2 enzyme in its native and mutated formas with p.Pro222Gln e p.Pro222Thr that are related to the salt wasting form of HSD3B2 deficiency. This study demonstrated a good genotype-phenotype correlation in patients either for residual activities or for structural changes. Therefore, it has been demonstrated that such analyses are effective to evaluate functional aspects for novel mutations / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Inspired by natural catalytic systems, metalloporphyrins and Salen complexes have been used as catalysts for the oxidation of xenobiotics in the presence of several oxygen donors, both in homogeneous and heterogeneous catalysis. These catalysts have been highly efficient and selective in the reactions of different substrates, such as pharmaceuticals and pesticides. In this context, the work developed in this dissertation presents the oxidation studies of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid herbicide using ferroporphyrins and Jacobsen catalyst as catalysts of these reactions with several oxygen donors. The results shows that the metalloporphyrin and the complex employed in this study are efficient catalysts for oxidation of 2,4-D in the presence of oxygen donors iodosilbenzene (PhIO), metachloroperbenzoic acid (m-CPBA) and hydrogen peroxide (H2O2) both in homogeneous and heterogeneous. The reactions with the unsupported catalysts achieved higher yields than those obtained with the supported catalysts, which is possibly related to the difficulties of access to the catalytic center imposed by the support. The conversion of 2,4-D reached more than 50% in some systems, and, in general, oxidation reactions with the three oxygen donors were selective promoting the formation of hydroquinone (reactions with PhIO and H2O2) and 3,5- dichlorocatechol (reactions with m-CPBA). One of the products identified in the reactions is a metabolite of 2,4-D produced in vivo systems, indicating that the catalysts used in this study can be considered good models of cytochrome P450 in the oxidation of 2,4-D. / Inspirados em sistemas catalíticos naturais, metaloporfirinas e complexos salen têm sido utilizados como catalisadores para a oxidação de xenobióticos na presença de diversos doadores de oxigênio, tanto em catálise homogênea quanto heterogênea. Esses catalisadores têm se mostrado altamente eficientes e seletivos nas reações de diferentes substratos, tais como fármacos e pesticidas. Dentro desse contexto, o trabalho desenvolvido nessa dissertação apresenta os estudos da oxidação do herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) utilizando ferroporfirinas e catalisador de Jacobsen como catalisadores dessas reações com diversos doadores de oxigênio. Os resultados mostram que a metaloporfirina e o complexo salen empregados nesse estudo são eficientes catalisadores para a oxidação do 2,4-D na presença dos doadores de oxigênio iodosilbenzeno (PhIO), ácido metacloroperbenzóico (m-CPBA) e peróxido de hidrogênio (H2O2), tanto em meio homogêneo como heterogêneo. As reações com os catalisadores não suportados alcançaram rendimentos mais altos do que os obtidos com os catalisadores suportados, o que está possivelmente relacionado as dificuldades de acesso ao centro catalítico imposta pelo suporte. A conversão de 2,4-D atingiu mais de 50% em alguns sistemas, e, em geral, as reações de oxidação com os três doadores de oxigênio foram seletivas promovendo a formação de hidroquinona (reações com PhIO e H2O2) e 3,5-diclorocatecol (reações com m-CPBA). Um dos produtos identificados nas reações é um metabólito do 2,4-D produzido sistemas in vivo, indicando que os catalisadores utilizados nesse estudo podem ser considerados bons modelos do citocromo P450 na oxidação do 2,4-D.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-08-29T21:11:40Z No. of bitstreams: 1 Silvana Sousa Paz Avaliação de marcadores....pdf: 756990 bytes, checksum: 5aac886be232eac44d86b25a30837ac4 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-29T21:11:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silvana Sousa Paz Avaliação de marcadores....pdf: 756990 bytes, checksum: 5aac886be232eac44d86b25a30837ac4 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / As leucemias são malignidades hematopoiéticas, caracterizadas por subgrupos biologicamente distintos, sendo os tipos mais frequentes de cânceres em crianças e adolescentes. Polimorfismos em genes de enzimas que metabolizam xenobióticos podem estar relacionados com a inserções/deleções, polimorfismos de nucleotídeo simples (SNP’s) e variações no número de cópias e têm sido relacionados com a patogênese de algumas neoplasias hematológicas, como a leucemia linfóide aguda (LLA). O objetivo deste estudo foi o de determinar as frequências de polimorfismos em genes associados ao estresse oxidativo e metabolismo de xenobióticos (GSTT1, GSTM1, CYP2E1, NQO1 e MPO), em pacientes pediátricos com LLA, associando-as a aspectos clínicos e marcadores de evolução da doença. A casuística foi composta por 37 pacientes pediátricos seguidos na clínica ONCO e tratados pelo protocolo GBTLI-LLA 93. O perfil hematológico dos pacientes foi realizado ao diagnóstico e durante o tratamento e os polimorfismos gênicos foram investigados por reação da polimerase em cadeia - polimorfismo de tamanho de fragmento de restrição (PCR-RFLP) e por reação da polimerase em cadeia multiplex (PCR Multiplex). As análises estatísticas apresentaram significância para os valores de leucócitos totais nos D1 e D7 (p= 0,0016) e nos D1 e D14 (p= 0,0059); linfócitos nos D1 e D7 (p= 0,0088) e D1 e D14 (p= 0,0101); segmentados neutrófilos nos D1 e D7 (p= 0,0033) e D1 e D14 (p= 0,0252); blastos periféricos D1 e D7 (p< 0,0001) e D1 e D14 (p< 0,0001) e; para a contagem de blastos na medula óssea (MO) nos D1 e D15 (p<0,0001), D1 e D28 (p< 0,0001) e D15 e D28 (p= 0,0005). As frequências alélicas e genotípicas para os genes estudados estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg. A mutação do gene MPO foi associada a infiltração da MO (p= 0,0473) e presença de blastos no líquor (p= 0,0473). O polimorfismo do gene GSTT1 foi associado à contagem de leucócitos (p= 0,014) e plaquetas (p= 0,0034) no D1 e a contagem de leucócitos (p=0,037) e segmentados neutrófilos (p= 0,0008) no D7. A presença do polimorfismo no gene NQO1 foi associado à infiltração da MO (p= 0,0410) e a presença de blastos no líquor (p= 0,0410). Entretanto, o polimorfismo NQO1 apresentou associação com a presença de palidez (p=0,0096). Os dados encontrados corroboram em parte com dados encontrados na literatura, sendo necessária a realização de um estudo com numero maior de pacientes para confirmação dos achados relacionados aos genes investigados e a LLA. / Leukemia is characterized by biologically distinct subgroups and is the most frequent hematological malignity in childhood. Polymorphisms in genes of enzymes that metabolize xenobiotics may be related to insertions/ deletions, single nucleotide polymorphisms (SNP's) and gene copies variation and have been related to the pathogenesis of some hematologic malignancies, including acute lymphoblastic leukemia (ALL). The aim of this study was to investigate genes polymorphisms associated with the oxidative stress and xenobiotic metabolism (GSTT1, GSTM1, CYP2E1, NQO1 and MPO) in a group of childhood ALL patients, associating them with clinical evolution and prognostic markers. The casuistic was compound by 37 pediatric patients followed and treated at the clinic ONCO with the protocol GBTLI-LLA 93. The hematological profile of patients was performed at diagnosis and during treatment and gene polymorphisms were investigated by Polimerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorfism (PCR-RFLP) and Polimerase Chain Reaction Multiplex (Multiplex PCR). Statistical analyses were significant for values of total leukocytes in D1 and D7 (p= 0.0016) and in D1 e D14 (p= 0.0059); lymphocytes in D1 and D7 (p= 0.0088), D1 and D14 (p= 0.0101); neutrophils in D1 and D7 (p= 0.0033), D1 and D14 (p= 0.0252). It was also find statistical significance at the number of peripheral blasts in D1 and D7 (p< 0.0001), D1 and D14 (p< 0.0001); the blast count in bone marrow (BM) in D1 and D15 (p<0.0001), D1 and D28 (p< 0.0001) and D15 and D28 (p= 0.0005). The allelic and genotypic frequencies of all gene polymorphism investigated were in Hardy-Weinberg equilibrium. The MPO gene mutation was associated with infiltration of the BM in D28 (p= 0.0473) and the presence of blasts in the CSF (p= 0.0473). The GSTT1 gene polymorphism was associated with leukocyte (p= 0.014) and platelet counts (p= 0.0034) in D1 and with leukocytes (p=0,037) and neutrophils counts (p= 0.0008) in D7. The NQO1 gene polymorphism presence was associated with BM infiltration at D28 (p= 0.0410) and the presence of blasts in the CSF (p= 0.0410). However, the NQO1 polymorphism was associated with the presence of pallor (p=0.0096). Result described here corroborated in part with previous described data, being necessary to carry out additional study with a larger number of patients to confirm the finding related to genes polymorphism investigated and the clinical evolution of ALL patients.