Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) é uma bactéria fitopatógênica que causa de cancro cítrico em plantações no mundo inteiro. Trinta e cinco proteínas alvo foram selecionadas para estudos de proteômica estrutural a partir do genoma de Xac. As proteínas foram clonadas, expressas e testadas usando uma nova metodologia de triagem de proteínas que permite que espectros de RMN 2D 15N-HSQC sejam coletados antes da purificação da proteína em estudo. Esta abordagem possibilitou determinar quais proteínas alvo melhor se adequavam para estudos estruturais futuros por RMN e/ou cristalografia de raios X de forma rápida e eficaz. A proteína ClpS de Xac, descrita como moduladora da atividade da protease bacteriana ClpAP, foi uma das proteínas selecionadas para estudos estruturais por RMN usando esta metodologia. O assinalamento das ressonâncias da cadeia principal e das cadeias laterais desta proteína usando experimentos de tripla ressonância e dados de dinâmica e de troca H/D forneceram informações sobre a sua estrutura secundária. Um modelo tridimensional foi gerado por modelagem por homologia a partir de um homólogo de E. coli e foi validado por acoplamentos dipolares residuais (DHN ) obtidos experimentalmente. Todos os dados RMN sugerem que a região N-terminal de ClpS se apresenta desestruturada. O mapeamento por RMN da interação de ClpS com a sua parceira ClpA é também apresentado. / Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) is a phytopathogenic bacterium that causes citrus canker around the world. Thirty-five target proteins for structural proteomics studies have been selected from the Xac genome. The target proteins were cloned, expressed and tested using a novel screening methodology that allows for 2D 15N-HSQC NMR spectra to be collected prior to the purification of the target protein. This approach allowed us to determine which target proteins were amenable for future structural studies by NMR and/or X-ray crystallography in a fast and efficient manner. The ClpS protein, which has been described as a modulator of substrate specificity of the bacterial protease ClpAP, was one of the proteins selected structural studies by NMR using this methodology. Backbone and side-chain assignment derived from 3D triple resonance NMR experiments and dynamic data from hydrogen-deuterium exchange NMR experiments have provided information on the secondary structure elements of this protein. A model for Xac ClpS was generated by homology modeling from an E. coli homogue and validated using experimentally obtained DHN residual dipolar couplings. All NMR data suggest that the N-terminal region of the protein ClpS is highly unstructured. NMR mapping of the interaction of ClpS with its partner protein ClpA is also presented.

O diguanilato cíclico (c-di-GMP) é uma molécula de sinalização intracelular que atua na regulação de importantes processos bacterianos como motilidade, formação de biofilme e virulência. As diguanilato ciclases (DGCs), contendo um domínio GGDEF ativo, catalisam a formação de c-di-GMP a partir de duas moléculas de GTP. A bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xanthomonas axonopodis pv citri; Xac) é o agente causal do cancro cítrico, uma doença que ataca todas as variedades e espécies de citros. O genoma de Xac codifica 31 proteínas contendo domínios GGDEF. Treze destas proteínas possuem também domínios PAS e/ou GAF, que são ubíquos domínios sensores e de sinalização. Para tentar entender melhor o papel na sinalização por c-di-GMP das interações entre domínios GGDEF e domínios PAS e/ou GAF, estudos bioquímicos e funcionais foram realizados com as proteínas XAC0610 e XAC2446. XAC0610 contém um domínio GAF, quatro domínios PAS e um domínio GGDEF conservado. Análises fenotípicas com a linhagem nocaute XacΔ0610 mostraram que XAC0610 atua na regulação da motilidade e sobrevivência de Xac ao tratamento com H2O2. Ensaios de atividade enzimática demonstraram que XAC0610 é uma DGC cataliticamente ativa, e que a mutação sítio-dirigida de um resíduo conservado de lisina (Lys759) provoca uma grande redução na atividade de DGC. Os domínios GAF e PAS de XAC0610 aparentemente não atuam como domínios sensores, entretanto são importantes para a dimerização da proteína, necessária para a obtenção de altos níveis de atividade de DGC. Além disso, várias observações sugerem que XAC0610 não é submetida à inibição alostérica pelo produto, um mecanismo regulatório comumente utilizado para o controle da atividade de DGC. Por outro lado, os dados de cinética enzimática de XAC0610HIS-35-880 revelaram um efeito de cooperatividade positiva para a ligação dos substratos, com uma constante de dissociação para a ligação da primeira molécula de GTP (K1) cerca de 3-5 vezes maior que a constante de dissociação para a ligação da segunda molécula de GTP (K2). A partir deste estudo, nós apresentamos um esquema cinético geral mais apropriado para as análises dos dados cinéticos de enzimas DGCs e propomos que a ligação cooperativa do substrato talvez possa desempenhar um importante papel na regulação in vivo da atividade de algumas DGCs, aumentando sua sensibilidade a pequenas variações nos níveis celulares de GTP. Outra proteína caracterizada neste trabalho, XAC2446 possui um domínio GAF e um domínio GGDEF que, ao contrário do domínio GGDEF de XAC0610, não deve apresentar atividade de DGC. Mesmo assim, análises funcionais mostraram que XAC2446 regula negativamente a formação de biofilme e positivamente a motilidade de Xac. Ensaios de duplo híbrido em leveduras identificaram que XAC2446 interage com XAC2897, contendo um domínio GGDEF potencialmente ativo, e XAC1185, contendo um domínio HD fosfohidrolase de (p)ppGpp. Alguns estudos indicam que altos níveis celulares de c-di-GMP e baixos níveis de (p)ppGpp podem ser necessários durante a formação de biofilme. XAC2446 talvez possa atuar como um inibidor da atividade enzimática de XAC2897 e XAC1185 e influenciar, indiretamente e antagonicamente, tanto os níveis celulares de c-di-GMP quanto de (p)ppGpp. / Cyclic di-GMP is a bacterial second messenger that regulates a range of functions, including cellular motility, biofilm formation and virulence. This molecule is produced from two GTP substrates by the activity of diguanylate cyclases (DGCs) containing a GGDEF domain. The phytopathogenic bacteria Xanthomonas citri subsp. citri (Xanthomonas axonopodis pv citri; Xac) causes citrus canker in a wide variety of citrus species. The Xac genome codes for 31 proteins with GGDEF domains. Thirteen of the 31 Xac GGDEF domain-containing proteins also possess PAS (Per-Arnt-Sim) or GAF (cGMP-specific phosphodiesterases, adenylyl cyclases and FhlA) domains that are ubiquitous signaling and sensory domains. In order to better understand the relationship between these commonly associated domains, biochemical and functional studies were carried out with the XAC0610 and XAC2446 proteins. XAC0610 is a large multi-domain protein containing one GAF domain, four PAS domains and one GGDEF domain. This protein has a demonstrable in vivo and in vitro diguanylate cyclase (DGC) activity. Analysis of a XacΔ0610 knockout strain revealed that XAC0610 plays a role in the regulation of Xac motility and resistance to H2O2. Site-directed mutagenesis of a conserved DGC lysine residue (Lys759 in XAC0610) resulted in a severe reduction in XAC0610 DGC activity. XAC0610 DGC activity was also impaired by removal of the N-terminal GAF and PAS domains, which are probably needed for proper protein dimerization. Furthermore, experimental and in silico analysis suggest that XAC0610 is not subject to allosteric product inhibition, a common regulatory mechanism for DGC activity control. Instead, steady-state kinetics of XAC0610 DGC activity revealed a positive cooperative effect of the GTP substrate with a dissociation constant for the binding of the first GTP molecule (K1) approximately three to five times greater than the dissociation constant for the binding of the second GTP molecule (K2). We present a general kinetics scheme that should be used when analyzing DGC kinetics data and propose that cooperative GTP binding could be a common, though up to now overlooked, feature of these enzymes that may in some cases offer a physiologically relevant mechanism for regulation of DGC activity in vivo. The other characterized protein, XAC2446, has a GAF domain and a degenerated GGDEF domain. Unlike XAC0610, XAC2446 should not present DGC activity. Nevertheless, functional analysis of XAC2446 demonstrated that it plays a role in the regulation of Xac motility and biofilm formation. A yeast two-hybrid screen identifies XAC2897 (a potentially active GGDEF domain-containing protein) and XAC1185 (a (p)ppGpp hydrolase) as specific binding partners of the XAC2446 protein. As indicated by studies in other bacteria, high cellular levels of c-di-GMP and low levels of (p)ppGpp may be both required for biofilm formation. It is possible that XAC2446 might have a role in the antagonistic regulation of c-di-GMP and (p)ppGpp cellular levels by acting as an inhibitor of both XAC2897 and XAC1185 enzymatic activities.

O cancro cítrico, causado pela bactéria Gram negativa Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é considerado uma das principais doenças da citricultura nacional e mundial, devido à susceptibilidade do hospedeiro e por não existirem métodos de controle eficientes. Dados da literatura relatam que alguns genes de bactérias fitopatogênicas possuem uma seqüência consenso de nucleotídeos (TTCGC...N15...TTCGC) denominada “PIP box" ou “plant-inducible-promoter box", localizada na região promotora e responsável pela ativação da expressão de fatores de patogenicidade e virulência quando o patógeno entra em contato com a planta hospedeira. O objetivo deste trabalho foi mapear e investigar no genoma da Xac a expressão de genes contendo seqüências do tipo “PIP box", a 5’ da ORF ou internamente na região codificadora, através da técnica de macroarranjo. Com auxílio de uma ferramenta de bioinformática (script PERL), 208 seqüências consenso para o elemento cis-regulatório “PIP box" foram mapeados no genoma da Xac, e clones contendo seqüências codificadoras associadas aos promotores do tipo “PIP box" foram recuperados do banco de clones gerado pelo projeto de seqüenciamento da bactéria e validados por seqüenciamento. Os DNAs plasmidiais representando cada clone foram preparados e imobilizados em membranas de náilon (macroarranjo), as quais foram hibridadas com sondas de cDNAs marcadas com [a33P] dCTP e obtidas a partir de RNA total extraído da bactéria em estádio não infectante (cultivada em meio de cultura Caldo Nutriente – meio CN) e da bactéria infectante (cultivada por 12 horas ou 20 horas em meio XAM1 indutor de patogenicidade e virulência, ou coletada por exsudação 3 dias ou 5dias após inoculação em folhas de laranjeira). A análise da expressão dos genes contendo promotores “PIP box" putativos revelou 67 genes diferencialmente expressos quando a bactéria teve o seu programa de infecção disparado (indução “in vitro" ou “in vivo"). A validação dos resultados de macroarranjo foi realizada para alguns dos genes por meio de RT-PCR semi-quantitativo e a funcionalidade da seqüência “PIP box" para alguns promotores foi demonstrada através do gene repórter GUS. Os genes com expressão diferencial foram classificados segundo a função biológica das respectivas proteínas codificadas e estão envolvidos em processos tão distintos quanto sistema de secreção tipo III, metabolismo de membrana e parede celular, sistema de captação de ferro, metabolismo de açúcares e degradação da parede vegetal, transdução de sinais, metabolismo de flagelo, formação de biofilme e adesividade, metabolismo de ácidos nucléicos, transportadores de membrana, metabolismo energético e resposta a estresse ambiental. O possível papel destas modificações para a interação planta-patógeno e a instalação do cancro cítrico é discutida. / The citrus canker, caused by the bacterial pathogen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), is considered worldwide as one of the most important disease of citrus crop due to the lack of resistance in citrus plants and to the absence of efficient methods to control the disease. It was already shown that several genes involved in virulence and pathogenicity in plant pathogenic bacteria have a consensus nucleotide sequence (TTCGC…N15…TTCGC) named plant-inducible-promoter box or PIP box, located in the promoter region of the genes, which are responsible to activate the expression of genes during the host-bacteria interaction. The aim of this work was to map in Xac genome the genes containing the PIP box sequence in the promoter region, or internal to the ORF sequence, and analyze their expression during plant infection using the macroarray technique. Using a PERL script, 208 PIP box consensus sequence associated to genes were found in the Xac genome and clones containing all these genes and their PIP box sequences were recovered from a Xac genome clone bank and reconfirmed by sequencing. The plasmidial DNA containing the gene and the PIP box from each clone were purified, immobilized onto a nylon membrane (macroarray) and hybridized with [a33P] dCTP-labeled cDNAs synthesized from Xac total RNA isolated from bacteria in non-infecting (grown in NB nutrient medium) and infecting (grown for 12 or 20 hours in XAM1 medium that mimics the environment of the plant intercellular space (“in vitro") or for 3 or 5 days in orange plant leaves (“in vivo") conditions. The gene expression profile resulting from the array analysis revealed that 67 genes were differentially expressed during the temporal course of the infection. The results were validated through the analysis of expression profile for some genes using semi-quantitative RT-PCR and the PIP box functionality for some promoters was demonstrated using GUS as reporter gene. The differentially expressed genes were classified regarding the biological function of the encoded protein and related to several relevant processes as type III secretion system, membrane and cellular wall metabolism, iron uptake, sugar metabolism and host cell wall degradation, signal transduction, flagellum metabolism, biofilm formation and adhesiveness, nucleic acid metabolism, membrane transporters, energetic metabolism and stress response. The possible roles of these modifications for the bacteria-plant interaction and disease installation are discussed.

O diguanilato cíclico (c-di-GMP) é uma molécula de sinalização intracelular que atua na regulação de importantes processos bacterianos como motilidade, formação de biofilme e virulência. As diguanilato ciclases (DGCs), contendo um domínio GGDEF ativo, catalisam a formação de c-di-GMP a partir de duas moléculas de GTP. A bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xanthomonas axonopodis pv citri; Xac) é o agente causal do cancro cítrico, uma doença que ataca todas as variedades e espécies de citros. O genoma de Xac codifica 31 proteínas contendo domínios GGDEF. Treze destas proteínas possuem também domínios PAS e/ou GAF, que são ubíquos domínios sensores e de sinalização. Para tentar entender melhor o papel na sinalização por c-di-GMP das interações entre domínios GGDEF e domínios PAS e/ou GAF, estudos bioquímicos e funcionais foram realizados com as proteínas XAC0610 e XAC2446. XAC0610 contém um domínio GAF, quatro domínios PAS e um domínio GGDEF conservado. Análises fenotípicas com a linhagem nocaute XacΔ0610 mostraram que XAC0610 atua na regulação da motilidade e sobrevivência de Xac ao tratamento com H2O2. Ensaios de atividade enzimática demonstraram que XAC0610 é uma DGC cataliticamente ativa, e que a mutação sítio-dirigida de um resíduo conservado de lisina (Lys759) provoca uma grande redução na atividade de DGC. Os domínios GAF e PAS de XAC0610 aparentemente não atuam como domínios sensores, entretanto são importantes para a dimerização da proteína, necessária para a obtenção de altos níveis de atividade de DGC. Além disso, várias observações sugerem que XAC0610 não é submetida à inibição alostérica pelo produto, um mecanismo regulatório comumente utilizado para o controle da atividade de DGC. Por outro lado, os dados de cinética enzimática de XAC0610HIS-35-880 revelaram um efeito de cooperatividade positiva para a ligação dos substratos, com uma constante de dissociação para a ligação da primeira molécula de GTP (K1) cerca de 3-5 vezes maior que a constante de dissociação para a ligação da segunda molécula de GTP (K2). A partir deste estudo, nós apresentamos um esquema cinético geral mais apropriado para as análises dos dados cinéticos de enzimas DGCs e propomos que a ligação cooperativa do substrato talvez possa desempenhar um importante papel na regulação in vivo da atividade de algumas DGCs, aumentando sua sensibilidade a pequenas variações nos níveis celulares de GTP. Outra proteína caracterizada neste trabalho, XAC2446 possui um domínio GAF e um domínio GGDEF que, ao contrário do domínio GGDEF de XAC0610, não deve apresentar atividade de DGC. Mesmo assim, análises funcionais mostraram que XAC2446 regula negativamente a formação de biofilme e positivamente a motilidade de Xac. Ensaios de duplo híbrido em leveduras identificaram que XAC2446 interage com XAC2897, contendo um domínio GGDEF potencialmente ativo, e XAC1185, contendo um domínio HD fosfohidrolase de (p)ppGpp. Alguns estudos indicam que altos níveis celulares de c-di-GMP e baixos níveis de (p)ppGpp podem ser necessários durante a formação de biofilme. XAC2446 talvez possa atuar como um inibidor da atividade enzimática de XAC2897 e XAC1185 e influenciar, indiretamente e antagonicamente, tanto os níveis celulares de c-di-GMP quanto de (p)ppGpp. / Cyclic di-GMP is a bacterial second messenger that regulates a range of functions, including cellular motility, biofilm formation and virulence. This molecule is produced from two GTP substrates by the activity of diguanylate cyclases (DGCs) containing a GGDEF domain. The phytopathogenic bacteria Xanthomonas citri subsp. citri (Xanthomonas axonopodis pv citri; Xac) causes citrus canker in a wide variety of citrus species. The Xac genome codes for 31 proteins with GGDEF domains. Thirteen of the 31 Xac GGDEF domain-containing proteins also possess PAS (Per-Arnt-Sim) or GAF (cGMP-specific phosphodiesterases, adenylyl cyclases and FhlA) domains that are ubiquitous signaling and sensory domains. In order to better understand the relationship between these commonly associated domains, biochemical and functional studies were carried out with the XAC0610 and XAC2446 proteins. XAC0610 is a large multi-domain protein containing one GAF domain, four PAS domains and one GGDEF domain. This protein has a demonstrable in vivo and in vitro diguanylate cyclase (DGC) activity. Analysis of a XacΔ0610 knockout strain revealed that XAC0610 plays a role in the regulation of Xac motility and resistance to H2O2. Site-directed mutagenesis of a conserved DGC lysine residue (Lys759 in XAC0610) resulted in a severe reduction in XAC0610 DGC activity. XAC0610 DGC activity was also impaired by removal of the N-terminal GAF and PAS domains, which are probably needed for proper protein dimerization. Furthermore, experimental and in silico analysis suggest that XAC0610 is not subject to allosteric product inhibition, a common regulatory mechanism for DGC activity control. Instead, steady-state kinetics of XAC0610 DGC activity revealed a positive cooperative effect of the GTP substrate with a dissociation constant for the binding of the first GTP molecule (K1) approximately three to five times greater than the dissociation constant for the binding of the second GTP molecule (K2). We present a general kinetics scheme that should be used when analyzing DGC kinetics data and propose that cooperative GTP binding could be a common, though up to now overlooked, feature of these enzymes that may in some cases offer a physiologically relevant mechanism for regulation of DGC activity in vivo. The other characterized protein, XAC2446, has a GAF domain and a degenerated GGDEF domain. Unlike XAC0610, XAC2446 should not present DGC activity. Nevertheless, functional analysis of XAC2446 demonstrated that it plays a role in the regulation of Xac motility and biofilm formation. A yeast two-hybrid screen identifies XAC2897 (a potentially active GGDEF domain-containing protein) and XAC1185 (a (p)ppGpp hydrolase) as specific binding partners of the XAC2446 protein. As indicated by studies in other bacteria, high cellular levels of c-di-GMP and low levels of (p)ppGpp may be both required for biofilm formation. It is possible that XAC2446 might have a role in the antagonistic regulation of c-di-GMP and (p)ppGpp cellular levels by acting as an inhibitor of both XAC2897 and XAC1185 enzymatic activities.

A habilidade de sensoriar o ambiente extracelular e responder às suas mudanças é inerente para a maioria das bactérias. As concentrações de nutrientes direcionam os processos metabólicos relacionados à sobrevivência e proliferação. O fosfato inorgânico (Pi) é um dos nutrientes cuja regulação, sensoriamento e sinalização são bastante conservados em bactéria. Um dos mecanismos de captação do íon fosfato com alta afinidade é o sistema Pst, um transportador do tipo ABC (ATP-Binding Cassette) , localizado na membrana interna das células. Este transportador, juntamente com as proteínas PhoR/PhoB que formam um sistema de dois componentes (Two-Component Regulatory System) , são capazes de sensoriar e monitorar os níveis deste íon nas células. Ambos os sistemas pertencem ao chamado regulon Pho, conjunto de genes envolvidos no transporte, captação e metabolização do fosfato. Estudos tem mostrado que a interação entre os sistema Pst e o sistema doiscomponentes PhoR/PhoB é mediada pela proteína PhoU, um regulador negativo cujo gene encontra-se no mesmo operon do transportador. Apesar de muito estudados em Escherichia coli , poucas informações existem sobre as características destes sistemas em Xanthomonas citri subsp. citri , bactéria responsável pelo cancro cítrico e de grande importância econômica para o país. Estudos realizados pelo nosso grupo mostraram que X. citri conserva a maioria dos genes descritos como pertencentes ao regulon Pho, incluindo o sistema Pst, as proteínas PhoR/PhoB e PhoU. Este trabalho, portanto, tem como objetivos, a caracterização funcional e estrutural da proteína PhoU de X. citri e a análise da possível interação de PhoU com a proteína PhoR, a histidina quinase do sistema dois componentes. Para tal, as proteínas foram expressas em linhagens de E. coli Tuner e purificadas por cromatografia de afinidade a metal, seguida de exclusão molecular. Visando a caracterização biofísica e estrutural da proteína PhoU, foram realizados ensaios de dicroísmo circular, cristalização, análises de bioinformática e modelagem molecular. Os resultados de bioinformática mostraram que PhoU conserva características estruturais e funcionais quando comparada com ortólogos. Após sua purificação, a proteína foi produzida na sua forma enovelada e mostrou interação com ligantes, conforme descrito na literatura para ortólogos. A expressão da proteína PhoR também foi obtida e ensaios de pull-down foram realizados para a caracterização da interação entre PhoU-PhoR. Adicionalmente, foram realizados estudos de expressão das proteínas em diferentes condições de cultivo, utilizando-se anticorpos policlonais anti-PhoU e anti-PhoR. Os resultados apresentados neste projeto são de grande importância uma vez que se obteve a padronização dos processos de produção de ambas as proteínas e ensaios biofísicos e estruturais para a futura caracterização do complexo, o que será de grande relevância para a compreensão do papel destes sistemas na fisiologia da bactéria. / The ability to sensor the extracellular environment and respond to its changes is inherent to most bacteria. Nutrient concentrations direct metabolic processes related to survival and proliferation. Inorganic phosphate (Pi) is one of the nutrients whose regulation, sensing and signalling are quite preserved in bacteria. One of the mechanisms for phosphate ion uptake with high affinity is the Pst system, composed by an ABC transporter (ATP-Binding Cassette), located on the inner membrane of the cells. This transporter, along with the PhoR/PhoB proteins, which form a Two Component Regulatory System, are capable of sensing and monitoring the levels of phosphate in cells. Both systems belong to the called regulon Pho, set of genes involved in phosphate transport, uptake and metabolism. Studies have shown that the interaction between the Pst system and the two component PhoR/PhoB system is mediated by the PhoU protein, a negative regulator, whose gene is located in the same operon of Pst system. Although much studied in Escherichia coli , there are few information about of these systems in Xanthomonas citri subsp. citri , the major causative of citric canker. Studies conducted by our group showed that X. citri conserves most of the genes described as belonging to regulon Pho, including the Pst system, the proteins PhoR/PhoB and PhoU. This work, therefore, aimed at performing functional and structural characterization of the X. citri PhoU protein and analyzing the possible interaction of PhoU with the PhoR protein, the histidine kinase of the Two Component System. For this, the proteins were expressed in E. coli Tuner strains and purified by metal affinity chromatography, followed by size exclusion chromatography. Aiming at the biophysical and structural characterization of the PhoU protein, we performed circular dichroism, crystallization, bioinformatics and molecular modeling. The results of bioinformatics showed that PhoU retains structural and functional characteristics when compared with orthologs. After purification, the protein was produced in its folded form and showed interaction with ligands, as described in the literature for orthologs. Expression of the PhoR protein was also obtained and Pull Down assays were performed for the characterization of the interaction between PhoUPhoR. In addition, protein expression studies were carried out under different culture conditions using polyclonal anti-PhoU and anti-PhoR antibodies. The results presented in this project are of great importance, once the standardization of the production processes of both proteins has been obtained, as well as biophysical and structural information. These information will be important for future characterization of the complex, which will be of great relevance for the understanding of the role of these systems in the physiology of bacteria.

Orientador: José Carlos Barbosa / Banca: Sílvio Aparecido Lopes / Banca: Eduardo Sanches Stuchi / Banca: Antônio Baldo Geraldo Martins / Banca: Rita de Cássia Panizzi / Resumo: A distribuição espacial do cancro cítrico em talhões com laranjeira 'Natal' enxertada em limoeiro 'Cravo' com 3 anos de idade foi estudada utilizando a geoestatística. Foram utilizados 13 talhões mapeados pelo Fundecitrus (Fundo de Defesa da Citricultura), com 595 ou 1080 plantas cada, infectados naturalmente com Xanthomonas citri subsp. citri, em uma única propriedade, no Estado de São Paulo. A severidade da doença em cada planta foi avaliada por meio de uma escala com os seguintes níveis: 0 - sem folhas com sintomas; 1 - de 1 a 5 folhas com sintomas; 2 - de 6 a 10 folhas com sintomas; 3 - de 11 a 20 folhas com sintomas; 4 - de 21 a 50 folhas com sintomas e 5 - > 50 folhas com sintomas. Nestes talhões, as coordenadas correspondentes à posição das plantas contaminadas foram obtidas com um GPS, permitindo mapear a doença no talhão. A distribuição espacial foi avaliada por ajuste de semivariogramas e interpolação dos dados por krigagem. A distribuição de plantas com cancro cítrico no talhão mostrou-se agregada, com raio de agregação de 30 a 45 m. Os mapas de krigagem mostraram que os focos da doença ocorreram mais frequentemente nos limites dos talhões. Quando a nota média de severidade da doença foi menor que 0,04, o semivariograma apresentou efeito pepita puro, indicando que não houve dependência espacial / Abstract: The spatial distribution of citrus canker in areas with orange 'Natal' grafted on 'Rangpur' lime with three years of age were studied using geostatistics. We used 13 plots mapped by Fundecitrus (Citrus Defense Fund), with 595 or 1080 individual plants, naturally infected with Xanthomonas citri subsp. citri that were on the same property in the State of São Paulo. Disease severity in each plant was assessed using a scale with the following levels: 0 - no leaf with symptoms, 1 - 1 - 5 leaves with symptoms; 2 - 6 -10 leaves with symptoms; 3 - 11 - 20 leaves with symptoms; 4 - 21 - 50 leaves with symptoms and 5 - > 50 leaves with symptoms. In these plots, the coordinates corresponding to the position of symptomatic of infected plants was obtained with a GPS, allowing mapping the symptomatic plants in the block. The spatial distribution was evaluated by fitting of semivariograms and kriging interpolation of the data. The distribution of plants with citrus canker in the block was aggregated, with aggregate radius of 30 - 45 meters. Kriging maps showed that the foci of diseased plants stood on the edge of the blocks. When the average grade of severity was less than 0.04, the semivariogram showed pure nugget effect, indicating that no spatial dependence / Doutor

Orientador: Marcos Antonio Machado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T03:27:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Winck_FlaviaVischi_M.pdf: 4501613 bytes, checksum: 37c71381bde27b6bd814d565ab527886 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é o agente causador do cancro cítrico, doença que leva a severas perdas econômicas devido à contaminação e à erradicação de plantas de citros. Com o seqüenciamento completo do genoma de Xac, vários genes supostamente envolvidos com a patogenicidade de Xac foram identificados. Os genes ligados à resposta de hipersensibilidade (hrp) e avirulência (avr) em geral estão relacionados à patogenicidade de Xanthomonas, entretanto, poucos estudos funcionais destes genes de Xac foram feitos. Foram construídas linhagens mutantes de Xac para a perda de função dos genes hrpF e avrXacE2 e, nas análises in vivo, foi verificado que hrpF está envolvido na patogenicidade de Xac e é essencial para a manifestação dos sintomas primários da doença. A mutação de avrXacE2 não provocou alterações na capacidade de Xac em provocar os sintomas do cancro, portanto, este gene não parece ser essencial para a patogenicidade da bactéria, podendo não estar envolvido diretamente na patogenicidade de Xac. Os genes hrpF e avrXacE2 foram clonados em vetores de expressão e foram realizados testes de indução da expressão destas proteínas em sistemas heterólogos. Somente a proteína AvrXacE2 foi expressa, purificada e submetida a teste de interação com as proteínas citoplasmáticas da linhagem mutante de Xac para o gene avrXacE2. Os testes de interações não confirmaram a identificação de proteínas com afinidade específica pela proteína recombinante AvrXacE2. A proteína HrpF não foi super-expressa em sistema heterólogo. Nas análises de proteoma comparativo da linhagem de Xac selvagem versus linhagem mutante para o gene hrpF, foram detectadas alterações na expressão de proteínas citoplasmáticas e "pericelulares". Com base nas observações pode-se supor que HrpF possa influenciar processos celulares relacionados à respostas à situações de estresse e não somente atuar na translocação de moléculas efetoras via T3SS. A partir do que foi exposto neste trabalho, sugere-se que as técnicas de estudos funcionais de genes e análises proteômicas podem conjuntamente permitir que novos mecanismos relacionados a patogenicidade de Xac sejam interpretados. Com os mutantes produzidos neste estudo, espera-se criar condições para novos ensaios funcionais visando a melhor compreensão da patogenicidade de Xac e buscar novas formas de combate ao cancro cítrico / Abstract: The bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causative agent of the citrus canker disease, which leads to economic losses due the contamination and erradication of citrus plants. The complete sequencing of its genome identified a number of genes supposedly involved with pathogenicity. Genes that code for hipersensitivity response (hrp) and avirulence (avr), in general, are related to the pathogenicity of Xanthomonas, however, only a few functional studies of these genes in Xac have been made. Here we report findings based on genomics and proteomics methods for Xac. Mutant strains of Xac for genes hrpF and avrXacE2 and in vivo assays demonstrated that hrpF is strongly involved in the pathogenicity of Xac and is essential for the manifestation of the primary symptoms of the citrus canker. On the other hand, the lack of avrXacE2 expression did not result in modifications in the capacity of Xac to elicite the symptoms of canker, therefore, this gene does not seem to be essential for the pathogenicity of the bacterium. The genes hrpF and avrXacE2 were cloned in expression vectors and tests of induction of the expression of these proteins in heterologous systems were carried out. The protein AvrXacE2 was expressed, purified and tested on interaction assays with cytoplasmic proteins of the mutant of Xac for the gene avrXacE2. The tests of interactions had not confirmed the identification of proteins with specific affinity for the recombinant protein AvrXacE2. The protein HrpF was not overexpressed in heterologous system. In the comparative proteome of the wild versus mutant strains for hrpF, modifications in the cytoplasmic protein expression and "pericellular" expression levels were detected. We postulate that, besides acting as a translocator of molecules through T3SS, HrpF may influence stress-related cellular responses. Thus, it is an opportune time to highlight the new and different ways in which HrpF serves Xac function. Moreover, we can assume that the techniques of functional genomics and proteomics analyses will clarify the mechanisms of pathogenicity used by Xac to cause citrus canker and, thus, enable the search for additional information to control the disease / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

O cancro cítrico, causado pela bactéria Gram negativa Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é considerado uma das principais doenças da citricultura nacional e mundial, devido à susceptibilidade do hospedeiro e por não existirem métodos de controle eficientes. Dados da literatura relatam que alguns genes de bactérias fitopatogênicas possuem uma seqüência consenso de nucleotídeos (TTCGC...N15...TTCGC) denominada “PIP box” ou “plant-inducible-promoter box”, localizada na região promotora e responsável pela ativação da expressão de fatores de patogenicidade e virulência quando o patógeno entra em contato com a planta hospedeira. O objetivo deste trabalho foi mapear e investigar no genoma da Xac a expressão de genes contendo seqüências do tipo “PIP box”, a 5’ da ORF ou internamente na região codificadora, através da técnica de macroarranjo. Com auxílio de uma ferramenta de bioinformática (script PERL), 208 seqüências consenso para o elemento cis-regulatório “PIP box” foram mapeados no genoma da Xac, e clones contendo seqüências codificadoras associadas aos promotores do tipo “PIP box” foram recuperados do banco de clones gerado pelo projeto de seqüenciamento da bactéria e validados por seqüenciamento. Os DNAs plasmidiais representando cada clone foram preparados e imobilizados em membranas de náilon (macroarranjo), as quais foram hibridadas com sondas de cDNAs marcadas com [a33P] dCTP e obtidas a partir de RNA total extraído da bactéria em estádio não infectante (cultivada em meio de cultura Caldo Nutriente – meio CN) e da bactéria infectante (cultivada por 12 horas ou 20 horas em meio XAM1 indutor de patogenicidade e virulência, ou coletada por exsudação 3 dias ou 5dias após inoculação em folhas de laranjeira). A análise da expressão dos genes contendo promotores “PIP box” putativos revelou 67 genes diferencialmente expressos quando a bactéria teve o seu programa de infecção disparado (indução “in vitro” ou “in vivo”). A validação dos resultados de macroarranjo foi realizada para alguns dos genes por meio de RT-PCR semi-quantitativo e a funcionalidade da seqüência “PIP box” para alguns promotores foi demonstrada através do gene repórter GUS. Os genes com expressão diferencial foram classificados segundo a função biológica das respectivas proteínas codificadas e estão envolvidos em processos tão distintos quanto sistema de secreção tipo III, metabolismo de membrana e parede celular, sistema de captação de ferro, metabolismo de açúcares e degradação da parede vegetal, transdução de sinais, metabolismo de flagelo, formação de biofilme e adesividade, metabolismo de ácidos nucléicos, transportadores de membrana, metabolismo energético e resposta a estresse ambiental. O possível papel destas modificações para a interação planta-patógeno e a instalação do cancro cítrico é discutida. / The citrus canker, caused by the bacterial pathogen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), is considered worldwide as one of the most important disease of citrus crop due to the lack of resistance in citrus plants and to the absence of efficient methods to control the disease. It was already shown that several genes involved in virulence and pathogenicity in plant pathogenic bacteria have a consensus nucleotide sequence (TTCGC…N15…TTCGC) named plant-inducible-promoter box or PIP box, located in the promoter region of the genes, which are responsible to activate the expression of genes during the host-bacteria interaction. The aim of this work was to map in Xac genome the genes containing the PIP box sequence in the promoter region, or internal to the ORF sequence, and analyze their expression during plant infection using the macroarray technique. Using a PERL script, 208 PIP box consensus sequence associated to genes were found in the Xac genome and clones containing all these genes and their PIP box sequences were recovered from a Xac genome clone bank and reconfirmed by sequencing. The plasmidial DNA containing the gene and the PIP box from each clone were purified, immobilized onto a nylon membrane (macroarray) and hybridized with [a33P] dCTP-labeled cDNAs synthesized from Xac total RNA isolated from bacteria in non-infecting (grown in NB nutrient medium) and infecting (grown for 12 or 20 hours in XAM1 medium that mimics the environment of the plant intercellular space (“in vitro”) or for 3 or 5 days in orange plant leaves (“in vivo”) conditions. The gene expression profile resulting from the array analysis revealed that 67 genes were differentially expressed during the temporal course of the infection. The results were validated through the analysis of expression profile for some genes using semi-quantitative RT-PCR and the PIP box functionality for some promoters was demonstrated using GUS as reporter gene. The differentially expressed genes were classified regarding the biological function of the encoded protein and related to several relevant processes as type III secretion system, membrane and cellular wall metabolism, iron uptake, sugar metabolism and host cell wall degradation, signal transduction, flagellum metabolism, biofilm formation and adhesiveness, nucleic acid metabolism, membrane transporters, energetic metabolism and stress response. The possible roles of these modifications for the bacteria-plant interaction and disease installation are discussed.

Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) é uma bactéria fitopatógênica que causa de cancro cítrico em plantações no mundo inteiro. Trinta e cinco proteínas alvo foram selecionadas para estudos de proteômica estrutural a partir do genoma de Xac. As proteínas foram clonadas, expressas e testadas usando uma nova metodologia de triagem de proteínas que permite que espectros de RMN 2D 15N-HSQC sejam coletados antes da purificação da proteína em estudo. Esta abordagem possibilitou determinar quais proteínas alvo melhor se adequavam para estudos estruturais futuros por RMN e/ou cristalografia de raios X de forma rápida e eficaz. A proteína ClpS de Xac, descrita como moduladora da atividade da protease bacteriana ClpAP, foi uma das proteínas selecionadas para estudos estruturais por RMN usando esta metodologia. O assinalamento das ressonâncias da cadeia principal e das cadeias laterais desta proteína usando experimentos de tripla ressonância e dados de dinâmica e de troca H/D forneceram informações sobre a sua estrutura secundária. Um modelo tridimensional foi gerado por modelagem por homologia a partir de um homólogo de E. coli e foi validado por acoplamentos dipolares residuais (DHN ) obtidos experimentalmente. Todos os dados RMN sugerem que a região N-terminal de ClpS se apresenta desestruturada. O mapeamento por RMN da interação de ClpS com a sua parceira ClpA é também apresentado. / Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) is a phytopathogenic bacterium that causes citrus canker around the world. Thirty-five target proteins for structural proteomics studies have been selected from the Xac genome. The target proteins were cloned, expressed and tested using a novel screening methodology that allows for 2D 15N-HSQC NMR spectra to be collected prior to the purification of the target protein. This approach allowed us to determine which target proteins were amenable for future structural studies by NMR and/or X-ray crystallography in a fast and efficient manner. The ClpS protein, which has been described as a modulator of substrate specificity of the bacterial protease ClpAP, was one of the proteins selected structural studies by NMR using this methodology. Backbone and side-chain assignment derived from 3D triple resonance NMR experiments and dynamic data from hydrogen-deuterium exchange NMR experiments have provided information on the secondary structure elements of this protein. A model for Xac ClpS was generated by homology modeling from an E. coli homogue and validated using experimentally obtained DHN residual dipolar couplings. All NMR data suggest that the N-terminal region of the protein ClpS is highly unstructured. NMR mapping of the interaction of ClpS with its partner protein ClpA is also presented.

Les plasmides pSci de Spiroplasma citri GII3 possèdent une structure mosaïque avec de nombreuses régions conservées. Des dérivés du plasmide pSci2 ont été produits par délétions successives et leur capacité de réplication a été évaluée. Le plus petit réplicon obtenu ne contient plus qu’une CDS (pE) et ses régions flanquantes. L’inactivation dans un vecteur navette du gène pE est suffisante pour abolir la réplication de ce plasmide dans S. citri. Des dérivés des pSci ont été introduits efficacement dans S. kunkelii et S. phoeniceum, deux spiroplasmes phytopathogènes pour lesquels aucun outil génétique n’était disponible jusqu’à présent. La stabilité des dérivés des pSci a également été évaluée par leur capacité à persister en l’absence de pression de sélection. L’instabilité ségrégationnelle des plasmides dans lesquels soj a été délété ou inactivé indique que la protéine de partition Soj/ParA est essentielle au maintien des plasmides pSci. L’incompatibilité sélective entre un plasmide pSci et ses dérivés a été exploitée pour produire une collection de souches possédant des profils plasmidiques différents. L’analyse des phénotypes d’acquisition et de transmission de plusieurs de ces mutants suggère que la CDS traG portée par le pSci6 est essentielle à la transmission de S. citri GII3. En revanche, les plasmides pSci1-5, codant les protéines adhésine-like ScARPs, ne sont indispensables ni à l’acquisition ni à la transmission. Dans le cadre de ce travail, plusieurs outils génétiques ont été adaptés aux mollicutes. Le promoteur Pxyl/tetO2 a été utilisé pour contrôler l’expression du gène de la spiraline chez S. citri et M. agalactiae. Enfin, un système de linéarisation de plasmide in vivo basé sur l’expression de l’endonucléase I-SceI a été utilisé pour l’élimination de plasmides pSci chez S. citri. / Plasmids pSci from Spiroplasma citri GII3 display a mosaic gene organization with highly conserved regions. Through successive deletions, various pSci2 derivatives were constructed and assessed for their ability to replicate. The smallest functional replicon consists of one single CDS (pE) and its flanking, intergenic regions. Furthermore, shuttle (S. citri/E. coli) plasmids, in which the pE gene was disrupted, failed to replicate in S. citri, suggesting that PE is the replication protein. S. citri plasmids were efficiently introduced into S. kunkelii and S. phoeniceum, two plant pathogenic spiroplasmas, the transformation of which had never been described before. Studying stability of various pSci-derived plasmids in the absence of selection pressure strongly suggests the occurrence of an active partition system involving the soj-like gene. Selective incompatibility between a given pSci plasmid and its derivatives was used to remove plasmids from the wild-type strain. As a result, a collection of S. citri GII3 mutants differing in their plasmid contents was produced. Experimental transmission of these mutants through injection to or ingestion by the leafhopper vector will provide new insights into the role of plasmid encoded determinants in the biology of S. citri. First data indicated that pSci6 traG is required for insect transmission of S. citri GII3. In contrast, pSci1-5, encoding adhesin-like proteins, are not essential for both transmission and acquisition. In the frame of this work, new genetic tools have been adapted for use in mollicutes. The tetracycline inducible promoter, Pxyl/tetO2, was used to control spiraline gene in S. citri and M. agalactiae. Also, an in vivo linearization system based on the expression of the I-SceI-endonuclease was used to remove pSci plasmids from S. citri.