TARGINO, C. S. P. C. Estudo da atividade antifúngica e dos mecanismos de ação do peptídeo Ctn[15-34], um fragmento c- terminal da Crotalicidina, derivado de uma catelicidina expressa nas glândulas de veneno de cascavéis. 2017. 131 f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by ciências farmacêuticas pgcf (pgcf.ufc@gmail.com) on 2017-06-12T13:41:28Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_cspctargino.pdf: 6282751 bytes, checksum: 5fc1e8e14aea822773a453246b9ae64c (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-06-12T16:36:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_cspctargino.pdf: 6282751 bytes, checksum: 5fc1e8e14aea822773a453246b9ae64c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-12T16:36:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_cspctargino.pdf: 6282751 bytes, checksum: 5fc1e8e14aea822773a453246b9ae64c (MD5) Previous issue date: 2017-04-27 / Crotalicidin (Ctn), a 34-residue cathelicidin from a South American rattlesnake, and its fragment (Ctn[15–34]) have shown anti-infective and cytotoxic activities against Gramnegative bacteria and certain tumor lines, respectively. The extent of such effects has been related to physicochemical characteristics such as helicity and hydrophobicity. We now report the anti-fungal activity of Ctn and its fragments (Ctn[1–14]) and (Ctn[15–34]) And characterize the possible mechanisms of action of peptides against Candida albicans.MIC determination and luminescent cell viability assays were used to evaluate the anti-infective activity of Ctn and its fragments (Ctn[1–14]) and (Ctn[15–34]) as anti-fungal agents against opportunistic yeast and dermatophytes. Cytotoxicity towards healthy eukaryotic cells was assessed in vitro with healthy human kidney-2 (HK-2) cells and erythrocytes. Fragments Ctn[1–14] and Ctn[15–34] lost activity against dermatophytes, but became more active against pathogenic yeasts, including several Candida species and Cryptococcus laurentii, with MICs as low as 5 μM. Interestingly, the two peptide fragments were less cytotoxic to healthy HK-2 cells and less hemolytic to human erythrocytes than the standard-of-care amphotericin B (AMB).The checkerboard technique was performed to estimate the effects of combining either one of the peptides with AMB against C. albicans strains, and it was the synergy between Ctn peptides and AMB, with consequent reduction in MICs of both drug and peptides. In general, the Ctn[15-34] presented the smallest MICs against the different Candida species, and low cytotoxicity against eukaryotic cells. To characterize the anti- Candida activity of Ctn[15-34] were performed the phospholipase activity assay, time killing assay, and flow cytometry techniques.The plasmatic membrane damage was roughly estimated based on the amount of product generated by phospholipase activity after treatment of 4N3OBA lipid (substrate) with Ctn[15-34]; At 10 μM a big increase in phospholipase activity could be noticed compared to non-treated and treated lipids at 5μM. Analysis of the time killing assays of cells treated with Ctn [15-34] and AMB, showed that they did not reduce the number of CFUs in the same fashion, which suggested that Ctn[15-34] and AMB could have different mechanisms of action against C.albicans. Ctn[15-34] alone promoted cell membrane disruption, like other AMPs, in yeasts. Moreover, the C. albicans cell death pathway detected after the peptide treatment was necrosis, which further confirmed cell membrane damage capacity by Ctn[15-34].Together, Ctn and its fragments are promising for the treatment of fungal diseases, and the Ctn [15-34] is a most valuable candidate for further 12 development as an antifungal therapeutic peptide lead, particularly against yeast infections where it could be usedfully applied either alone or in combination with a standard antibiotic such as AMB. / A crotalicidina (Ctn), uma catelicidina de 34-resíduos isolada de cascavel da América do Sul, e o seu fragmento (Ctn[15-34]) demonstraram previamente atividades antimicrobiana contra bactérias Gram negativas e citotóxica contra células tumorais. A extensão de tais efeitos tem sido relacionada com suas características físico-químicas, como a forma helicoidal e hidrofobicidade. O presente trabalho teve o objetivo geral de avaliar a atividade antifúngica do Ctn e seus fragmentos (Ctn[1-14] e Ctn[15-34]) e caracterizar os possíveis mecanismos de ação dos peptídeos contra Candida albicans. Determinação de Concentração inibitória mínima (CIM) e ensaios de viabilidade celular por ensaios de luminescência foram utilizados para avaliar a ação do Ctn e seus fragmentos (Ctn[1-14] e Ctn[15-34]) como agentes antifúngicos contra cepas clínicas de leveduras oportunistas e dermatófitos. A citotoxicidade em relação a células eucarióticas foi avaliada in vitro com células renais da linhagem HK-2 e eritrócitos. Ctn foi o peptídeo mais ativo contra dermatófitos e também o mais tóxico para células eucarióticas saudáveis. Os fragmentos Ctn[1-14] e Ctn [15-34] não demonstraram atividade contra dermatófitos, mas foram ativos contra leveduras patogênicas, incluindo várias espécies de Candida sp. e Cryptococcus laurentii, com CIMs de até 5μm. É interessante notar que os dois fragmentos peptídicos foram menos citotóxicos para as células HK-2 e menos hemolíticos para os eritrócitos humanos do que a Anfotericina B (ANF). A técnica checkerboard foi realizada para estimar os efeitos da combinação dos peptídeos com ANF frente a cepas de C. albicans. Foi observado o efeito sinérgico entre as crotalicidinas e a ANF, com a consequente redução nas CIM de ambos, fármaco e peptídeos. De modo geral, o fragmento Ctn[15-34] apresentou as menores CIMs contra as diferentes espécies de Candida, e baixa citotoxicidade contra células eucariotas. Para caracterizar a atividade anti-Candida do Ctn[15-34] foram realizados ensaios para determinar atividade fosfolipásica, a curva do tempo de morte, e técnicas de citometria de fluxo. O dano à membrana plasmática foi estimado com base na quantidade de produto gerada pela atividade fosfolipásica após tratamento do lípido 4N3OBA (substrato) com Ctn[15-34]; a 10 μM pode ser observado um grande aumento na atividade fosfolipásica em comparação com os lipídeos não tratados, e tratados com 5 μM. A análise das curvas de tempo de morte das células tratadas com Ctn[15-34] e AMB, mostrou que eles não reduziram o número de UFCs da mesma forma, sugerindo que Ctn[15-34] e AMB poderiam ter diferentes mecanismos de ação contra C .albicans. Ctn[15-34] promoveu rompimento da membrana celular, assim como outros peptídeos 10 antimicrobianos (PAMs), em leveduras. Além disso, a via de morte celular da C. albicans detectada por citometria após o tratamento com peptídeo foi a necrose, o que confirmou ainda mais a capacidade de dano da membrana celular por Ctn[15-34]. Juntos, Ctn e seus fragmentos são promissores para o tratamento de doenças fúngicas, e o Ctn[15-34] é um candidato muito valioso para o futuro desenvolvimento de um peptídeo antifúngico, que pode ser aplicado sozinho ou em combinação com um antibiótico padrão como a AMB

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-10-17T03:22:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347963.pdf: 5315133 bytes, checksum: 479bf40f096e7da108ddccad20292210 (MD5) Previous issue date: 2017 / O diagnóstico das neoplasias de células linfoides B maduras (NCLBM) é baseado nos exames histopatológicos, imunofenotípicos, citogenéticos e moleculares. Atualmente, a imunofenotipagem por citometria de fluxo é considerada uma ferramenta fundamental para o diagnóstico dessas neoplasias e existe uma tendência de tentar alcançar a subclassificação correta das NCLBM com apenas a avaliação do imunofenótipo. No entanto, devido à sobreposição fenotípica, esse propósito não pode ser atingido em todos os casos. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar a importância dos novos marcadores imunofenotípicos CD150 e CD307a para o diagnóstico diferencial das NCLBM. Por conseguinte, foi avaliada a expressão de ambos antígenos por meio da citometria de fluxo em 120 amostras de pacientes portadores de NCLBM. As amostras foram marcadas com o painel anticorpos monoclonais pela técnica de marcação direta e a expressão de CD150 e CD307a foi avaliada por meio da intensidade de fluorescência média (IFM) nas células B neoplásicas e qualitativamente por meio da comparação com o controle negativo interno. Os resultados mostram que existe uma expressão diferencial do antígeno CD150 entre os casos de linfoma de Burkitt (LB) e as neoplasias de células B precursoras, portanto, a expressão de CD150 parece ser útil na identificação dos casos de LB com características fenotípicas de precursor B. A forte expressão de CD150 nos dois casos de linfoma folicular (LF) grau 3A avaliados sugerem que esse marcador é importante para o diagnóstico diferencial desse subtipo de NCLBM e o LF de baixo grau. A perda da expressão de CD150 observada nos plasmócitos clonais dos linfomas com diferenciação plasmocitária (LDP), representa um achado inédito e a única alteração fenotípica observada em todos casos de LDP estudados. Foi observado que todos os casos de linfoma de células do manto (LCM) apresentaram diminuição da expressão de CD307a em relação aos linfócitos B normais. Em contrapartida, a expressão desse marcador no grupo das leucemias linfoides crônicas (LLC) foi heterogênea com casos totalmente negativos até casos com expressão forte e maior à observada nos linfócitos B normais. Assim, pode ser inferido que a expressão moderada e forte desse marcador poderia excluir o diagnóstico de LCM. Foi corroborado que tanto o marcador CD150 quanto o CD307a apresentam menor expressão nos casos de LLC com marcadores prognósticos desfavoráveis. Em vista dos resultados obtidos, a inclusão desses marcadores no painel imunofenotípico de rotina pode contribuir com o aprimoramento da imunofenotipagem por citometria de fluxo para o diagnóstico diferencial das NCLBM.<br> / Abstract : Diagnosis of mature B cell neoplasms (MBCN) is based on results yielded by histopathological, immunophenotypic, cytogenetic and molecular analysis. Consequently, flow cytometric immunophenotyping is deemed fundamental as a tool for B cell neoplasms diagnosis. Given the advantages this methodology provides, there exists a tendency to attempt to fully subclassify MBCN solely on the basis of flow cytometric immunophenotyping results. However, due to the existence of overlapping phenotypes this aim is not achieved in every single case. Because of that, the goal of the present study was to investigate on the importance of novel immunophenotypic markers CD150 and CD307a in the differential diagnosis of the MBCN. To accomplish that, the expression of both antigens was analyzed in 120 samples taken from patients diagnosed with MBCN. Samples were assessed with a panel of monoclonal antibodies using a direct staining protocol and the CD150 and CD307a expression was quantitated by calculating the mean fluorescence intensity (MFI) for neoplastic B cell in each case, and was also ascertained in qualitative terms in comparison with internal negative control. A differential expression of CD150 has been proven to exist between Burkitt lymphoma (BL) and precursor B cell neoplasms cases; therefore, the expression of CD150 might identify BL patients with phenotypic features of B cell precursors. Both follicular lymphoma (FL) grade 3A cases studied showed high homogenic levels of that marker, which becomes relevant in differential diagnosis of that entity with low grade FL. Neoplastic plasma cells of B cell lymphomas with plasmacytic differentiation (LPD) showed a loss of expression of CD150 when compared to normal polyclonal plasma cells. Such decrease was the only phenotypic aberration observed in every LPD sample evaluated. It was also ascertained that every mantle cell lymphoma (MCL) case showed lower levels of CD307a in comparison to normal B cell population. Differently, a spectrum of CD307a expression, from negative to bright, was seen in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Thus, moderate and bright CD307a expression virtually excludes MCL diagnosis. A lower expression of both markers in CLL patients with unfavorable prognosis was confirmed in this study. In conclusion, these results suggest that the inclusion of both markers in an immunophenotypic panel could improve the differential diagnosis of MBCN by flow cytometry.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_8373_Dissertação Aline Tonini.pdf: 3894770 bytes, checksum: 01254e8bb2870f224c8464341035058b (MD5) Previous issue date: 2014-12-04 / O diagnóstico de rotina pós-natal da toxoplasmose congênita é baseado na detecção de anticorpos IgM e/ou IgA anti-T. gondii no soro dos neonatos. No entanto, em um número significativo de neonatos infectados esses anticorpos não são detectados, dificultando o diagnóstico precoce da doença. Portanto, neste estudo foi avaliado o desempenho da pesquisa de anticorpos anti-T. gondii por citometria de fluxo no diagnóstico sorológico pós-natal precoce da toxoplasmose congênita. Foram avaliados 88 amostras de soro de crianças com infecção congênita pelo T. gondii (TOXO) e 19 amostras de soro de crianças não infectadas (NI). A sensibilidade do teste foi de 47,6% para IgM, 72,6% para IgA e 75% para IgG, com 100% de especificidade para todos os testes. Quanto a pesquisa de subclasses de IgG, a sensibilidade foi de 73,9% para IgG1, 60,2% para IgG2 e 83% para IgG3 com 100% de especificidade para todos os testes. A sensibilidade de IgG4 foi superior às demais, alcançando 94,7%, embora apresentou uma baixa especificidade de 4,6%. A pesquisa da avidez de IgG quando aplicada para segregação dos grupos TOXO e NI, apresentou um ótimo desempenho com 97% de sensibilidade e 93% de especificidade. Foi também realizado uma análise comparativa da presença de IgG e IgG3 em crianças do grupo TOXO e NI com suas respectivas mães. Nossos resultados mostraram que as crianças infectadas apresentaram uma reatividade média desses anticorpos equivalentes a de suas respectivas mães, o que sugere estarem sintetizando estes anticorpos em resposta a infecção pelo T. gondii. Em contraste, as crianças não infectadas apresentaram uma menor reatividade média desses anticorpos em relação à suas respectivas mães. Além disso, nosso estudo propôs um algoritmo para o diagnóstico da toxoplasmose congênita utilizando o teste de IgM por métodos convencionais disponíveis na rotina dos laboratórios clínicos como estratégia inicial seguido da pesquisa de IgG3 e avidez de IgG pela citometria de fluxo com desempenho final de 98% de sensibilidade e 93% de especificidade. A análise dos dados demonstrou a aplicabilidade da citometria de fluxo para a pesquisa de anticorpos IgG3 e avidez de IgG anti-T. gondii como uma ferramenta complementar para o diagnóstico precoce da toxoplasmose congênita.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-10-07T13:04:23Z No. of bitstreams: 1 2014_TatianaMariaGiraldoJaramillo.pdf: 3709622 bytes, checksum: febfca93298a6da4512196ad16ff3e02 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2014-10-15T14:05:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_TatianaMariaGiraldoJaramillo.pdf: 3709622 bytes, checksum: febfca93298a6da4512196ad16ff3e02 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-15T14:05:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_TatianaMariaGiraldoJaramillo.pdf: 3709622 bytes, checksum: febfca93298a6da4512196ad16ff3e02 (MD5) / A infecção por Leishmania (Viannia) braziliensis tem um amplo espectro de manifestações clínicas e imunológicas. Uma variedade de células estão envolvidas na defesa do hospedeiro contra o parasito. Entre elas, as células dendríticas (DCs) são elementos chaves para o sistema imune, pois atuam como sentinelas na periferia e alertam os linfócitos T do tipo do antígeno invasor, direcionando sua polarização e inicializando uma resposta imune. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar a interação de células dendríticas humanas com L. braziliensis, já que, esse contato desencadeia estímulos para a produção de citocinas e moléculas co-estimulatórias envolvidas na resposta inflamatória, contribuindo para o desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa protetora. Assim, monócitos humanos foram isolados a partir de células mononucleares de sangue periférico, purificados por separação magnética e colocados em cultura com IL-4 e GM-CSF para gerar DCs imaturas, as quais foram infectadas com promastigotas de L. braziliensis durante 12 e 24 h. As células foram caracterizadas por citometria de fluxo, usando os marcadores de superfície CD1a, HLA-DR, CD86 (B7-2)e DC-SIGN (CD209). Foi observada uma taxa de infecção de 46±3.5% com 7,2±0.6 amastigotas/DCs e 52.5± 2.4% com 6,1±1.6 amastigotas/DCs após 12 e 24 h de cultura, respectivamente. Os marcadores de superfície revelaram uma porcentagem de expressão de 70,5% (CD1a), 87,9% (HLA-DR), 94% (CD86) e 97,5% (DC-SIGN) nas células não infectadas; e 71% (CD1a), 89,9% (HLA-DR), 98,3% (CD86) e 97% (DC-SIGN) para células infectadas após 24 h. Após 12 h de infecção não detectamos alterações no padrão de expressão de moléculas de superfície. A inibição da apoptose pode tanto favorecer a apresentação dos antígenos quanto a disseminação do parasito. Além disso, foram encontradas principalmente as citocinas IL-12p40 e TNF-α nos sobrenadantes das culturas, enquanto não detectamos as citocinas IL-10, IL-6, IL-1β e TGF-β. __________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmania (Viannia) braziliensis infection leads to a broad spectrum of clinical and immunological manifestations. A great variety of cells is involved in host defense against the parasite. Among those, dendritic cells (DCs) are key elements of the immune system, which acts as sentinels in the periphery and alert T lymphocytes about the type of invading antigen, addressing their polarization and initiating an early immune response. The aim of this work was study the interaction of human dendritic cells with L. braziliensis, this contact triggers stimuli for the production of cytokine and co-stimulatory molecules involved in the inflammatory response, contributing to the development of protective adaptive immune response. Thereby, monocytes were isolated from peripheral blood mononuclear cells, subsequently purified by magnetic separation, and cultured with IL-4 and GM-CSF to generate immature DCs, which were infected with L. braziliensis promastigotes during 12 e 24 h. The cells where characterized by flow cytometry using surface markers CD1a, HLA-DR, CD86 and DC-SIGN. It was observed an infection rate of 46±3.5% with 7,140±0.6 amastigotes/DC and 52.50± 2.4% with 6,1±1.6 amastigotes/DC 12 and 24 h post infection, respectively. The surface markers showed a percentage of expression of 70.5% (CD1a), 87.9% (HLA-DR), 94% (CD86) and 97.5% (DC-SIGN) in non-infected cells; and 71% (CD1a), 89.9% (HLA-DR), 98.3% (CD86) and 97% (DC-SIGN) in infected cells after 24 h infection. After 12 h of infection, we not detected differences of surface molecules expression. Moreover, cell death delay can either stimulate antigen- presentation or favor parasite dissemination. Additionally, the cytokines IL-12p40 and TNF- α were detected in the culture supernatants, whereas IL-10, IL-6, IL-1β and TGF-β were not detected.

Made available in DSpace on 2018-08-01T22:33:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_8400_Renata Flavia de Carvalho.pdf: 1192218 bytes, checksum: f603e8dbc23084f4feb3b0cc306ed227 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / A poliploidia desempenha um papel relevante na diversificação e especiação das Angiospermas, incluindo a família Primulaceae. Espécies diploides, tetraploides e octaploides são reportadas para os gêneros Cyclamen, Dodecatheon e Primula, mas os aspectos evolutivos que conduzem às mudanças cromossômicas são pouco compreendidos. Para expandir o conhecimento sobre esse assunto em Primulaceae, nós estudamos três espécies de Myrsine (M. coriacea, M. umbellata e M. parvifolia) que mostram diferentes habilidades para ocupar os variados tipos de vegetação dentro da Mata Atlântica brasileira. A caracterização citogenética evidenciou indivíduos com 2n = 45 cromossomos para M. parvifolia e M. coriacea, com a maioria dos indivíduos das três espécies tendo 2n = 46. Os cariogramas apresentaram pares de cromossomos morfologicamente semelhantes e distintos, sugerindo uma origem monofilética e alopoliploide verdadeiro para as três espécies. Além disso, um evento de pós-poliploidização relacionado a rearranjos cromossômicos estruturais foi evidenciado a partir de diferenças no valor médio nuclear 2C e morfometria dos cromossomos encontrados entre as espécies. Assim como tem sido feito para outras espécies, abordagens de citogenética e de tamanho do genoma acuradas representam um ponto de partida para o entendimento da origem e influência da poliploidização e mudanças pós-poliploidização no cariótipo das espécies de Myrsine. Além disso, a ocupação diversa das espécies de Myrsine em ambientes distintos pode ser atribuída à alopoliploidia e seus efeitos. Portanto, este estudo pioneiro de Myrsine fornece informações sobre o papel relevante da poliploidia na evolução do cariótipo e diversificação em Primulaceae. Palavras-chave: Citogenética, citometria de fluxo, Floresta Atlântica, Myrsinaceae, poliploidia, Rapanea.

Orientador : Irene Lorand-Metze / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T08:47:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_GislaineBorba_M.pdf: 1136616 bytes, checksum: 39ae5f174c71eaaa0994339452586771 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A leucemia linfóide crônica apresenta grande variabilidade na sua apresentação e evolução clínica, bem como, na sua resposta ao tratamento. Estudando a apoptose destas células in vivo, observou-se que ela se encontra bloqueada, o que não ocorre após a cultura a curto prazo, onde este processo acontece espontaneamente. Neste estudo, avaliamos o grau de apoptose in vitro e suas interações com alguns parâmetros clínicos e laboratoriais. Foram avaliados a idade, o estádio clínico segundo os critérios de Rai e Binet, índice de massa tumoral (TTM) e os seguintes parâmetros laboratoriais: hemoglobina (g/dl), contagem de leucócitos, linfócitos e plaquetas (/l ), a porcentagem de células com cluster de AgNOR, a porcentagem de células positivas para a Anexina V, o índex e o número absoluto de células CD8 positivas. A apoptose foi medida através da técnica da Anexina V e a taxa de proliferação através da técnica das AgNORs. Houve correlação inversa entre a porcentagem de células positivas para a Anexina V e a contagem de linfócitos periféricos (r=-0,49), com o estádio de Rai (r=-0,40), com o estádio de Binet (r=-0,50), com com o TTM (r=-0,51) e com a porcentagem de células com um cluster de AgNOR (r=-0,45). As correlações diretas ocorreram com os valores de hemoglobina (r=0,34) e de plaquetas (r=0,52). O número de células CD8 positivas mostrou correlação com a contagem de linfócitos periféricos (r=0,49). Quando esta variável foi mantida constante, foi possível detectar uma correlação entre a contagem de células CD8 positivas e o estádio clínico (r=-0,47), com o TTM (r=-0,42) e com a contagem de plaquetas (r=0,67). Os linfócitos CD4 positivos apresentaram uma correlação somente com os linfócitos CD8 positivos. Na análise de clusters, foi possível a criação de três grupos de pacientes com diferentes taxas de apoptose, utilizando os valores do TTM e dos clusters de AgNOR. Portanto, nos foi permitido concluir com este trabalho que, com a progressão da doença, ocorre o aumento da massa tumoral e da taxa de proliferação paralelalmente ao aumento da susceptibilidade à apoptose / Abstract: Chronic lymphocytic leukemia (CLL) presents considerable variability in clinical presentation as well as in its evolution. In contrast to the inhibition of apoptosis in vivo, spontaneous apoptosis after short-term culture occurs. We studied the degree of this apoptosis in vitro, and its interactions with several clinical and laboratory parameters. Apoptosis was measured by the annexin V technique. Proliferation rate was evaluated by the AgNOR (nucleolar organizer regions) technique. There were inverse correlations between the percentage of annexin V-positive cells and peripheral lymphocyte count (r=-0,49), Rai stage (r=-0,40), Binet stage (r=-0,50) , TTM (total tumor mass score; r=-0,51), and percentage of cells with one AgNOR cluster (r=-0,45). Direct correlations were found with hemoglobin values (r=0,34) and platelet counts (r=0,52). The number of CD8positive cells showed a correlation with perIpheral lymphocyte count (r=0,49). When this variable was held constant, a correlation was detected between CD8-positive cells and staging (r=-0,47), TTM (r=-0,42), and platelet count (r=0,67). CD4-positive lymphocytes presented a correlation only with CD8-positive lymphocytes. In a cluster analysis, it was possible to create three groups of patients with different apoptosis rate using the TTM and AgNOR values. We conclude that, with the progression of the disease, together with the increase of tumor mass and proliferation rate, there is a decrease in the susceptibility to apoptosis / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:13:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2928_1.pdf: 1648084 bytes, checksum: 945302eb189a3a710e3e0e8bcbdfc641 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / A LTA é uma infecção parasitária tendo Leishmania (Viannia) braziliensis) como agente etiológico de maior incidência no Brasil. Em todas as formas clínicas da doença, sabe-se que a resposta imune é dependente de células T. Embora estudos avaliem a resposta humoral na LTA, ainda não está esclarecido o papel de anticorpos específicos na imunidade contra Leishmania. Além disso, o diagnóstico da LTA demonstra dificuldades pois o mesmo é realizado por associações clínicas, epidemiológicas e laboratoriais. Considerando os benefícios da citometria de fluxo, uma nova abordagem utilizada na pesquisa de anticorpos com aplicabilidade superior aos diferentes protocolos de detecção e revelação convencionais, este estudo trouxe uma alternativa através da pesquisa de anticorpos IgG de L(V)braziliensis, aplicável ao diagnóstico da LTA e critério de cura.O objetivo deste estudo foi comparar as técnicas de reação de imunofluorescência indireta (IFI) e citometria de fluxo na avaliação clínica-laboratorial dos pacientes antes e após cura clínica e avaliar a aplicabilidade da citometria de fluxo no monitoramento pós-terapêutico dos pacientes. Soros de 14 pacientes antes do tratamento (AT), 13 pacientes 1 ano após tratamento (PT), 10 pacientes 2 e 5 anos PT foram analisados e os resultados foram expressos em níveis de reatividade de IgG, a partir da porcentagem de parasitos fluorescentes positivos (PPFP). A diluição 1:256 das amostras permitiu diferenciar os indivíduos AT e PT. A análise comparativa da IFI e da citometria de fluxo pela curva ROC (Receiver Operating Characteristic Curve) demonstrou, respectivamente, ASC (área sob a curva) =0,78 (IC95%= 0,64-0,89) e ASC=0,90 (IC95%= 0,75-0.95), demonstrando elevada acurácia do teste de citometria de fluxo. Nossos dados demonstram que 20% foi o melhor ponto de corte identificado pela curva ROC para o ensaio de citometria de fluxo. Este ensaio apresentou sensibilidade de 86% e especificidade de 77%, enquanto a IFI apresentou sensibilidade de 71% e especificidade de 69%. O monitoramento pós terapêutico através da análise comparativa dos índices de desempenho das técnicas em 1, 2 e 5 anos PT, revelou melhor desempenho da citometria de fuxo em relação a IFI. Portanto, a citometria de fluxo demonstrou ser uma alternativa diagnóstica aplicada ao estudo da LTA e que as informações obtidas nesse estudo abrem perspectivas para o monitoramento de cura pós- terapêutica da LTA

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000439544-Texto+Completo-0.pdf: 1258585 bytes, checksum: 19aa18ec90c3c36b13cb69c6788c4a18 (MD5) Previous issue date: 2012 / Bipolar Disorder (BD) is a complex, multifactorial and chronic psychiatic illness. It is characterized by alternating cycles of mania and depression, with periods of remission or euthymia. Several studies have suggested a direct interaction between nervous, endocrine and immune systems in the pathophysiology of BD. An immune activation, as evidenced by increased plasma levels of proinflammatory cytokines, has been frequently reported in BD. However, the majority of the studies have mainly investigated mania and depression phases, and very few studies have been developed with euthymic patients. In this study, we investigated cellular and molecular mechanisms potentially involved in the inflammatory process in BD, including various lymphocytes subtypes and intracelular pathways of lymphocyte activation. Twentyseven euthymic female subjects with BD type I and 24 age- and sex-matched controls were recruited in this study. Lymphocytes were isolated and stimulated in vitro to assess Th1/Th17/Th2 cytokines (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-17, IFN-ע and TNF-æ) and expression of mitogen-activated protein kinases (MAPKs). The expression of MAPKs (p-oERK and p38), lymphocyte subtypes and cytokines were assessed by flow cytometry. All cytokines assessed were found elevated in bipolar disorder compared with healthy controls. In particu-lar, it was evidenced a bias to a Th1 inflammatory profile in BD. Interestingly, we observed a significant reduction (-56%) of regulatory T cells (CD4+CD25+Foxp3+) and expansion (43%) of CD8+ regulatory T cells (CD8+CD28-) in BD. The lymphocytes of BD patients showed an significant increase in p-ERK in relation to p-p38, indicating lymphocyte activation. Our data suggest that multiple molecular and cellular mechanisms contribute to the immunological imbalance observed in BD. / O Transtorno Bipolar (TB) é uma doença psiquiátrica crônica, complexa e multifatorial, caracterizada por ciclos alternados de mania e depressão, intercalados com períodos de remissão ou eutimia. Diversos estudos vêm demonstrando associações entre sistema nervoso, endócrino e imunológico na patofisiologia do TB. Uma ativação imune, evidenciada por níveis plasmáticos aumentados de citocinas pró-inflamatórias, tem sido freqüentemente relatada no TB. No entanto, a maioria dos estudos refere-se principalmente às fases de mania e depressão, e poucos estudos foram desenvolvidos na fase de eutimía. Neste estudo, investigamos mecanismos celulares e moleculares potencialmente envolvidos no fenômeno inflamatório no TB, incluindo diversos subtipos linfocitários e vias intracelulares de ativação linfocitária. Vinte e sete pacientes mulheres com TB I eutímicos e 24 controles saudáveis pareados por sexo e idade foram recrutadas neste estudo. Os linfócitos foram isolados e estimulados in vitro para avaliar as citocinas Th1/Th17/Th2 (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-17, IFN-ע e TNF-æ) e expressão de proteínas cinases ativadas por mitógeno (MAPKs). A expressão das MAPKs (p-ERK e p-p38), subtipos linfocitários e citocinas foram avaliados por citometria de fluxo. Todas as citocinas avaliadas encontraram-se elevadas nos bipolares em comparação com controles sau-dáveis. Em particular, foi evidenciado um viés para um perfil Th1 (inflamatório) no TB I. Interessantemente, observamos uma redução significativa (-56%) de células T regulatórias (CD4+CD25+Foxp3+) e expansão (43%) de células T CD8+ regulatórias (CD8+CD28-) no TB. Os linfócitos dos pacientes bipolares apresentaram um aumento significativo de p-ERK em relação a p-p38, indicando uma ativação linfocitária. Concluindo, nossos dados sugerem que múltiplos mecanismos celulares e moleculares contribuem para um desequilíbrio imune observado no TB.

Orientador: Regina Kiomi Takahira / Banca: Raimundo Souza Lopes / Banca: Patrícia Mendes Pereira / Resumo: O concentrado de plaquetas é um hemocomponente importante para a transfusão de grandes quantidades de plaquetas. Durante a estocagem, as plaquetas sofrem lesões que devem ser analisadas por meio de testes laboratoriais. O objetivo do presente estudo foi avaliar as qualidades físicas, químicas, microbiológicas, estruturais e funcionais plaquetárias em concentrados de plaquetas caninos estocados durante 5 e 7 dias. Foram realizadas contagem de plaquetas, leucócitos e hemácias por unidade, mensuração do pH, glicose, avaliação do swirling, análise microbiológica, avaliação da agregação plaquetária e da expressão da GPIIbIIIa pela citometria de fluxo. As análises foram realizadas logo após a centrifugação, e no quinto (grupo I) e sétimo (grupo II) dias de estocagem dos concentrados de plaquetas obtidos de 22 cães hígidos. Todas as bolsas foram negativas para o isolamento de microorganismos. Houve diminuição significativa nas contagens de plaquetas e leucócitos, pH, glicose e swirling nos dois grupos. Ocorreu diminuição na resposta agregatória nos dois grupos, com o uso isolado e associado de ADP e epinefrina. Os anticorpos CD41 e CD61 apresentaram alta porcentagem de fluorescência em todos os momentos, e não houve variação significativa na média de intensidade de fluorescência das plaquetas durante a estocagem. Conclui-se que, mantida a esterilidade microbiológica, os concentrados de plaquetas caninas podem ser estocados por até 7 dias, no entanto, há uma maior perda da viabilidade plaquetária e qualidade dos concentrados quando comparados ao grupo armazenado durante 5 dias. Houve perda funcional das plaquetas durante a estocagem pela redução da agregação plaquetária. Os anticorpos CD41 e CD61 podem ser utilizados na avaliação da GPIIbIIIa de plaquetas caninas estocadas durante os períodos avaliados / Abstract: Platelet concentrate is an important blood component for platelet transfusion. During storage, platelets undergo lesions that should be evaluated by laboratory assays. The aim of this study was to evaluate the physical, chemical, microbiological, structural and functional platelet qualities in canine platelet concentrate stored for 5 and 7 days. Platelet, leukocytes and erythrocytes concentrations per unit, pH and glucose measurements, swirling observation, microbiological analysis, assessment of platelet agregation and expression of GPIIbIIIa by flow cytometry were performed. Analyses were performed after centrifugation, and the fifth (group I) and seventh (group II) days of platelet concentrate storage obtained from 22 healthy dogs. All platelet concentrate bags were negative for microorganisms isolation. Platelet and leukocytes concentrations, pH, glucose, and swirling decreased significantly during storage, in both groups. A significant reduction in aggregatory response was detected in both groups, in the presence of ADP, epinephrine or both simultaneously. CD41 and CD61 antibodies showed high fluorescence at all times, and no significant variation in mean fluorescence intensity during storage. In conclusion, canine platelet concentrates should be stored for 5 days, however, can be stored for up to 7 days with greater loss of viability and quality of bags during this period. There was functional loss observed by the reduction of platelet aggregation during storage in both groups. CD41 and CD61 antibodies can be used to assess GPIIbIIIa in canine platelets stored during the evaluated period / Mestre

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-05T17:41:51Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 388353 bytes, checksum: 897cb0cd725d5dc562e4412ef8f785fc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T17:41:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 388353 bytes, checksum: 897cb0cd725d5dc562e4412ef8f785fc (MD5) Previous issue date: 2005-12-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O gênero Eucalyptus, da família Myrtaceae, apresenta cerca de 800 espécies e vários híbridos naturais. Além da importância biológica, é de múltiplo interesse comercial, destacando-se na indústria farmacêutica e na produção de biomassa lenhosa. A quantificação do conteúdo de DNA nuclear é útil em estudos de relações filogenéticas. Também é uma informação importante no mapeamento de genomas. Para a determinação do conteúdo de DNA nuclear em plantas, a citometria de fluxo é considerada a metodologia mais utilizada. No entanto, os estudos com Eucalyptus apresentam diferenças entre os valores encontrados. Outra técnica cujos resultados permitem a determinação da quantidade de DNA nuclear é a citometria de imagem. O objetivo deste trabalho é reavaliar as divergências nas quantificações de DNA nuclear em Eucalyptus, pela aplicação das citometrias de fluxo e de imagem. As quantificações foram realizadas com o uso do citômetro de fluxo, associado à coloração com iodeto de propídeo, dos núcleos isolados. Os padrões de referência foram folhas de Raphanus sativus Saxa (1,11 pg), Lycopersicon esculentum Stupicke (1,96 pg) e hemácias de Gallus gallus Leghorn fêmea (2,33 pg). Histogramas da intensidade de fluorescência relativa foram obtidos após a análise dos núcleos isolados dos padrões internos combinados com E. globulus, E. grandis e E. urophylla. Os valores em pg de DNA nuclear encontrados para E. globulus e E. grandis foram de 1,39 e 1,41 (padrão R. sativus), 1,20 e 1,22 (padrão L. esculentum), e 1,05 e 1,09 (padrão G. gallus). A quantificação para E. urophylla foi de 1,01 pg (padrão G. gallus). As espécies de Eucalyptus analisadas não apresentaram diferenças entre si maiores que 5,4% no conteúdo de DNA do genoma em pg. Todavia, variações em uma única planta, resultantes dos diferentes padrões, apresentaram divergências de até 32%. A citometria de imagem, dos núcleos corados pela reação de Feulgen, foi realizada para analisar o conteúdo de DNA de E. globulus, cujos valores foram de 1,16 (padrão R. sativus) e 1,02 pg (padrão L. esculentum). O uso de fluorocromos (intercalantes ou base específicos) e a interferência de compostos secundários na coloração foram considerados pontos críticos na análise pela citometria de fluxo; além dos padrões de referência e dos coeficientes de variação para ambas as citometrias. Em todas as análises os maiores coeficientes de variação foram 3,80 (citometria de fluxo) e 4,83% (citometria de imagem). Pela comparação entre as metodologias aplicadas, demonstrou-se o valor mais elevado da estimativa do conteúdo de DNA nuclear em E. globulus via citometria de fluxo, cerca de 16% maior do que na citometria de imagem. As proporções entre os padrões vegetais continuaram as mesmas em ambas as citometrias. Embora a quantificação mais precisa de DNA nuclear em picogramas para E. globulus seja proveniente da citometria de fluxo das folhas, pelo valor do CV, a mais acurada foi considerada a média dos dados obtidos via citometria de imagem dos meristemas, cujo valor foi 1,09 pg DNA/2C. / The Eucalyptus genus of Myrtaceae family has about 800 species and some natural hybrids. Beyond the biological importance, it is of multiple commercial interests, being distinguished in the pharmaceutical industry and the production of pulp biomass. The quantification of the nuclear DNA content is useful in studies of phylogenetics. Also it is important information for genome mapping. For nuclear DNA content determination, flow cytometry is considered the most appropriate methodology. However, Eucalyptus studies present differences between values. Another technique whose results allow the determination of the nuclear DNA amount is the image cytometry. The objective of this work was to reevaluate the divergences in the measures of nuclear DNA in Eucalyptus, for the application of flow and image cytometries. The measures had been carried through with the use of flow cytometer and stain with propidium iodide, of the isolated nuclei. The reference standards were leaves of Raphanus sativus cv. Saxa (1.11 pg), Lycopersicon esculentum cv. Stupicke (1.96 pg) and Gallus gallus female Leghorn erythrocytes (2.33 pg). Histograms of relative fluorescence intensity have generated after analysis of the isolated nuclei of combined internal standards with E. globulus, E. grandis and E. urophylla. The values in pg of nuclear DNA found for E. globulus and E. grandis xhad been of 1.39 and 1.41 (standard R. sativus), 1.20 and 1.22 (standard L. esculentum), and 1,05 and 1,09 (standard G. gallus). The quantification for E. urophylla pg was of 1.01 (standard G. gallus). The Eucalyptus species analyzed did not present differences among themselves greater than 5.4% in genomic DNA content in pg. However, intraspecific variations in only one plant, resultant of the different standards, presented divergences of up to 32%. The image cytometry analyses, with Feulgen reaction stain nuclei, were carried out to analyze the E. globulus DNA content, whose values were of 1.16 (standard R. sativus) and 1.02 pg (standard L. esculentum). The fluorochrome use (DNA- intercalating or base specific) and the secondary compounds interference in the staining were considered critical points in the analysis for the flow cytometry; besides the standards of reference and the coefficients of variation for both the cytometries. In all the analyses the bigger variation coefficients were 3.80 (flow cytometry) and 4.83 (image cytometry). For the comparison between the applied methodologies, the increase of the estimate of the nuclear DNA content was confirmed in E. globulus by flow cytometry, about 16% greater as compared to image cytometry. The ratios between plant standards remained the same ones in both techniques. Although the most precise nuclear DNA quantification in picogramas for E. globulus was proceeding from flow cytometry of leaves, by CV value, the most accurate was considered the average of meristem image cytometry data, whose value was 1.09 pg DNA/2C.