Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-08Bitstream added on 2014-06-13T21:03:52Z : No. of bitstreams: 1 souza_ec_dr_jabo.pdf: 821266 bytes, checksum: 46390da0d02b9c37aa41e4af297432aa (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cancro cítrico é uma das principais doenças da cultura do citros, provocando lesões nas folhas, ramos e frutos, tendo como consequência a queda dos frutos e folhas, o que leva à perdas significativas na produção. A partir do sequenciamento completo do genoma da bactéria gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), agente causal do cancro cítrico, abriu-se a possibilidade da utilização de estratégias de análise genômica funcional no estudo da função de genes da bactéria relacionados com a infecção na planta e com o desenvolvimento da doença. Uma das estratégias utilizadas foi a obtenção de mutantes de Xac contendo genes relacionados à patogenicidade e virulência interrompidos pelo método de mutagênese insercional aleatória utilizando o transposon Tn5 (LAIA et al., 2009). No presente trabalho a técnica de microarranjos de DNA foi utilizada para avaliar a expressão global de genes de dois mutantes de Xac 72 h após a infecção in planta. Em um dos mutantes (8B7) o gene interrompido foi o xrvA, um regulador de virulência, e no outro mutante (18D6) o gene interrompido codifica uma histidina quinase híbrida sensora que faz parte de um sistema de transdução de sinal de dois componentes. Os resultados das hibridizações revelaram um total de 553 genes diferencialmente expressos para os dois mutantes estudados quando comparado com o genótipo selvagem (Xac 306), sendo 323 no mutante 8B7 e 230 no mutante 18D6. Esses genes foram divididos em diferentes categorias funcionais e uma análise funcional comparativa revelou que eles podem desempenhar um papel importante no processo de patogenicidade / Citrus canker is a major disease affecting citrus crops worldwide, causing lesions on leaves, branches and fruits that results in the falling of fruit and leaves, leading to significant losses in orange production. The complete genome sequencing of Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), a Gram-negative bacteria and the causal agent of citrus canker, allowed the possibility of using functional genomic strategies to study the function of genes related to plant infection and disease development in this bacteria. One strategy was to produce mutants for phatogenicity and virulence genes by random insertional mutagenesis using Tn5 Transposon (LAIA et al., 2009). In the present work DNA microarray analysis was used to evaluate the global gene expression profile of two Xac mutants after 72 hours of plant infection. One mutant (8B7) carry a mutation in the xrvA gene (XAC1495), a virulence regulator, and the other (18D6) carry a mutation in a hybrid histidine quinase sensor of a two-component signal transduction system. The results revealed a total of 553 differentially expressed genes for the two mutant strains compared with Xac wild type, with 323 in the mutant 8B7, and 230 in the mutant 18D6. These genes were allocated into several functional categories and a comparative functional analysis showed that they can play an important role in the pathogenicity and virulence of Xac

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Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-09-23Bitstream added on 2014-06-13T19:23:56Z : No. of bitstreams: 1 rosa_j_dr_jabo.pdf: 2608907 bytes, checksum: b7b01ebc553dff94742210a39847a17e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundecitrus / A distribuição espacial do cancro cítrico em talhões com laranjeira ‘Natal’ enxertada em limoeiro ‘Cravo’ com 3 anos de idade foi estudada utilizando a geoestatística. Foram utilizados 13 talhões mapeados pelo Fundecitrus (Fundo de Defesa da Citricultura), com 595 ou 1080 plantas cada, infectados naturalmente com Xanthomonas citri subsp. citri, em uma única propriedade, no Estado de São Paulo. A severidade da doença em cada planta foi avaliada por meio de uma escala com os seguintes níveis: 0 - sem folhas com sintomas; 1 - de 1 a 5 folhas com sintomas; 2 - de 6 a 10 folhas com sintomas; 3 - de 11 a 20 folhas com sintomas; 4 - de 21 a 50 folhas com sintomas e 5 - > 50 folhas com sintomas. Nestes talhões, as coordenadas correspondentes à posição das plantas contaminadas foram obtidas com um GPS, permitindo mapear a doença no talhão. A distribuição espacial foi avaliada por ajuste de semivariogramas e interpolação dos dados por krigagem. A distribuição de plantas com cancro cítrico no talhão mostrou-se agregada, com raio de agregação de 30 a 45 m. Os mapas de krigagem mostraram que os focos da doença ocorreram mais frequentemente nos limites dos talhões. Quando a nota média de severidade da doença foi menor que 0,04, o semivariograma apresentou efeito pepita puro, indicando que não houve dependência espacial / The spatial distribution of citrus canker in areas with orange 'Natal' grafted on ‘Rangpur’ lime with three years of age were studied using geostatistics. We used 13 plots mapped by Fundecitrus (Citrus Defense Fund), with 595 or 1080 individual plants, naturally infected with Xanthomonas citri subsp. citri that were on the same property in the State of São Paulo. Disease severity in each plant was assessed using a scale with the following levels: 0 - no leaf with symptoms, 1 – 1 - 5 leaves with symptoms; 2 – 6 -10 leaves with symptoms; 3 – 11 - 20 leaves with symptoms; 4 – 21 - 50 leaves with symptoms and 5 - > 50 leaves with symptoms. In these plots, the coordinates corresponding to the position of symptomatic of infected plants was obtained with a GPS, allowing mapping the symptomatic plants in the block. The spatial distribution was evaluated by fitting of semivariograms and kriging interpolation of the data. The distribution of plants with citrus canker in the block was aggregated, with aggregate radius of 30 - 45 meters. Kriging maps showed that the foci of diseased plants stood on the edge of the blocks. When the average grade of severity was less than 0.04, the semivariogram showed pure nugget effect, indicating that no spatial dependence

Segundos mensageiros nucleotídicos são amplamente utilizados por bactérias para se adaptar às mudanças ambientais e fisiológicas. Neste cenário destaca-se o c-di-GMP, um segundo mensageiro praticamente universal em bactérias responsável por controlar a transição do estilo de vida bacteriano. Em geral, altos níveis celulares de c-di-GMP promovem um estado séssil, de formação de biofilme, enquanto baixos níveis induzem a motilidade. Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), um fitopatógeno de grande importância econômica no Brasil, possui uma complexa regulação da sinalização de c-di-GMP, possuindo mais de 30 proteínas envolvidas na síntese, na degradação e na detecção deste segundo mensageiro. Dentre essas proteínas, destacam-se as que possuem os domínios de síntese e degradação presentes na mesma cadeia polipetídica, os domínios GGDEF e EAL respectivamente. A análise das estruturas primárias das 11 proteínas GGDEF-EAL codificadas pelo genoma de Xac revelou que a maior parte delas (6) provavelmente possui o domínio GGDEF inativo, enquanto o EAL é ativo. Três possivelmente possuem ambos os domínios ativos enquanto outras duas possuem ambos os domínios inativos. O nocaute do gene xac2382 que codifica uma dessas proteínas (que possui um domínio periplasmático seguido dos domínios citoplasmáticos HAMP-GGDEF-EAL), demonstra um aumento de motilidade e uma diminuição na formação de biofilme. Construções de fragmentos da proteína revelaram que XAC2382 necessita pelo menos dos domínios HAMP-GGDEF para complementar a cepa nocaute e que a atividade de diguanilato ciclase é essencial para isto. O domínio periplasmático de XAC2382 se mostrou interagir com XAC2383, uma proteína codificada por um gene presente no mesmo cluster do gene de XAC2382, e essa interação parece importante para o controle da motilidade de Xac. A estrutura de XAC2383 foi resolvida por cristalografia de raios X na qual foi revelada uma topologia típica de proteínas da família das periplasmic binding proteins (PBPs) possuindo ainda uma cavidade carregada positivamente contendo um motivo Ser-Thr-Ser (amnioácidos 152-154) importante para a ligação de compostos com grupos fosfatos ou fosfonatos. A mutação sítio dirigida nesse motivo aboliu os efeitos na motilidade dependentes dessa proteína. Esses resultados sugerem que XAC2383 é um sensor periplasmático de um composto eletronegativo e esta proteína interage com XAC2382 regulando a motilidade bacteriana. XAC0495, uma proteína com ambos os domínios GGDEF-EAL provavelmente inativos, pode fazer parte de um sistema de dois componentes com a histidina quinase XAC0494. XAC0495 se comporta como um monômero em solução e possui um formato alongado, como revelado por experimentos de SAXS. / Nucleotide based second messengers are widely used by bacteria in signaling pathways that mediate adaptations to environmental and physiological changes. c-di-GMP is a nucleotide second messenger ubiquitous in Gram-negative bacteria, where it plays a role in many important behaviors that define bacterial lifestyle. In general, high cellular levels of c-di-GMP promote biofilm formation, while low levels induce bacterial motility. Xanthomonas citri subsp. Citri (Xac), a pathogen of great economic importance in Brazil, has a complex repertoire of c-di-GMP signaling molecules, with more than 30 genes coding for proteins involved in the synthesis, degradation and detection of this second messenger. Among these proteins, many have both GGDEF and EAL domains (often associated with c-di-GMP synthesis and degradation, respectively) present in the same polypeptide chain. Analysis of the primary structure of 11 GGDEF-EAL proteins coded by the Xac genome revealed that six most likely possess an inactive GGDEF domain plus an active EALdomain. Another three proteins have both domains active while the other two have both domains inactive. The knockout of the xac2382 gene, coding for a protein which contains a periplasmic domain followed by cytoplasmic HAMP, GGDEF (active) and EAL (active) domains, shows an increase in motility and a decrease in biofilm formation. Constructions containing fragments of this protein revealed that constructs containing at least the HAMP and GGDEF domains are able to complement the knockout strain and that diguanilate cyclase activity is essential for this. The XAC2382 periplasmic domain was shown to interact with a protein encoded by a gene situated in the same cluster, XAC2383, and that this interaction seems crucial for the control of Xac motility. The structure of XAC2383 was solved by X-ray crystallography and was shown to adopt a topology typical of the periplasmic binding proteins (PBP) family. The protein possesses a positively charged groove that contains a Ser-Thr-Ser motif (152STS154) important for the binding of compounds with phosphate or phosphonate groups. Site-directed mutagenesis of this motif abolished the effects on motility caused by this protein. These results suggest that XAC2383 is a periplasmic protein responsible for sensing a compound with electronegative characteristics and which interacts with XAC2382, thereby regulating the bacterial motility. Another protein, XAC0495 (with both GGDEF-EAL domains probably inactive) may be part of a two-component system with the histidine kinase XAC0494. Small-angle X-ray scattering (SAXS) experiments reveal that XAC0495 exists as an elongated monomer in solution.

Segundos mensageiros nucleotídicos são amplamente utilizados por bactérias para se adaptar às mudanças ambientais e fisiológicas. Neste cenário destaca-se o c-di-GMP, um segundo mensageiro praticamente universal em bactérias responsável por controlar a transição do estilo de vida bacteriano. Em geral, altos níveis celulares de c-di-GMP promovem um estado séssil, de formação de biofilme, enquanto baixos níveis induzem a motilidade. Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), um fitopatógeno de grande importância econômica no Brasil, possui uma complexa regulação da sinalização de c-di-GMP, possuindo mais de 30 proteínas envolvidas na síntese, na degradação e na detecção deste segundo mensageiro. Dentre essas proteínas, destacam-se as que possuem os domínios de síntese e degradação presentes na mesma cadeia polipetídica, os domínios GGDEF e EAL respectivamente. A análise das estruturas primárias das 11 proteínas GGDEF-EAL codificadas pelo genoma de Xac revelou que a maior parte delas (6) provavelmente possui o domínio GGDEF inativo, enquanto o EAL é ativo. Três possivelmente possuem ambos os domínios ativos enquanto outras duas possuem ambos os domínios inativos. O nocaute do gene xac2382 que codifica uma dessas proteínas (que possui um domínio periplasmático seguido dos domínios citoplasmáticos HAMP-GGDEF-EAL), demonstra um aumento de motilidade e uma diminuição na formação de biofilme. Construções de fragmentos da proteína revelaram que XAC2382 necessita pelo menos dos domínios HAMP-GGDEF para complementar a cepa nocaute e que a atividade de diguanilato ciclase é essencial para isto. O domínio periplasmático de XAC2382 se mostrou interagir com XAC2383, uma proteína codificada por um gene presente no mesmo cluster do gene de XAC2382, e essa interação parece importante para o controle da motilidade de Xac. A estrutura de XAC2383 foi resolvida por cristalografia de raios X na qual foi revelada uma topologia típica de proteínas da família das periplasmic binding proteins (PBPs) possuindo ainda uma cavidade carregada positivamente contendo um motivo Ser-Thr-Ser (amnioácidos 152-154) importante para a ligação de compostos com grupos fosfatos ou fosfonatos. A mutação sítio dirigida nesse motivo aboliu os efeitos na motilidade dependentes dessa proteína. Esses resultados sugerem que XAC2383 é um sensor periplasmático de um composto eletronegativo e esta proteína interage com XAC2382 regulando a motilidade bacteriana. XAC0495, uma proteína com ambos os domínios GGDEF-EAL provavelmente inativos, pode fazer parte de um sistema de dois componentes com a histidina quinase XAC0494. XAC0495 se comporta como um monômero em solução e possui um formato alongado, como revelado por experimentos de SAXS. / Nucleotide based second messengers are widely used by bacteria in signaling pathways that mediate adaptations to environmental and physiological changes. c-di-GMP is a nucleotide second messenger ubiquitous in Gram-negative bacteria, where it plays a role in many important behaviors that define bacterial lifestyle. In general, high cellular levels of c-di-GMP promote biofilm formation, while low levels induce bacterial motility. Xanthomonas citri subsp. Citri (Xac), a pathogen of great economic importance in Brazil, has a complex repertoire of c-di-GMP signaling molecules, with more than 30 genes coding for proteins involved in the synthesis, degradation and detection of this second messenger. Among these proteins, many have both GGDEF and EAL domains (often associated with c-di-GMP synthesis and degradation, respectively) present in the same polypeptide chain. Analysis of the primary structure of 11 GGDEF-EAL proteins coded by the Xac genome revealed that six most likely possess an inactive GGDEF domain plus an active EALdomain. Another three proteins have both domains active while the other two have both domains inactive. The knockout of the xac2382 gene, coding for a protein which contains a periplasmic domain followed by cytoplasmic HAMP, GGDEF (active) and EAL (active) domains, shows an increase in motility and a decrease in biofilm formation. Constructions containing fragments of this protein revealed that constructs containing at least the HAMP and GGDEF domains are able to complement the knockout strain and that diguanilate cyclase activity is essential for this. The XAC2382 periplasmic domain was shown to interact with a protein encoded by a gene situated in the same cluster, XAC2383, and that this interaction seems crucial for the control of Xac motility. The structure of XAC2383 was solved by X-ray crystallography and was shown to adopt a topology typical of the periplasmic binding proteins (PBP) family. The protein possesses a positively charged groove that contains a Ser-Thr-Ser motif (152STS154) important for the binding of compounds with phosphate or phosphonate groups. Site-directed mutagenesis of this motif abolished the effects on motility caused by this protein. These results suggest that XAC2383 is a periplasmic protein responsible for sensing a compound with electronegative characteristics and which interacts with XAC2382, thereby regulating the bacterial motility. Another protein, XAC0495 (with both GGDEF-EAL domains probably inactive) may be part of a two-component system with the histidine kinase XAC0494. Small-angle X-ray scattering (SAXS) experiments reveal that XAC0495 exists as an elongated monomer in solution.

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La compréhension de l'émergence des maladies infectieuses végétales causées par les bactéries passe par l'identification des populations sources, des routes d'invasion et des voies de dissémination, ainsi que par l'estimation des paramètres biotiques et abiotiques associés. Xanthomonas citri pv. citri (Xcc) est l'agent pathogène responsable du chancre Asiatique des agrumes. La bactérie est distribuée dans plusieurs pays agrumicoles du monde et listée comme organisme de quarantaine par ceux où elle est absente. Nous avons abordé l'épidémiologie moléculaire de Xcc à deux échelles spatio-temporelles grâce à un schéma de 14 microsatellites (MLVA-14) et un schéma de 31 marqueurs minisatellites (MLVA-31). Le typage MLVA-14 s'est montré adapté au génotypage d'une bactérie monomorphe comme Xcc. Le typage MLVA-31 a permis de diviser le pathovar Xcc en quatre groupes génétiques distincts correspondant aux différences de gammes d'hôtes mise en évidence chez cette bactérie. Le pathotype A (souches à large gamme d'hôtes parmi les rutacées) est séparé en deux groupes génétiques, tandis que les pathotypes A* et Aw (souches à gamme d'hôtes restreinte au limettier Mexicain et quelques espèces proches) constituent chacun un groupe génétique. Alors que l'expansion géographique de Xcc depuis son aire d'origine dans la première moitié du XXème siècle a quasi exclusivement concerné un seul groupe génétique, trois des quatre groupes décrits ont contribué à l'émergence de Xcc en Afrique au cours de la dernière décennie. La bactérie est pré-adaptée et a été introduite avec son hôte depuis sa population d'origine, faisant de la barrière migratoire la seule étape à franchir pour rencontrer un succès d'invasion. L'objectif de cette thèse a été de décrire les différentes populations émergentes grâce à des approches d'épidémiologie moléculaire et inférentielles, et identifier les différentes origines, routes et acteurs de la dissémination. Nous avons dans un premier temps montré la coexistence de deux groupes génétiques distincts au Mali : DAPC1 qui est dispersé dans quatre provinces du pays et DAPC2 qui est resté cantonné à l'espace péri-urbain de Bamako. L'analyse de l'émergence de Xcc au Sénégal a révélé le succès invasif de DAPC2 dans un autre environnement. La structure des populations DAPC1 du Mali et DAPC2 du Sénégal suggèrent que les plants de pépinières constituent une voie de dissémination majeure dans ces pays. À l'opposé, DAPC2 de Bamako n'est pas détecté en pépinières au Mali et n'a pas montré de caractère invasif. L'existence d'une population « tête de pont » invasive de souches DAPC1 au Mali donnant lieu à une épidémie au Burkina Faso a été mise en évidence par une approche ABC (calcul Bayésien approché). Les populations DAPC2 du Mali et du Sénégal ne présentent pas de lien épidémiologique direct mais partagent des liens de parenté avec des souches présentes dans le sous-continent Indien. Dans un deuxième temps, l'analyse d'une population de souches appartenant au pathotype A* en Ethiopie nous a permis de procéder à des estimations de paramètres démographiques, tels que les tailles efficaces. Nous avons montré que l'approche inférentielle nous permettait d'éclairer l'histoire démographique de Xcc dans un cas d'émergence, et de mettre en avant une dynamique saisonnière accentuant probablement le déséquilibre mutation-dérive lié à la situation d'émergence. L'émergence de Xcc en Afrique est principalement associée aux activités humaines. Sa dissémination locale et globale peut alors être considérablement limitée par des mesures de gestion plus stricte au niveau des pépinières et des flux de commerces. / Several plant emerging infectious diseases are caused by bacteria. To improve our understanding of their emergence, a description of the emerging populations, the reconstruction of invasion routes and pathways, as well as the identification of involved biotic and abiotic parameters are fundamental. The bacterium Xanthomonas citri pv. citri (Xcc) is responsible for Asiatic citrus canker. It is present in many citrus producing countries and listed as a quarantine organism in canker-free countries.Two MLVA schemes were used for molecular epidemiological analyses of Xcc. The first one, MLVA-14, targeted 14 microsatellite markers, and is useful to describe the genetic diversity of this monomorphic bacterium. The second, MLVA-31, targeted 31 minisatellite markers, is suited to global epidemiology analyses. Based on MLVA-31 data, Xcc is divided in four genetic groups (referred to as DAPC clusters) corresponding to Xcc pathotype classification based on host range. Three pathotypes were described: pathotype A strains are able to infect most citrus species, while pathotypes A* and AW strains are naturally restricted to fewer host species.DAPC 1 is responsible for almost all cases of geographical expansion of Xcc over the first half of the 20th century, we show that three Xcc genetic clusters have emerged in Africa over the last decade. Xcc is pre-adapted to its host species. Invasive success of Xcc is then mostly conditioned by migration events. Our objectives were to describe these invasive populations using a molecular epidemiology approach and to assess the origin, routes and actors of this dissemination in Africa. Two genetic clusters were found in Mali: DAPC1 is present in four provinces while DAPC2 is restricted to the Bamako urban environment. In contrast, DAPC2 emerging populations in Senegal showed an invasive succes in an other environment. Populations structures of DAPC1 in Mali and DAPC2 in Senegal highlighted the role of nurseries in Xcc dissemination. On the contrary, DAPC2 strains in Bamako were not detected in Malian nurseries and showed a limited invasive success. Approximate Bayesian Computation highlighted an invasive bridgehead scenario between DAPC1 in Mali and Burkina Faso. DAPC2 populations in Mali and Senegal were not found epidemiologically related but were genetically related to strains previously reported from the Indian subcontinent.Demographic parameters inference, such as effective population sizes, were inferred from Ethiopian pathotype A* populations. The inference approach was useful to decipher the demographic history of this emerging population, and suggested seasonal fluctuations in population sizes over time.Emergence of Xcc in Africa was found strongly related to human activities. Therefore, the local and global dispersion could be limited by a better management of nurseries and trade.

Na busca por compostos voláteis para utilização no manejo comportamental de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), a resposta destes insetos foi avaliada frente às substâncias liberadas por plantas de laranja, Citrus sinensis (L.) Osbeck, variedade \'Pêra\', enxertadas sobre limão-cravo, C. limonia Osbeck, sadias vs sintomáticas para Huanglongbing (HLB). Voláteis destas plantas, bem como seus extratos foram testados em olfatômetro \'Y\' e analisados por GC-MS. Somente fêmeas foram atraídas, tanto para os voláteis quanto para os extratos, e preferencialmente os de plantas doentes. Foram encontrados 47 compostos em extratos de plantas sadias e doentes, dos quais 11 [hexanal; α-tujeno; α-pineno; sabineno; β-mirceno; α-terpineno; limoneno; linalol; composto 37 (não identificado); β-elemeno e β-copaeno] presentes em maior quantidade nos extratos de plantas doentes, sendo que 3 desses compostos (sabineno, linalol e β -elemeno) foram majoritários nos extratos de ambas as plantas, doentes e sadias. Esses três compostos, bem como uma substância padrão para atração (salicilato de metila), foram testados em diferentes concentrações e misturas em laboratório, casa-de-vegetação e campo. O efeito destas substâncias foi dependente de sua concentração e, embora limoneno tenha alterado a resposta comportamental das fêmeas, apenas salicilato de metila e linalol foram atraentes. Em laboratório, a mistura desses dois compostos apresentou efeito sinérgico na atração de fêmeas e, em casa-de-vegetação, a adição de linalol junto a plantas de citros aumentou a atratividade das mesmas para insetos adultos, sugerindo importante participação desses compostos no processo de seleção hospedeira pelo inseto. Estes resultados acrescentam novas informações para a busca de um atraente para D. citri visando o manejo comportamental do inseto vetor das bactérias Liberibacter, associadas ao HLB, a mais importante doença dos citros no mundo. / With the aim of searching for volatile compounds to use in behavioral management of Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), the response of these insects was assessed against the substances released by sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck], variety \'Pera\', grafted on Rangpur (C. limonia Osbeck), healthy and Huanglongbing (HLB) symptomatic plants. Plant volatiles as well as plant extracts were tested in Y-tube olfactometer assays and analyzed by GC-MS. Only females were attracted to plant volatiles and extracts and they preferred those from HLB-infected plants. A total of 47 compounds was found in the extracts from healthy and infected plants, from which 11 [hexanal; α-thujene; α-pinene; sabinene; β- myrcene; α-terpinene; limonene; linalool; compound #37 (not identified); β-elemene; and β-coapene] were present in higher amounts in infected plant extracts. Three of these volatiles (sabinene, linalool and β-elemene) represented major compounds in both infected and healthy plant blend extracts. These three compounds, as well as a standard substance used for attraction (methyl salicylate), were tested in different concentrations and mixtures in laboratory, greenhouse and field. The effect of these substances was dependent on its concentration and, although limonene changed female behavioral response, only methyl salicylate and linalool were attractive. In the laboratory, the mixture of these two compounds showed a synergistic effect in attracting females and, in greenhouse, the addition of linalool to citrus plants increased the attractiveness of plants to adult insects, suggesting an important role for these compounds in the host selection process by the insect. These results provide novel information about attractants to D. citri with the aim of developing a behavioral management approach of the insect vector for Liberibacter, bacteria associated to HLB, the most important citrus disease worldwide.

O Brasil é o maior produtor de laranja doce no mundo. Entretanto, a cultura enfrenta grandes problemas, devido ao ataque de pragas e doenças, o que reduz a produtividade da cultura. Entre estas doenças, destaca-se o huanglongbing (HLB), doença associada a três espécies da bactéria Candidatus Liberibacter. No Brasil, o psilídeo Diaphorina citri é o inseto transmissor do HLB. A falta de cultivares de laranja doce resistentes ao HLB torna a transformação genética de plantas uma medida em potencial para o controle desta doença. Plantas transgênicas de laranja doce expressando um RNA de dupla fita (dsRNA) de um gene essencial à sobrevivência de D. citri podem resultar no controle do inseto por meio do mecanismo de RNA de interferência. Tal mecanismo resulta na degradação do RNAm homólogo ao dsRNA. Este trabalho teve por objetivo produzir plantas transgênicas de laranja doce, expressando um fragmento do gene DcV-ATPase-A de D. citri, em uma construção gênica tipo hairpin. Dessa forma, o silenciamento gênico por RNA de interferência seria ativado no psilídeo quando este for submetido à alimentação nas plantas transgênicas. O trabalho foi iniciado com a elaboração da construção gênica contendo uma sequência repetida e invertida do gene DcV-ATPase-A de D. citri, para formação de um hairpin. Segmentos de epicótilo, provenientes de sementes germinadas in vitro das laranjas \'Hamlin\', \'Pêra\' e \'Valência\' (Citrus sinensis L. Osbeck) foram utilizados como fontes de explantes para a transformação genética via Agrobacterium tumefaciens. Paralelamente aos experimentos de transformação genética, insetos adultos de D. citri foram submetidos a experimentos de alimentação artificial, contendo RNA de dupla fita (dsRNA) ou pequenos RNA interferentes (siRNA) da DcV-ATPase-A. Ao final do período de alimentação, foram avaliadas o número de insetos vivos e a expressão relativa do RNAm da DcV-ATPase-A. Através de PCR e Southern blot, a transgenia foi confirmada em 26 e 39 plantas de laranja \'Hamlin\' e \'Valência\', respectivamente. A transgenia não foi confirmada nas plantas regeneradas de laranja \'Pêra\'. O número de inserções no transgene variou de 1 a 4 cópias. A produção dos siRNAs foi confirmada em 10 plantas de laranja \'Valência\', através de siRNA blot. O uso de dietas artificiais contendo dsRNA ou siRNA do gene DcV-ATPase-A não resultou em diferenças significativas no número de insetos vivos, ou no nível de expressão relativa do RNAm do gene DcV-ATPase-A em insetos adultos de D. citri. / Brazil is the largest sweet orange producer in the world. However, this crop faces major problems due to the attack of pests and diseases that reduce its productivity. Among the diseases, stands out the huanglongbing (HLB), disease associated with three different species of the Candidatus Liberibacter bacteria. In Brazil, the psyllid Diaphorina citri is the insect vector of HLB. The absence of resistant sweet orange cultivars to HLB makes the genetic transformation of plants a potential methodology to control this disease. Sweet orange transgenic plants engineered to express double strand RNA (dsRNA) of an essential gene for D. citri survival could result in insect control by RNA interference. This mechanism results in degradation of homologous RNAm to dsRNA. The aim of this work was to produce transgenic sweet orange plants expressing a fragment of D. citri DcV-ATPase-A gene, in a hairpin construction aiming gene silencing by RNA interference in D. citri, when fed on sweet orange transgenic plants. The work started developing a gene construct containing an inverted and repeated sequence of DcV-ATPase-A gene, to form a hairpin. Epicotyl segments collected from in vitro germinated seedlings of \'Hamlin\', \'Pêra\' and \'Valência\' sweet oranges (Citrus sinensis L. Osbeck) were used as explants for the genetic transformation experiments via Agrobacterium tumefaciens. At the same time, adults of D. citri underwent artificial diet experiments containing dsRNA or siRNA of DcV-ATPase-A. At the end of feeding time, the survival of insects and the relative expression of DcV-ATPase-A RNAm were evaluated. Through PCR and Southern blot analysis, 26 \'Hamlin\' and 39 \'Valência\' sweet orange transgenic lines were confirmed. None of the regenerated \'Pêra\' plants were transgenic. The transgenic plants had 1 to 4 T-DNA insertions. The siRNA products were observed in 10 \'Valência\' plants, through siRNA blot. The artificial diets containing dsRNA or siRNA of DcV-ATPase-A resulted in no differences in the number of live insects and in the relative expression of DcV-ATPase-A RNAm in adult insects.

Huanglongbing (HLB) é considerada a doença mais devastadora dos citros. O HLB é causado pela bactéria \'Candidatus Liberibacter spp.\' e transmitido pelo inseto vetor, o psilídeo Diaphorina citri. Não existem ainda métodos curativos para essa doença, ou variedades resistentes, e seu manejo é baseado na aquisição de mudas sadias, monitoramento e controle químico frequente do vetor e inspeção e erradicação de plantas sintomáticas. Devido à dificuldade de manejo da doença, muitos produtores acabam por abandonar a atividade citrícola. O objetivo desse trabalho foi determinar o modelo de gradiente de dispersão da doença que melhor se ajusta aos dados de proporção de plantas sintomáticas erradicadas, a fim de propor medidas mais eficientes de manejo. Para isso, foram ajustados os modelos potência inversa e exponencial negativo à dados de proporção de plantas sintomáticas erradicadas em relação a borda dos lotes, para 21 lotes retangulares de pomares comerciais de laranja doce. Foram utilizadas duas abordagens para a análise dos gradientes, denominadas de \"concêntrica\" e \"direcional\". Para ambas utilizou-se a proporção de plantas erradicadas para faixas de 20 em 20 metros de distância em relação a todas as bordas do pomar para a primeira (concêntrica), e em relação a cada borda dos lotes (direcional). Em ambas as abordagens analisadas, houve melhor ajuste do modelo potência inversa. No entanto, a abordagem concêntrica obteve 15 ajustes de um total de 21 lotes, enquanto que para a abordagem direcional, houve ajuste do modelo para apenas seis lotes. Esses resultados demonstram que há um gradiente de doença da borda para o interior dos lotes, e que ocorre um influxo de insetos vetores de todas as direções. Além disso, o ajuste do modelo da potência inversa sugere que os lotes sofreram influência de fontes de inóculo externas, ou seja, psilídeos bacterilíferos pousam preferencialmente na borda dos pomares e uma pequena parte adentra o interior do lote levando a doença. O gradiente de dispersão em relação da borda dos lotes é consequência da disseminação primária, a qual só poderá ser evitada com o manejo regional, sendo indispensável para um manejo eficiente do HLB a curto e médio prazo.Huanglongbing (HLB) é considerada a doença mais devastadora dos citros. O HLB é causado pela bactéria \'Candidatus Liberibacter spp.\' e transmitido pelo inseto vetor, o psilídeo Diaphorina citri. Não existem ainda métodos curativos para essa doença, ou variedades resistentes, e seu manejo é baseado na aquisição de mudas sadias, monitoramento e controle químico frequente do vetor e inspeção e erradicação de plantas sintomáticas. Devido à dificuldade de manejo da doença, muitos produtores acabam por abandonar a atividade citrícola. O objetivo desse trabalho foi determinar o modelo de gradiente de dispersão da doença que melhor se ajusta aos dados de proporção de plantas sintomáticas erradicadas, a fim de propor medidas mais eficientes de manejo. Para isso, foram ajustados os modelos potência inversa e exponencial negativo à dados de proporção de plantas sintomáticas erradicadas em relação a borda dos lotes, para 21 lotes retangulares de pomares comerciais de laranja doce. Foram utilizadas duas abordagens para a análise dos gradientes, denominadas de \"concêntrica\" e \"direcional\". Para ambas utilizou-se a proporção de plantas erradicadas para faixas de 20 em 20 metros de distância em relação a todas as bordas do pomar para a primeira (concêntrica), e em relação a cada borda dos lotes (direcional). Em ambas as abordagens analisadas, houve melhor ajuste do modelo potência inversa. No entanto, a abordagem concêntrica obteve 15 ajustes de um total de 21 lotes, enquanto que para a abordagem direcional, houve ajuste do modelo para apenas seis lotes. Esses resultados demonstram que há um gradiente de doença da borda para o interior dos lotes, e que ocorre um influxo de insetos vetores de todas as direções. Além disso, o ajuste do modelo da potência inversa sugere que os lotes sofreram influência de fontes de inóculo externas, ou seja, psilídeos bacterilíferos pousam preferencialmente na borda dos pomares e uma pequena parte adentra o interior do lote levando a doença. O gradiente de dispersão em relação da borda dos lotes é consequência da disseminação primária, a qual só poderá ser evitada com o manejo regional, sendo indispensável para um manejo eficiente do HLB a curto e médio prazo. / Huanglongbing (HLB) is considered the most devastating disease of citrus. HLB is caused by the bacterium \'Candidatus Liberibacter spp.\' and transmitted by the insect vector, the psyllid Diaphorina citri. There are no curative methods for this disease, or resistant varieties, and its management is based on the acquisition of healthy seedlings, monitoring and frequent chemical control of the vector and inspection and eradication of symptomatic plants. Due to the difficulty of managing the disease, many producers end up abandoning citrus activity. The objective of this work was to determine the disease dispersion gradient model that best fits the proportion of symptomatic eradicated plants, in order to propose more efficient management measures. For this, inverse power and negative exponential models were adjusted to the proportion of symptomatic plants eradicated in relation to batch border for 21 rectangular plots of commercial sweet orange orchards. Two approaches were used for the analysis of gradients, of \"concentric\" and \"directional\". For both, the proportion of eradicated plants for strips 20-by-20-m apart from all orchard edges was used for the first (concentric), and for each lot border (directional). In both approaches analyzed, there was better fit of the inverse power model. However, the concentric approach obtained 15 adjustments of a total of 21 batches, whereas for the directional approach, there was adjustment of the model to only six batches. These results demonstrate that there is a disease gradient from the edge to the interior of the batches, and that an influx of vector insects from all directions occurs. In addition, the adjustment of the inverse potency model suggests that the lots were influenced by external inoculum sources, that is, bacterial insects preferentially land on the edge of the orchards and a small part enters the interior of the lot leading to illness. The dispersion gradient in relation to the edge of the lots is a consequence of the primary dissemination, which can only be avoided with the regional management, being indispensable for an efficient management of the HLB in the short and medium term.