A indústria dos citros é de grande importância econômica e social para o Brasil, que é considerado o maior produtor e exportador de suco concentrado de laranja do mundo. Porém, sérios problemas relacionados a doenças têm afetado a produção e qualidade dos citros. Com o desenvolvimento da engenharia genética e a clonagem de genes relacionados à resistência a doenças em plantas, a transformação genética têm se mostrado uma ferramenta auxiliar a programas de melhoramento genético de citros. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de laranja doce das variedades ‘Hamlin’, ‘Valência, ‘Natal’ e ‘Pêra’ expressando o gene hrpN, sob o controle do promotor Pgst1, induzível pelo patógeno. A avaliação da resposta de plantas transgênicas da variedade ‘Hamlin’ contra o agente causal do cancro cítrico, a bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, também foi realizada. Segmentos de epicótilo foram transformados via Agrobacterium tumefaciens, e selecionados em meio de cultura suplementado com canamicina ou gentamicina. A transformação genética foi confirmada por PCR e Southern blot. A transcrição do gene foi avaliada por RT-PCR e a produção da proteína harpina foi analisada por western blot. A eficiência de transformação variou de 2,7 e 6,2% de acordo com a variedade de laranja. Algumas linhagens de plantas transgênicas apresentaram desenvolvimento anormal, não permitindo a realização da análise por Southern blot nem a multiplicação por enxertia. Plantas de laranja ‘Hamlin’ foram propagadas por enxertia e avaliadas para resistência a Xanthomonas axonopodis pv. citri. Todas as linhagens apresentaram redução na severidade dos sintomas causados pela bactéria X. axonopodis pv. citri, avaliados 30 dias após a inoculação. / The citrus industry has a great economic and social importance for Brazil, which is considered largest producer and orange juice exporter in the world. However, serious problems related to pathogens have affected citrus production and quality. With the development of genetic engineering and the characterization of genes related with plant disease resistance, the genetic transformation became an important tool in citrus breeding programs. The objective of this work was the production of transgenic plants of four sweet orange cultivars ‘Hamlin’, ‘Valencia’, ‘Natal’ and ‘Pera’ expressing hrpN gene under the control of Pgst1 inducible promoter. The evaluation of ‘Hamlin’ sweet orange transgenic plants infected with the causal agent of citrus canker, Xanthomonas axonopodis pv. citri was carry out. Epicotyl segments were inoculated with Agrobacterium tumefaciens, and selected in a culture medium supplemented with kanamycin or gentamycin. The genetic transformation was confirmed by PCR and Southern blot analysis. The gene transcription was evaluated by RT-PCR and the production of harpin protein was detected by western blot. The genetic transformation efficiency varied from 2,7% to 6,2% depending on the cultivar. Some transgenic lines had abnormal development, not allowing performing Southern blot analysis or multiplication by grafting. Plants of ‘Hamlin&#146 sweet orange were propagated by grafting and evaluated for Xanthomonas axonopodis pv. citri resistance. All tested plants presented reduction in the severity of the symptoms caused by bacterium X. axonopodis pv. citri 30 days after the inoculation.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:07:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Wilson_Morandi_Filho.pdf: 463965 bytes, checksum: 4f011d565e10b13a07b93ccabfb80913 (MD5) Previous issue date: 2008-04-24 / Mealybugs of the Pseudococcidae family have been reported as causing direct damage (losses in production) and indirect (transmission of virus) in vineyards. Few information is available about the species occuring in the vineyards and the bioecology of pseudococidae in Brazil. In this work we identified the species of Pseudococcidae associated with vineyards in Serra Gaúcha region; studied the biology and determined the thermal requirements of Planococcus citri estimating the number of annual generations in different producing regions and, evaluated the effect of insecticides alternative to phosphorous for the control of the species. P. citri, Planococcus minor, Pseudococcus viburni, Pseudococcus maritimus, Dysmicoccus brevipes were found associated with the vineyards in the region. P. citri was the most abundant species. The biology of P. citri was studied in leaves of the vine cultivars Cabernet Sauvignon, Italy and Isabel, in fruits of cultivar Italy, in roots of cultivars Isabel and in 101-14 and IAC-572 rootstocks. On roots of the rootstock IAC-572, P. citri was unable to complete the life cycle. The average period from egg to adult males was 24.63 ± 0.10 days with viability of 32% while females lasted 32.00 ± 0.11 days with viability of 56% when fed on leaves of vine cultivars. In roots, the cycle duration of the females and males was 32.45±0.19 and 29.50±0.51 days, respectively. The lowest viability of the nymphal cycle was found in roots of Isabel, 8.1% for females and 4.0% for males while the high viability was obtained in leaves of Cabernet Sauvignon, 62.7% and 32.7% for females and males, respectively. The mealybug P. citri completed the life cycle in leaves of the vine cultivars Cabernet Sauvignon, Italy, Isabel; roots of the rootstocks 101-14 and Isabel. The Italy grape berries allowed the nymphal development of P. citri, however the adults were infertile. The roots of the door graft IAC-572 are immune to P. citri. The speed of development of P. citri increases with temperature elevation. The temperatures of 25°C and 28°C were the most appropriate for the insect development. The threshold temperature and thermal constant for the full cycle (egg-adult) of P. citri in vine leaves of the cultivar Italy was 8.16°C and 574.71 degree days, respectively. Based on the thermal requirements, we estimated that the insect may have 5.7 annual generations in Bento Gonçalves (RS), 6.2 in Bagé (RS), 6.9 in São Lourenço (MG), 7.9 in Londrina ( PR), 9.7 in Jales (SP) and 11.5 in Petrolina (PE). In the assessment of insecticides for the control of the insect, the neonicotinoids acetamiprid (0.60 g ai / plant), imidacloprid (0.70 g ai / plant) and thiamethoxam (0.75 g ai plant) were effective in the control of P. citri in vine plants with 1 year old. In adult plants (15 years) the same treatments and doses were not effective to pest control. Foliar spray of acetamiprid (6 20 ia/100L), imidacloprid (7 ia/100L), thiamethoxam (7.5 g ia/100L) and insect growth regulators buprofezin (25 ia/100L) and pyriproxyfen (10g ai 100L) were not effective to control P. citri. / Cochonilhas da família Pseudococcidae têm sido relatadas como causadoras de danos diretos (perdas na produção) e indiretos (transmissão de vírus) na cultura da videira. Poucas informações estão disponíveis sobre as espécies presentes nos vinhedos e a bioecologia das mesmas. Neste trabalho foram identificadas as espécies de Pseudococcidae associados à cultura da videira na região da Serra Gaúcha; estudado a biologia e determinado as exigências térmicas de Planococcus citri, estimado o número de gerações anuais nas diferentes regiões produtoras e avaliado o efeito de inseticidas alternativos aos fosforados para o controle da espécie. P. citri, Planococcus minor, Pseudococcus viburni, Pseudococcus maritimus, Dysmicoccus brevipes foram constatadas associadas à cultura da videira na região da Serra Gaúcha, sendo que P. citri foi a espécie mais abundante nos vinhedos. A biologia de P. citri foi estudada em folhas de videira das cultivares Cabernet Sauvignon, Itália e Isabel, bagas da cultivar Itália e raízes da cultivar Isabel e porta-enxertos 101-14 e IAC-572. Em raízes do porta-enxerto IAC-572 a cochonilha não completou o ciclo biológico. Em bagas de uva Itália, o inseto completou a fase de ninfa, porém os adultos foram inférteis. Em folhas de videira das diferentes cultivares, a duração média do período ovo a adulto dos machos foi de 24,630,10 dias com viabilidade de 32% enquanto que as fêmeas duraram 32,000,11 dias com viabilidade de 56%. Em raízes, a duração do ciclo biológico das fêmeas e machos foi de 32,450,19 e 29,500,51 dias, respectivamente. A menor viabilidade do ciclo ninfal foi verificada em raízes de Isabel, sendo de 8,1% para fêmeas e 4,0% para machos enquanto a maior foi obtida em folhas de Cabernet Sauvignon, sendo de 62,70% e 32,7% para fêmeas e machos, respectivamente. Em folhas a fecundidade foi de 67,2710,70; 53,331,68 e 66,094,68 ovos por fêmea nas cultivares Cabernet Sauvignon, Itália e Isabel, respectivamente. Enquanto em raízes, foi obtido 30,406,12 e 70,0010,5 ovos por fêmea no porta-enxerto 101-14 e Isabel, respectivamente. A velocidade de desenvolvimento de P. citri aumenta com a elevação da temperatura sendo a faixa de temperatura entre 25 ºC e 28 ºC a mais adequada para a espécie. A temperatura base e a constante térmica para o ciclo total (ovo-adulto) de P. citri em folhas de videira da cultivar Itália foi de 8,16 ºC e 574,71 graus-dia, respectivamente. Com base nas exigências térmicas estimou-se que o inseto pode completar 5,7 gerações anuais em Bento Gonçalves (RS), 6,2 em Bagé (RS), 6,9 em São Lourenço (MG), 7,9 em Londrina (PR), 9,7 em Jales (SP) e 11,5 em Petrolina (PE). Na avaliação de inseticidas para o controle de P. citri verificou-se que os neonicotinóides acetamiprid (0,60g i.a./planta), imidacloprid (0,70g i.a./planta) e tiametoxam (0,75g i.a./planta) são eficazes no controle de P. citri em plantas de videira com um ano de idade. Entretanto, em plantas com 15 anos de idade de C. sauvignon os inseticidas neonicotinóides acetamiprid, imidacloprid e tiametoxam nas mesmas doses não foram eficazes para o controle da espécie. Ao estudar o efeito dos inseticidas neonicotinóides acetamiprid (6g i.a./100L), imidacloprid (7g i.a./100L), tiametoxam (7,5g i.a./100L) e os reguladores de crescimento buprofezin (25g i.a./100L) e pyriproxyfen (10g i.a./100L) aplicados via foliar observou-se que os mesmos não proporcionam mortalidade significativa de P. citri na cultura da videira após a pulverização nos vinhedos e avaliação da mortalidade em laboratório.

Planococcus citri se considera una plaga importante de los cítricos en todo el mundo. El manejo de este fitófago se basa en los principios de la Producción Integrada, que requiere conocimientos precisos sobre la biología, ciclo estacional y comportamiento de las poblaciones de P. citri. Entre los años 1992 a 1998 se ha realizado un seguimiento de las poblaciones de P. citri y de sus enemigos naturales en diversas parcelas de cítricos tratadas y no tratadas con productos fitosanitarios. Estos seguimientos se han realizado tanto en diferentes partes del árbol como con trampas pegajosas con feromona sexual. En la zona de estudio, P. citri desarrolló cinco generaciones al año. La temperatura crítica de desarrollo y la integral térmica de P. citri fueron 8,3°C y 562,4°C-día, respectivamente. Las larvas de primera edad invadieron el cáliz de los frutos en los meses de mayo a julio, alcanzando en julio valores elevados en porcentaje de cálices invadidos, con una media del 72. P. citri invadió el fruto desde el cáliz a partir del mes de agosto, con una media de parcelas y años de un 22 de frutos atacados exteriormente. La población de P. citri fluctuó durante los años sucesivos, en parcelas no tratadas, manteniéndose entre un 10 y un 30 de frutos atacados. Los pesticidas organofosforados aplicados en primavera controlaron satisfactoriamente la población de P. citri. Hemos determinado que los umbrales de tratamiento son, en primavera, un 70 de cálices de los frutos ocupados y en agosto y septiembre, un 20 de frutos ocupados. La población de P. citri mostró una pauta de distribución agregativa bajo el cáliz de los frutos, sobre los frutos y en el tronco, con el índice de Taylor b de 1,45, 1,41 y 1,42 respectivamente. Se aconseja muestrear unos 130 frutos mediante un muestreo enumerativo en el caso de poblaciones bajas y medias, y 200 frutos mediante un muestreo binomial para poblaciones elevadas. El control biológico ejerció una función muy importante en la regulación de .... / Martínez Ferrer, MT. (2003). Biología y control del cotonet Planococcus citri (Homoptera: Pseudococcidae) en huertos de cítricos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/27775 / Palancia

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5298.pdf: 2436195 bytes, checksum: 47a2b6b8993059d60e028c4518c3ca75 (MD5) Previous issue date: 2013-05-24 / Universidade Federal de Sao Carlos / The citrus canker is an economically important disease for citrus crop. At the moment, there is no effective means of prevention or cure for this disease, which has contributed to citrus canker wide distribution around the world. The etiologic agents are bacteria of the genus Xanthomonas classified into two species, X. citri and X. fuscans. This study aimed to perform the differential proteomic analysis of cell surface proteins of Xanthomonas citri subsp. citri (XAC), the more virulent specie, between infectious (in vivo) and non-infectious (in vitro) conditions of growth. Additionally, the same analysis was performed by shotgun for XAC against the Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii type B (XauB), less virulent specie, both after growth in vivo. Initially, we performed growth curves of both bacteria on leaves of a common citrus host (Citrus aurantifolia) in order to investigate the dynamics of population growth in vivo and the efficiency of cell recovery by two different methods. For proteomic analysis, intact bacterial cells had their surface proteins labeled with fluorescence (DIGE CyDye Fluor minimal dyes), were then lysed and the total protein extract analyzed by differential gel electrophoresis (2D-DIGE), as standardized in this study. Protein profiles were analyzed by DeCyder 7.0 software and spots differentially expressed (ANOVA p <0.05) were isolated from gels, identified by mass spectrometry and search in protein databases of the annotated genome sequence of the bacteria. Seventy-nine spots from XAC were analyzed and thirty different proteins were identified, of which 10 correspond to known membrane or cell surface proteins: Ton-B dependent receptors and OmpA-related proteins exhibited lower expression in infectious condition, differently of Ferric enterobactin receptors, 60 kDa chaperonin (GroEL) and DnaK which showed higher expression after host interaction. XAC and XauB total extraction analysis by shotgun identified just two XAC proteins. Cell surface proteins with increased in vivo expression in virulent strain (XAC) could provide future targets of biotechnological interest for fighting citrus canker for being possibly related to phytopathogenicity and/or host spectrum. / O cancro cítrico é uma doença economicamente importante para a citricultura. Devido à inexistência de medidas eficazes de prevenção e combate, o cancro cítrico ainda é uma doença de ampla distribuição. Os agentes etiológicos são bactérias do gênero Xanthomonas, sendo classificadas em duas espécies, X. citri e X. fuscans, as quais diferem em virulência e espectro de hospedeiros cítricos. Este trabalho teve como objetivo a análise diferencial do subproteoma da superfície celular de Xanthomonas citri subsp. citri (XAC), espécie mais virulenta e causadora da cancrose A, entre duas condições de crescimento, infectante (in vivo) e não infectante (in vitro). Adicionalmente, a análise proteômica total por shotgun (LC-MS/MS) foi realizada para comparação de XAC com Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii tipo B (XauB), espécie menos virulenta, ambas após crescimento in vivo. Inicialmente, foram realizadas curvas de crescimento de ambas as bactérias em folhas de um hospedeiro cítrico comum (Citrus aurantifolia) a fim de se conhecer a dinâmica de crescimento populacional in vivo e a eficiência da recuperação bacteriana por dois diferentes métodos. Para as análises proteômicas, células bacterianas intactas tiveram suas proteínas de superfície marcadas com fluorescência (CyDye DIGE Fluor minimal dyes) e em seguida foram lisadas, sendo o extrato proteico total analisado por eletroforese diferencial em gel bidimensional (2D-DIGE), técnica padronizada neste trabalho. Os perfis proteicos de XAC foram analisados pelo software DeCyder 7.0 (GE Healthcare) e spots com expressão diferencial (ANOVA p<0,05) foram isolados dos géis e identificados por espectrometria de massas seguida de busca pela ferramenta Mascot em bancos de proteínas anotadas a partir da sequência genômica. Dos 79 spots de XAC analisados foram identificadas 30 diferentes proteínas, sendo que 10 correspondem a proteínas reconhecidamente de membrana e/ou superfície celular: receptores dependentes de Ton-B e proteínas relacionadas a OmpA foram encontradas com menor expressão na condição in vivo, enquanto que receptor de enterobactina, chaperonina 60 kDa (GroEL) e DnaK apresentaram maior expressão após interação com hospedeiro cítrico. Em relação à comparação do extrato total de XAC e XauB por shotgun foi possível identificar apenas duas proteínas de XAC. Proteínas da superfície celular com maior expressão na linhagem virulenta (XAC) na condição in vivo poderão ser futuros alvos de interesse biotecnológico para combate ao cancro cítrico por estarem possivelmente relacionadas com a fitopatogenicidade e/ou maior espectro de hospedeiros cítricos.