Na busca por compostos voláteis para utilização no manejo comportamental de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), a resposta destes insetos foi avaliada frente às substâncias liberadas por plantas de laranja, Citrus sinensis (L.) Osbeck, variedade \'Pêra\', enxertadas sobre limão-cravo, C. limonia Osbeck, sadias vs sintomáticas para Huanglongbing (HLB). Voláteis destas plantas, bem como seus extratos foram testados em olfatômetro \'Y\' e analisados por GC-MS. Somente fêmeas foram atraídas, tanto para os voláteis quanto para os extratos, e preferencialmente os de plantas doentes. Foram encontrados 47 compostos em extratos de plantas sadias e doentes, dos quais 11 [hexanal; α-tujeno; α-pineno; sabineno; β-mirceno; α-terpineno; limoneno; linalol; composto 37 (não identificado); β-elemeno e β-copaeno] presentes em maior quantidade nos extratos de plantas doentes, sendo que 3 desses compostos (sabineno, linalol e β -elemeno) foram majoritários nos extratos de ambas as plantas, doentes e sadias. Esses três compostos, bem como uma substância padrão para atração (salicilato de metila), foram testados em diferentes concentrações e misturas em laboratório, casa-de-vegetação e campo. O efeito destas substâncias foi dependente de sua concentração e, embora limoneno tenha alterado a resposta comportamental das fêmeas, apenas salicilato de metila e linalol foram atraentes. Em laboratório, a mistura desses dois compostos apresentou efeito sinérgico na atração de fêmeas e, em casa-de-vegetação, a adição de linalol junto a plantas de citros aumentou a atratividade das mesmas para insetos adultos, sugerindo importante participação desses compostos no processo de seleção hospedeira pelo inseto. Estes resultados acrescentam novas informações para a busca de um atraente para D. citri visando o manejo comportamental do inseto vetor das bactérias Liberibacter, associadas ao HLB, a mais importante doença dos citros no mundo. / With the aim of searching for volatile compounds to use in behavioral management of Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), the response of these insects was assessed against the substances released by sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck], variety \'Pera\', grafted on Rangpur (C. limonia Osbeck), healthy and Huanglongbing (HLB) symptomatic plants. Plant volatiles as well as plant extracts were tested in Y-tube olfactometer assays and analyzed by GC-MS. Only females were attracted to plant volatiles and extracts and they preferred those from HLB-infected plants. A total of 47 compounds was found in the extracts from healthy and infected plants, from which 11 [hexanal; α-thujene; α-pinene; sabinene; β- myrcene; α-terpinene; limonene; linalool; compound #37 (not identified); β-elemene; and β-coapene] were present in higher amounts in infected plant extracts. Three of these volatiles (sabinene, linalool and β-elemene) represented major compounds in both infected and healthy plant blend extracts. These three compounds, as well as a standard substance used for attraction (methyl salicylate), were tested in different concentrations and mixtures in laboratory, greenhouse and field. The effect of these substances was dependent on its concentration and, although limonene changed female behavioral response, only methyl salicylate and linalool were attractive. In the laboratory, the mixture of these two compounds showed a synergistic effect in attracting females and, in greenhouse, the addition of linalool to citrus plants increased the attractiveness of plants to adult insects, suggesting an important role for these compounds in the host selection process by the insect. These results provide novel information about attractants to D. citri with the aim of developing a behavioral management approach of the insect vector for Liberibacter, bacteria associated to HLB, the most important citrus disease worldwide.

Orientadores: Celso Eduardo Benedetti, Thelma Aguiar Pertinhez / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T11:25:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vanini_MarinaMarquesTeixeira_D.pdf: 4190459 bytes, checksum: 7f5524ada199418936817a26a2c2aadb (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Dentro do programa Smolbnet (Structural Molecular Biology Network) da Fapesp (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), a orf (open reading frame) XAC1516 da bactéria causadora do cancro cítrico, Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), foi selecionada para estudos de estrutura e função. XAC1516 codifica uma lipoproteína de membrana externa semelhante a membros da família OmlA/SmpA (Outer membrane lipoprotein A/Small membrane protein A) de pequenas lipoproteínas, amplamente distribuída entre as Proteobacteria 'beta¿ e 'gama¿. Apesar de se conhecer o papel de muitas lipoproteínas, nenhum membro OmlA/SmpA tem estrutura 3D (tridimensional) determinada e pouco se sabe sobre esta família do ponto de vista funcional, sendo sugerido um possível papel na manutenção da integridade do envelope celular. Curiosamente, no genoma de diversas bactérias o gene omlA apresenta localização adjacente ao gene fur (ferric uptake regulator), que codifica o principal regulador transcricional dos níveis intracelulares de ferro em bactérias Gram-negativas. O curto espaço intergênico entre omlA e fur sugere que os seus promotores são sobrepostos e que suas funções e/ou regulação podem estar associadas. Este trabalho procurou investigar a função da proteína OmlA de Xac, primordialmente através da determinação da sua estrutura 3D e análise das suas propriedades dinâmicas por Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Também se buscou estudar a possibilidade de associação regulatória e/ou funcional entre omlA e fur, e o envolvimento do lócus no metabolismo de ferro ou na resposta ao estresse celular. Nós observamos que durante a infecção em folhas de citrus OmlA tem sua expressão aumentada em Xac e que neste processo os genes omlA e fur são co-ativados, sugerindo seu envolvimento na interação planta-patógeno. No entanto, o lócus não foi ativado em condições associadas ao metabolismo de ferro e à regulação por Fur observada em outros organismos. Ensaios de mono-híbrido foram realizados para tentar detectar possíveis fatores de ligação ao promotor do lócus omlA e fornecer informações sobre a sua regulação, mas sem sucesso. Pela primeira vez, as propriedades conformacionais e dinâmicas foram determinadas por RMN para um membro da família OmlA, e a estrutura 3D da proteína OmlA de Xac não revelou sua associação direta com processos de captação de ferro. A proteína possui extremidades desenvoveladas e uma porção central estruturada intercalada por loops flexíveis e composta de três fitas 'beta¿ e duas pequenas 'alfa¿ hélices que se empacotam num arquitetura do tipo bicamada 'alfa¿/¿beta¿. Curiosamente, este enovelamento se assemelha aos domínios da proteína BLIP (ß-lactamase inhibitory protein), um inibidor de 'beta¿-lactamase envolvido em interações proteína-proteína. Testes in vivo de co-expressão das proteínas OmlA e 'beta¿-lactamase não indicaram que OmlA possua atividade de inibição da 'beta¿-lactamase, e que portanto é provável que se associe a outra(s) proteína(s). Possíveis parceiros de interação não foram detectados através de experimentos de pull-down e coimunoprecipitação. Apesar disso, os resultados sugerem que a proteína OmlA pode estar envolvida em algum tipo de interação proteína-proteína associada à infecção na planta e sua co-ativação com fur deve fazer parte de uma resposta global relacionada à ativação de mecanismos de importância para sobrevivência de Xac durante a colonização na planta / Abstract: The XAC1516 gene from the citrus canker pathogen, Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), was selected for structural and functional studies in the context of the Fapesp Smolbnet program. XAC1516 codes for an outer membrane lipoprotein similar to members of the OmlA/SmpA (Outer membrane lipoprotein A/Small membrane protein A) family of small lipoproteins widely distributed across the 'beta¿ and 'gama¿ Proteobacteria. Although the role of numerous bacterial lipoproteins is known, the tridimensional (3D) structure of OmlA/SmpA members has never been reported and little is known about its biological function. However, it has been proposed a role of OmlA in the stability of the cellular envelope. Curiously, the omlA gene is located adjacently to the fur (ferric uptake regulator) gene, which codes for the most important transcriptional regulator of iron intracellular levels in Gram-negative bacteria. The tight intergenic spacement between omlA and fur suggests that they have superimposed promoters and that their function or regulation may be associated. In this work, we have investigated the function of the OmlA protein from Xac essentially through its 3D structure determination and dynamic analysis by Nuclear Magnetic Resonance (NMR). We also investigated the possibility of a functional association between omlA and fur and the involvement of this locus in iron metabolism or cellular stress response. We found that in Xac OmlA expression is enhanced during citrus infection and that in this process omlA and fur are co-activated, thus suggesting their involvement in plantpathogen interaction. The locus, though, was not actived upon conditions associated to iron metabolism or Fur regulation already observed in other organisms. One-hybrid assay were performed in order to detect possible transcriptional factors implicated in omlA/fur expression or repression, but without success. Conformational and dynamical properties of OmlA were determined by NMR. The protein has unfolded N and C termini and a structurally well defined core interconnected by flexible loops and composed by three 'beta¿-strands and two small 'alfa¿-helices, which pack against each other forming a two-layer 'alfa¿/¿beta¿ scaffold. Curiously, this fold ressembles the domains of BLIP ('beta¿-lactamase inhibitory protein), a 'beta¿-lactamase inhibitor involved in protein-protein interaction. OmlA and 'beta¿-lactamase co-expression in vivo experiments did not indicate that OmlA has a 'beta¿-lactamase inhibitory activity. It is possible then that OmlA associates with another protein or proteins, but interacting partners were not detected through pulldown and coimmunoprecipitation assays. Nonetheless, the results suggests that OmlA may be implicated in some sort of protein-protein interaction associated to plant infection and its coactivation with fur may take part of a global response related to activation of important mechanisms for Xac surviving during its colonization in plant / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Ljubica Tasic, Marco Aurelio Zezzi Arruda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-17T19:46:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_AdrianaMartini_M.pdf: 8608342 bytes, checksum: fca9bf20d004eaa7ecfd1a0213382c0b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A expressão protéica da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) foi avaliada aplicando técnicas de espectrometria de massas (MS) na tentativa de identificar a presença de 40 proteínas classificadas como possíveis chaperonas de secreção dos Sistemas Secretórios do Tipo III e IV. Embora o processo de virulência da Xac ainda não seja bem elucidado, acredita-se que as proteínas alvo desempenhem papel importante em caminhos secretórios. Estas proteínas participam no encaminhamento dos fatores de virulência para a secreção, proporcionando-lhes estrutura específica e compatível aos caminhos secretórios, previnem sua aglomeração e interações inapropriadas. Para alcançar os objetivos, a Xac foi cultivada em três condições distintas: meio de cultura LB, considerado como controle, e meios enriquecidos com extratos provenientes de folhas e cascas de laranja, que mimetizam a presença da planta hospedeira por conterem nutrientes específicos. A separação das proteínas da Xac foi realizada por eletroforese em uma e duas dimensões, que permitiu verificar a presença das proteínas alvo na região de 8-23 kDa com pI na faixa 4-7. Após lise tríptica, as análises de espectrometria de massas (MS) foram realizadas utilizando-se exclusivamente as técnicas de ionização suave MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) e ESI (Electro Spray Ionization). Foram identificadas 12 proteínas da Xac até então consideradas hipotéticas, sendo uma delas, potencial chaperona secretória dessa bactéria. Aplicando técnica de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) foi avaliado o consumo preferencial da Xac em relação aos extratos de casca e folha de laranja, como, também, a produção de metabólitos. O estudo de metalômica qualitativa possibilitou a identificação de espécies metálicas ligadas às proteínas da Xac por ICP-MS em frações obtidas por cromatografia líquida / Abstract: The proteome of the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) was studied with the aim to identify 40 hypothetical proteins and possible secretion chaperones from the Type III and Type IV Secretion Systems. It is believed that the target proteins can interact in a conserved manner with virulence factors providing them specific and appropriate structures to travel through the secretion pathways, prevent their improper interactions and agregation. For this purpose, Xac was cultived in three distinct conditions: rich medium (LB), used as the control condition, and in media enriched with orange¿s leaves and peels extracts, which simulate the presence of the host plant cell by containing specific nutrients. After protein separation by electrophoresis (1D and 2D), and detection of proteins in the region of 8-23 kDa and pI range from 4-7, characteristic of the target proteins, tryptic lysis was executed. Mass Spectrometry (MS) analyses applying soft ionization sources, MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) or ESI (Electro Spray Ionization), enabled the identification of 12 proteins, one of them possible secretion chaperone, that were considered hypothetical. Gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) was used as a tool for monitoring the consumption of specific nutrients present in the extracts by Xac and the production of its metabolites. Also, ICP-MS was applied in a qualitative Xac's metalomics that enabled the discrimination of important metallic species in protein fractions obtained by HPLC / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T23:20:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cernadas_RaulAndres_D.pdf: 2626366 bytes, checksum: 35442a2f5cdd8214cd7309ecd63c7954 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A forma mais agressiva de cancro cítrico, cancrose A, é causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), que ataca qualquer variedade ou espécie de citros. Além de Xac, Xanthomonas axonopodis pv aurantifolii (Xaa) causa um tipo mais leve da doença, cancrose C, restrita ao limão Galego (Citrus aurantifolii). Na laranja Pêra (Citrus sinensis), Xaa provoca uma resposta de defesa que impede o desenvolvimento dos sintomas do cancro incluindo a ruptura da epiderme que é fundamental à disseminação da bactéria. Neste trabalho, abordamos a patogenicidade diferencial entre Xac e Xaa na laranja Pêra para estudar a expressão gênica na planta associada ao desenvolvimento dos sintomas (hipertrofia e hiperplasia celular) e à resposta de defesa. O projeto apresenta a identificação e caracterização de genes expressos diferencialmente em resposta à infecção por Xac e Xaa responsáveis pelo cancro cítrico. A partir de três estratégias independentes (Display diferencial de PCR, Hibridação subtrativa suprimida e micro arranjos de DNA) detalhou-se o perfil transcricional de folhas de laranja infiltradas com Xaa, Xac ou água como controle. Mais de 120 genes candidatos foram validados através de PCR quantitativo em tempo real ou hibridação Northern. Os genes diferencialmente expressos a 6 ou 48 hs após da infecção (hai) aparecem agrupados em categorias funcionais como: remodelamento de parede celular, divisão e expansão celular, tráfego de vesículas, resposta de defesa, metabolismo de nitrogênio e carbono e sinalização de hormônios como auxina, giberelina e etileno. Inicialmente, tanto Xaa quanto Xac induzem respostas de defesa associadas com ataque de patógenos incluindo a produção de espécies reativas de oxigênio e lignificação da parede celular. Notavelmente, a mudança no perfil transcricional mostra que Xac suprime as defesas da planta entre 6 e 48 hai, ao mesmo tempo em que induz genes relacionados com o metabolismo da parede celular, divisão celular e trafego de vesículas, entre outros. A conseqüência dessa manipulação transcricional no hospedeiro por parte de Xac dá origem à um estado fisiológico típico de expansão celular (hipertrofia). O inibidor de trafego de vesículas, Brefeldina A, atrasou o desenvolvimento dos sintomas do cancro, indicando que essa atividade está mais relacionada com hipertrofia celular do que com respostas de defesa. No perfil transcricional de folhas infectadas com Xaa destaca-se a ativação de uma via de sinalização por proteína quinase ativada por patógeno, envolvendo também fatores de transcrição do tipo WRKY, assim como elementos de resposta a etileno. Tanto Xac quanto Xaa parecem modular a transcrição de genes relacionados com sinalização e transporte de auxinas e biosíntese de giberelina. O tratamento de folhas de laranja com, ácido naftalenoacético (NAA) e ácido giberélico (GA3) demonstrou que esses hormônios induzem a expressão de genes de remodelamento de parede celular, biosíntese de giberelina e sinalização de auxina. Além disso, o inibidor de biosíntese de giberelina (Chlorocoline Chloride) diminuiu significativamente a expressão de genes induzidos por NAA sugerindo que exista uma regulação cruzada entre auxina e giberelina que controla a expressão de genes relacionados com divisão e expansão celular em citros. Finalmente, duas regiões promotoras de genes que codificam proteínas relacionadas com patogenicidade (PR-1 e PR-5) foram isoladas e caracterizadas. Esses genes são fortemente induzidos por Xaa e Xac em 6 e 48 hai. Substancialmente, existem elementos similares com o "upa box" nas regiões promotoras de PR-1 e PR-5. Mediante experimentos de Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) demonstrou-se que a proteína PthA4 de Xanthomonas é capaz de ligar-se no "upa box" presente nos promotores de PR-1 e PR-5. Tanto o promotor de PR-1 quanto o de PR-5 dirigem a expressão transitória do gene repórter uidA em N. benthamiana mediante Agro infiltração. / Resumo: A forma mais agressiva de cancro cítrico, cancrose A, é causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), que ataca qualquer variedade ou espécie de citros. Além de Xac, Xanthomonas axonopodis pv aurantifolii (Xaa) causa um tipo mais leve da doença, cancrose C, restrita ao limão Galego (Citrus aurantifolii). Na laranja Pêra (Citrus sinensis), Xaa provoca uma resposta de defesa que impede o desenvolvimento dos sintomas do cancro incluindo a ruptura da epiderme que é fundamental à disseminação da bactéria. Neste trabalho, abordamos a patogenicidade diferencial entre Xac e Xaa na laranja Pêra para estudar a expressão gênica na planta associada ao desenvolvimento dos sintomas (hipertrofia e hiperplasia celular) e à resposta de defesa. O projeto apresenta a identificação e caracterização de genes expressos diferencialmente em resposta à infecção por Xac e Xaa responsáveis pelo cancro cítrico. A partir de três estratégias independentes (Display diferencial de PCR, Hibridação subtrativa suprimida e micro arranjos de DNA) detalhou-se o perfil transcricional de folhas de laranja infiltradas com Xaa, Xac ou água como controle. Mais de 120 genes candidatos foram validados através de PCR quantitativo em tempo real ou hibridação Northern. Os genes diferencialmente expressos a 6 ou 48 hs após da infecção (hai) aparecem agrupados em categorias funcionais como: remodelamento de parede celular, divisão e expansão celular, tráfego de vesículas, resposta de defesa, metabolismo de nitrogênio e carbono e sinalização de hormônios como auxina, giberelina e etileno. Inicialmente, tanto Xaa quanto Xac induzem respostas de defesa associadas com ataque de patógenos incluindo a produção de espécies reativas de oxigênio e lignificação da parede celular. Notavelmente, a mudança no perfil transcricional mostra que Xac suprime as defesas da planta entre 6 e 48 hai, ao mesmo tempo em que induz genes relacionados com o metabolismo da parede celular, divisão celular e trafego de vesículas, entre outros. A conseqüência dessa manipulação transcricional no hospedeiro por parte de Xac dá origem à um estado fisiológico típico de^expansão celular (hipertrofia). O inibidor de trafego de vesículas, Brefeldina A, atrasou o desenvolvimento dos sintomas do cancro, indicando que essa atividade está mais relacionada com hipertrofia celular do que com respostas de defesa.No perfil transcricional de folhas infectadas com Xaa destaca-se a ativação de uma via de sinalização por proteína quinase ativada por patógeno, envolvendo também fatores de transcrição do tipo WRKY, assim como elementos de resposta a etileno. Tanto Xac quanto Xaa parecem modular a transcrição de genes relacionados com sinalização e transporte de auxinas e biosíntese de giberelina. O tratamento de folhas de laranja com, ácido naftalenoacético (NAA) e ácido giberélico (GA3) demonstrou que esses hormônios induzem a expressão de genes de remodelamento de parede celular, biosíntese de giberelina e sinalização de auxína. Além disso, o inibidor de biosíntese de giberelina (Chlorocoline Chloridè) diminuiu significativamente a expressão de genes induzidos por NAA sugerindo que exista uma regulação cruzada entre auxina e giberelina que controla a expressão de genes relacionados com divisão e expansão celular em citros. Finalmente, duas regiões promotoras de genes que codificam proteínas relacionadas com patogenicidade (PR-1 e PR-5) foram isoladas e caracterizadas. Esses genes são fortemente induzidos por Xaa e Xac em 6 e 48 hai. Substancialmente, existem elementos similares com o "upa box" nas regiões promotoras de PR-1 e PR-5. Mediante experimentos de Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) demonstrou-se que a proteína PthA4 de Xanthomonas é capaz de ligar-se no "upa box" presente nos promotores de PR-1 e PR-5. Tanto o promotor de PR-1 quanto o de PR-5 dirigem a expressão transitória do gene repórter uidA em N. benthamiana mediante Agro infiltração / Abstract: The most aggressive form of the citrus canker disease is caused by the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), which can infect all commercial varieties or species of citrus. In addition to Xac, Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii (Xaa) causes a weaker form of the disease, known as cancrose C, which is restricted to Mexican Lime (Citrus aurantifolii). In sweet orange (Citrus sinensis), Xaa triggers a defense response that halts the canker-symptoms development including the epidermal rupture, which is essential for bacterial dissemination. In this work, we approached the differential pathogenicity existing between Xac and Xaa in order to survey the host gene expression associated with symptoms development (cellular hypertrophy and hyperplasia) and defense response in sweet orange. The project presents the identification and initial characterization of differentially expressed genes in response to the infection with the citrus canker pathogens, Xac and Xaa. Three independent strategies were conducted in order to have a detailed transcriptional profiling of orange leaves infected with Xaa, Xac or water as mock control (Differential Display PCR, Suppression Subtractive Hybridization and GeneChip Microarrays). More than 120 candidate genes were validated through quantitative real time PCR or Northern blot. The differentially expressed genes at 6 or 48 hours after infection (hai) were grouped into functional categories: cell-wall remodeling, cell division and expansion, vesicle trafficking, carbon and nitrogen metabolism or hormone signaling, auxin, gibberellin and ethylene. Initially, both Xaa and Xac elicit a defense response associated with pathogen attack that includes the production of reactive oxygen species (ROS) and cell-wall lignification. Notably, the changes in the transcriptional profiles show that Xac suppresses the plant defenses between 6 and 48 hai and at the same time it induces genes related to the cell-wall metabolism, cell division and vesicle trafficking among others. The consequence of this host manipulation by Xac originates a physiological state very similar to that of cell expansion (hypertrophy). The vesicle trafficking inhibitor, Brefeldin A, delayed the development of canker symptoms indicating that this activity is more related to the cellular enlargement than to the defense responses. The transcriptional profile of Xaa-infiltrated leaves highlights the activation of amitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway related to pathogen attack with the involvement of other components of defense responses like WRKY-transcriptional factors and ethylene-response elements. Both Xac and Xaa appear to modulate the transcription of genes related to auxin signaling and transport and gibberellin biosynthesis. Treatments of orange leaves with 1- naphthylphthalamic acid (NAA) . / Abstract: The most aggressive form of the citrus canker disease is caused by the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), which can infect all commercial varieties or species of citrus. In addition to Xac,Xanlhomonas axonopodis pv. aurantifolii (Xaa) causes a weaker form of the disease, known as cancrose C, which is restricted to Mexican Lime {Citrus aurantifolii). In sweet orange {Citrus sinensis), Xaa triggers a defense response that halts the canker-symptoms development including the epidermal rupture, which is essential for bacterial dissemination. In this work, we approached the differential pathogenicity existing between Xac and Xaa in order to survey the host gene expression associated with symptoms development (cellular hypertrophy and hyperplasia) and defense response in sweet orange. The project presents the identification and initial characterization of differentially expressed genes in response to the infection with the citrus canker pathogens, Xac and Xaa. Three independent strategies were conducted in order to have a detailed transcriptional profiling of orange leaves infected with Xaa, Xac or water as mock control (Differential Display PCR, Suppression Subtractive Hybridization and GeneChip Microarrays). More than 120 candidate genes were validated through quantitative real time PCR or Northern blot. The differentially expressed genes at 6 or 48 hours after infection (hai) were grouped into functional categories: cell-wall remodeling, cell division and expansion, vesicle trafficking, carbon and nitrogen metabolism or hormone signaling, auxin, gibberellin and ethylene. Initially, both Xaa and Xac elicit a defense response associated with pathogen attack that includes the production of reactive oxygen species (ROS) and cell-wall lignification. T Notably, the changes in the transcriptional profiles show that Xac suppresses the plant defenses between 6 and 48 hai and at the same time it induces genes related to the cell-wall metabolism, cell division and vesicle trafficking among others. The consequence of this host manipulation by Xac originates a physiological state very similar to that of cell expansion (hypertrophy). The vesicle trafficking inhibitor, Brefeldin A, delayed the development of canker symptoms indicating that this activity is more related to the cellular enlargement than to the defense responses. The transcriptional profile of Xaa-infiltrated leaves highlights the activation of a mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway related to pathogen attack with the involvement of other components of defense responses like WRKY-transcriptional factors and ethylene-response elements. Both Xac and Xaa appear to modulate the transcription of genes related to auxin signaling and transport and gibberellin biosynthesis. Treatments of orange leaves with 1-naphthylphihalamic acid (NAA) e Gihherellic Acid (GKi) demonstrated that these hormones induce the expression of genes related to cell-wall remodeling, gibberellin biosynthesis and auxin signaling. Moreover, the gibberellin-biosynthesis inhibitor (Chlorocoline Chloride) decreased significantly the expression of auxin-induced genes suggesting a cross-talk regulation between auxin and gibberellin controlling the expression of citrus genes associated with cell division and expansion. Finally, two promoter regions of the pathogenesis related (PR) genes, PR-I and PR-5.2, were isolated and characterized. These genes are strongly up-regulated by Xaa and Xac at 6 or 48 hai. Substantially, there are "upd" box-like motifs in the promoter regions of both PR-I and PR-5.2. By means of Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) we have demonstrated that PthA4 from Xac is capable of binding the "upd" box-like regions found in PR-1 e PR-5 promoters. Furthermore, both of the isolated promoters (PR-1 and PR-5) address the transient expression of the reporter gene uidA in JV. bethamiana leaves through agro infiltration / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O Brasil é o maior produtor de laranja doce no mundo. Entretanto, a cultura enfrenta grandes problemas, devido ao ataque de pragas e doenças, o que reduz a produtividade da cultura. Entre estas doenças, destaca-se o huanglongbing (HLB), doença associada a três espécies da bactéria Candidatus Liberibacter. No Brasil, o psilídeo Diaphorina citri é o inseto transmissor do HLB. A falta de cultivares de laranja doce resistentes ao HLB torna a transformação genética de plantas uma medida em potencial para o controle desta doença. Plantas transgênicas de laranja doce expressando um RNA de dupla fita (dsRNA) de um gene essencial à sobrevivência de D. citri podem resultar no controle do inseto por meio do mecanismo de RNA de interferência. Tal mecanismo resulta na degradação do RNAm homólogo ao dsRNA. Este trabalho teve por objetivo produzir plantas transgênicas de laranja doce, expressando um fragmento do gene DcV-ATPase-A de D. citri, em uma construção gênica tipo hairpin. Dessa forma, o silenciamento gênico por RNA de interferência seria ativado no psilídeo quando este for submetido à alimentação nas plantas transgênicas. O trabalho foi iniciado com a elaboração da construção gênica contendo uma sequência repetida e invertida do gene DcV-ATPase-A de D. citri, para formação de um hairpin. Segmentos de epicótilo, provenientes de sementes germinadas in vitro das laranjas \'Hamlin\', \'Pêra\' e \'Valência\' (Citrus sinensis L. Osbeck) foram utilizados como fontes de explantes para a transformação genética via Agrobacterium tumefaciens. Paralelamente aos experimentos de transformação genética, insetos adultos de D. citri foram submetidos a experimentos de alimentação artificial, contendo RNA de dupla fita (dsRNA) ou pequenos RNA interferentes (siRNA) da DcV-ATPase-A. Ao final do período de alimentação, foram avaliadas o número de insetos vivos e a expressão relativa do RNAm da DcV-ATPase-A. Através de PCR e Southern blot, a transgenia foi confirmada em 26 e 39 plantas de laranja \'Hamlin\' e \'Valência\', respectivamente. A transgenia não foi confirmada nas plantas regeneradas de laranja \'Pêra\'. O número de inserções no transgene variou de 1 a 4 cópias. A produção dos siRNAs foi confirmada em 10 plantas de laranja \'Valência\', através de siRNA blot. O uso de dietas artificiais contendo dsRNA ou siRNA do gene DcV-ATPase-A não resultou em diferenças significativas no número de insetos vivos, ou no nível de expressão relativa do RNAm do gene DcV-ATPase-A em insetos adultos de D. citri. / Brazil is the largest sweet orange producer in the world. However, this crop faces major problems due to the attack of pests and diseases that reduce its productivity. Among the diseases, stands out the huanglongbing (HLB), disease associated with three different species of the Candidatus Liberibacter bacteria. In Brazil, the psyllid Diaphorina citri is the insect vector of HLB. The absence of resistant sweet orange cultivars to HLB makes the genetic transformation of plants a potential methodology to control this disease. Sweet orange transgenic plants engineered to express double strand RNA (dsRNA) of an essential gene for D. citri survival could result in insect control by RNA interference. This mechanism results in degradation of homologous RNAm to dsRNA. The aim of this work was to produce transgenic sweet orange plants expressing a fragment of D. citri DcV-ATPase-A gene, in a hairpin construction aiming gene silencing by RNA interference in D. citri, when fed on sweet orange transgenic plants. The work started developing a gene construct containing an inverted and repeated sequence of DcV-ATPase-A gene, to form a hairpin. Epicotyl segments collected from in vitro germinated seedlings of \'Hamlin\', \'Pêra\' and \'Valência\' sweet oranges (Citrus sinensis L. Osbeck) were used as explants for the genetic transformation experiments via Agrobacterium tumefaciens. At the same time, adults of D. citri underwent artificial diet experiments containing dsRNA or siRNA of DcV-ATPase-A. At the end of feeding time, the survival of insects and the relative expression of DcV-ATPase-A RNAm were evaluated. Through PCR and Southern blot analysis, 26 \'Hamlin\' and 39 \'Valência\' sweet orange transgenic lines were confirmed. None of the regenerated \'Pêra\' plants were transgenic. The transgenic plants had 1 to 4 T-DNA insertions. The siRNA products were observed in 10 \'Valência\' plants, through siRNA blot. The artificial diets containing dsRNA or siRNA of DcV-ATPase-A resulted in no differences in the number of live insects and in the relative expression of DcV-ATPase-A RNAm in adult insects.

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T05:38:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Campos_BrunaMedeia_D.pdf: 41386343 bytes, checksum: 8048b677c8a43e7438a1c349c584b9ec (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O cancro cítrico, causado pelo fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) constitui uma doença que afeta todos os cultivares comerciais de citros e é uma ameaça para a citricultura brasileira. A doença é caracterizada pela formação de pústulas, devido à hiperplasia e hipertrofia induzida pela bactéria. A patogenicidade de Xac é dependente do sistema secretório tipo III, que transloca proteínas efetoras pertencentes à família AvrBs3/PthA para dentro da célula hospedeira. Estudos recentes mostram que PthAs funcionam como fatores de transcrição no hospedeiro, transativando genes específicos da planta que irão beneficiar a bactéria ou desencadear uma resposta de defesa. Com o objetivo de entender melhor o mecanismo de ação de PthAs como ativadores da transcrição, nosso laboratório identificou, através da técnica de duplo-híbrido, várias proteínas de laranja (Citrus sinensis) que interagiram com diferentes PthAs. Entre elas, destacamos uma ciclofilina (CsCyp), que realiza isomerização de resíduos de prolina, uma proteína com domínio tioredoxina (CsTdx), relacionada com interação proteína-proteína e redução de pontes dissulfeto e uma cisteína protease (CsCP), envolvida na resposta de defesa da planta. Este trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural e funcional de CsCyp. A resolução da estrutura de CsCyp mostrou que CsCyp pertence ao grupo de ciclofilinas divergentes que possuem um loop adicional (KSGKPLH), duas cisteínas invariáveis (C40 e C168) e um glutamato (E83) conservado. Este último interage com resíduos do loop, estabilizando-o. A função destes elementos era desconhecida até o momento e o trabalho visou elucidar sua atuação na regulação da atividade PPIase da proteína. Neste trabalho, verificamos que C40 e C168 formam uma ponte dissulfeto. Dados de modelagem e simulação suportaram a hipótese de que a formação da ponte dissulfeto induz mudanças conformacionais que quebram a interação do E83 com o loop divergente, levando ao fechamento do sítio ativo de CsCyp. O estudo descreveu, portanto um mecanismo de regulação redox, que controla a atividade PPIase da proteína. Adicionalmente, mostrou-se que CsTdx interage com CsCyp através dos resíduos conservados C40 e C168, sendo críticos para tal interação. Foi mostrado também que CsCyp interage com o domínio C-terminal (CTD) da RNA Polimerase II (RNA Pol II), especificamente com a repetição YSPSAP. Surpreendentemente, através da transformação de plantas com construções para silenciamento e superexpressão de CsCyp, verificamos que plantas de citros com níveis reduzidos de CsCyp apresentaram um aumento dos sintomas do cancro cítrico quando infiltradas com Xac, enquanto que plantas com níveis aumentados de CsCyp apresentaram sintomas reduzidos quando infiltradas com Xac, indicando que CsCyp tem papel importante no desenvolvimento dos sintomas do cancro cítrico. Este trabalho também mostra a expressão e purificação das proteínas CsTdx e CsCP e a comprovação de que CsCP interage com PthAs 2 e 3 através de ensaios de duplo-híbrido / Abstract: Citrus canker, caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is a disease that affects most species of the genus Citrus and represents a threat to the Brazilian citrus industry. The disease is characterized by the formation of pustules due to hyperplasia and hypertrophy induced by the bacteria. Xac pathogenicity is dependent on a type III secretory system that translocates effector proteins which belongs to AvrBs3/PthA family inside the host cell. Recent studies showed that these proteins work as transcriptional factors that transactivate specific plant genes which will either benefit the bacteria or trigger defense response. To gain insights into PthA mechanism of action as transcription activators, our laboratory identified that PthA targeted the citrus protein complex comprising the thioredoxin CsTdx, ubiquitin-conjugating enzymes CsUev/Ubc13 and cyclophilin CsCyp. Also, we showed previously that the CsCyp binds the citrus thioredoxin CsTdx and the C-terminal domain of RNA Polymerase II (CTD), and that CsCyp complements the function of Cpr1 and Ess1, two yeast prolyl-isomerases that regulate transcription by the isomerization of proline residues of the regulatory C-terminal domain (CTD) of RNA polymerase II. In this work we solved the 3D structure of CsCyp in complex with its inhibitor cyclosporine A (CsA), showing that CsCyp is a divergent cyclophilin that carries the additional loop KSGKPLH, invariable cysteines C40 and C168, and conserved glutamate E83. Despite the suggested roles in ATP and metal binding, the function of these unique structural elements remains unknown. Here we show that the conserved cysteines form a disulfide bond that inactivates the enzyme, whereas E83, which belongs to the catalytic loop and is also critical for enzyme activity, is anchored to the divergent loop to maintain the active site open. In addition, we demonstrate that C40 and C168 are required for the interaction with CsTdx and that CsCyp binds the citrus CTD YSPSAP repeat. Our data support the model where formation of the C40- C168 disulfide bond induces a conformational change that disrupts the interaction of the divergent and catalytic loops, via E83, causing the active site to close. This suggests a new type of allosteric regulation in divergent cyclophilins, involving disulfide bond formation and a loop displacement mechanism. Moreover, we present evidence that PthA2 inhibits the peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase) activity of CsCyp in a similar fashion as CsA, and that silencing of CsCyp, as well as treatments with CsA, enhance canker lesions in Xac-infected leaves. Given that CsCyp appears to function as a negative regulator of cell growth and that Ess1 negatively regulates transcription elongation in yeast, we propose that PthAs activate host transcription by inhibiting the PPIase activity of CsCyp on the CTD / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Le cuivre, souvent utilisé pour gérer les bactérioses en agriculture, est largement utilisé dans la lutte contre Xanthomonas citri pv. citri (Xcc), agent responsable du chancre asiatique des agrumes. La récente détection d’un phénotype résistant au cuivre (CuR) chez Xcc dans deux territoires ultramarins français a motivé une étude génomique qui a révélé, dans les génomes de souches CuR, la présence d’un plasmide conjugatif portant un transposon adaptatif de type Tn3. Sa conservation chez plusieurs espèces de Xanthomonas phytopathogènes suggère le rôle des transferts horizontaux (HGT) dans l’adaptation de Xcc. Nous avons donc analysé, dans l’océan Indien, les relations phylogénétiques de souches sensibles et CuR en prenant en compte à la fois les SNP et les variations de contenu en gènes. La datation de la phylogénie a permis de formuler des scenarii d’introduction de la bactérie dans la région. La phylogénie a montré une structure géographique forte à l’échelle de l’océan Indien, qui s’estompe à l’échelle de la Réunion et disparaît à l’échelle du verger. Au sein des vergers, l’admixture est un élément favorable aux HGT entre souches génétiquement différentes. Ils sont pourtant peu caractérisés chez les bactéries du genre Xanthomonas. Nous avons ainsi analysé la dispersion de l’ensemble des gènes plasmidiques connus de la famille des Xanthomonadaceae dans l’ensemble des génomes bactériens de NCBI, mettant en évidence à la fois la forte prévalence des gènes plasmidiques au sein des Xanthomonadaceae mais aussi la limite taxonomique forte à leur échange par conjugaison. L’importance du mosaïsme plasmidique, en partie lié aux éléments mobiles a aussi été illustrée. L’ensemble de nos résultats souligne l’importance des HGT dans l’évolution des bactéries du genre Xanthomonas, et la nécessité de caractériser finement le contenu et le fonctionnement du génome environnemental des Xanthomonadaceae pour appréhender au mieux l’adaptation de ces bactéries phytopathogènes. / Copper, frequently used in agriculture to control bacterial diseases, is commonly used against Xanthomonas citri pv. citri (Xcc), the bacterial agent of Asiatic citrus canker. The recent detection of a copper-resistant phenotype in two French overseas regions motivated a genomic study which revealed, in copper-resistant (CuR) strains, a conjugative plasmid encoding an adaptive transposon of the Tn3 family. Its conservation in several Xanthomonas species suggested the role of horizontal gene transfer (HGT) in Xcc adaptation. We therefore analyzed the evolutionary history of susceptible and CuR Xcc strains in the Indian Ocean using both SNP and gene content variations. The dating of the obtained phylogeny allowed us to hypothesize the history of Xcc introduction into the region. The phylogeny showed a strong geographic structure among islands of the Indian Ocean region, which faded at the Réunion scale and disappeared at the grove scale. Among the groves, admixture is a factor favoring HGT between genetically distinct strains. This form of evolution is however largely uncharacterized in the Xanthomonas genus. To fill this gap, we searched genetic homology between the whole known plasmid gene content of the Xanthomonadaceae family and the complete set of genomes hosted in NCBI databases. We highlighted both the ubiquity of plasmid genes in the Xanthomonadaceae family and the taxonomical barrier of their sharing by conjugation. The small fraction of genes that were exchanged through the complete sharing of plasmids also revealed the importance of plasmid mosaicism, partly due to mobile genetic elements. Taken together, our results highlight the importance of bacterial communities in the evolution of phytopathogenic bacteria of the Xanthomonas genus, and the need for a precise characterization of the content and the functioning of the Xanthomonadaceae environmental genome in order to fully apprehend the adaptation of these phytopathogenic bacteria.

Orientador: Francisco Javier Medrano Martin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:29:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_Kelly_D.pdf: 4767617 bytes, checksum: 886f6b5d543544a3913da5d9e5dae0bb (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Aminopeptidases realizam a clivagem de resíduos de aminoácidos de peptídios e proteínas. Elas estão presentes em todos os organismos e desempenham importantes papéis em processamento de alimentos, maturação de proteínas pela eliminação do resíduo de metionina Nterminal, patogenicidade e muitos outros processos celulares. Neste trabalho foi realizada a clonagem, expressão, purificação e caracterização de uma prolina iminopeptidase de Xylella fastidiosa(Xf1510) e de uma aminopeptidase de Xanthomonasaxonopodispv. citri (Xac2987). Estes dois genes foram anotados como prováveis prolina iminopeptidases. Ambos foram clonados em vetor de expressão pET15b, expressados em Escherichiacoli, e purificados na fração solúvel em um passo por cromatografia a metal imobilizado (IMAC). Ensaios de atividade enzimática confirmaram que a Xf1510 é uma prolina iminopeptidase, e que a Xac2987 é uma aminopeptidase de amplo espectro e não uma prolina iminopeptidase como foi anotada no banco de dados, sendo capaz de catalisar a remoção de diferentes aminoácidos de substratos sintéticos. Os espectros de dicroísmo circular das enzimas mostram que ambas podem ser incluídas na família das a/ß a/ß hidrolases e que estão enoveladas. A proteína Xf1510 apresenta maior atividade na faixa de pH entre 7,5 e 8,5. A temperatura ótima para hidrólise de prolina foi 45ºC. O pH ótimo para a atividade enzimática da proteína Xac2987 foi encontrado na faixa de pH de 6,5 e 7,5; sendo o pH ótimo 6,6. Neste pH a temperatura ótima para a hidrólise de alanina foi encontrada à 40ºC. Estudos estruturais com relação ao pH e estabilidade térmica das proteínas foram acompanhados por dicroísmo circular. Estudos de desnaturação térmica e química indicam que as proteínas Xf1510 e Xac2987 apresentam estados intermediários antes de atingirem o desenovelamento máximo / Abstract: Aminopeptidases release the Nterminal amino acid residue from polypeptides and proteins. They are present in all organisms and play several important roles in food processing, maturation of proteins by elimination of the Nterminal methionine, pathogenicity and many other cellular processes. We report here, the cloning, expression, purification and characterization of a proline iminopeptidase from X.fastidiosa(Xf1510) and a broad specificity aminopeptidase from X.axonopodispv. citri(Xac2987). These two genes have been annotated as putative proline iminopeptidase. Both genes were cloned into the pET15b expression vector, expressed in Escherichia coli, and purified to apparent homogeneity in one step by IMAC. The protein was expressed in the soluble fraction and could be purified in one step by IMAC. Enzymatic assays confirmed Xf1510 as a PIP, and Xac2987 as a broad spectrum aminopeptidase, being able to catalyze the removal of different synthetic substrates. The circular dichroism spectrum allowed us to classify the proteins as part of the a/ß hydrolyses family. Structural studies with pH dependence and thermal stability were preformatted by circular dichroism. The Xf1510 protein presents greater activity in the range of pH between 7,5 and 8,5. The optimum temperature for prolina hydrolysis was 45ºC. The pH optimum for the enzymatic activity of the Xac2987 protein was found in the range of pH of 6,5 and 7,5; being pH optimum 6,6. In this pH the temperature for alanine hydrolysis was found to 40ºC. Structural studies with regard to pH and thermal stability of proteins had been followed by circular dichroism. Studies of thermal and chemical denaturation indicate that the proteins Xf1510 and Xac2987 present intermediate states before reaching the maximum unfolding / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

[EN] Disease problems are frequently observed in citrus orchards in Panama, but in most cases their aetiology is unknown. Between 2010 and 2013 a total of 85 plots cultivated with different citrus species of citrus were surveyed in the main production areas in Panamá. Greasy spot, caused by the fungus Zasmidium citri-griseum, was identified as the most prevalent citrus disease in the country. Other fungal pathogens causing foliar and fruit diseases were also identified by the first time in Panamá: melanose caused by Diaporthe citri, postbloom fruit drop and anthracnose caused by Colletotrichum acutatum, and scab caused by Elsinoë fawcettii. A collection of 42 isolates of Mycosphaerellaceae from different citrus-growing regions in Spain, Morocco, Ghana and Panama were characterized. Strain were identified based on morphological characteristics, growth at different temperatures, ITS sequencing and pathogenicity on citrus plants. The species Amycosphaerella africana was associated with greasy spot of citrus in Spain and Morocco and Z. citri-griseum was identified as the causal agent of greasy spot in Panama, being also associated with the disease in Ghana. The study greasy spot epidemiology in Panama showed that the greatest defoliation of trees orange 'Valencia' affected by the disease occurred in the dry season between December and April. In the study of inoculum dynamics in the leaf litter, the days until complete decomposition of the leaves was related in the model with the accumulated rainfall per week (mm), days with precipitation >1 mm per week (nº) and average relative humidity per week (%). Ascospores released from the leaf litter were related with days until complete decomposition of leaves, days with precipitation >1 mm per week (nº), weekly cumulative rainfall (mm) and average temperature (ºC). Furthermore, the experiment of airborne inoculum showed that the highest levels of Z. citri-griseum inoculum were recorded during April and May, coinciding with the onset of the rainy season. Likewise, the highest values of greasy spot incidence in trap plants were recorded during the months of higher inoculum availability. Disease control experiments confirmed the efficacy of the fungicide fenbuconazole to reduce the severity of greasy spot in grapefruit and sweet orange in Panama. However, harvested yield was not significantly affected by the application of fungicide sprays. / [ES] En las plantaciones de cítricos en Panamá se observan con frecuencia problemas de enfermedades, sin embargo en la mayoría de los casos se desconoce su etiología. Por tal motivo, durante los años 2010 a 2013 se prospectaron un total de 85 parcelas de diversas especies de cítricos en las principales zonas productoras del país. Se diagnosticó a la mancha grasienta, causada por Zasmidium citri-griseum, como la enfermedad más prevalente en los cítricos de Panamá. Se identificaron por primera vez en Panamá también otros patógenos fúngicos causantes de enfermedades foliares y de frutos como Diaporthe citri agente causal de la melanosis, Elsinoë fawcettii agente causal de la roña de los cítricos, Colletotrichum acutatum agente causal de la caída prematura de frutos y antracnosis. Se caracterizó una colección de 42 aislados de Mycosphaerellaceae procedentes de diferentes regiones productoras de cítricos en España, Marruecos, Ghana y Panamá. Los aislados se identificaron a nivel de especie a partir de sus características morfológicas, culturales (fisiológicas), moleculares (región ITS) y patogénicas. Se identificó la especie Amycosphaerella africana asociada a la mancha grasienta de los cítricos en España y Marruecos y Z. citri-griseum como agente causal de la mancha grasienta en Panamá, estando asociada también a la enfermedad en Ghana. En el estudio epidemiológico de la mancha grasienta en Panamá, mostró que la mayor defoliación de los árboles de naranja 'Valencia' afectados por la enfermedad ocurrió en la época seca entre los meses de diciembre a abril. En el estudio de dinámica de la producción de inóculo en la hojarasca, el modelo resultante para los días hasta la descomposición total de las hojas relaciono a las variables climáticas precipitación pluvial acumulada por semana (mm), días con precipitación pluvial >1 mm por semana (nº) y humedad relativa promedio por semana (%). En relación a las ascosporas liberadas a partir de la hojarasca el modelo resultante relaciono a las variables climáticas días hasta la descomposición total de las hojas, días con precipitación pluvial >1 mm por semana (nº), precipitación pluvial acumulada por semana (mm) y la temperatura promedio (ºC). Por otro lado, el experimento de seguimiento del inóculo en el aire, mostró que la mayor disponibilidad de inóculo de Z. citri-griseum ocurre durante los meses de abril y mayo cuando se inicia la estación de lluvias. De igual manera, la mayor incidencia de la mancha grasienta en las plantas trampa coincidió con los meses de mayor disponiblidad de inóculo. No obstante, se registraron infecciones también durante otras épocas del año. En los ensayos de control se confirmó la eficacia del fungicida fenbuconazol, que redujo significativamente la severidad de la mancha grasienta en pomelo y naranja en Panamá. Sin embargo, no se detectó un efecto significativo de los tratamientos sobre el peso de la cosecha de frutos. / [CAT] En les plantacions de cítrics en Panamà s'observen ben sovint problemes de malalties, no obstant això en la majoria dels casos es desconeix la seua etiologia. Per tal motiu, durant els anys 2010 al 2013 es visitaren un total de 85 parcel¿les de diverses espècies de cítrics en les principals zones productores del país. Es diagnosticà la taca greixosa, causada per Zasmidium citri-griseum, com la malaltia més àmpliament distribuïda en els cítrics de Panamà. Es van identificar per primera vegada en Panamà també altres patògens fúngics causants de malalties foliars i de fruits com Diaporthe citri agent causal de la melanosi, Elsinoë fawcettii agent causal de la ronya dels cítrics, Colletotrichum acutatum agent causal de la caiguda prematura de fruits i antracnosi. Es va caracteritzar una col¿lecció de 42 aïllats de Mycosphaerellaceae procedents de diferents regions productores de cítrics a Espanya, El Marroc, Ghana i Panamà. Els aïllats es van identificar a nivell d'espècie a partir de les seues característiques morfològiques, culturals (temperatures), moleculars (regió ITS) i patogèniques. Es va identificar l'espècie Amycosphaerella africana associada al la taca greixosa dels cítrics a Espanya i El Marroc i Z. citri-griseum com a agent causal de la taca greixosa en Panamà, estant associada també a la malaltia a Ghana. En l'estudi epidemiològic de la taca greixosa en Panamà, va mostrar que la major defoliació dels arbres de taronja 'València' afectats per la malaltia va ocórrer en l'època seca entre els mesos de desembre a abril. En el estudi de la dinàmica de la producció d'inòcul en la fullaraca, el model resultant per als dies fins a la descomposició total del les fulles es relacionà amb les variables climàtiques precipitació pluvial acumulada per setmana (mm), dies amb precipitació pluvial >1 mm per setmana (nº) i humitat relativa mitjana per setmana (%). En relació a les ascospores alliberades a partir de la fullaraca, el model resultant relacionà les variables climàtiques dies fins a la descomposició total de les fulles, dies amb precipitació pluvial >1 mm per setmana (nº), precipitació pluvial acumulada per setmana (mm) i la temperatura mitjana (ºC). D'altra banda, l'experiment de seguiment de l'inòcul en el aire, va mostrar que la major disponibilitat d'inòcul de Z. citri-griseum ocorregué durant els mesos d'abril i maig quan s'inicia l'estació de pluges. De la mateixa manera, la major incidència de la taca greixosa en les plantes trampa va coincidir amb els mesos de major disponibilitat d'inòcul. No obstant això, se van registrar infeccions també durant altres èpoques de l'any. En els assajos de control es va confirmar l'eficàcia del fungicida fenbuconazol, que va reduir significativament la severitat de la taca greixosa en pomelo i taronja en Panamà. No obstant això, no es va detectar un efecte significatiu dels tractaments sobre el pes de la collita de fruits. / Aguilera Cogley, VA. (2016). ENFERMEDADES FÚNGICAS DE LOS CÍTRICOS EN PANAMÁ. ESTUDIO PARTICULAR DE LA MANCHA GRASIENTA CAUSADA POR Mycosphaerellaceae [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61447 / TESIS

Upland cotton (Gossypium hirsutum) is an important crop in Mississippi. Economic losses are incurred every year due to the feeding and treatment of crop pests and plant pathogens. Because it is often unclear what differentiates a pest from a pathogen, I will use the umbrella term “biotic stressor” or BST when referring to a plant pest or pathogen. BSTs employ a special set of proteins known as ‘effectors’ that function at the site of BST physical attack. Effectors dictate how the host-BST relationship will unfold. Effectors include the proteins produced by the BST that are recognized by the plant and invoke the subsequent plant immune responses to the BST. Moreover, some effectors are responsible for the successful modification of the host tissues for the survival of the pest. In this study I utilized Illumina sequencing and computational biology approaches to identify effectors within three evolutionarily diverse cotton BSTs; specifically, Lygus lineolaris (tarnished plant bug), Xanthomonas citri pv. malvacearum (Xcm) (bacterial cotton blight), and Rotylenchulus reniformis (reniform nematode). Transcripts from the Lygus lineolaris salivary gland were found to encode putative degradative proteins used for the extra-oral digestion of host tissues by the insect. Production, assembly, and comparison of a whole genome assembly of the first Xcm genome obtained from a strain isolated in the cotton producing region of the United States revealed that the cotton Xcm is similar to other reported Xcm assemblies and contains most of the proteins found in these other strains. Genome and life-stage specific transcriptome sequencing of the nematode Rotylenchulus reniformis resulted in the identification of 41,570 transcripts of which 3,033 were up-regulated in the parasitic sedentary female life-stage. These studies collectively provide insight into the mechanisms by which key cotton BSTs invade and damage cotton. Further study of the BST effectors and the plant biomolecules with which they interact should facilitate development of highly targeted mechanisms of minimizing/eliminating BST damage. Such customized BST management will increase profits for farmers and maximize resource utilization in an environmentally responsible manner.