A captação de maltose em bactérias é feita por um sistema transportador do tipo ABC composto por uma proteína ligadora de substrato (MalE), duas proteínas transmembrana e uma ATPase. No presente trabalho descrevemos a clonagem, expressão e análise bioquímica e estrutural da proteína MalE da bactéria fitopatogênica Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) O gene malE de Xac foi clonado em vetor de expressão pET28a, a proteína recombinante foi expressa em Escherichia coli e purificada por cromatografia de afinidade ao níquel. Amostras da proteína solúvel foram analisadas quanto à estrutura secundária, interação com possíveis ligantes, estabilidade frente a diferentes condições físico-químicas. Ensaios de cristalização possibilitaram a obtenção de cristais em diferentes condições, um deles apresentou grupo espacial P6122, mas não foi possível resolver a estrutura. Com base nas estruturas conhecidas de ortólogos de MalE, geramos um modelo estrutural para a proteína de Xac e foram feitas análises quanto à interação com trealose e maltose. Modelos estruturais dos componentes transmembrana (LacF e LacG) e ATPase (UgpC) do sistema transportador de maltose de Xac também foram gerados. Os resultados representam uma contribuição importante para o conhecimento sobre a fisiologia e sistemas de transporte de Xac. / Maltose uptake in bacteria is mediated by an ABC transporter comprising a substrate binding protein (MalE), two transmembrane proteins, and one ATPase. In the present study, we describe the cloning, expression and biochemical as well as structural analyses of the MalE protein of the phytopagen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac). The malE gene of Xac was cloned in the pET28a expression vector, the recombinant protein was expressed in Escherichia coli and, subsequently, purified by nickel affinity chromatography. Samples of soluble protein were analyzed regarding secondary structure, interaction with putative ligants and stability under different physico-chemical conditions. Crystallization trials were carried out under different conditions, one particular condition yielded crystal with a P6122space group, but the structure was not solved. Based on known ortholog structures, a structural model for Xac MalE was obtained allowing interaction with modeled threhalose and maltose. Structural models the transmembrane (LacF and LacG) and ATPase (UgpC) components were also obtained. The present results represent an important contribution to the knowledge of the physiology and transporter systems found in Xac.

Orientador: Ljubica Tasic / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-19T07:18:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fattori_Juliana_D.pdf: 11382370 bytes, checksum: c763644c24af47a0076a054c0186f7b1 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O presente estudo teve por objetivo a caracterização estrutural de quatro possíveis chaperonas de secreção da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Esta caracterização é importante para entender as funções destas proteínas e consequentemente compreender os mecanismos de virulência da Xac que é a causadora do cancro cítrico. Das quatro proteínas estudadas, a XACb0033 é considerada uma possível chaperona de secreção do sistema de secreção do tipo IV; a XAC1346 são possíveis chaperonas de secreção do sistema de secreção do tipo III e a XAC1990, foi identificada em 2007 como uma proteína do sistema flagelar (FlgN). As quatro proteínas, clonadas em pET23a, foram expressas em E. coli, purificadas e obtidas enoveladas conforme as análises de dicroísmo circular (CD). Por CD também se observou um alto conteúdo helicoidal na estrutura secundária das proteínas. Elas foram caracterizadas por filtração em gel analítica, espectrometria de massas, técnicas de difusão de ressonância magnética nuclear (DOSY-NMR) e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). Por SAXS obteve-se um modelo do envelope molecular de duas proteínas que foi condizente com a estrutura tridimensional obtida por bioinformática. Baseando-se nos resultados obtidos foi possível especular a classificação da XAC0419 como provável chaperona secretória da classe I e a FlgN (XAC1990) foi classificada como uma chaperona flagelar (classe III); e para a XACb0033 observou-se similaridade estrutural com a VirE1, que é a única chaperona secretória do sistema de secreção do tipo IV conhecida até o momento / Abstract: The aim of this study was the structural characterization of four possible secretion chaperones from the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). This characterization is very important to better understand the function of such proteins and the virulence mechanisms from Xac, which is the bacterium responsible for provoking the citrus canker. Among the target proteins, XACb0033 is a possible secretion chaperone from type IV secretion system, XAC0419 and XAC1346 are possible secretion chaperones from type III secretion system and XAC1990 was earlier identified as a flagellar protein (FlgN). All four target proteins, cloned into pET23a, were expressed in E. coli, purified and found folded as observed in the circular dichroism analyses (CD). It was also verified (CD experiments) that these proteins have a high helical content. These proteins were further characterized by analytical gel filtration, mass spectrometry (MS), diffusion techniques in nuclear magnetic resonance (DOSY-NMR) and small angle X-ray scattering (SAXS). Molecular envelops were built for two target proteins applying the SAXS data. These envelops were in good agreement with the 3D structures predicted by bioinformatics. Finally, XAC0419 was considered a possible class I secretion chaperone based on the obteined results. XAC1990 (FlgN) was confirmed as a flagellar chaperone (class III), while obtained results for XACb0033 pointed structural similarity with VirE1, the unique type IV secretion system chaperone known so far / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T05:56:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_AndreLuizAraujo_D.pdf: 43759919 bytes, checksum: 379266575f1db46c7d620232efb9ba13 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O cancro cítrico resulta da interação compatível entre a bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri e Citrus spp. A doença não tem cura, é de fácil disseminação e difícil controle. O cenário é preocupante, pois a doença diminui drasticamente o rendimento e a qualidade dos frutos de plantas infectadas, ocasionando um forte impacto econômico na citricultura mundial. Os principais sintomas do cancro cítrico, resultantes dos processos de hipertrofia (aumento do volume celular) e hiperplasia (aumento da divisão celular), são dependentes da proteína efetora PthA de X. citri. PthA integra a família de fatores de transcrição conhecida como efetores ativadores de transcrição (transcription activator-like ou TAL). O principal homólogo de PthA é o efetor AvrBs3 de X. campestris pv. vesicatoria que atua regulando a transcrição de genes do hospedeiro em benefício do patógeno. A similaridade entre estas proteínas gira em torno de 97%, sugerindo, portanto, função semelhante para PthA. Através de uma série de microarranjos, investigou-se o perfil de expressão gênica de laranja doce (Citrus sinensis) dependente de PthA (X. citri) e de PthCs de X. aurantifolii, uma bactéria que causa cancro cítrico apenas no limão galego e que, em laranja doce, induz uma reação de hipersensibilidade. Desta forma, verificou-se a regulação positiva ou negativa de uma série de genes. Os PthCs regularam negativamente genes associados à sinalização por auxina e induziram a expressão de genes de defesa e silenciamento gênico. Em contrapartida, PthAs induziram uma série de genes intimamente relacionados aos sintomas de cancrose, incluindo: genes associados aos processos de aumento e divisão celular, síntese e remodelamento de parede celular, bem como genes envolvidos na sinalização por auxina e giberelina. Neste sentido, efetuou-se o isolamento de regiões promotoras de cinco genes, os quais são potencialmente regulados por PthA. A análise destas regiões revelou a presença de um possível TATA-box notavelmente semelhante àquele encontrado no gene upa20, denominado UPA-box (up-regulated por AvrBs3), sugerindo que estes genes poderiam ser transativados por PthA em citros. De fato, ensaios de retardamento de mobilidade eletroforética (electrophoretic mobility shift assay ou EMSA), demonstraram a ligação específica de PthA2 e 4 ao TATA-box encontrado na região promotora do gene que codifica uma proteínas relacionada à patogênese (pathogenesis-related proteins ou PR). Este resultado corrobora com a hipótese de que os efetores TAL atuam como proteínas ligadoras de elementos TATA. Finalmente, experimentos de co-imunoprecipitação de cromatina (ChIP) e cotransformação demonstraram, ainda que em resultados preliminares, que particularmente PthA4 é capaz de transativar pr5 in planta. Embora o cancro cítrico ainda não seja completamente entendido a nível molecular, os dados aqui apresentados sugerem fortemente a ação de PthAs como fatores de transcrição, bem como aponta candidatos à regulação positiva intimamente associados aos processos de hipertrofia e hiperplasia. Além disso, as regiões promotoras aqui isoladas podem ajudar no desenvolvimento de novas estratégias para a geração de plantas resistentes à cancrose / Abstract: Citrus canker is a result of a compatible interaction between Xanthomonas axonopodis pv. citri and Citrus spp. There is no cure for citrus canker, and the disease is easily spread and difficult to be managed. The scenario is threatening since the disease dramatically diminishes the quality of fruits in infected plants leading to great economic losses for the world citrus producers. The main citrus canker symptoms known as hypertrophy (cell enlargement) and hyperplasia (cell division) are PthA-dependent. PthA is an effector protein from X. citri which belongs to the TAL effectors (transcription activatorlike) family. The closest homologue of PthA is AvrBs3 from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, a TAL effector that acts as a transcriptional factor to modulate host transcription to the pathogen's benefit. Similarity shared by these two proteins is around 97%, suggesting that PthA plays a similar role in the citrus host. Through a number of microarray experiments, we investigate the gene transcription in sweet orange (Citrus sinensis) in response to the transient expression of PthA from X. citri or PthC from X. aurantifolii, pathotype C, a bacteria that causes citrus canker in Mexican lime but in orange trigger a hypersensitive response in sweet orange. We observed that PthCs down-regulated various auxin signaling genes and induced the expression of genes involved in defense and gene silencing. On the other hand, PthAs induces several genes implicated in canker development such as cell division and elongation, cell-wall synthesis and remodeling, synthesis, mobilization and signaling of auxin and gibberellin. Promoter regions of PthA-induced genes were isolated and shown to have predicted PthA and PthC binding sites at or near their putative TATA boxes. Moreover, competition gel shift assays confirmed that PthA4 shows preferential binding to the TATA box of the pathogenesis-related (pr5) gene promoter, supporting the idea that TAL effectors may act as general TATA-binding proteins. Finally, both chromatin immunoprecipitation (ChIP) and co-transformation assays demonstrated however as preliminary results, that PthA4 is able to transactivate pr5 in planta. Albeit the molecular mechanism by which citrus canker develop remains elusive at the molecular level, we provided data supporting the notion that PthA acts as a transcriptional factor, as well as identified PthA-induced genes associated with hypertrophy and hyperplasia. Furthermore, the promoter regions isolated here might be useful to obtain citrus plants resistant to the canker bacteria / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Ljubica Tasic / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-20T16:55:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Prando_Alessandra_D.pdf: 9977861 bytes, checksum: 15d25bce7d95433f95b938e68fdeaac8 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Até o momento, pouco se sabe sobre os mecanismos de virulência da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (XAC), agente causador do cancro cítrico. Acredita-se que chaperonas de secreção (CS) estão envolvidas no processo de patogenicidade de XAC primeiramente formando complexos com fatores de virulência e auxiliando no encaminhamento desses para os sistemas de secreção utilizando o ATP como fonte de energia. Neste trabalho foram adquiridos dados de fluorescência de emissão, dicroísmo circular, desenovelamento térmico e de ressonância magnética nuclear de H NMR e de 2D {N,H} HSQC de duas proteínas da XAC, a XAC1990 (FlgN) e XACb0033. Para ambas proteínas foram propostas estruturas 3D usando a análise de footprinting com restrições SASA e rmsd. Para as estruturas propostas foi verificado que os dados de fluorescência corroboram com a estrutura 3D não ocorrendo o mesmo para os dados de CD e NMR que revelaram baixo conteúdo helicoidal além de ausência de estrutura 3 D. A interação da proteína FlgN com a sua proteína parceira FlgK também foi sugerida através das análises de CD e fluorescência. Na segunda parte do trabalho foram estudadas as interações entre a proteína Hsp90 da laranja com diferentes ligantes aplicando a técnica de Saturation Transfer Difference (STD-NMR) e espectroscopia de fluorescência. Estas análises revelaram dados que corroboraram com o modelo proposto e, além disso, indicaram que os hidrogênios H-8 e H-2 da adenina e H-1'da ribose estão localizados no sítio ligante da proteína com os fosfatos orientados para fora. Através da fluorescência foram calculados os valores de Kd e foi verificado que a geldanamicina é um potente inibidor de Hsp90 da laranja / Abstract: So far, the Xanthomonas axonopodis pv. citri (XAC) mechanisms of bacterial virulence is unknown. It is believed that secretion chaperones (CS) are involved in the XAC's virulence process by first forming complexes with virulence factors, and assisting in their presentation to corresponding secretion systems using ATP as a source of energy. Fluorescence emission, circular dichroism, thermal unfolding and nuclear magnetic resonance NMR H and 2D {N,H} HSQC data from two proteins of XAC, XAC1990 (FlgN) and XACb0033 were collected. For both proteins, 3D structures were proposed using the footprinting analysis with RMSD and SASA restrictions. For the proposed structures were verified which the fluorescence data were consistent with the 3D structure. The CD and NMR data revealed low-helical content and absence of 3D structure. The interaction of the protein FlgN with its partner, FlgK, was suggested by CD and fluorescence analysis. In the second part, the interactions between the orange's Hsp90 protein with different ligants using Saturation Transfer Difference (STD-NMR) and fluorescence spectroscopy techniques were studied. These analyzes revealed which the data were consistent with the proposed model and moreover showed that the adenine's hydrogens H-8 and H-2 and ribose's hydrogen H-1'are located in the protein binding site with the phosphate driven out. By fluorescence values were calculed Kd and it was verified that geldanamycin is a potent inhibitor of orange's Hsp90 / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

La compartimentation est un aspect fondamental dans la compréhension de l’apparition de la vie sur terre mais aussi dans l’élaboration de cellules minimales. Les coacervats sont capables de séquestrer de grandes quantités de molécules par diffusion depuis le milieu extérieur mais ne permettent pas d’encapsuler ces molécules à cause de l’absence de barrière physique entre le milieu intérieur et extérieur. Les vésicules quant à elles, ne permettent pas de séquestrer de grandes quantités de molécules à cause de la bicouche membranaire qui empêche la diffusion des molécules depuis le milieu extérieur. Nous avons développé une nouvelle méthode pour encapsuler des biomolécules basées sur une transition de coacervats à vésicules. Notre système basé sur des acides gras saturés à longues chaînes, peut former des coacervats pour séquestrer des biomolécules puis des vésicules en diminuant le pH pour encapsuler les molécules préalablement séquestrées. Les résultats montrent des taux d’encapsulation supérieurs à ceux obtenus par les méthodes d’encapsulation basées sur l’hydratation de films lipidiques. L’encapsulation d’enzymes ainsi que des substrats de la réaction dans les vésicules ont permis de montrer l’accomplissement de réactions enzymatiques dans ces compartiments de manière beaucoup plus rapide qu’en milieu dilué permettant de générer un bioréacteur efficace. La synthèse de protéines ainsi que l’accomplissement de voies métaboliques n’ont pas été clairement mises en évidence dans les vésicules et constituent un élément décisif dans l’élaboration d’un nouveau modèle de cellule minimale. / Compartmentalization is of importance for our understanding of the emergence of life on earth but also for the development and design of minimal cells. Coacervation phenomenon allows spontaneous sequestration by molecular diffusion from aqueous medium but do not allow encapsulation of molecule inside. On the contrary, vesicular systems do not allow spontaneous encapsulation of molecules inside. Here we introduce a model built from saturated long chain fatty acids. This system can form both membranous vesicles and membrane free coacervated droplets that result from clouding by decreasing ph. We have shown that a large amount of proteins is encapsulated into vesicles after pre-crowding into coacervated. Encapsulation of enzyme in vesicles allow to increase the reaction rate compared to the reaction rate in diluted medium. Synthesis of proteins by cell-free system and metabolic reactions with proteins of mollicutes have not clearly been shown but they represent an essential element in the development of a minimal cell.

Spiroplasma citri est un mollicute phytopathogène transmis de plante à plante par des cicadelles du genre Circulifer selon un mode persistant circulant-multipliant. Les franchissements de l’épithélium intestinal et des glandes salivaires sont basés sur un mécanisme d’endocytose/exocytose. Ce processus d’invasion met en jeu, au sein de complexes protéiques, des protéines bactériennes spécifiques qui reconnaissent des motifs déterminés présents à la surface des cellules eucaryotes. La recherche de protéines de l’insecte vecteur interagissant avec S. citri a notamment conduit à l’identification de l’actine. Cette interaction a pu être confirmée à la fois in vitro et in vivo. L’interaction de l’actine avec son partenaire chez S. citri, qui s’est avéré être la phosphoglycérate kinase (PGK), est impliquée dans l’internalisation du spiroplasme dans les cellules de l’insecte. La région minimale de liaison à l’actine de la PGK a également été déterminée.La réalisation d’un mutant de S. citri dépourvu de PGK a été entreprise avec le plasmide navette pGOT mais n’a pas permis la sélection de spiroplasmes mutés dans ce gène essentiel. Néanmoins, la recherche de l’évènement de recombinaison chez les clones obtenus a permis de mettre en évidence la mutation de deux gènes chez ces derniers.L'ensemble des protéines impliquées dans la transmission du spiroplasme, identifiées au préalable chez ce dernier, n’étant pas essentielle au cours de ce processus, une étude préliminaire des complexes multi-protéiques contenant plusieurs de ces protéines a été réalisée. L’identification de complexes impliquant à la fois la PGK, la P32 et les ScARPs pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes régissant la vection de S. citri par son insecte. / Spiroplasma citri is a phytopathogenic mollicute transmitted from plant to plant by leafhoppers of the genus Circulifer in a persistent and propagative manner on condition to cross the intestinal and salivary glands barriers of the insect. These crossings are based on a endocytosis/exocytosis mechanism which involves bacterial protein complexes in order to recognize specific patterns on the surface of eukaryotic cells.Specific molecular interactions between S. citri proteins and those of C. haematoceps were investigated using far Western technology and had notably led to the identification of actin. This interaction has been confirmed both in vitro and in vivo. The interaction of actin with his partner in S. citri, which has been identified as the phosphoglycerate kinase (PGK), is involved in the internalization of spiroplasma into the insect cells. The minimal actin-binding region of PGK was also determined.The realization of a S. citri PGK mutant was carried out using the shuttle plasmid pGOT but the selection of spiroplasmas mutated in this essential gene failed. Nevertheless, findings in the localization of recombination events in S. citri chromosome, allowed us to identify mutations in two genes that could be tested in our experimental transmission system.The set of proteins involved in the spiroplasmal transmission, previously identified as non essential proteins in the invasion process, prompted us to study the role of multi-protein complexes containing several of these proteins. Identification of complexes involving both the PGK, the P32 and ScARPs should enable us to better understand mechanisms governing the transmission of S. citri by its insect.

Os inseticidas neonicotinóides são atualmente o principal grupo químico utilizado para o controle de insetos sugadores, constituindo-se uma boa opção para o controle de Diaphorina citri Kuwayama. Outra opção de controle do psilídeo tem sido a exploração do parasitóide Tamarixia radiata (Waterson). A compatibilidade dessas duas estratégias de controle poderia auxiliar na implementação de programas de manejo integrado de pragas na cultura do citros. No entanto, faltam estudos sobre a caracterização da suscetibilidade de D. citri para os inseticidas neonicotinóides e o impacto desses inseticidas sobre T. radiata. Sendo assim, os objetivos do trabalho foram o de caracterizar a suscetibilidade de D. citri a inseticidas neonicotinóides, realizar o monitoramento da suscetibilidade a esses inseticidas em populações de D. citri coletadas em pomares de diferentes regiões do Estado de São Paulo e avaliar os efeitos letais e subletais desses inseticidas sobre o parasitóide T. radiata. Os inseticidas avaliados foram: thiamethoxam, thiacloprid e imidacloprid. O método de bioensaio adotado foi o de contato residual para a caracterização da suscetibilidade de D.citri a esses inseticidas. O monitoramento da suscetibilidade a esses inseticidas em diferentes populações de D. citri foi realizado com concentrações diagnósticas baseadas na concentração letal 95 (CL95) de cada inseticida. Para avaliar os efeitos letais e subletais desses inseticidas sobre T. radiata foram realizados bioensaios de contato direto em adultos e pupas, toxicidade residual em adultos, e persistência da atividade biológica desses inseticidas sobre a superfície de folhas de citros. Entre os neonicotinóides testados, a maior toxicidade a D. citri foi observado com thiametoxam, seguidos por imidacloprid e thiaclopid. Os resultados do monitoramento apresentaram diferenças significativas na suscetibilidade das populações de D. citri aos inseticidas neonicotinóides. Para thiamethoxam, a sobrevivência estimada para as populações de D. citri testadas na concentração diagnóstica variou entre 5,5 e 16%, para thiacloprid variou entre 4,5 e 22,5 % e para imidacloprid entre 4 e 14%. Uma alta toxicidade desses inseticidas foi observada para adultos e pupas de T. radiata. No entanto, os efeitos subletais desses inseticidas a 10% da concentração recomendada sobre o estágio de pupa causou redução significativa no parasitismo somente com thiamethoxam. A emergência, longevidade e razão sexual de T. radiata não foram afetadas pelos inseticidas avaliados. A toxicidade residual de thiametoxam, thiacloprid e imidaclopid em folhas de mudas de citros foi relativamente elevada para adultos de T. radiata e com persistência de pelo menos 14 dias. / The neonicotinoids insecticides are currently the main chemical group used for controlling sucking pests and represent a good option for the control of Diaphorina citri Kuwayama. Another control alternative of this pest is the exploitation of parasitoid Tamarixia radiata (Waterson). The compatibility of these control strategies could be very helpful for the implementation of integrated pest management program in citrus. However, there are few studies on the characterization of the susceptibility of D. citri to neonicotinoid insecticides and the evaluation of the impact of these insecticides on T. radiata. Therefore, the objectives of this research were to evaluate the susceptibility of D. citri to neonicotinoid insecticides, to monitor the susceptibility to these insecticides in D. citri populations collected from different citrus groves in the State of São Paulo, and to evaluate the lethal and sublethal effects of these insecticides on T. radiata. The insecticides evaluated in this study were: thiamethoxam, thiacloprid e imidacloprid. A residual contact bioassay was used to characterize the susceptibility of D. citri to these insecticides. A diagnostic concentration bioassays based on lethal concentration 95 (LC95) of each insecticide were used for monitoring the susceptibility of D. citri populations. The lethal and sublethal effects of these insecticides on T. radiata were conducted by using direct contact bioassays on adult and pupal stages of T. radiata, residual contact bioassays and persistence of biological activity of these insecticides on citrus leaf surface. Among the neonicotinoid insecticides tested, the highest toxicity was observed with thiametoxam, followed by imidacloprid and thiaclopid. A significant difference in the susceptitibity to neonicotinoid insecticides was detected in D. citri populations. For thiamethoxam, the survivorship at diagnostic concentration varied from 5.5 to 16%, for thiacloprid varied from 4.5 to 22.5 %, and for imidacloprid from 4 to 14%. The toxicity of these insecticides was high to adult and pupal stages of T. radiata. However, the sublethal effects of these insecticides at 10% of the recommended rate on pupae stage caused the reduction of the parasitism capacity only with thiamethoxam. The emergence, longevity and sexual ratio of T. radiata were not affected by any insecticide tested. The residual toxicity of thiametoxam, thiacloprid and imidaclopid sprayed on citrus seedling leaves was relatively high to D. citri adults and lasted at least 14 days.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-04-28Bitstream added on 2014-06-13T20:21:38Z : No. of bitstreams: 1 teixeira_ec_dr_araiq.pdf: 2441746 bytes, checksum: 6a8b98becf92d1426314457c9b30825c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho teve como principal objetivo realizar estudos funcionais na bactéria Xac, estudando o possível envolvimento dos genes copA, copB e cutC no mecanismo de resistência a cobre nesta bactéria. Estes estudos funcionais envolveram: análise da expressão dos genes durante o crescimento na presença de cobre por Northern e Western blots e por eletroforese bi-dimensional, produção e purificação das proteínas recombinantes e produção de anticorpos, inativação de um dos genes (copA) para avaliar a participação da proteína CopA no mecanismo de resistência a cobre e análise da interação das proteínas de resistência a cobre com outras proteínas de Xac através do ensaio de duplo híbrido de leveduras. Os resultados obtidos mostraram que a linhagem mutante infecta a planta, mas os sintomas são mais retardados na presença do metal, quando comparada à linhagem selvagem. O crescimento das células mutantes na ausência e presença de cobre in planta indicou maior sensibilidade ao cobre pelas células mutantes. Na tentativa de verificar se as proteínas CopA, CopB e CutC interagem com outras proteínas de Xac, um ensaio de duplo híbrido de leveduras foi realizado. Através deste ensaio, algumas proteínas foram identificadas, as quais necessitam de estudos de caracterização adicionais. / Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causal agent of the citrus canker, a serious disease that affects the most commercial citrus cultivars causing serious economic impacts. Symptoms include canker lesions, leading to abscission of fruit and leaves and general tree decline. By sequencing the genome of this bacterium (ONSA Network, FAPESP, Brazil), a better knowledge of this microorganism and its molecular interactions with the host might be elucidated. For this, we analyzed the gene expression during growth in the presence of copper by Northern and Western blots, 2D-electrophoresis, production and purification of the CopA, CopB, and CutC recombinant proteins, inactivation of the copA gene to evaluate the participation of CopA protein in the copper resistance mechanism, and protein-protein interactions assays by the yeast two-hybrid assay. Results showed that the mutant strain infects the plant, but the lesions formation was retarded in the presence of copper. The mutant strain showed more sensitivity to copper than the wild type strain during growth in planta. In order to verify whether the CopA, CopB, and CutC proteins interact with other proteins of Xac, a yeast two-hybrid assay was performed. By this assay, some proteins were identified, which need further characterizations.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-06-03Bitstream added on 2014-06-13T18:35:00Z : No. of bitstreams: 1 bonini_m_me_botfca.pdf: 503952 bytes, checksum: 1553a755d247df6ec4852dd6104b7a70 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Empresa Privada / O presente trabalho teve por objetivo avaliar a produção e a sensibilidade de 48 isolados de Xanthomonas axonopodis pv. citri e de 14 isolados de Xanthomonas spp. à bacteriocinas. Estudos foram realizados para verificar o efeito da temperatura, tempo de incubação e do tipo do meio de cultura sobre a produção de bacteriocina por isolados de X. axonopodis pv. citri. Todos isolados de X. axonopodis pv. citri não foram sensíveis às bacteriocinas produzidas por eles, não sendo essas afetadas pelo meio BDA, nutriente ágar + NaCl e YPDA, nos diferentes tempos e temperaturas de incubação. Porém, isolados de X. axonopodis pv. passiflorae foram sensíveis às bacteriocinas produzidas por 25 isolados de avaliados e o isolado de X. campestri pv. campestris e o de X. axonopodis pv. manihotis apresentaram sensibilidade variável. Dos 25 isolados de X. axonopodis pv. citri apenas cinco não foram inibidos pelas bacteriocinas produzidas por dois isolados de X. axonopodis pv. passiflorae. As bacteriocinas produzidas pelos isolados de X. axonopodis pv. citri (FDC-806) e de X. axonopodis pv. passiflorae (Mar 2850-A) foram termolábeis e resistentes à lisozima e sensíveis a DNAse. A bacteriocina produzida pelo isolado de X. axonopodis pv. passiflorae foi resistente à ação de proteinase K, tripsina e RNAse enquanto que a produzida pelo isolado de X. axonopodis pv. citri foi sensível a essas enzimas. / The objective of this work was to evaluate the production and sensitivity of 48 Xanthomonas axonopodis pv. citri strains and 14 Xanthomonas spp. strains to bacteriocins. A number of studies were carried out to verify the effect of temperature, incubation time, and type of culture medium on bacteriocine yield by X. axonopodis pv. citri strains. None of the X. axonopodis pv. citri strains were sensitive to the bacteriocins produced by themselves, and were not affected by the PDA, nutrient agar + NaCl, and YPDA media, at the different incubation times and temperatures studied. However, X. axonopodis pv. passiflorae and strains were sensitive to the bacteriocins produced by the 25 Xac strains evaluated, while a X. campestri pv. campestris and X. axonopodis pv. manihotis strains showed variable sensitivity. Of the 25 X. axonopodis pv. citri strains, only five were not inhibited by the bacteriocins produced by the two X. axonopodis pv. passiflorae strains. The bacteriocins produced by X. axonopodis pv. citri (FDC-806) and X. axonopodis pv. passiflorae (Mar 2850-A) were thermolabile and resistant to lysozyme and sensitive to DNAse. The bacteriocin produced by the X. axonopodis pv. passiflorae was resistant to the action of proteinase K, trypsin and RNAse, while the bacteriocin produced by the X. axonopodis pv. citri isolate was sensitive to those enzymes.

Resumo: A mancha marrom de alternaria, causada pela Alternaria alternata f. sp. citri, afeta o tangor murcote causando lesões em folhas, ramos e frutos, acarretando em desfolha e manchas que depreciam o fruto comercialmente. Os objetivos deste trabalho foram verificar o efeito do meio de cultura no isolamento, da temperatura e do fotoperíodo no crescimento micelial do patógeno, avaliar a sensibilidade do patógeno à fungicidas in vitro e estabelecer o melhor produto e dose para o controle da doença no campo. As avaliações laboratoriais constaram de avaliações de crescimento micelial, medição do tamanho de conídios, concentração de conídos/mL e avaliação de meios de culturas para isolamento do patógeno. Os resultados do teste in vitro mostraram que os ingredientes ativos trifloxystrobin, iprodione, azoxystrobin, difenoconazole, pyraclostrobin, trifloxystrobin + propiconazole e trifloxystrobin + tebuconazole inibiram completamente o crescimento micelial do patógeno. No ensaio de campo todos os tratamento foram superiores a testemunha quanto a produtividade. Concluindo que o controle da doença é recomendado independente do produto utilizado. Entre os produtos utilizados o tratamento com trifloxystrobin + propiconazole foi rentável comparando-se custo e produtividade. / Abstract: The brown spot caused by Alternaria alternata f. sp. citri, affects the Murcott tangor causing lesions in leaves, branches and fruits, defoliation and depreciating the fruit commercially. The objectives of this work went to determine the influence of temperature, media culture and sensibility several fungicides and rates in vitro and in the field. The results showed that: In in vitro test the ingredients active trifloxystrobin, iprodione, azoxystrobin, difenoconazole, pyraclostrobin, trifloxystrobin + propiconazole and trifloxystrobin + tebuconazole inhibited the micelial growth of the pathogen completely. In the field all fungicides treatments were effectives with productivity. Among the used products the treatment trifloxystrobin + propiconazole was profitable being compared cost and productivity. / Orientador: Edson Luiz Furtado / Coorientador: Wilson Story Venâncio / Banca: Nilton Luiz de Souza / Banca: Maristella Dalla Pria / Mestre