Na busca por compostos voláteis para utilização no manejo comportamental de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), a resposta destes insetos foi avaliada frente às substâncias liberadas por plantas de laranja, Citrus sinensis (L.) Osbeck, variedade \'Pêra\', enxertadas sobre limão-cravo, C. limonia Osbeck, sadias vs sintomáticas para Huanglongbing (HLB). Voláteis destas plantas, bem como seus extratos foram testados em olfatômetro \'Y\' e analisados por GC-MS. Somente fêmeas foram atraídas, tanto para os voláteis quanto para os extratos, e preferencialmente os de plantas doentes. Foram encontrados 47 compostos em extratos de plantas sadias e doentes, dos quais 11 [hexanal; α-tujeno; α-pineno; sabineno; β-mirceno; α-terpineno; limoneno; linalol; composto 37 (não identificado); β-elemeno e β-copaeno] presentes em maior quantidade nos extratos de plantas doentes, sendo que 3 desses compostos (sabineno, linalol e β -elemeno) foram majoritários nos extratos de ambas as plantas, doentes e sadias. Esses três compostos, bem como uma substância padrão para atração (salicilato de metila), foram testados em diferentes concentrações e misturas em laboratório, casa-de-vegetação e campo. O efeito destas substâncias foi dependente de sua concentração e, embora limoneno tenha alterado a resposta comportamental das fêmeas, apenas salicilato de metila e linalol foram atraentes. Em laboratório, a mistura desses dois compostos apresentou efeito sinérgico na atração de fêmeas e, em casa-de-vegetação, a adição de linalol junto a plantas de citros aumentou a atratividade das mesmas para insetos adultos, sugerindo importante participação desses compostos no processo de seleção hospedeira pelo inseto. Estes resultados acrescentam novas informações para a busca de um atraente para D. citri visando o manejo comportamental do inseto vetor das bactérias Liberibacter, associadas ao HLB, a mais importante doença dos citros no mundo. / With the aim of searching for volatile compounds to use in behavioral management of Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), the response of these insects was assessed against the substances released by sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck], variety \'Pera\', grafted on Rangpur (C. limonia Osbeck), healthy and Huanglongbing (HLB) symptomatic plants. Plant volatiles as well as plant extracts were tested in Y-tube olfactometer assays and analyzed by GC-MS. Only females were attracted to plant volatiles and extracts and they preferred those from HLB-infected plants. A total of 47 compounds was found in the extracts from healthy and infected plants, from which 11 [hexanal; α-thujene; α-pinene; sabinene; β- myrcene; α-terpinene; limonene; linalool; compound #37 (not identified); β-elemene; and β-coapene] were present in higher amounts in infected plant extracts. Three of these volatiles (sabinene, linalool and β-elemene) represented major compounds in both infected and healthy plant blend extracts. These three compounds, as well as a standard substance used for attraction (methyl salicylate), were tested in different concentrations and mixtures in laboratory, greenhouse and field. The effect of these substances was dependent on its concentration and, although limonene changed female behavioral response, only methyl salicylate and linalool were attractive. In the laboratory, the mixture of these two compounds showed a synergistic effect in attracting females and, in greenhouse, the addition of linalool to citrus plants increased the attractiveness of plants to adult insects, suggesting an important role for these compounds in the host selection process by the insect. These results provide novel information about attractants to D. citri with the aim of developing a behavioral management approach of the insect vector for Liberibacter, bacteria associated to HLB, the most important citrus disease worldwide.

Huanglongbing (HLB) é considerada a doença mais devastadora dos citros. O HLB é causado pela bactéria \'Candidatus Liberibacter spp.\' e transmitido pelo inseto vetor, o psilídeo Diaphorina citri. Não existem ainda métodos curativos para essa doença, ou variedades resistentes, e seu manejo é baseado na aquisição de mudas sadias, monitoramento e controle químico frequente do vetor e inspeção e erradicação de plantas sintomáticas. Devido à dificuldade de manejo da doença, muitos produtores acabam por abandonar a atividade citrícola. O objetivo desse trabalho foi determinar o modelo de gradiente de dispersão da doença que melhor se ajusta aos dados de proporção de plantas sintomáticas erradicadas, a fim de propor medidas mais eficientes de manejo. Para isso, foram ajustados os modelos potência inversa e exponencial negativo à dados de proporção de plantas sintomáticas erradicadas em relação a borda dos lotes, para 21 lotes retangulares de pomares comerciais de laranja doce. Foram utilizadas duas abordagens para a análise dos gradientes, denominadas de \"concêntrica\" e \"direcional\". Para ambas utilizou-se a proporção de plantas erradicadas para faixas de 20 em 20 metros de distância em relação a todas as bordas do pomar para a primeira (concêntrica), e em relação a cada borda dos lotes (direcional). Em ambas as abordagens analisadas, houve melhor ajuste do modelo potência inversa. No entanto, a abordagem concêntrica obteve 15 ajustes de um total de 21 lotes, enquanto que para a abordagem direcional, houve ajuste do modelo para apenas seis lotes. Esses resultados demonstram que há um gradiente de doença da borda para o interior dos lotes, e que ocorre um influxo de insetos vetores de todas as direções. Além disso, o ajuste do modelo da potência inversa sugere que os lotes sofreram influência de fontes de inóculo externas, ou seja, psilídeos bacterilíferos pousam preferencialmente na borda dos pomares e uma pequena parte adentra o interior do lote levando a doença. O gradiente de dispersão em relação da borda dos lotes é consequência da disseminação primária, a qual só poderá ser evitada com o manejo regional, sendo indispensável para um manejo eficiente do HLB a curto e médio prazo.Huanglongbing (HLB) é considerada a doença mais devastadora dos citros. O HLB é causado pela bactéria \'Candidatus Liberibacter spp.\' e transmitido pelo inseto vetor, o psilídeo Diaphorina citri. Não existem ainda métodos curativos para essa doença, ou variedades resistentes, e seu manejo é baseado na aquisição de mudas sadias, monitoramento e controle químico frequente do vetor e inspeção e erradicação de plantas sintomáticas. Devido à dificuldade de manejo da doença, muitos produtores acabam por abandonar a atividade citrícola. O objetivo desse trabalho foi determinar o modelo de gradiente de dispersão da doença que melhor se ajusta aos dados de proporção de plantas sintomáticas erradicadas, a fim de propor medidas mais eficientes de manejo. Para isso, foram ajustados os modelos potência inversa e exponencial negativo à dados de proporção de plantas sintomáticas erradicadas em relação a borda dos lotes, para 21 lotes retangulares de pomares comerciais de laranja doce. Foram utilizadas duas abordagens para a análise dos gradientes, denominadas de \"concêntrica\" e \"direcional\". Para ambas utilizou-se a proporção de plantas erradicadas para faixas de 20 em 20 metros de distância em relação a todas as bordas do pomar para a primeira (concêntrica), e em relação a cada borda dos lotes (direcional). Em ambas as abordagens analisadas, houve melhor ajuste do modelo potência inversa. No entanto, a abordagem concêntrica obteve 15 ajustes de um total de 21 lotes, enquanto que para a abordagem direcional, houve ajuste do modelo para apenas seis lotes. Esses resultados demonstram que há um gradiente de doença da borda para o interior dos lotes, e que ocorre um influxo de insetos vetores de todas as direções. Além disso, o ajuste do modelo da potência inversa sugere que os lotes sofreram influência de fontes de inóculo externas, ou seja, psilídeos bacterilíferos pousam preferencialmente na borda dos pomares e uma pequena parte adentra o interior do lote levando a doença. O gradiente de dispersão em relação da borda dos lotes é consequência da disseminação primária, a qual só poderá ser evitada com o manejo regional, sendo indispensável para um manejo eficiente do HLB a curto e médio prazo. / Huanglongbing (HLB) is considered the most devastating disease of citrus. HLB is caused by the bacterium \'Candidatus Liberibacter spp.\' and transmitted by the insect vector, the psyllid Diaphorina citri. There are no curative methods for this disease, or resistant varieties, and its management is based on the acquisition of healthy seedlings, monitoring and frequent chemical control of the vector and inspection and eradication of symptomatic plants. Due to the difficulty of managing the disease, many producers end up abandoning citrus activity. The objective of this work was to determine the disease dispersion gradient model that best fits the proportion of symptomatic eradicated plants, in order to propose more efficient management measures. For this, inverse power and negative exponential models were adjusted to the proportion of symptomatic plants eradicated in relation to batch border for 21 rectangular plots of commercial sweet orange orchards. Two approaches were used for the analysis of gradients, of \"concentric\" and \"directional\". For both, the proportion of eradicated plants for strips 20-by-20-m apart from all orchard edges was used for the first (concentric), and for each lot border (directional). In both approaches analyzed, there was better fit of the inverse power model. However, the concentric approach obtained 15 adjustments of a total of 21 batches, whereas for the directional approach, there was adjustment of the model to only six batches. These results demonstrate that there is a disease gradient from the edge to the interior of the batches, and that an influx of vector insects from all directions occurs. In addition, the adjustment of the inverse potency model suggests that the lots were influenced by external inoculum sources, that is, bacterial insects preferentially land on the edge of the orchards and a small part enters the interior of the lot leading to illness. The dispersion gradient in relation to the edge of the lots is a consequence of the primary dissemination, which can only be avoided with the regional management, being indispensable for an efficient management of the HLB in the short and medium term.

Na busca por compostos voláteis para utilização no manejo comportamental de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), a resposta destes insetos foi avaliada frente às substâncias liberadas por plantas de laranja, Citrus sinensis (L.) Osbeck, variedade \'Pêra\', enxertadas sobre limão-cravo, C. limonia Osbeck, sadias vs sintomáticas para Huanglongbing (HLB). Voláteis destas plantas, bem como seus extratos foram testados em olfatômetro \'Y\' e analisados por GC-MS. Somente fêmeas foram atraídas, tanto para os voláteis quanto para os extratos, e preferencialmente os de plantas doentes. Foram encontrados 47 compostos em extratos de plantas sadias e doentes, dos quais 11 [hexanal; α-tujeno; α-pineno; sabineno; β-mirceno; α-terpineno; limoneno; linalol; composto 37 (não identificado); β-elemeno e β-copaeno] presentes em maior quantidade nos extratos de plantas doentes, sendo que 3 desses compostos (sabineno, linalol e β -elemeno) foram majoritários nos extratos de ambas as plantas, doentes e sadias. Esses três compostos, bem como uma substância padrão para atração (salicilato de metila), foram testados em diferentes concentrações e misturas em laboratório, casa-de-vegetação e campo. O efeito destas substâncias foi dependente de sua concentração e, embora limoneno tenha alterado a resposta comportamental das fêmeas, apenas salicilato de metila e linalol foram atraentes. Em laboratório, a mistura desses dois compostos apresentou efeito sinérgico na atração de fêmeas e, em casa-de-vegetação, a adição de linalol junto a plantas de citros aumentou a atratividade das mesmas para insetos adultos, sugerindo importante participação desses compostos no processo de seleção hospedeira pelo inseto. Estes resultados acrescentam novas informações para a busca de um atraente para D. citri visando o manejo comportamental do inseto vetor das bactérias Liberibacter, associadas ao HLB, a mais importante doença dos citros no mundo. / With the aim of searching for volatile compounds to use in behavioral management of Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), the response of these insects was assessed against the substances released by sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck], variety \'Pera\', grafted on Rangpur (C. limonia Osbeck), healthy and Huanglongbing (HLB) symptomatic plants. Plant volatiles as well as plant extracts were tested in Y-tube olfactometer assays and analyzed by GC-MS. Only females were attracted to plant volatiles and extracts and they preferred those from HLB-infected plants. A total of 47 compounds was found in the extracts from healthy and infected plants, from which 11 [hexanal; α-thujene; α-pinene; sabinene; β- myrcene; α-terpinene; limonene; linalool; compound #37 (not identified); β-elemene; and β-coapene] were present in higher amounts in infected plant extracts. Three of these volatiles (sabinene, linalool and β-elemene) represented major compounds in both infected and healthy plant blend extracts. These three compounds, as well as a standard substance used for attraction (methyl salicylate), were tested in different concentrations and mixtures in laboratory, greenhouse and field. The effect of these substances was dependent on its concentration and, although limonene changed female behavioral response, only methyl salicylate and linalool were attractive. In the laboratory, the mixture of these two compounds showed a synergistic effect in attracting females and, in greenhouse, the addition of linalool to citrus plants increased the attractiveness of plants to adult insects, suggesting an important role for these compounds in the host selection process by the insect. These results provide novel information about attractants to D. citri with the aim of developing a behavioral management approach of the insect vector for Liberibacter, bacteria associated to HLB, the most important citrus disease worldwide.

Os inseticidas neonicotinóides são atualmente o principal grupo químico utilizado para o controle de insetos sugadores, constituindo-se uma boa opção para o controle de Diaphorina citri Kuwayama. Outra opção de controle do psilídeo tem sido a exploração do parasitóide Tamarixia radiata (Waterson). A compatibilidade dessas duas estratégias de controle poderia auxiliar na implementação de programas de manejo integrado de pragas na cultura do citros. No entanto, faltam estudos sobre a caracterização da suscetibilidade de D. citri para os inseticidas neonicotinóides e o impacto desses inseticidas sobre T. radiata. Sendo assim, os objetivos do trabalho foram o de caracterizar a suscetibilidade de D. citri a inseticidas neonicotinóides, realizar o monitoramento da suscetibilidade a esses inseticidas em populações de D. citri coletadas em pomares de diferentes regiões do Estado de São Paulo e avaliar os efeitos letais e subletais desses inseticidas sobre o parasitóide T. radiata. Os inseticidas avaliados foram: thiamethoxam, thiacloprid e imidacloprid. O método de bioensaio adotado foi o de contato residual para a caracterização da suscetibilidade de D.citri a esses inseticidas. O monitoramento da suscetibilidade a esses inseticidas em diferentes populações de D. citri foi realizado com concentrações diagnósticas baseadas na concentração letal 95 (CL95) de cada inseticida. Para avaliar os efeitos letais e subletais desses inseticidas sobre T. radiata foram realizados bioensaios de contato direto em adultos e pupas, toxicidade residual em adultos, e persistência da atividade biológica desses inseticidas sobre a superfície de folhas de citros. Entre os neonicotinóides testados, a maior toxicidade a D. citri foi observado com thiametoxam, seguidos por imidacloprid e thiaclopid. Os resultados do monitoramento apresentaram diferenças significativas na suscetibilidade das populações de D. citri aos inseticidas neonicotinóides. Para thiamethoxam, a sobrevivência estimada para as populações de D. citri testadas na concentração diagnóstica variou entre 5,5 e 16%, para thiacloprid variou entre 4,5 e 22,5 % e para imidacloprid entre 4 e 14%. Uma alta toxicidade desses inseticidas foi observada para adultos e pupas de T. radiata. No entanto, os efeitos subletais desses inseticidas a 10% da concentração recomendada sobre o estágio de pupa causou redução significativa no parasitismo somente com thiamethoxam. A emergência, longevidade e razão sexual de T. radiata não foram afetadas pelos inseticidas avaliados. A toxicidade residual de thiametoxam, thiacloprid e imidaclopid em folhas de mudas de citros foi relativamente elevada para adultos de T. radiata e com persistência de pelo menos 14 dias. / The neonicotinoids insecticides are currently the main chemical group used for controlling sucking pests and represent a good option for the control of Diaphorina citri Kuwayama. Another control alternative of this pest is the exploitation of parasitoid Tamarixia radiata (Waterson). The compatibility of these control strategies could be very helpful for the implementation of integrated pest management program in citrus. However, there are few studies on the characterization of the susceptibility of D. citri to neonicotinoid insecticides and the evaluation of the impact of these insecticides on T. radiata. Therefore, the objectives of this research were to evaluate the susceptibility of D. citri to neonicotinoid insecticides, to monitor the susceptibility to these insecticides in D. citri populations collected from different citrus groves in the State of São Paulo, and to evaluate the lethal and sublethal effects of these insecticides on T. radiata. The insecticides evaluated in this study were: thiamethoxam, thiacloprid e imidacloprid. A residual contact bioassay was used to characterize the susceptibility of D. citri to these insecticides. A diagnostic concentration bioassays based on lethal concentration 95 (LC95) of each insecticide were used for monitoring the susceptibility of D. citri populations. The lethal and sublethal effects of these insecticides on T. radiata were conducted by using direct contact bioassays on adult and pupal stages of T. radiata, residual contact bioassays and persistence of biological activity of these insecticides on citrus leaf surface. Among the neonicotinoid insecticides tested, the highest toxicity was observed with thiametoxam, followed by imidacloprid and thiaclopid. A significant difference in the susceptitibity to neonicotinoid insecticides was detected in D. citri populations. For thiamethoxam, the survivorship at diagnostic concentration varied from 5.5 to 16%, for thiacloprid varied from 4.5 to 22.5 %, and for imidacloprid from 4 to 14%. The toxicity of these insecticides was high to adult and pupal stages of T. radiata. However, the sublethal effects of these insecticides at 10% of the recommended rate on pupae stage caused the reduction of the parasitism capacity only with thiamethoxam. The emergence, longevity and sexual ratio of T. radiata were not affected by any insecticide tested. The residual toxicity of thiametoxam, thiacloprid and imidaclopid sprayed on citrus seedling leaves was relatively high to D. citri adults and lasted at least 14 days.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-02-15T15:39:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1246444 bytes, checksum: 4901c76fe1d76e482dba8c70875663f3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-15T15:39:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1246444 bytes, checksum: 4901c76fe1d76e482dba8c70875663f3 (MD5) Previous issue date: 2016-03-31 / O Brasil é o maior produtor mundial de frutos cítricos e maior exportador de suco de laranja. A maior produção está em São Paulo, seguida por Bahia, Paraná e Minas Gerais. Entre as pragas que atacam as plantas cítricas, a que vem se destacando pela rápida disseminação, difícil controle e por ser altamente destrutiva é o Huanglongbing. Tem como agente etiológico a bactéria Candidatus liberibacter sp. e é transmitida através do inseto vetor Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae). No Brasil, é regulamentada como praga quarentenária presente, e a Instrução Normativa No 53, publicada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento em 16 de outubro de 2008, aprova os critérios e procedimentos para que os órgãos estaduais de defesa sanitária vegetal realizem os levantamentos de ocorrência do HLB e adotem medidas de prevenção e erradicação. Este trabalho buscou avaliar a evolução do HLB no estado de Minas Gerais, no período do segundo semestre de 2010 ao primeiro semestre de 2015, assim como as ações no levantamento e controle da praga. Para isso, foram analisados os dados dos Relatórios de Vistoria de Plantas Cítricas entregues pelos produtores ao Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA) e dos relatórios de levantamento fitossanitário realizado nos pomares comerciais pelos fiscais do IMA, com os objetivos de detectar plantas cítricas com sintomas de HLB e coletar amostras dessas plantas para análise laboratorial e confirmação oficial da presença da praga. Houve aumento no número de plantas cítricas com sintomas de HLB erradicadas, sendo o município de Três Pontas e a coordenadoria de Varginha os que mais eliminaram plantas nesse período. Propriedades com área menor do que 15 hectares apresentaram taxas de erradicação maiores do que propriedades com área maior do que 100 hectares. Os resultados dos relatórios de levantamento fitossanitário indicaram que desde 2013 não são confirmados novos focos da praga em municípios produtores de citros em Minas Gerais, que se restringem a 20 municipalidades. As ações para levantamento e controle da praga requerem disponibilidade de recursos humanos e financeiros, e os esforços para que ela não se dissemine devem ser mantidos e intensificados. / Brazil is currently in the first position worldwide in citros production and orange juice exportation. The main producing states are São Paulo, Paraná, Bahia and Minas Gerais. From all the diseases that attack citrus plants, the one that has been highlighted by the rapid spread, difficult to control and to be highly destructive is the HLB (ex-greening). It is caused by the bacterium Candidatus liberibacter sp. and transmitted by Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae). In Brazil is regulated as present quarantine pest and the Normative Instruction No. 53 issued by the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply on October 16, 2008 approves the criteria and procedures for state agencies of plant health protection conduct the surveys on occurrence of HLB and adopt prevention and eradication measures. This study aimed to evaluate the evolution of HLB in the state of Minas Gerais in the second half of 2010 to the first half of 2015, and the evaluation of actions in the survey and control of the disease. To do this, data from Citrus Plant Inspection Reports delivered by producers to the Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA) and phytosanitary survey reports conducted in commercial orchards by IMA’s supervisors in order to detect citrus plants with symptoms of HLB were analyzed and to collect samples of these plants for laboratory analysis and official confirmation of the presence of the disease. It was noted that the second half of 2010 to the first half of 2015 there was an increase in the number of citrus plants with symptoms of HLB eradicated, and the city of Três Pontas and the coordinating office of Varginha eliminated more plants in this period. Properties with an area less than 15 hectares showed higher eradication rates than properties with an area greater than 100 hectares. The results of phytosanitary survey reports showed that since 2013 is not confirmed new outbreaks of the disease in citrus producing municipalities in Minas Gerais, which is restricted in 20 municipalities. The actions for the survey and control of the disease require the availability of human and financial resources and efforts so that it can not be established must be maintained and intensified.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6066.pdf: 3990215 bytes, checksum: 05550a0cc5074637afaa52685749e202 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / Financiadora de Estudos e Projetos / Brazil is a major exporter of oranges in the world, with the state of São Paulo, the largest citrus producer in the country. In the last years plants of the genus citrus have been strongly affected by various diseases and among them, the disease Huanglongbing (HLB) have occupied prominent role and importance due to the devastating damage caused to citrus production worldwide. Caused by Candidatus Liberibacter spp., a bacterium that colonizes and blocks the conductive vessels of elaborated sap (phloem) and transmitted by the vector, hemiptera, the psyllid Diaphorina citri. In this context, it is necessary to search for strategies to control the disease in citrus orchards. In order to identify a cysteine peptidase D. citri, in this work, the identification, recombinant expression and characterization of a cysteine peptidase D. citri, the type (cathepsin B) called DiaciCATHB was performed. The identification of an ORF for cysteine peptidase was performed using the database of the transcriptome of D. citri. Recombinant expression was performed in Pichia pastoris yeast cells. For activation of the recombinant enzyme important factors were observed, acidic conditions and incubation in suitable temperature and time. Kinetic characterization of the enzyme was verified by hydrolysis of the synthetic substrate Z-Phe-Arg-MCA, resulting in a (km) of 15.7 mM. Inhibition of the enzymatic activity tests were conducted using the recombinant inhibitor of cysteine peptidases CaneCPI-4, resulting in the inhibition constant (Ki) of 0.05 nM. The analysis of gene expression DiaciCATHB demonstrated that gene expression occurs in all stages of insect development, there is however a significant difference in expression level. According to the developmental stages of the insect D. citri, the expression level gradually increases DiaciCATHB, being higher in nymph and adult stages. The present results do not prove that the location and function performed by the enzyme DiaciCATHB, but regardless, the cysteine peptidase in this study has the potential to become an important target for use in future studies on insect control. / O Brasil é um dos maiores exportadores de laranjas do mundo, sendo o estado de São Paulo o maior produtor de citros no país. Nos últimos anos as plantas do gênero citrus têm sido fortemente afetadas por diversas patologias e dentre estas, a doença Huanglongbing (HLB) têm ocupado papel de destaque e importância devido aos danos devastadores causados a citricultura mundial. Causada pela Candidatus Liberibacter spp., uma bactéria que coloniza e obstrui os vasos condutores da seiva elaborada (floema) e transmitida pelo vetor, hemíptero, o psilídeo Diaphorina citri. Neste contexto, se faz necessário à busca por estratégias de controle para a doença nos pomares de citros. Com a finalidade de identificar uma cisteíno peptidase de D. citri, no presente trabalho, foi realizada a identificação, expressão recombinante e caracterização de uma cisteíno peptidase de D. citri, do tipo (catepsina B) denominada DiaciCATHB. A identificação de uma ORF para cisteíno peptidase de foi realizada através do banco de dados do transcriptoma de D. citri. A expressão recombinante foi realizada em células da levedura Pichia pastoris. Para a ativação da enzima recombinante fatores importantes foram observados, como condições ácidas e incubação em temperatura e tempo adequados. A caracterização cinética da enzima foi verificada pela hidrólise do substrato sintético Z-Phe-Arg-MCA, resultando em um (Km) de 15,7 μM. Testes de inibição da atividade enzimática foram realizados utilizando a o inibidor de cisteíno peptidases recombinante CaneCPI-4, resultando na constante de inibição (Ki) de 0,05 nM. A análise de expressão do gene DiaciCATHB demonstrou que a expressão do gene ocorre em todas as fases de desenvolvimento do inseto, havendo no entanto, uma diferença significativa no nível de expressão. De acordo com as fases de desenvolvimento do inseto D. citri, o nível de expressão de DiaciCATHB aumenta gradualmente, sendo maior nas fases de ninfa e adulto. Os resultados obtidos nesse trabalho não comprovam qual a localização e função exercida pela enzima DiaciCATHB, porém, independente disso, a cisteíno peptidase em estudo apresenta potencial para tornar-se um importante alvo para a utilização em futuros estudos no controle do inseto.

Os inseticidas neonicotinóides são atualmente o principal grupo químico utilizado para o controle de insetos sugadores, constituindo-se uma boa opção para o controle de Diaphorina citri Kuwayama. Outra opção de controle do psilídeo tem sido a exploração do parasitóide Tamarixia radiata (Waterson). A compatibilidade dessas duas estratégias de controle poderia auxiliar na implementação de programas de manejo integrado de pragas na cultura do citros. No entanto, faltam estudos sobre a caracterização da suscetibilidade de D. citri para os inseticidas neonicotinóides e o impacto desses inseticidas sobre T. radiata. Sendo assim, os objetivos do trabalho foram o de caracterizar a suscetibilidade de D. citri a inseticidas neonicotinóides, realizar o monitoramento da suscetibilidade a esses inseticidas em populações de D. citri coletadas em pomares de diferentes regiões do Estado de São Paulo e avaliar os efeitos letais e subletais desses inseticidas sobre o parasitóide T. radiata. Os inseticidas avaliados foram: thiamethoxam, thiacloprid e imidacloprid. O método de bioensaio adotado foi o de contato residual para a caracterização da suscetibilidade de D.citri a esses inseticidas. O monitoramento da suscetibilidade a esses inseticidas em diferentes populações de D. citri foi realizado com concentrações diagnósticas baseadas na concentração letal 95 (CL95) de cada inseticida. Para avaliar os efeitos letais e subletais desses inseticidas sobre T. radiata foram realizados bioensaios de contato direto em adultos e pupas, toxicidade residual em adultos, e persistência da atividade biológica desses inseticidas sobre a superfície de folhas de citros. Entre os neonicotinóides testados, a maior toxicidade a D. citri foi observado com thiametoxam, seguidos por imidacloprid e thiaclopid. Os resultados do monitoramento apresentaram diferenças significativas na suscetibilidade das populações de D. citri aos inseticidas neonicotinóides. Para thiamethoxam, a sobrevivência estimada para as populações de D. citri testadas na concentração diagnóstica variou entre 5,5 e 16%, para thiacloprid variou entre 4,5 e 22,5 % e para imidacloprid entre 4 e 14%. Uma alta toxicidade desses inseticidas foi observada para adultos e pupas de T. radiata. No entanto, os efeitos subletais desses inseticidas a 10% da concentração recomendada sobre o estágio de pupa causou redução significativa no parasitismo somente com thiamethoxam. A emergência, longevidade e razão sexual de T. radiata não foram afetadas pelos inseticidas avaliados. A toxicidade residual de thiametoxam, thiacloprid e imidaclopid em folhas de mudas de citros foi relativamente elevada para adultos de T. radiata e com persistência de pelo menos 14 dias. / The neonicotinoids insecticides are currently the main chemical group used for controlling sucking pests and represent a good option for the control of Diaphorina citri Kuwayama. Another control alternative of this pest is the exploitation of parasitoid Tamarixia radiata (Waterson). The compatibility of these control strategies could be very helpful for the implementation of integrated pest management program in citrus. However, there are few studies on the characterization of the susceptibility of D. citri to neonicotinoid insecticides and the evaluation of the impact of these insecticides on T. radiata. Therefore, the objectives of this research were to evaluate the susceptibility of D. citri to neonicotinoid insecticides, to monitor the susceptibility to these insecticides in D. citri populations collected from different citrus groves in the State of São Paulo, and to evaluate the lethal and sublethal effects of these insecticides on T. radiata. The insecticides evaluated in this study were: thiamethoxam, thiacloprid e imidacloprid. A residual contact bioassay was used to characterize the susceptibility of D. citri to these insecticides. A diagnostic concentration bioassays based on lethal concentration 95 (LC95) of each insecticide were used for monitoring the susceptibility of D. citri populations. The lethal and sublethal effects of these insecticides on T. radiata were conducted by using direct contact bioassays on adult and pupal stages of T. radiata, residual contact bioassays and persistence of biological activity of these insecticides on citrus leaf surface. Among the neonicotinoid insecticides tested, the highest toxicity was observed with thiametoxam, followed by imidacloprid and thiaclopid. A significant difference in the susceptitibity to neonicotinoid insecticides was detected in D. citri populations. For thiamethoxam, the survivorship at diagnostic concentration varied from 5.5 to 16%, for thiacloprid varied from 4.5 to 22.5 %, and for imidacloprid from 4 to 14%. The toxicity of these insecticides was high to adult and pupal stages of T. radiata. However, the sublethal effects of these insecticides at 10% of the recommended rate on pupae stage caused the reduction of the parasitism capacity only with thiamethoxam. The emergence, longevity and sexual ratio of T. radiata were not affected by any insecticide tested. The residual toxicity of thiametoxam, thiacloprid and imidaclopid sprayed on citrus seedling leaves was relatively high to D. citri adults and lasted at least 14 days.

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2016-08-29T21:08:03Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Leonardo_Melo-UEFS_PGCA-2.pdf: 1657755 bytes, checksum: 78e6ca37c9610faf17a158b94e25bcb8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-29T21:08:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Leonardo_Melo-UEFS_PGCA-2.pdf: 1657755 bytes, checksum: 78e6ca37c9610faf17a158b94e25bcb8 (MD5) Previous issue date: 2016-04-08 / Funda??o de Amparo ? Pesquisa do Estado da Bahia - FAPEB / The Huanglongbing (HLB) is the disease of greatest concern for growers because they spread quickly and cause severe symptoms. The Diaphorina citri insect is the main vector of the HLB. The application of insecticides is a control measure of the vector insect of the HLB widely adopted. The amount of pesticides needed for an effective control of this insect is better estimated if such application is combined with a monitoring of its population by yellow sticky traps. These insects are captured for a manual count in research centers. So, this research aims to discover a computational approach of classification of Diaphorina citri insect images with higher accuracy rate that the classification rate currently used in manual counting procedure and thus enable the automation of this important counting procedure. For this, have been tried and combined computational methods for features extraction (ORB, SIFT, SURF, BRISK and FREAK), grouping of characteristics (Mini Batch K-Means) and features classification for machine learning (KNN and SVM), using a generated bank with 1152 images of insects. The best found classification approach (extractor SURF/SIFT, BoF with Diaphorina citri features and SVM with core RBF) generated classification performance results for the metric accuracy, which outperformed the best measured result in research that evaluated the counting manual process. In this approach, the highest achieved accuracy, in the cross validation process, was 98.17% and was 2.54% as standard deviation and the accuracy of the final test of generalization model was 99.14%. The achieved result is of great importance for the control of HLB. The achieved classification accuracy rates were higher than rates reported in the manual procedure, making possible the construction of computer systems to high accuracy for the control of this insect. This automated control can provide significant savings of funds. / O Huanglongbing (HLB) ? a doen?a de maior preocupa??o para os citricultores por se propagar com rapidez e provocar severos sintomas. O inseto Diaphorina citri ? o principal vetor do HLB. A aplica??o de inseticidas ? uma medida de controle do inseto vetor do HLB amplamente adotada. A quantidade de inseticidas necess?ria para um controle efetivo desse inseto ? melhor estimada se essa aplica??o for combinada a um monitoramento de sua popula??o por meio de armadilhas adesivas amarelas. Esses insetos s?o capturados para uma contagem manual em centros de pesquisa. Ent?o, esta pesquisa tem por objetivo descobrir uma abordagem computacional de classifica??o de imagens de insetos Diaphorina citri com taxa de acur?cia de classifica??o maiores que a taxa de classifica??o utilizada atualmente no procedimento manual de contagem e, assim, possibilitar a automa??o desse importante procedimento de contagem. Para isso, foram experimentados e combinados m?todos computacionais para a extra??o de caracter?sticas (ORB, SIFT, SURF, BRISK e FREAK), agrupamento de caracter?sticas (Mini Batch K-Means) e classifica??o de caracter?sticas por aprendizagem de m?quina (KNN e SVM), utilizando um banco gerado com 1152 imagens de insetos. A melhor abordagem de classifica??o encontrada (extrator SURF/SIFT, BoF com caracter?sticas do Diaphorina citri e SVM com n?cleo RBF) gerou resultados de desempenho de classifica??o, pela m?trica da acur?cia, que superaram o melhor resultado medido na pesquisa que avaliou o processo de contagem manual. Nessa abordagem, a maior acur?cia atingida no processo de valida??o cruzada foi de 98,17% e teve 2,54% como desvio padr?o e a acur?cia do teste final de generaliza??o de modelo foi de 99,14%. O resultado alcan?ado ? de grande import?ncia para o controle do HLB. As taxas de acur?cia de classifica??o alcan?adas foram superiores as taxas relatadas no procedimento manual, tornando vi?vel a constru??o de sistemas computacionais de alta acur?cia para o controle desse inseto. Esse controle automatizado pode proporcionar uma economia significativa de recursos financeiros.

The variation in the insect immune system is an important regulator of insect populations and the pathogens they carry. A central component of insect immunity is melanin, whose production creates cytotoxic intermediates that help to protect against a broad spectrum of pathogens. Melanin is also used in insect cuticle where it helps to improve thermoregulation and desiccation resistance, with insects having less melanized cuticles in warmer and more humid environments. Considering that cuticle melanin and immune melanin are formed by near identical biochemical pathways, they are pleiotropically linked (that is, one or more linked genes influence multiple traits). This has lead to the cuticle-dependent immune investment (CDII) hypothesis, which states that adaptive responses in the cuticle can lead to non-adaptive changes in immunity and could lead to an increase in transmission of insect vectored pathogens in warming climates, due to a weaker defense against the pathogen. However, the impact of CDII on cuticle melanin and immunity, as well as infection prevalence and intensity, under seasonal conditions in the field is still unclear. In this project, we study a population of Asian citrus psyllids, Diaphorina citri, in the field over four seasons. Diaphorina citri vectors a Gram-negative bacteria, Candidatus Liberbacter asiaticus (CLas), that is responsible for Huanglongbing, aka citrus greening disease, which has cost the Florida citrus industry several billion dollars. We assess pathogen load of CLas by quantitative PCR, and assess levels of phenoloxidase activity in the insect hemolymph to measure insect immune function. We assess levels of cuticle melanin. Our results show a significant correlation between temperature, cuticle melanin, and immune function. However, the affect of seasonality on infection prevalence and intensity remains unclear. THE EFFECT OF CLIMATE ON PHYSIOLOGY AND IMMUNE FUNCTION IN THE ASIAN CITRUS PSYLLID, DIAPHORINA CITRI

Tamarixia radiata (Waterston, 1922) é um dos principais agentes de controle biológico de Diaphorina citri Kuwayama, vetor de huanglongbing, no Brasil. Esse parasitóide apresenta alta eficiência de parasitismo, grande capacidade de dispersão, estabelecimento e adaptação em campo. No entanto, a eficiência desse inimigo natural pode ser afetada devido ao uso indiscriminado de pesticidas na citricultura para o controle de diversas pragas e pela carência de estudos que avaliam o impacto total de inseticidas. Sendo assim, os objetivos do trabalho foram: avaliar os efeitos letais e subletais de alguns inseticidas sobre adultos e pupas de T. radiata. Além da mortalidade, foram também avaliados os efeitos de inseticidas sobre a capacidade de parasitismo, a longevidade, a razão sexual e a taxa instantânea de crescimento de T. radiata. Os inseticidas avaliados foram: imidacloprid (neonicotinóide), lambda-cyhalothrin (piretróide) e abamectin (avermectina) nas concentrações recomendada de 96; 7,5 e 3,2 mg de ingrediente ativo por litro de água (ppm) respectivamente, além de 10 e 50% da concentração recomendada de cada inseticida. O método de bioensaio adotado foi o de contato residual do inseticida em adultos do parasitóide, utilizando-se de discos de folhas de laranjeiras pulverizados em Torre de Potter. O efeito de abamectin sobre adultos da geração parental e geração F1 de T. radiata foi também avaliado mediante pulverização de ramos de murta, Murraya paniculata (L.) Jack e sobre pupas de T. radiata utilizando-se método de bioensaio de contato direto. A maior toxicidade a adultos de T. radiata foi observada para imidacloprid (72,7% de mortalidade), seguido por lambdacyhalothrin (19,4%) e abamectin (3,0%). Abamectin causou maior redução na capacidade de parasitismo do parasitóide (28,8%), seguido por imidacloprid (31,3%) e lambda-cyhalothrin (40,1%) na concentração recomedada de cada inseticida. Os inseticidas testados não afetaram a razão sexual do parasitóide. Lambda-cyhalothrin não afetou a longevidade do parasitóide. Por outro lado, imidacloprid reduziu a longevidade. Verificou-se uma redução de 56 e 80% na emergência dos descendentes da geração parental a 50 e 100% da concentração recomendada de abamectin, entretanto, nenhum efeito foi observado para os descendentes da geração F1 do parasitóide. A longevidade de machos da geração parental foi reduzida em 8,4 dias a 50% da concentração recomendada de abamectin, no entanto, nenhum efeito significativo foi verificado para a geração F1 do parasitóide. Foi verificado efeito negativo sobre a capacidade de parasitismo da geração parental e da geração F1 do parasitóide quando abamectin foi pulverizado em ramos de murta. No entanto, abamectin afetou a emergência dos descendentes da geração parental e geração F1 de T. radiata, com valores variando de 24,4 a 84,2% e 0 a 95,1% respectivamente. Abamectin afetou a razão sexual de ambas as gerações. Um decréscimo na longevidade do parasitóide foi observado a 10, 50 e 100% da concentração recomendada de abamectin para os descendentes da geração parental e somente a 50% da concentração recomendada para os descendentes da geração F1. Abamectin não afetou a emergência de adultos e nem a razão sexual quando aplicado sobre pupas de T. radiata. E abamectin não afetou a taxa instantânea de crescimento de T. radiata em todas as concentrações testadas. / Tamarixia radiata (Waterston, 1922) is one of the major biological control agents of Diaphorina citri Kuwayama, vector of huanglongbing, in Brazil. This parasitoid has been very effective due to the high parasitism rates, high dispersal ability and high establishment and adaptation rates in the field. However, the efficiency of T. radiata may be affected by the indiscriminate use of pesticides to control many other citrus pests and due to the lack of studies that evaluated the total impact of pesticides. Therefore, the objectives of this research were to evaluate the lethal and sublethal effects of some insecticides on T. radiate adults and pupae. Besides mortality, the effect of insecticides on parasitism capacity, longevity, sex ratio and instantaneous rate of increase of T. radiata were also evaluated. The insecticides evaluated were imidacloprid (neonicotinoid), lambda-cyhalothrin (pyrethroid) and abamectin (avermectin) at recommended rates of 96; 7.5 e 3.2 mg of active ingredient per liter of water (ppm) respectivelly, plus 10 e 50% of recommended rates of each insecticide. A residual contact bioassay was used by spraying the insecticide onto orange leaf discs with Potter tower. The effect of abamectin was also evaluated on parental and F1 generations of T. radiata by spraying the insecticide on branches of Murraya paniculata (L.) Jack and on pupae of T. radiata by direct contact bioassay. The highest toxicity to T. radiata adults was observed with imidacloprid (72.7% mortality), followed by lambda-cyhalothrin (19.4%) and abamectin (3.0%). Abamectin promoted the highest reduction in the parasitism capacity (28.8%), followed by imidacloprid (31.3%) and lambdacyhalothrin (40.1%) at recommended rates of each insecticide. The insecticides tested did not affect the sex ratio of the parasitoid. Lambda-cyhalothrin did not affect the longevity of the parasitoid. On the other hand, imidacloprid caused reduction in the longevity. A reduction of 56 and 80% in the emergence of offspring of parental generation was obtained at 50 and 100% of recommended rate of abamectin. However, no effect was observed to the offspring of F1 generation. The longevity of males from the parental generation was reduced in 8.4 days at 50% of the recommended rate of abamectin; however, no significant effect was detected to F1 generation of the parasitoid. There was effect on parasitism capacity of the parental and F1 generations of the parasitoid when abamectin was sprayed on M. paniculata. However, abamectin affected the emergence of offspring from parental and F1 generations of T. radiata, with values varying from 24.4 to 84.2% and 0 to 95.1% respectively. Abamectin affected the sex ratio of both generations. A decrease in the longevity of the parasitoid was observed at 10, 50 and 100% of recommended rate of abamectin to the offspring of parental generation and only at 50% of recommended rate to the offspring of F1 generation. Abamectin did not affect the adult emergence and neither the sex ratio when abamectin was applied on T. radiata pupae. And, abamectin did not affect the instantaneous rate of increase of T. radiata at all concentrations tested.