Resumo: A citricultura é uma atividade agro-industrial de suma importância para o Estado de São Paulo e para o Brasil. Com uma área plantada em torno de aproximadamente 1 milhão de hectares o país mantém a posição de maior produtor mundial de citros. Desse total, 77% encontram-se localizados na região Sudeste. O sistema citrícola representa 4,47% das exportações de produtos do agronegócio nacional, sendo que o suco de laranja concentrado representa 72% do valor dessas exportações. Entretanto, todo este potencial econômico vem sendo prejudicado por várias doenças dentre elas uma denominada Cancro Cítrico, a qual é causada por um fitopatógeno bacteriano denominado Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). Com o objetivo de analisar os feitos da interação entre essa bactéria e seu hospedeiro natural, utilizou-se a técnica de Análise da Transcrição Reversa em Tempo Real (qRT-PCR) para quantificar a expressão dos genes que compõem o SSTT, SSTQ, algumas ORFs hipotéticas e as quatro cópias do gene pthA. Para tanto, realizou-se um estudo prévio com 10 genes candidatos visando identificar os mais adequados para serem usados como genes de referência no processo de normalização de dados em experimentos dessa natureza. O experimento contou com quatro replicatas biológicas e duas replicatas técnicas. Com base nos resultados, verificou-se que os genes rpoB e rpoC parecem ser os mais indicados para a normalização de dados em experimentos de expressão gênica por qRT-PCR que envolvam analises intergrupos. A maioria dos genes que compõem o SSTT se mostraram induzidos quando a bactéria esteve em contato com seu hospedeiro, com destaque para os genes hrpXct e hrpB4, o que sugere que este sistema tenha um importante papel na patogenicidade dessa bactéria. Por outro lado, os resultados e o estudo da expressão gênica evidenciaram que... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The citrus is an agro-industrial activity of great importance for the State of São Paulo and Brazil. With a planted area around 1 million hectares the country maintains its position of world's leading producer of citrus. Of these, 77% are located in the Southeast. The citrus system represents 4.47% of national agribusiness exportation, being the orange juice concentrate responsible for 72% of the value of these exports. However, all this economic potential is being hampered by diseases among them one called citrus canker, which is caused by a phytopathogenic bacterium known as Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). With the aim of analyzing the achievements of the interaction between this bacterium and its natural host, we used the technique of Real- Time Reverse Transcription Analysis (qRT-PCR) to quantify the expression of genes that comprise the SSTT, SSTQ, some hypothetical ORFs and the four copies of the gene pthA. Thus, a preliminary study with 10 candidate genes were conducted to identify the most suitable ones for use as reference in the process of data standardization in such experiments. The experiment had four biological replicates and two technical replicates. Based on the results, it was found that the rpoB and rpoC genes seem to be the most suitable for the standardization of data in experiments of gene expression by qRT-PCR analysis involving intergroup. Most of the genes that comprise the SSTT was induced when the bacterium was in contact with its host, with emphasis on the genes... (Complete abstract, click electronic access below) / Orientador: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Leandro Marcio Moreira / Banca: Luiz Roberto Furlan / Mestre

Os inseticidas neonicotinóides são atualmente o principal grupo químico utilizado para o controle de insetos sugadores, constituindo-se uma boa opção para o controle de Diaphorina citri Kuwayama. Outra opção de controle do psilídeo tem sido a exploração do parasitóide Tamarixia radiata (Waterson). A compatibilidade dessas duas estratégias de controle poderia auxiliar na implementação de programas de manejo integrado de pragas na cultura do citros. No entanto, faltam estudos sobre a caracterização da suscetibilidade de D. citri para os inseticidas neonicotinóides e o impacto desses inseticidas sobre T. radiata. Sendo assim, os objetivos do trabalho foram o de caracterizar a suscetibilidade de D. citri a inseticidas neonicotinóides, realizar o monitoramento da suscetibilidade a esses inseticidas em populações de D. citri coletadas em pomares de diferentes regiões do Estado de São Paulo e avaliar os efeitos letais e subletais desses inseticidas sobre o parasitóide T. radiata. Os inseticidas avaliados foram: thiamethoxam, thiacloprid e imidacloprid. O método de bioensaio adotado foi o de contato residual para a caracterização da suscetibilidade de D.citri a esses inseticidas. O monitoramento da suscetibilidade a esses inseticidas em diferentes populações de D. citri foi realizado com concentrações diagnósticas baseadas na concentração letal 95 (CL95) de cada inseticida. Para avaliar os efeitos letais e subletais desses inseticidas sobre T. radiata foram realizados bioensaios de contato direto em adultos e pupas, toxicidade residual em adultos, e persistência da atividade biológica desses inseticidas sobre a superfície de folhas de citros. Entre os neonicotinóides testados, a maior toxicidade a D. citri foi observado com thiametoxam, seguidos por imidacloprid e thiaclopid. Os resultados do monitoramento apresentaram diferenças significativas na suscetibilidade das populações de D. citri aos inseticidas neonicotinóides. Para thiamethoxam, a sobrevivência estimada para as populações de D. citri testadas na concentração diagnóstica variou entre 5,5 e 16%, para thiacloprid variou entre 4,5 e 22,5 % e para imidacloprid entre 4 e 14%. Uma alta toxicidade desses inseticidas foi observada para adultos e pupas de T. radiata. No entanto, os efeitos subletais desses inseticidas a 10% da concentração recomendada sobre o estágio de pupa causou redução significativa no parasitismo somente com thiamethoxam. A emergência, longevidade e razão sexual de T. radiata não foram afetadas pelos inseticidas avaliados. A toxicidade residual de thiametoxam, thiacloprid e imidaclopid em folhas de mudas de citros foi relativamente elevada para adultos de T. radiata e com persistência de pelo menos 14 dias. / The neonicotinoids insecticides are currently the main chemical group used for controlling sucking pests and represent a good option for the control of Diaphorina citri Kuwayama. Another control alternative of this pest is the exploitation of parasitoid Tamarixia radiata (Waterson). The compatibility of these control strategies could be very helpful for the implementation of integrated pest management program in citrus. However, there are few studies on the characterization of the susceptibility of D. citri to neonicotinoid insecticides and the evaluation of the impact of these insecticides on T. radiata. Therefore, the objectives of this research were to evaluate the susceptibility of D. citri to neonicotinoid insecticides, to monitor the susceptibility to these insecticides in D. citri populations collected from different citrus groves in the State of São Paulo, and to evaluate the lethal and sublethal effects of these insecticides on T. radiata. The insecticides evaluated in this study were: thiamethoxam, thiacloprid e imidacloprid. A residual contact bioassay was used to characterize the susceptibility of D. citri to these insecticides. A diagnostic concentration bioassays based on lethal concentration 95 (LC95) of each insecticide were used for monitoring the susceptibility of D. citri populations. The lethal and sublethal effects of these insecticides on T. radiata were conducted by using direct contact bioassays on adult and pupal stages of T. radiata, residual contact bioassays and persistence of biological activity of these insecticides on citrus leaf surface. Among the neonicotinoid insecticides tested, the highest toxicity was observed with thiametoxam, followed by imidacloprid and thiaclopid. A significant difference in the susceptitibity to neonicotinoid insecticides was detected in D. citri populations. For thiamethoxam, the survivorship at diagnostic concentration varied from 5.5 to 16%, for thiacloprid varied from 4.5 to 22.5 %, and for imidacloprid from 4 to 14%. The toxicity of these insecticides was high to adult and pupal stages of T. radiata. However, the sublethal effects of these insecticides at 10% of the recommended rate on pupae stage caused the reduction of the parasitism capacity only with thiamethoxam. The emergence, longevity and sexual ratio of T. radiata were not affected by any insecticide tested. The residual toxicity of thiametoxam, thiacloprid and imidaclopid sprayed on citrus seedling leaves was relatively high to D. citri adults and lasted at least 14 days.

Orientadores: Marcos Antonio Machado, Raquel Luciana Boscariol-Camargo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T20:37:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoes_ThiagoSena_M.pdf: 6491430 bytes, checksum: 1dd8f0cde7283c457f3dfd61e7ff367d (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Huanglongbing (HLB), também conhecido como greening é uma das mais importantes doenças dos citros no mundo e é causada pela bactéria Candidatus Liberibacter spp. Esta doença é originária da China e da África, onde estão presentes as variantes Ca. L. asiaticus e Ca. L. africanus, respectivamente. Em 2004, a doença foi encontrada no Brasil onde foi identificada a forma asiática e também uma nova variante denominada Ca. L. americanus. A bactéria Ca.Liberibacter vive e se desenvolve no floema da planta hospedeira, causando amarelecimento do ramo infectado, deformação e queda do fruto. Até o momento não foi possível o cultivo em meio de cultura de Ca. Liberibacter e muito pouco é conhecido sobre sua biologia. Outra doença importante para a cultura, o cancro cítrico, também é originária do continente asiático, e causa grandes perdas de produção devido à desfolha da planta e a queda precoce de frutos. Seu agente causal, a bactériaXanthomonas axonopodis pv. citri provoca lesões necróticas em folhas, ramos e frutos. Não existem variedades resistentes ao HLB ou ao cancro cítrico, o que torna necessários estudos buscando fontes alternativas de resistência às doenças. Uma das possibilidades para se obter resistência é o uso de plantas geneticamente modificadas com genes que expressam peptídeos antimicrobianos ou que atuem no mecanismo de ativação da resposta das plantas às doenças. Os genes atacinaA e Xa21 já foram empregados em construções genéticas para variedades de laranjas doces, sendo que ambos apresentaram resistência a patógenos bacterianos em outras culturas, e diminuição no número de lesões causadas pelo patógeno X axonopodis em: I plantas transgênicas de laranja doce. Outro gene interessante, o Nprl, é um regulador que atua 0(1, indução de respostas de defesa da planta contra patógenos. Em outras culturas, a superexpressão de Npr 1 culturas promoveu aumento da resistência a fungos e bactérias. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a resposta de plantas de laranjas geneticamente modificadas com estes três genes, quando infectadas com Ca. Liberibacter, e a resposta das plantas contendo o gene AtNpr 1 quando inoculadas com X axonopodis. O monitoramento da resposta à inoculação com Ca. Liberibacter foi realizado através da avaliação da presença de sintomas de HLB, e pela quantificação da bactéria nos tecidos do floema por meio de qPCR, utilizando-se a região ribossomal 16S bacteriana, previamente caracterizada. Já as plantas inoculadas com a bactéria causadora do cancro cítrico foram analisadas através da expressão de PR-proteínas, da quantificação do desenvolvimento da população bacteriana por meio de curva de crescimento, e pela análise visual de sintomas. A bactéria Ca. Liberibacter foi capaz de se multiplicar em todos os eventos de transformação analisados, porém quatro deles (transformados com o gene AtNprl) não manifestaram sintoma da doença. Duas plantas desta construção também apresentaram redução no número e tamanho das lesões causadas por X axonopodis, indicando uma possível tolerância desta planta à bactéria. / Abstract: Huanglongbing (HLB), also known as greening, is the world most important citrus disease and it is caused by the bacterium Candidatus Liberibacter spp. This disease was originated from China and Africa, where were discovered the variants Ca. L. asiaticus and Ca. L. africanus, respectively. In 2004, the disease was detected in Brazil, where the variants asiaticus and a new one called americanus were identified. The Ca. Liberibacter bacteria inhabit phloem vessels of host plants, causing yellowing of infected branches, and fruits abscission. At the moment, it was not possible to cultivate Ca. Liberibacter, and very little is known about its biology. Another important disease of citrus, the citrus canker, is also originated from Asian continent and causes huge damages to citrus production because of leaf drop and prematurely falI of fruits. Its causal agent, the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri, causes necrotic lesions in leaves, branches and fruits. There is no varietal resistance to HLB ar citrus canker, and it is necessary to develop studies in order to achieve altemative resistance sources to these diseases. One possibility to obtain resistance is the use of genetically modified plants expressing antimicrobial peptides genes, or expressing genes that act in theplant defense response machinery. The genes attacinA and Xa21 were used in genetic constructions for sweet orange varieties, and both showed resistarice to bacterial pathogens in other crops, with small number of lesions caused by X axonopodis in transgenic sweet orange plants. Another interesting gene, the Nprl, is a regulator that acts in the induction of plant defense response against pathogens. 1n other crops, the Npr 1 super-expression caused high leveI of resistance to bacterial and fungal pathogens. The goal ofthe present study was to evaluate the response of genetically modified sweet orange plants with these three genes, after infection of Ca. Liberibacter, and the response of plants containing the AtNprl gene, after X axonopodis inoculation. The response to Ca. Liberibacter infection was analyzed by the evaluation of HLB symptoms and by the quantification of phloem-associated bacteria by qPCR based on a previously characterized Ca. Liberibacter 168 ribosomal region. PIants inoculated with the causal agent of citrus canker were analyzed by RT-PCR to detect the expression of PR-proteins. The quantification of bacterial population was deveIoped using a growth curve and by visual analysis of symptoms. The bacterium Ca. Liberibacter grown in alI the transformation events analyzed, however four of them (transformed with the AtNprl gene) did not develop disease symptoms. Also, two. plants of this construction showed reduction in the number and size of lesions caused by X axonopodis, indicating a possible induction of plant tolerance to citrus canker. / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2016-08-29T21:08:03Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Leonardo_Melo-UEFS_PGCA-2.pdf: 1657755 bytes, checksum: 78e6ca37c9610faf17a158b94e25bcb8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-29T21:08:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Leonardo_Melo-UEFS_PGCA-2.pdf: 1657755 bytes, checksum: 78e6ca37c9610faf17a158b94e25bcb8 (MD5) Previous issue date: 2016-04-08 / Funda??o de Amparo ? Pesquisa do Estado da Bahia - FAPEB / The Huanglongbing (HLB) is the disease of greatest concern for growers because they spread quickly and cause severe symptoms. The Diaphorina citri insect is the main vector of the HLB. The application of insecticides is a control measure of the vector insect of the HLB widely adopted. The amount of pesticides needed for an effective control of this insect is better estimated if such application is combined with a monitoring of its population by yellow sticky traps. These insects are captured for a manual count in research centers. So, this research aims to discover a computational approach of classification of Diaphorina citri insect images with higher accuracy rate that the classification rate currently used in manual counting procedure and thus enable the automation of this important counting procedure. For this, have been tried and combined computational methods for features extraction (ORB, SIFT, SURF, BRISK and FREAK), grouping of characteristics (Mini Batch K-Means) and features classification for machine learning (KNN and SVM), using a generated bank with 1152 images of insects. The best found classification approach (extractor SURF/SIFT, BoF with Diaphorina citri features and SVM with core RBF) generated classification performance results for the metric accuracy, which outperformed the best measured result in research that evaluated the counting manual process. In this approach, the highest achieved accuracy, in the cross validation process, was 98.17% and was 2.54% as standard deviation and the accuracy of the final test of generalization model was 99.14%. The achieved result is of great importance for the control of HLB. The achieved classification accuracy rates were higher than rates reported in the manual procedure, making possible the construction of computer systems to high accuracy for the control of this insect. This automated control can provide significant savings of funds. / O Huanglongbing (HLB) ? a doen?a de maior preocupa??o para os citricultores por se propagar com rapidez e provocar severos sintomas. O inseto Diaphorina citri ? o principal vetor do HLB. A aplica??o de inseticidas ? uma medida de controle do inseto vetor do HLB amplamente adotada. A quantidade de inseticidas necess?ria para um controle efetivo desse inseto ? melhor estimada se essa aplica??o for combinada a um monitoramento de sua popula??o por meio de armadilhas adesivas amarelas. Esses insetos s?o capturados para uma contagem manual em centros de pesquisa. Ent?o, esta pesquisa tem por objetivo descobrir uma abordagem computacional de classifica??o de imagens de insetos Diaphorina citri com taxa de acur?cia de classifica??o maiores que a taxa de classifica??o utilizada atualmente no procedimento manual de contagem e, assim, possibilitar a automa??o desse importante procedimento de contagem. Para isso, foram experimentados e combinados m?todos computacionais para a extra??o de caracter?sticas (ORB, SIFT, SURF, BRISK e FREAK), agrupamento de caracter?sticas (Mini Batch K-Means) e classifica??o de caracter?sticas por aprendizagem de m?quina (KNN e SVM), utilizando um banco gerado com 1152 imagens de insetos. A melhor abordagem de classifica??o encontrada (extrator SURF/SIFT, BoF com caracter?sticas do Diaphorina citri e SVM com n?cleo RBF) gerou resultados de desempenho de classifica??o, pela m?trica da acur?cia, que superaram o melhor resultado medido na pesquisa que avaliou o processo de contagem manual. Nessa abordagem, a maior acur?cia atingida no processo de valida??o cruzada foi de 98,17% e teve 2,54% como desvio padr?o e a acur?cia do teste final de generaliza??o de modelo foi de 99,14%. O resultado alcan?ado ? de grande import?ncia para o controle do HLB. As taxas de acur?cia de classifica??o alcan?adas foram superiores as taxas relatadas no procedimento manual, tornando vi?vel a constru??o de sistemas computacionais de alta acur?cia para o controle desse inseto. Esse controle automatizado pode proporcionar uma economia significativa de recursos financeiros.

The variation in the insect immune system is an important regulator of insect populations and the pathogens they carry. A central component of insect immunity is melanin, whose production creates cytotoxic intermediates that help to protect against a broad spectrum of pathogens. Melanin is also used in insect cuticle where it helps to improve thermoregulation and desiccation resistance, with insects having less melanized cuticles in warmer and more humid environments. Considering that cuticle melanin and immune melanin are formed by near identical biochemical pathways, they are pleiotropically linked (that is, one or more linked genes influence multiple traits). This has lead to the cuticle-dependent immune investment (CDII) hypothesis, which states that adaptive responses in the cuticle can lead to non-adaptive changes in immunity and could lead to an increase in transmission of insect vectored pathogens in warming climates, due to a weaker defense against the pathogen. However, the impact of CDII on cuticle melanin and immunity, as well as infection prevalence and intensity, under seasonal conditions in the field is still unclear. In this project, we study a population of Asian citrus psyllids, Diaphorina citri, in the field over four seasons. Diaphorina citri vectors a Gram-negative bacteria, Candidatus Liberbacter asiaticus (CLas), that is responsible for Huanglongbing, aka citrus greening disease, which has cost the Florida citrus industry several billion dollars. We assess pathogen load of CLas by quantitative PCR, and assess levels of phenoloxidase activity in the insect hemolymph to measure insect immune function. We assess levels of cuticle melanin. Our results show a significant correlation between temperature, cuticle melanin, and immune function. However, the affect of seasonality on infection prevalence and intensity remains unclear. THE EFFECT OF CLIMATE ON PHYSIOLOGY AND IMMUNE FUNCTION IN THE ASIAN CITRUS PSYLLID, DIAPHORINA CITRI

Genomas bacterianos são extremamente dinâmicos e boa parte dessa dinâmica ocorre devido a transferência horizontal e aquisição de DNA exógeno, um processo natural e fundamental para a evolução, adaptação e diversificação dos microrganismos. Ilhas genômicas são grandes regiões do cromossomo bacteriano adquiridas por transferência horizontal e estão presentes em apenas algumas linhagens, podendo conferir alguma vantagem adaptativa. Em Pseudomonas aeruginosa, até o momento foram caracterizadas pelo menos dezesseis ilhas genômicas e cada uma delas confere características diferentes a seus hospedeiros. Em P. aeruginosa UCBPP-PA14 (ou simplesmente PA14), encontram-se duas ilhas de patogenicidade denominadas PAPI-1 e PAPI-2, sendo a primeira a maior e a mais estudada, contendo 115 ORFs (“Open Reading Frame”, ou quadros abertos de leitura). Dentre estes, o gene int codifica uma integrase essencial para a excisão e integração de PAPI-1, e o gene soj é necessário para a manutenção da ilha na célula e é expresso apenas quando esta se encontra na forma epissomal. PAPI-1 codifica um provável sistema de secreção tipo IV (T4SS), similar ao do elemento móvel ICEHin1056, responsável pela transferência deste para outras bactérias. O objetivo deste trabalho foi identificar fatores genéticos e ambientais que contribuem para a transferência de PAPI-1 entre linhagens de P. aeruginosa. Foi observado que os mutantes por transposon nos genes PAPI-1 PA14_59860, PA14_59880, PA14_59920 e PA14_59940 têm a frequência de transferência de PAPI-1 diminuída, mas os genes interrompidos nesses mutantes não são essenciais para a excisão da ilha. Também foi mostrado que os reguladores percepção de quorum RhlR e MvfR têm influência na expressão do gene int, mas não de soj. O terceiro regulador de percepção de quorum, LasR, assim como a proteína H-NS MvaT, não tem influência na expressão de int e de soj. Ensaios de RT-PCR quantitativos mostraram que o choque térmico aumentou os níveis do mRNA de soj, mas não de int, corroborando dados previamente sugeridos pela literatura, que mostram uma maior freqüência de transferência de PAPI-1 nessas condições. Também foi analisado se o segundo mensageiro celular em bactérias, c-di-GMP, poderia contribuir para a excisão/manutenção de PAPI-1. Alterações nas concentrações deste segundo mensageiro pela superexpressão de proteínas responsáveis por sua síntese ou degradação não foram capazes de afetar a excisão/manutenção de PAPI-1. Houve diminuição na frequência de transferência de PAPI-1 a partir de linhagens doadoras superexpressando uma diguanilato ciclase ou uma fosfodiesterase de c-di-GMP, mas provavelmente este efeito não se deve aos níveis alterados desse segundo mensageiro. Em Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 (XAC), uma região de 86 kb possui uma grande semelhança com PAPI-1 na organização dos genes. Além disso, possui uma série de ORFs relacionados aos genes “core” que definem uma família de ilhas genômicas sintênicas das quais PAPI-1 faz parte. Entretanto, os genes acessórios encontrados entre os blocos de genes conservados varia muito entre PAPI-1 e a região de XAC. Foi determinado que esta região de XAC não pode se excisar do cromossomo nas condições analisadas. Por fim, com o intuito de verificar as possíveis interações entre os produtos dos genes conservados em PAPI-1 e XAC, ensaios de duplo-híbrido foram realizados, porém não foi possível determiná-las, visto que apenas resultados falsos positivos foram obtidos. Este trabalho mostrou pela primeira vez que a percepção de quorum está envolvida com a expressão de soj e determinou uma extensa similaridade entre essa ilha e uma região do genoma de XAC / Bacterial genomes are extremely dynamic mostly because of horizontal gene transfer, a natural and fundamental process for evolution, adaptation and diversification of microorganisms. Genomic islands are large DNA segments acquired by horizontal gene transfer which are present only in a few strains and may confer some adaptative advantage. At least sixteen genomic islands have been characterized in Pseudomonas aeruginosa to date and each confers different characteristics to its host strain. P. aeruginosa UCBPP-PA14 (PA14) harbors two pathogenicity islands named PAPI-1 and PAPI-2. PAPI-1 is the largest one, carrying 115 open reading frames (ORFs). Among these, int codes for an integrase essential for PAPI-1 excision and integration, and soj is required for maintaining PAPI-1 in the cells, being expressed only when this island is in an episomal, circular form. PAPI-1 also harbors genes coding for a type four secretion system (T4SS) similar to the mobile element ICEHin1056, which is responsible for transferring this element to other bacteria. In this work, we show that transposon insertion in PAPI-1 genes PA14_59860, PA14_59880, PA14_59920 and PA14_59940 lowered the frequency of conjugation of PAPI-1 from PA14 to other bacteria, but those genes were not essential for PAPI-1 excision. Quorum sensing regulators RhlR and MvfR had a role in int expression, but did not alter soj transcription. The third quorum sensing regulator LasR, as well as the H-NS protein MvaT, did not alter both int and soj expression. Quantitative RT-PCR assays showed that cells incubated at heat shock conditions present higher levels of soj, mRNA, confirming published data that showed an increase in PAPI-1 transfer in these conditions. It was also analyzed whether the second messenger c-di-GMP would contribute to PAPI-1 excision/maintenance. Changes in the levels of this second messenger in cells overexpressing proteins responsible for its synthesis or degradation did not affect PAPI-1 excision and maintenance. A decrease in PAPI-1 transfer frequency was detected when those cells were used as donors in conjugation, but this effect cannot be attributed to the altered c-di-GMP levels. In Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 (XAC), an 86 kb genome region shares similarity with PAPI-1 regarding gene homology and organization. It also carries ORFs related to the core genes that define a syntenic family of genomic islands that includes PAPI-1. Nevertheless, the accessory genes dispersed among the clusters of conserved genes are not related, when comparing PAPI-1 and this region in XAC. An epissomal form of this putative XAC island could not be detected in the conditions tested in this work. Finally, in order to verify interactions involving the conserved proteins in PAPI-1 and XAC, two hybrid assays were carried out, but only false positives results were obtained

Genomas bacterianos são extremamente dinâmicos e boa parte dessa dinâmica ocorre devido a transferência horizontal e aquisição de DNA exógeno, um processo natural e fundamental para a evolução, adaptação e diversificação dos microrganismos. Ilhas genômicas são grandes regiões do cromossomo bacteriano adquiridas por transferência horizontal e estão presentes em apenas algumas linhagens, podendo conferir alguma vantagem adaptativa. Em Pseudomonas aeruginosa, até o momento foram caracterizadas pelo menos dezesseis ilhas genômicas e cada uma delas confere características diferentes a seus hospedeiros. Em P. aeruginosa UCBPP-PA14 (ou simplesmente PA14), encontram-se duas ilhas de patogenicidade denominadas PAPI-1 e PAPI-2, sendo a primeira a maior e a mais estudada, contendo 115 ORFs (“Open Reading Frame”, ou quadros abertos de leitura). Dentre estes, o gene int codifica uma integrase essencial para a excisão e integração de PAPI-1, e o gene soj é necessário para a manutenção da ilha na célula e é expresso apenas quando esta se encontra na forma epissomal. PAPI-1 codifica um provável sistema de secreção tipo IV (T4SS), similar ao do elemento móvel ICEHin1056, responsável pela transferência deste para outras bactérias. O objetivo deste trabalho foi identificar fatores genéticos e ambientais que contribuem para a transferência de PAPI-1 entre linhagens de P. aeruginosa. Foi observado que os mutantes por transposon nos genes PAPI-1 PA14_59860, PA14_59880, PA14_59920 e PA14_59940 têm a frequência de transferência de PAPI-1 diminuída, mas os genes interrompidos nesses mutantes não são essenciais para a excisão da ilha. Também foi mostrado que os reguladores percepção de quorum RhlR e MvfR têm influência na expressão do gene int, mas não de soj. O terceiro regulador de percepção de quorum, LasR, assim como a proteína H-NS MvaT, não tem influência na expressão de int e de soj. Ensaios de RT-PCR quantitativos mostraram que o choque térmico aumentou os níveis do mRNA de soj, mas não de int, corroborando dados previamente sugeridos pela literatura, que mostram uma maior freqüência de transferência de PAPI-1 nessas condições. Também foi analisado se o segundo mensageiro celular em bactérias, c-di-GMP, poderia contribuir para a excisão/manutenção de PAPI-1. Alterações nas concentrações deste segundo mensageiro pela superexpressão de proteínas responsáveis por sua síntese ou degradação não foram capazes de afetar a excisão/manutenção de PAPI-1. Houve diminuição na frequência de transferência de PAPI-1 a partir de linhagens doadoras superexpressando uma diguanilato ciclase ou uma fosfodiesterase de c-di-GMP, mas provavelmente este efeito não se deve aos níveis alterados desse segundo mensageiro. Em Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 (XAC), uma região de 86 kb possui uma grande semelhança com PAPI-1 na organização dos genes. Além disso, possui uma série de ORFs relacionados aos genes “core” que definem uma família de ilhas genômicas sintênicas das quais PAPI-1 faz parte. Entretanto, os genes acessórios encontrados entre os blocos de genes conservados varia muito entre PAPI-1 e a região de XAC. Foi determinado que esta região de XAC não pode se excisar do cromossomo nas condições analisadas. Por fim, com o intuito de verificar as possíveis interações entre os produtos dos genes conservados em PAPI-1 e XAC, ensaios de duplo-híbrido foram realizados, porém não foi possível determiná-las, visto que apenas resultados falsos positivos foram obtidos. Este trabalho mostrou pela primeira vez que a percepção de quorum está envolvida com a expressão de soj e determinou uma extensa similaridade entre essa ilha e uma região do genoma de XAC / Bacterial genomes are extremely dynamic mostly because of horizontal gene transfer, a natural and fundamental process for evolution, adaptation and diversification of microorganisms. Genomic islands are large DNA segments acquired by horizontal gene transfer which are present only in a few strains and may confer some adaptative advantage. At least sixteen genomic islands have been characterized in Pseudomonas aeruginosa to date and each confers different characteristics to its host strain. P. aeruginosa UCBPP-PA14 (PA14) harbors two pathogenicity islands named PAPI-1 and PAPI-2. PAPI-1 is the largest one, carrying 115 open reading frames (ORFs). Among these, int codes for an integrase essential for PAPI-1 excision and integration, and soj is required for maintaining PAPI-1 in the cells, being expressed only when this island is in an episomal, circular form. PAPI-1 also harbors genes coding for a type four secretion system (T4SS) similar to the mobile element ICEHin1056, which is responsible for transferring this element to other bacteria. In this work, we show that transposon insertion in PAPI-1 genes PA14_59860, PA14_59880, PA14_59920 and PA14_59940 lowered the frequency of conjugation of PAPI-1 from PA14 to other bacteria, but those genes were not essential for PAPI-1 excision. Quorum sensing regulators RhlR and MvfR had a role in int expression, but did not alter soj transcription. The third quorum sensing regulator LasR, as well as the H-NS protein MvaT, did not alter both int and soj expression. Quantitative RT-PCR assays showed that cells incubated at heat shock conditions present higher levels of soj, mRNA, confirming published data that showed an increase in PAPI-1 transfer in these conditions. It was also analyzed whether the second messenger c-di-GMP would contribute to PAPI-1 excision/maintenance. Changes in the levels of this second messenger in cells overexpressing proteins responsible for its synthesis or degradation did not affect PAPI-1 excision and maintenance. A decrease in PAPI-1 transfer frequency was detected when those cells were used as donors in conjugation, but this effect cannot be attributed to the altered c-di-GMP levels. In Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 (XAC), an 86 kb genome region shares similarity with PAPI-1 regarding gene homology and organization. It also carries ORFs related to the core genes that define a syntenic family of genomic islands that includes PAPI-1. Nevertheless, the accessory genes dispersed among the clusters of conserved genes are not related, when comparing PAPI-1 and this region in XAC. An epissomal form of this putative XAC island could not be detected in the conditions tested in this work. Finally, in order to verify interactions involving the conserved proteins in PAPI-1 and XAC, two hybrid assays were carried out, but only false positives results were obtained

Orientador: Ljubica Tasic / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-22T23:34:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Awan_AlmasTaj_D.pdf: 4796874 bytes, checksum: 185a66c389aae68c266f385689030ef0 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os biocombustíveis de segunda geração surgiram como fontes energéticas promissoras, podendo ser obtidos a partir de vários tipos de biomassa que não seja utilizada para alimentos. Um tipo de biomassa que apresenta baixo custo além de apresentar níveis elevados de carboidratos, é a biomassa obtida após o processamento da laranja (Citrus processing waste from oranges, CPWO). Há um grande interesse na exploração desta biomassa em termos da produção do bioetanol (etanol da 2G). Nosso trabalho visa melhorar os processos de hidrólise do CPWO comparando o rendimento do processo clássico de hidrólise ácida com aplicação de enzimas comerciais ou provenientes do microrganismo Xanthomonas axonopodis pv. citri, cepa 306 (um fitopatógeno). Os resultados obtidos com a presente investigação evidenciam que ocorreu a conversão bem-sucedida do CPWO em uma mistura de açúcares. A posteriori, os açúcares redutores que foram obtidos foram convertidos em bioetanol por meio da fermentação em mono- e co-cultura. Para tanto, foi empregada a espécie Saccharomyces cerevisiae e duas cepas de Candida parapsilosis IFM 48375 e NRRL Y-12969, sendo que as duas últimas foram isoladas a partir do bagaço da laranja. Os rendimentos em termos de bioetanol obtido nas fermentações aplicando co-culturas estavam ao redor de 50 a 62%, constituindo valores muito maiores comparados com os obtidos por cepas usadas individualmente. Além disso, os açúcares foram consumidos mais rapidamente (6 h), tornando tais processos atraentes em termos de custo e aplicações comerciais / Abstract: Second generation biofuels from renewable resources have come forth as a result of energy security coupled with diminishing fossil fuel resources. Lignocellulosic biomass is a renewable resource, which can be converted in to liquid transportation fuels. Utilization of agro-industrial waste for the generation of biofuels makes it a cleaner production (Green Chemistry). Brazil is the world¿s largest producer of oranges. The current project deals with Citrus Processing Waste from Oranges (CPWO), and obtaining valuable products such as bioethanol, hesperidin, and essential oil. The process of hydrolyzing CPWO was improved and the classical way of biomass saccharification, i.e. acid hydrolysis, was compared with the enzyme hydrolysis. In enzyme hydrolysis, apart from applying commercial enzymes, saccharification was also investigated with protein extracts of Xanthomonas axonopodis pv. citri strain 306 (Xac 306), a potent pathogen that causes Citrus canker disease. Later, the obtained reducing sugars were converted into bioethanol by submerged mono- and co-culture fermentations that involved three yeast strains: Saccharomyces cerevisiae, Candida parapsilosis IFM 48375 and NRRL Y-12969, the last two being isolated from bagasse. Results demonstrated successful hydrolyses by Xac enzymes that released high levels of fermentable sugars. Also during co-culture fermentation processes, it was noticed that ethanol yield was improved from 50% to 62% w/w (calculated on the basis of total dry matter contents) and sugars were consumed faster. Thus by employing co-culture fermentation strategy, apart from getting better bioethanol yields, fermentation time is also reduced that makes it a cost effective technique / Doutorado / Quimica Organica / Doutora em Ciências

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T05:36:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soprano_AdrianaSantos_D.pdf: 24018757 bytes, checksum: 29724fbb81a588e3bb656bf4c2df3390 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri (X. citri), afeta a maioria das espécies de Citrus, ocorre praticamente em todos continentes e se destaca como uma séria ameaça à citricultura brasileira. O mecanismo molecular pelo qual X. citri causa cancro não é inteiramente conhecido, entretanto, sabe-se que a bactéria utiliza o sistema secretório tipo III para injetar proteínas de patogenicidade, entre elas, PthAs da família AvrBs3/PthA, também conhecidas como efetores TAL (transcriptional activator-like). Os efetores TAL atuam como fatores de transcrição transativando genes específicos da planta que vão beneficiar a bactéria ou desencadear respostas de defesa. Com o objetivo de entender os mecanismos moleculares pelos quais os efetores TAL atuam, a técnica de duplo híbrido foi usada para identificar proteínas de laranja doce (Citrus sinensis) que interagem com PthA4, um dos efetores TAL de X. citri necessário para o desenvolvimento do cancro cítrico. A maioria das proteínas de laranja identificadas como alvos de PthA4 apresenta domínios de ligação à DNA ou RNA e está envolvida no controle da transcrição, estabilização de mRNAs e tradução. Várias dessas proteínas interagem entre si, sugerindo a presença de um complexo multiproteico como alvo de efetores TAL. Entre as proteínas envolvidas no controle da transcrição, destacamos a CsMAF1, uma proteína homóloga à MAF1 humana que atua como regulador negativo da RNA Polimerase III. Os resultados obtidos nesse trabalho revelam que CsMAF1 complementa o fenótipo do mutante maf1 de levedura, reprimindo a expressão de tRNAHis e que a expressão de PthA4 na cepa complementada restaura a síntese desse tRNA. Portanto, os dados mostram que CsMAF1 atua como um repressor da RNA Pol III em levedura e que PthA4 altera o estado repressor de CsMAF1 sobre a RNA Pol III. De forma surpreendente, verificamos que plantas de citros com níveis reduzidos de CsMAF1 apresentaram aumento significativo no número e intensidade de lesões hiperplásticas ou eruptivas quando infiltradas com X. citri, indicando que CsMAF1 desempenha um papel crítico no desenvolvimento dos sintomas do cancro cítrico. O aumento das lesões do cancro nas plantas silenciadas para CsMAF1 se correlaciona com um aumento expressivo de tRNAs, incluindo o tRNAHis, confirmando assim o papel repressor de CsMAF1 sobre a RNA Pol III em citros. Além disso, mostramos nesse trabalho que CsMAF1 é uma fosfoproteína que se encontra na forma dimérica em solução, uma característica singular ainda não descrita para membros dessa família de proteínas. Verificamos que CsMAF1 é fosforilada in vitro pelas quinases PKA e PKC e que apresenta sítios adicionais de fosforilação conservados para a quinase TOR, incluindo o resíduo Thr62. Curiosamente, tais sítios se localizam na interface de dimerização de CsMAF1, sugerindo que a fosforilação desses sítios deve regular a função da proteína e/ou seu estado multimérico. De fato, verificamos que a substituição do resíduo de treonina Thr 62 para ácido aspártico (Asp 62) diminui a proporção dímero:monômero de CsMAF1, indicando que a fosforilação de resíduos na interface do dímero desestabiliza o dímero, e que esse pode ser um mecanismo regulatório novo para essa classe de proteína. Desse modo, esses achados abrem novas perspectivas para o entendimento não só dos mecanismos moleculares envolvidos na regulação da RNA Pol III pela CsMAF1, como também do papel de PthA4 na interação com CsMAF1 e sua modulação da transcrição / Abstract: Citrus canker, caused by Xanthomonas citri (X. citri), is a disease that affects most of the Citrus species, occurs in almost all continents and stands as a threat to the Brazilian citrus industry. The molecular mechanism by which X. citri causes canker is poorly understood, however the bacterium injects pathogenicity proteins via the type III secretion system (T3S) including proteins of AvrBs3/PthA family, also known as transcriptional activator-like (TAL) effectors. TAL effectors have been extensively studied and are known to act as transcription factors that transactivate specific plant genes which either benefit the bacteria or trigger defense responses. To gain insights into the molecular mode of action of TAL effectors, a twohybrid screening was performed to identify sweet orange (Citrus sinensis) proteins that interact with PthA4, one of the X. citri TAL effectors required for citrus canker development. Among the proteins identified as PthA4 interactors, most are DNA and/or RNA-binding factors involved in chromatin remodeling and repair, transcriptional control and mRNA stabilization/modification. Several of these proteins interact with each other, suggesting the presence of a multiprotein complex as a target of TAL effectors. Among the proteins involved in transcription control, we selected for further studies the CsMAF1, a homolog of the human MAF1 that acts as a negative regulator of RNA polymerase III. The results presented here reveal that CsMAF1 complements the yeast maf1 mutant phenotype by repressing the tRNAHis transcription, and that PthA4 expression in the complemented strain restores the tRNAHis synthesis. Thus, the data show that CsMAF1 acts as a RNA Pol III repressor in yeast and that PthA4 somehow suppresses the repressor activity of CsMAF1 upon on the RNA Pol III. Surprisingly, we found that citrus plants with reduced levels of CsMAF1 showed a significant increase in the number, morphology and size of eruptive or hyperplastic lesions when infiltrated with X. citri, indicating the CsMAF1 plays a critical role in canker development. Increased canker lesions in CsMAF1 silenced plants correlated with a significant increase of tRNAs expression, including tRNAHis, thus confirming the repressor role of CsMAF1 upon the citrus RNA Pol III. Furthermore, we showed in this work that CsMAF1 is a phosphorylated and a dimer in solution, a feature that so far has not been reported for any member of this protein family. We found that CsMAF1 is phosphorylated in vitro by PKA and PKC, and has additional phosphorylation sites for the TOR kinase, including the Thr 62 residue. Interestingly, these phosphorylation sites are located at the dimerization interface of CsMAF1, suggesting that phosphorylation of such sites might regulate the function of the protein and / or its multimeric state. Indeed, mutation of threonine residue Thr62 to aspartic acid (Asp62) decreases the dimer:monomer CsMAF1 ratio, indicating that phosphorylation of the residues at the interface of the dimer destabilizes the dimer, and this may be a novel regulatory mechanism for this class of protein. Thus, these findings open new perspectives for the understanding of the molecular mechanisms involved in RNA Pol III regulation by CsMAF1, as well as for the role of PthA4 in the modulation of RNA Pol III transcription mediated by CsMAF1 / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Andrea Balan Fernandes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T08:19:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pegos_VanessaRodrigues_D.pdf: 41543267 bytes, checksum: 0c6ab77fc1de1527fad27fbf8c4b1e70 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. citri) é o causador do cancro cítrico em diversas espécies de citrus, sobretudo, laranjas. As epidemias de cancro cítrico tem causado severas perdas econômicas à citricultura mundial uma vez que não há estratégias de combate efetiva contra essa bactéria no campo. Diversos estudos demonstraram a importância de genes para a patogênese de X. citri, mas ainda não foram investigados genes envolvidos na aquisição e no metabolismo de micronutrientes tais como o fosfato. X. citri conserva o sistema de transporte do tipo ABC de fosfato inorgânico codificado pelo óperon pstSCAB. Adicionalmente a bactéria possui dois outros operons oprO/phoX e phoBR, os quais codificam, respectivamente, uma porina de membrana externa e uma proteína periplasmática ligadora e o sistema dois componentes de sinalização celular, ambos integrantes do regulon de fosfato (regulon pho). Neste trabalho, estudamos a resposta destes operons à carência de fosfato, bem como o papel da proteína ligadora periplasmática PstS, por meio de análises proteômica, metabolômica, estruturais baseadas em cristalografia de raio-X e funcionais utilizando um mutante de X. citri portador de deleção no gene pstS (Xac::pstS). Os dados obtidos foram comparados entre as linhagens selvagem e mutante. Primeiramente evidenciamos que o sistema ABC de fosfato é ativado em carência do íon, incluindo um aumento de expressão de PhoX e PstS de 49 e 33 vezes, respectivamente, e que X. citri apresenta a maioria dos genes do regulon pho. PhoX e PstS são proteínas ligadoras de fosfato que partilham 70% de identidade de aminoácidos e são originadas de uma duplicação gênica. Na ausência de PstS, PhoX parece exercer a função de captação, mas não é capaz de recuperar todos os fenótipos da bactéria selvagem. Adicionalmente, ensaios de transporte de fosfato com as bactérias selvagem e mutante mostraram diferenças no transporte e que o sistema ABC permance constitutivo na linhagem mutante. A deleção de pstS também culminou no retardamento do crescimendo da bactéria em folhas de C. sinensis, mas não interferiu na adesão bacteriana e na produção da goma, estas sim, influenciadas diretamente pela concentração de fosfato no meio. Análises de metabolômica evidenciaram que a carência de fosfato induz mudanças nas rotas bioquímicas, sobretudo na linhagem mutante que utiliza da via das pentoses e do metabolismo do piruvato para a produção de ATP. Este é o primeiro trabalho que evidencia o papel do sistema ABC de transporte de fosfato nesta bactéria e que relaciona de uma forma multidisciplinar, o papel do íon e dos componentes do regulon pho na bactéria X. citri. Adicionalmente, uma vez que o sistema é bem conservado em outras espécies, os resultados obtidos servem como modelo para o gênero Xanthomonas / Abstract: ! Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. citri) is the cause of citrus canker in several species of citrus, especially oranges. The citrus canker epidemics have caused severe economic losses to the citrus industry worldwide since no effective combat strategies against this bacterium. Several studies have demonstrated the importance of genes related to the pathogenesis of X. citri, but there is no studies about mechanisms of micronutrients acquisition such as phosphate. X. citri has an ATP-Binding Cassete transport system for inorganic phosphate encoded by pstSCAB operon. In addition, the bacterium has two other operons oprOphoX and phoBR, which encode respectively, an outer membrane porin and a periplasmic binding protein and two-components system. The three operons and other related genes are members of the phosphate regulon (pho regulon). In this work we studied the response of these operons in phosphate deprivation, and the role of periplasmic-binding protein PstS through proteomics analysis, metabolomics, crystallography and functionally based on a X. citri mutant deleted for pstS gene (Xac::pstS). Data were compared between wild type and mutant strains. We showed that the phosphate ABC system is activated during the ion depletion, including PstS and PhoX that showed increased levels of 49 and 30 times, respectively. In addition, we showed that X. citri displays most of the genes of the pho regulon. PhoX and PstS are phosphate binding proteins that share 70% amino acid identity and have origin from a gene duplication. In the absence of PstS, PhoX seems to complement the uptake function, but it is not able to recover all phenotypes of the wild type bacteria. Additionally, phosphate transport assays with wild type and mutant bacteria showed differences in transport and constitutivity of the ABCsystem in the mutant strain. The deletion of pstS also resulted in slowing of bacteria growth in Citrus sinensis leaves, but did not interfere with bacterial adhesion and gum production, two phenomena directly influenced by the phosphate concentration in the medium. Metabolomic analyzes showed that phosphate deprivation induces changes in biochemical pathways, especially the mutant strain that uses the pentose and pyruvate metabolism for ATP production. This is the first work that highlights the role of the ABC system for phosphate in this bacterium and that reveals in a multidisciplinary way, the role of the ion and the pho regulon components in the phytopathogenic bacterium. Additionally, once the system is well preserved in other species, the results serve as a model for the genus Xanthomonas / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular