Buscou-se produzir híbridos somáticos entre laranjas doces (Citrus sinensis) com tangerinas, mexericas (C. reticulata, C. reshni, C. sunki, C. deliciosa), tangores (C reticulata x C. sinensis) ou tangelo ‘Orlando’ (C. reticulata x C. paradisi), além da avaliação da resistência do híbrido somático laranja ‘Hamlin’ (C. sinensis) + mexerica ‘Montenegina’ (C. deliciosa) a Xanthomonas axonopodis cv. citri e Xylella fastidiosa. Foram utilizados como fonte de protoplastos calos embriogênicos e folhas coletadas de plântulas germinadas in vitro e de plantas cultivadas em casa-de-vegetação. Após o isolamento, protoplastos provenientes de calos e/ou suspensões embriogênicas foram fundidos quimicamente por polietilenoglicol (PEG) com protoplastos não embriogênicos oriundos de mesofilo foliar. Os calos provenientes da fusão foram induzidos a formação de embriões somáticos para posterior germinação e regeneração de plantas. As plantas regeneradas foram individualizadas, enraizadas ou microenxertadas e aclimatizadas em casa-de-vegetação. A confirmação da hibridação somática foi feita por análise morfológica, análise do DNA com marcadores moleculares do tipo RAPD, determinação da ploidia com a contagem do número de cromossomos e/ou citometria de fluxo. Foram obtidos dois híbridos somáticos do genitor embriogênico laranja ‘Hamlin’ com os genitores não embriogênicos mexerica ‘Montenegrina’ e tangerina ‘Dancy’. Ambos híbridos somáticos obtidos podem apresentar características complementares dos genitores, podendo ser utilizados diretamente como copa e em programas de melhoramento de copa de citros. O híbrido somático laranja ‘Hamlin’ com mexerica ‘Montenegrina’ foi avaliado mostrando resistência a Xanthomonas axonopodis cv. citri e a Xylella fastidiosa. / This research aimed to produce new somatic hybrid combinations between sweet orange (Citrus sinensis) with mandarins (C. reticulata, C. reshni, C. Sunki, C. deliciosa), tangors (C reticulata x C. sinensis) or ‘Orlando’ tangelo (C. reticulata x C. paradisi), and also evaluate the somatic hybrid ‘Hamlin’ sweet orange (Citrus sinensis) + ‘Montenegrina’ mandarin (Citrus deliciosa) for resistance to Xanthomonas axonopodis pv. citri and Xylella fastidiosa. Protoplast sources included embryogenic calli or suspension-culture derived calli, and leaves collected from plants cultivated in vitro or in screenhouses. After protoplast isolation, embryogenic protoplasts were chemically fused by polyethylene glycol (PEG) with mesophyll-derived non-embriogenic protoplasts. Fusion-derived calli were further cultured to embryo induction, germination, and plant regeneration. Regenerated plants were individually rooted or micrografted, and further acclimated in screenhouse. Somatic hybridization was confirmed by analysis of leaf morphology, molecular analysis by RAPD markers, ploidy determination by chromosome counting or flow cytometry. The producion of the somatic hybrids ‘Hamlin’ sweet orange + ‘Montenegrina’ mandarin and ‘Hamlin’ sweet orange + ‘Dancy’ mandarin was confirmed. These hybrids may have complementary traits from both progenitor and be used directly as scion cultivars or as parental lines in scion improvement programs. ‘Hamlin’ sweet orange + ‘Montenegrina’ mandarin somatic hybrid was resistant to Xanthomonas axonopodis pv. citri and Xylella fastidiosa.

Xylella fastidiosa (Xf) é o agente causal de doenças em várias culturas economicamente importantes. Recentemente foi identificada como sendo o agente causal da clorose variegada dos citros (CVC), doença que representa um grande problema para os citricultores paulistas, pois vem causando perdas econômicas significativas. Trata-se de uma bactéria gram-negativa, fastidiosa e restrita ao xilema das plantas hospedeiras. Um fato observado na interação Xf - citros, é que plantas infectadas por Xf podem demonstrar sintomas da doença um longo tempo após a infecção. Isto faz supor que a expressão de fatores de patogenicidade e/ou virulência ocorre somente após a população de Xf na planta atingir altas densidades celulares. Como fatores de patogenicidade/virulência de algumas bactérias são regulados por sensores de quorum, seria interessante determinar se esse mecanismo de regulação gênica ocorre em Xf, e quais genes bacterianos são regulados por densidade celular. O objetivo deste trabalho foi verificar se genes de patogenicidade putativos de Xf são modulados pela densidade celular em meio de cultura. Para tal, Xf foi cultivada em PW líquido, células no início da fase exponencial (baixa densidade celular) e na fase estacionária (alta densidade celular) foram coletadas, e RNA total foi extraído. Fragmentos de 20 genes de Xf relacionados à patogenicidade putativos foram transferidos em arranjos ordenados para membranas de náilon, e hibridizados, sob condições de alta estringência, com sondas complexas de primeiras fitas de cDNA marcadas com fosfatase alcalina. A detecção foi feita por quimioluminescência. Sob as condições experimentais utilizadas, os genes fur (XF-2344), gumC (XF-2369), protease-serina (XF-1851) e rsmA (XF-0125) tiveram sua expressão significativamente suprimida sob condições de alta densidade celular (p < 0,05). Já a expressão de rpfF (XF-1115) foi induzida significativamente (p < 0,06) sob condições de alta densidade celular. Os genes gumD (XF-2367), gumJ (XF-2362) e rpfA (XF-0290) tiveram a expressão detectada somente sob condições de alta densidade celular, enquanto a expressão de rpfB (XF-0287) foi detectada somente sob condições de baixa densidade celular. A expressão de celulase (XF0818), mdoH (XF-1623), pluxR (XF-0972), protease-RE (XF-1823), rpoN (XF-1408), xpsK (XF-1523) e xpsL (XF-1524) não foi afetada significativamente pela densidade populacional em meio PW, enquanto a expressão dos genes luxR/UHPA (XF-2608), poligalacturonase (XF-2466), rpfC (XF-1114) e rsmB (XF-0928) não foi detectada em ambas as condições. Usando RT-PCR, os transcritos de todos os genes, exceto gumC, foram detectados sob condições de baixa e alta densidade celular, indicando que a expressão de alguns genes relacionados à patogenicidade putativos em meio de cultura é muito baixa. Os resultados obtidos sugerem que os EPS são sintetizados por Xf predominantemente em condições de alta densidade celular em meio PW. Adicionalmente, os dados sugerem que Xf sintetiza uma molécula sinal similar à de Xcc em meio PW sob condições de alta densidade celular, e que a disponibilidade de ferro pode ser importante para a regulação gênica em condições de alta densidade celular. É possível que o padrão de expressão gênica observado possa ser alterado em função do meio de cultivo ou in planta. / Xylella fastidiosa (Xf) is the causal agent of several economically important plant diseases. Recently, Xf has been identified as the causal agent of citrus variegated chlorosis (CVC), a disease that represents a major economic problem for citrus growers in the São Paulo State. Xf is a gram-negative, fastidious and xylem-limited bacterium. Based on the fact that plants may show disease symptoms a long time after infection in Xf-citrus interaction, we hypothesize that the expression of pathogenicity/virulence factors in Xf occurs after the bacterial population reach high cell densities. Since pathogenicity/virulence factors of some bacteria are quorum-sensing regulated, it would be interesting to determine whether this mechanism of genetic regulation occurs in Xf, and which genes are regulated by cell-density. In order to determine whether Xf putative pathogenesis-related genes are modulated by cell-density in culture media, Xf was grown in liquid PW and cells were sampled at early log (low cell density) and stationary phase (high cell density) and total RNA was extracted. Fragmentos of 20 putative pathogenicity-related genes from Xf were hybridized on ordered arrays nylon membranes to alkaline phosphatase-labeled first strand cDNA from low and high celldensity conditions as probes, at high stringency conditions. Detection was performed using chemiluminescence. Our results indicate that the following putative pathogenicity-related genes are significantly suppressed (p < 0.05) at high cell-density conditions: fur (XF-2344), gumC (XF-2369), serine-protease (XF-1851) and rsmA (XF-0125). The expression of rpfF (XF-1115) was significantly induced (p < 0.06) at high cell-density conditions. Expression of gumD (XF-2367), gumJ (XF-2362) and rpfA (XF-0290) was detected only at high cell-density conditions, whereas expression of rpfB (XF-0287) was detected only at low cell-density conditions. The expression of cellulase (XF0818), mdoH (XF-1623), pluxR (XF-0972), protease-RE (XF-1823), rpoN (XF-1408), xpsK (XF-1523) and xpsL (XF-1524) was not affected by the Xf population density in PW medium, whereas expression of luxR/UHPA (XF-2608), polygalacturonase (XF-2466), rpfC (XF-1114) and rsmB (XF-0928) was not detected under our experimental conditions. Using RT-PCR, transcripts for all genes, except gumC, were detected under low or high cell densities, indicating that the expression of some putative pathogenesis-related genes in culture medium is very low. Our results suggest that EPS may be synthesized by Xf mainly at high cell density conditions in PW medium. Additionally, our data suggest that Xf may synthesize a signal molecule similar to the Xcc in PW medium at high cell density conditions, and that iron availability may be important for gene regulation at high cell density conditions. It is possible that gene expression patterns observed under our experimental conditions may be altered with the culture medium used or when Xf grows in planta.

Clorose Variegada dos Citros (CVC), causada pela bactéria Xylella fastidiosa Wells et al., tem causado grandes perdas na citricultura do estado de São Paulo, afetando cerca de 40% das plantas de laranja doce. A bactéria é transmitida por 12 espécies de cigarrinhas sugadoras de xilema (Hemiptera: Cicadellidae) da subfamília Cicadellinae. O manejo da CVC é baseado no plantio de mudas sadias, poda ou eliminação de árvores infectadas no campo, assim como o controle químico dos vetores. No entanto, as cigarrinhas vetoras possuem hábitats e hospedeiros alternativos que servem como refúgio, particularmente na vegetação adjacente aos pomares cítricos. Esta característica ecológica explica a rápida reinfestação dos pomares de laranja pelas cigarrinhas após a aplicação de inseticidas. O uso de plantas hospedeiras atrativas às cigarrinhas em uma estratégia de plantio-isca poderia reduzir a imigração de vetores da vegetação adjacente. O objetivo deste trabalho foi selecionar plantas hospedeiras adequadas para serem usadas neste tipo de estratégia, assim como testar a eficácia do plantio-isca em reduzir a população de cigarrinhas em um pomar de laranja. Experimentos de livre escolha foram conduzidos sob condições de casa-de-vegetação para avaliar a preferência de dois importantes vetores, Bucephalogonia xanthophis (Berg.) e Oncometopia facialis (Signoret) por plantas hospedeiras alternativas em relação à Citrus sinensis (L.) Osbeck (laranja doce). As espécies vegetais preferidas por B. xanthophis foram Baccharis dracunculifolia DC., Duranta repens L., Eupatorium maximiliani Shrad., E. laevigatum Lam. e Vernonia condensata Baker, enquanto que O. facialis apresentou preferência por D. repens e Lantana camara L. Um segundo estudo em casa-de-vegetação foi conduzido para avaliar o efeito da fertilização com níveis variados de nitrogênio sobre a preferência de B. xanthophis por uma das plantas hospedeiras selecionadas, V. condensata. Maiores porcentagens de adultos de B. xanthophis selecionaram plantas que haviam sido tratadas com doses mais elevadas de nitrogênio, até um limiar máximo. Em condições de campo (Fazenda Oxford, Gavião Peixoto, SP), 14 espécies de hospedeiros alternativos de cigarrinhas, incluindo plantas preferidas nos testes de livre escolha, foram avaliadas com respeito ao desenvolvimento vegetativo e incidência natural de cigarrinhas. Essas espécies foram plantadas em cinco linhas de 50 m (com espaçamento de 1 m entre linhas e 1 m entre plantas) entre um pomar de laranja doce e uma área de brejo (fonte de vetores) de maneira a formar um plantio-isca. Para avaliar o efeito do plantio-isca na migração de cigarrinhas de cigarrinhas da área de brejo, a população de vetores foi monitorada por armadilhas adesivas amarelas no interior de dois subtalhões no mesmo pomar de laranja, um separado do brejo pelo plantio-isca e outro sem esta barreira. Este monitoramento foi conduzido por vários meses antes e depois que o plantio-isca foi tratado com inseticidas sistêmicos. A população de vetores foi significantemente reduzida no subtalhão adjacente ao plantio-isca, após as plantas hospedeiras serem tratadas com inseticidas. Durante o período de amostragem antes do tratamento com inseticidas, observou-se uma queda na população de cigarrinhas da borda para o interior do subtalhão vizinho ao plantio-isca. Aloysia virgata (Ruiz & Pav.) Juss., Croton urucurana Baill., L. camara, e V. condensata foram consideradas as espécies mais adequadas para uso em plantio-isca porque são plantas atrativas às cigarrinhas e possuem rápido desenvolvimento e emissão de brotos após plantio ou poda. / Citrus variegated chlorosis (CVC), caused by Xylella fastidiosa Wells et al. has caused great losses in the citriculture of São Paulo State, affecting over 40% of the citrus plants. The bacterium is transmitted by 12 species of xylem-feeding leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae) in the subfamily Cicadellinae, commonly known as sharpshooters. CVC management is based on planting of healthy nursery trees, pruning or roguing of infected trees in the field as well as vector control. However, the sharpshooter vectors have alternative hosts and habitats that serve as refuge, particularly woody vegetation adjacent to the citrus groves. This ecological characteristic explains the rapid reinfestation of citrus groves by vectors after insecticide applications. The use of attractive alternative hosts plants of sharpshooters in a dead-end trap cropping strategy could reduce immigration of vectors from adjacent vegetation. The goal of this research was to select adequate host plants to be used in such strategy, as well as to test the efficacy of trap cropping for reducing sharpshooter populations in a citrus grove. Choice experiments were carried out under greenhouse conditions to evaluate the preference of two important vectors, Bucephalogonia xanthophis (Berg.) and Oncometopia facialis (Signoret), for alternative host plants in relation to Citrus sinensis (L.) Osbeck (sweet orange). Preferred plant species by B. xanthophis were Baccharis dracunculifolia DC., Duranta repens L., Eupatorium maximiliani Shrad., E. laevigatum Lam. and Vernonia condensata Baker, whereas O. facialis showed strong preference for D. repens e Lantana camara L. A second greenhouse study was conducted to evaluate the effect of fertilization with variable nitrogen levels on the preference of B. xanthophis for one of the selected host plants, V. condensata. Higher percentages of B. xanthophis adults selected plants that had been treated with higher doses of nitrogen, up to a threshold. Under field conditions (Fazenda Oxford, Gavião Peixoto, SP), 14 alternative hosts of the sharpshooters, including preferred host plants in the choice experiments, were evaluated with respect to vegetative growth and natural incidence of sharpshooters. These species were planted in five rows of 50 m (spaced 1 m in a row and 1 m between plants) between a sweet orange grove and a swamp (source of vectors), in order to form a trap crop. In order to assess the effect of the trap crop against immigration of sharpshooters from the swamp area, vector population was monitored by yellow sticky cards inside two adjacent plots in the same citrus grove, one separated from the swamp by the trap crop and the other without this barrier. Populations in the two citrus plots were monitored for several months before and after the trap crop was treated with a insecticide. Vector population was significantly reduced in the citrus plot adjacent the trap crop, after the alternative host plants were treated with insecticide. During the period of sampling before the insecticide treatments, a pattern of lower vector populations in rows of citrus trees closer to the trap crop was observed. Aloysia virgata (Ruiz & Pav.) Juss., Croton urucurana Baill., L. camara, and V. condensata were considered the most adequate species for trap cropping because of their attractiveness to the sharpshooters and rapid flushing and growth after planting or pruning.

O trabalho teve por objetivo avaliar a capacidade de infecção e multiplicação de estirpes de Xylella fastidiosa de citros [Citrus sinensis (L.) Osbeck] e de cafeeiro (Coffea arabica L.) em inoculações cruzadas, para investigar a possibilidade de disseminação deste patógeno de pomares cítricos infectados para cafezais ou vice versa. As inoculações foram realizadas mecanicamente com um isolado (CCT6570) de X. fastidiosa proveniente de árvore cítrica com clorose variegada dos citros (CVC) e um isolado (CCT6756) de planta de café com sintomas de atrofia dos ramos do cafeeiro (ARC). Quatro concentrações de células de cada isolado, variando de 10 3 a 10 9 unidades formadoras de colônias (UFC) por mL, foram inoculadas por agulha em citros e cafeeiro, para determinação de curvas de titulação e doses efetivas para infecção em cada combinação estirpe/hospedeiro. As plantas foram avaliadas por “polymerase chain reaction” (PCR) e isolamento em meio de cultura quanto à infecção por X. fastidiosa e população bacteriana, após 0,5; 2; 4 e 8 meses da inoculação. A estirpe de cafeeiro (ARC) de X. fastidiosa não colonizou citros nas concentrações de inóculo testadas. A inoculação da estirpe de citros (CVC) em cafeeiro resultou em baixas taxas de infecção, exigindo uma concentração de inóculo cerca de 10 vezes mais alta do que a necessária para a mesma taxa de infecção (25%) em citros. A dose efetiva para infecção de 25% das plantas (DE25) foi de 0,29 x 10 6 e 0,35 x 10 7 UFC/mL para as combinações (estirpe/hospedeiro) ARC/cafeeiro e CVC/citros, respectivamente. Já para a combinação heteróloga CVC/cafeeiro, a DE25 foi de 0,85 x 10 8 UFC/mL, evidenciando a dificuldade de colonização de plantas de café pela estirpe de citros. A população bacteriana da estirpe de citros foi mais elevada em citros que em cafeeiro em todas as épocas de avaliação, embora a diferença tenha sido significativa apenas aos 2 meses após a inoculação. Um teste preliminar demonstrou que o método de isolamento primário envolvendo maceração de pecíolo foliar de cafeeiro infectado não inibe o crescimento de X. fastidiosa em meio de cultura, propiciando assim, uma estimativa confiável da população de células cultiváveis da bactéria em cafeeiro. Em caráter complementar, realizou-se um estudo de comparação morfológica de seis isolados de X. fastidiosa de citros com CVC e de seis isolados de cafeeiro com ARC, provenientes de diferentes localidades dos Estados de São Paulo e Minas Gerais. Não houve relação entre período de incubação ou diâmetro médio das colônias e o hospedeiro de origem dos isolados. Entretanto, as colônias dos isolados de cafeeiro apresentaram coloração opalescente e margens lisas, enquanto que as de citros mostraram-se mais convexas e escuras, com o centro áspero e margens onduladas, apresentando numerosos filamentos semelhantes a exopolissacarídeos. / The goal of this research was to evaluate infection efficiency and multiplication of citrus [Citrus sinensis (L.) Osbeck] and coffee (Coffea arabica L.) strains of Xylella fastidiosa after cross inoculations, in order to assess the potential for spread of this pathogen from infected citrus groves to coffee plantations and vice versa. Mechanical inoculations were carried out with a X. fastidiosa isolate (CCT6570) from a citrus tree showing citrus variegated chlorosis (CVC) and an isolate (CCT6756) from a coffee tree with coffee stem atrophy (CSA). Four cell concentrations of each isolate, ranging between 10 3 a 10 9 colony forming units (CFU) per mL, were needle-inoculated in citrus and coffee plants, in order to determine titration curves and effective doses for infection in each strain/host combination. The rate of infected plants and the viable bacterial population were determined by polymerase chain reaction (PCR) and primary isolation in culture at 0.5, 2, 4 and 8 months after inoculation. The coffee (CSA) strain of X. fastidiosa did not colonize citrus in any of the inoculum concentrations tested. Cross inoculation of the citrus (CVC) strain in coffee resulted in low rates of infection and required an inoculum concentration 10 times higher than that necessary to obtain a similar (25%) rate of infection in citrus. The effective dose for 25% infection (ED25) was 0,29 x 10 6 and 0,35 x 10 7 CFU/mL for the homologous strain/host combinations, CSA/coffee and CVC/citrus, respectively. For the heterologous CVC/coffee combination, ED25 was higher (0,85 x 10 8 CFU/mL), showing the difficulty of colonizatin of coffee plants by the citrus strain. Bacterial population of the citrus strain was higher in citrus than in coffee plants at all evaluation dates, although statistical differences were found only at 2 months after inoculation. A preliminary test showed that the primary isolation method used, which includes maceration of infected coffee leaf petioles, does not inhibit bacterial grow in culture, thus allowing reliable estimates of X. fastidiosa populations in coffee. Another study was carried out to compare colony morphology of six isolates of X. fastidiosa from citrus with CVC and six isolates from coffee with CSA, obtained from different localities in the States of São Paulo and Minas Gerais. There was no relationship between incubation period or average colony diameter and the original host of the isolates. However, colonies of the coffee isolates showed opalescent colour and flat margins, whereas the colonies of all citrus isolates were darker and more convex, with rugous center and ondulated margins presenting numerous filaments.

Buscou-se produzir híbridos somáticos entre laranjas doces (Citrus sinensis) com tangerinas, mexericas (C. reticulata, C. reshni, C. sunki, C. deliciosa), tangores (C reticulata x C. sinensis) ou tangelo ‘Orlando’ (C. reticulata x C. paradisi), além da avaliação da resistência do híbrido somático laranja ‘Hamlin’ (C. sinensis) + mexerica ‘Montenegina’ (C. deliciosa) a Xanthomonas axonopodis cv. citri e Xylella fastidiosa. Foram utilizados como fonte de protoplastos calos embriogênicos e folhas coletadas de plântulas germinadas in vitro e de plantas cultivadas em casa-de-vegetação. Após o isolamento, protoplastos provenientes de calos e/ou suspensões embriogênicas foram fundidos quimicamente por polietilenoglicol (PEG) com protoplastos não embriogênicos oriundos de mesofilo foliar. Os calos provenientes da fusão foram induzidos a formação de embriões somáticos para posterior germinação e regeneração de plantas. As plantas regeneradas foram individualizadas, enraizadas ou microenxertadas e aclimatizadas em casa-de-vegetação. A confirmação da hibridação somática foi feita por análise morfológica, análise do DNA com marcadores moleculares do tipo RAPD, determinação da ploidia com a contagem do número de cromossomos e/ou citometria de fluxo. Foram obtidos dois híbridos somáticos do genitor embriogênico laranja ‘Hamlin’ com os genitores não embriogênicos mexerica ‘Montenegrina’ e tangerina ‘Dancy’. Ambos híbridos somáticos obtidos podem apresentar características complementares dos genitores, podendo ser utilizados diretamente como copa e em programas de melhoramento de copa de citros. O híbrido somático laranja ‘Hamlin’ com mexerica ‘Montenegrina’ foi avaliado mostrando resistência a Xanthomonas axonopodis cv. citri e a Xylella fastidiosa. / This research aimed to produce new somatic hybrid combinations between sweet orange (Citrus sinensis) with mandarins (C. reticulata, C. reshni, C. Sunki, C. deliciosa), tangors (C reticulata x C. sinensis) or ‘Orlando’ tangelo (C. reticulata x C. paradisi), and also evaluate the somatic hybrid ‘Hamlin’ sweet orange (Citrus sinensis) + ‘Montenegrina’ mandarin (Citrus deliciosa) for resistance to Xanthomonas axonopodis pv. citri and Xylella fastidiosa. Protoplast sources included embryogenic calli or suspension-culture derived calli, and leaves collected from plants cultivated in vitro or in screenhouses. After protoplast isolation, embryogenic protoplasts were chemically fused by polyethylene glycol (PEG) with mesophyll-derived non-embriogenic protoplasts. Fusion-derived calli were further cultured to embryo induction, germination, and plant regeneration. Regenerated plants were individually rooted or micrografted, and further acclimated in screenhouse. Somatic hybridization was confirmed by analysis of leaf morphology, molecular analysis by RAPD markers, ploidy determination by chromosome counting or flow cytometry. The producion of the somatic hybrids ‘Hamlin’ sweet orange + ‘Montenegrina’ mandarin and ‘Hamlin’ sweet orange + ‘Dancy’ mandarin was confirmed. These hybrids may have complementary traits from both progenitor and be used directly as scion cultivars or as parental lines in scion improvement programs. ‘Hamlin’ sweet orange + ‘Montenegrina’ mandarin somatic hybrid was resistant to Xanthomonas axonopodis pv. citri and Xylella fastidiosa.

O presente trabalho objetivou estudar tanto o progresso da Clorose Variegada dos Citros no tempo, quanto o arranjo espacial das plantas afetadas, visando caracterizar a dinâmica da doença em três regiões do Estado de São Paulo (Noroeste, Centro e Sul). Por meio de avaliação de sintomas visuais, foram mapeados, bimensalmente, três talhões de laranja-doce Pêra enxertada em limão Cravo, em três regiões do Estado de São Paulo, desde julho de 1998 até dezembro de 2000. O progresso no tempo foi avaliado por meio de ajuste a modelos matemáticos e análise das curvas de derivada. As curvas de progresso da CVC não puderam ser ajustadas a modelos conhecidos. O progresso da CVC apresentou diversos picos de derivada, em sua maioria coincidindo com a primavera e o verão. Para o estudo da dinâmica espacial, foram aplicadas as seguintes análises: seqüências ordinárias; áreas isópatas; lei de Taylor modificada; índice de dispersão e análise de dinâmica e estrutura de focos. Essas análises demonstraram pouca diferença no padrão espacial da doença entre as regiões, que pode ser considerado levemente agregado. Por meio de análise de autocorrelação, de densidade espectral, análise discriminante, e correlação de lags, procurou-se também estabelecer padrões na evolução de emissão de brotações pelas plantas, expressão de sintomas e detecção de infecções assintomáticas e a correlação dessas variáveis entre si e com o clima. Também foi feita a comparação entre estações do ano e regiões por meio de testes não-paramétricos. Número de novas brotações foi a variável que mais distinguiu entre as três regiões. As variáveis relacionadas à doença (infecções assintomáticas, infecções totais, sintomas e concentração bacteriana) apresentaram padrões sazonais, mas não foi observada diferença estatística entre as estações do ano. O pomar da região Noroeste apresentou maior quantidade de brotações novas e maior quantidade de sintomas. O pomar da região Sul apresentou maior quantidade de infecção assintomática. Não houve diferença de concentração bacteriana entre os pomares das três regiões. / This work aimed to evaluate the progress and spatial pattern of Citrus Variegated Chlorosis (CVC) in three regions in the state of São Paulo, Brazil. By bimonthly visual assessments three Pêra sweet orange/ Rangpur lime orchards in three regions (Northwest, Center and South) were mapped from july 1998 to december 2000. Progress was evaluated by fitting nine models do disease progress curves and by analysis of derivative curves. No model could be fitted to disease progress curves. Derivative curves showed peaks concentrated in spring and summer. To characterize spatial pattern the following analysis were used: ordinary runs, isopath areas;binary Taylor law; dispersion index and foci dynamics and structure analysis. All techniques showed small differences between regions and characterized CVC spatial pattern as slightly aggregated. By means of autocorrelation, spectral density analysis, discriminant analysis and lag correlation was tried to establish temporal patterns for vegatative flush emission, symptom expression, detection of assymptomatic infections. Also, was tried to establish correlations among variables and between them and weather variebles. A comparison by non-parametric tests was made between seasons and regions. Number of new vegetative flushes was the most distinctive variables for regions. The disease related variables (assymptomatic infections, total infection, symptoms and relative bacteria concentration) showed seasonal patterns but no statistical difference was found between seasons. Northwest orchard showed higher number of vegetative flushes. South orchard assymptomatic infections were higher than for the other orchards. There was no difference in relative bacteria concentration between regions.

Orientador: Alessandra Alves de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T17:43:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caserta_Raquel_D.pdf: 28122729 bytes, checksum: f611b63be786134a0c9fbad9785006b0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A produção do suco de laranja concentrado é uma das commodities mais importantes para o agronegócio brasileiro, entretanto, os constantes problemas fitossanitários que afetam a citricultura vem aumentando os custos de produção e consequentemente a rentabilidade econômica deste setor. É urgente a busca por alternativas para solucionar os problemas fitossanitários da citricultura, nesse sentido, a utilização de transgenia mostra-se uma ferramenta promissora, pois possibilita a obtenção de plantas com genes exógenos que conferem resistência a doenças. Uma das doenças que afetam a citricultura brasileira é a clorose variegada dos citros (CVC), causada pela bactéria Xylella fastidiosa, onde todas as variedades de Citrus sinensis mostram-se suscetíveis a doença. Uma estratégia que vem sendo utilizada para resistência a X. fastidiosa que afeta a cultura de uva na Califórnia-EUA envolve a chamada "confusão do patógeno" onde utiliza-se genes do próprio patógeno visando a alteração da sinalização molecular entre as células bacterianas, interferindo em sua patogenicidade. Neste trabalho foram abordadas as transformações de Nicotiana tabacum e Citrus sinensis com o gene rpfF de X. fastidiosa causadora da CVC, envolvido na síntese de uma molécula sinalizadora que regula a expressão de genes associados a patogenicidade dessa bactéria. Eventos dos cultivares de laranja doce Hamlin e Pineapple transformados com rpfF foram desafiados com X. fastidiosa e, após avaliações nas fases inicial e avançada de sintomas, foi observada uma redução na incidência e na severidade de sintomas de CVC. A movimentação bacteriana ao longo de tais plantas também foi comprometida, sendo que a população bacteriana em pontos distantes do ponto de inoculação foi maior em plantas do tipo selvagem quando comparadas as transgênicas. Esses resultados sugerem que as moléculas produzidas pelas plantas transgênicas foram capazes de alterar o comportamento da bactéria, reduzindo sua patogenicidade. Outro fitopatógeno que ataca pomares brasileiros é Xanthomonas citri subsp. citri, que também apresenta o gene rpfF, e assim como em X. fastidiosa, é responsável pela sinalização molecular. Eventos transgênicos de Carrizo e Pineapple também foram desafiados com X. citri. Nesse patógeno, a interrupção da sinalização mediada por DSF, Diffusible Signal Factor - uma molécula de ácido graxo, reduz sua virulência, e interessantemente, sintomas de cancro cítrico foram reduzidos nas plantas transgênicas. Em folhas transgênicas não foi observado o aparecimento de pústulas, e biofilmes formados na área da inoculação foram alterados. Genes modulados por DSF em bactérias isoladas de plantas transgênicas foram reprimidos, sugerindo que a sinalização foi comprometida. Por fim, seiva das plantas transgênicas não ativou a expressão do promotor engA::GFP em Xanthomonas campestris biosensoras, indicando que a molécula produzida por essas plantas foi capaz de alterar a sinalização. Por outro lado, a seiva das plantas transgênicas ativou a expressão do hxfA::PhoA em X. fastidiosa biosensoras, indicando a funcionalidade dessa molécula para esse fitopatógeno. Portanto, em ensaios com X. citri, o DSF das plantas transgênicas atuou como antagonista, diminuindo a virulência da bactéria através da alteração da sinalização molecular. Esses resultados mostram que as moléculas sinalizadoras produzidas por plantas transformadas com rpfF de X. fastidiosa são promissoras na tentativa de controle de CVC e cancro cítrico / Abstract: The production of concentrate orange juice is one of the most important commodities for Brazilian agribusiness, however, the constant phytosanitary problems affecting the citrus industry is increasing production costs and consequently the economic profitability of this sector. It is urgent to search for alternatives to solve citrus phytosanitary problems, in this sense, the use of transgenesis shows a promising tool because it enables the production of plants with exogenous genes that confer resistance to diseases. One of the diseases that affect Brazilian citrus industry is the citrus variegated chlorosis (CVC), caused by the bacterium Xylella fastidiosa, where all varieties of Citrus sinensis are susceptible to this disease. One strategy that has been used for X. fastidiosa resistance that affects grape cultures in California-USA involves the so-called "pathogen confusion" that is related to the usage of genes of the pathogen itself aiming to change the molecular signaling between bacterial cells by interfering in its pathogenicity. In this work we will discuss the transformation of Nicotiana tabacum and Citrus sinensis with the rpfF gene isolated from X. fastidiosa causing the CVC, involved in the synthesis of a signaling molecule that regulates the expression of genes associated with pathogenicity of these bacteria. Transgenic events of Hamlin and Pineapple transformed with rpfF were inoculated with X. fastidiosa and after evaluations in early and advanced stages of symptoms, a reduction was observed in the incidence and severity of symptoms of CVC. Bacterial movement along these plants was also impaired, and the bacterial population analyzed far from the point of inoculation was higher in wild type plants compared to transgenic ones. These results suggest that the molecules produced by the transgenic plants were able to change the behavior of the bacteria, reducing its pathogenicity. Another pathogen that attacks Brazilian orchards is Xanthomonas citri subsp. citri, which also features rpfF gene, and as in X. fastidiosa is responsible for molecular signaling. Transformed plants of Carrizo and Pineapple were also challenged with X. citri. In this pathogen, the interruption of DSF-mediated signaling reduces its virulence, and interestingly, citrus canker symptoms were reduced in transgenic plants. In transgenic leaves there was no pustules development and alterations in biofilms formed in the area of inoculation were observed. Genes modulated by DSF in bacteria isolated from transgenic plants were repressed, suggesting that signaling was compromised. Finally, sap of transgenic plants did not activate the expression of the promoter engA::GFP in Xanthomonas campestris biosensors, indicating that the molecule produced by these plants was able to change the signaling. On the other hand, the sap of transgenic plants activated the expression of hxfA::PhoA in X. fastidiosa biosensors, indicating the functionality of this molecule for this pathogen. Therefore, in assays with X. citri, the DSF of transgenic plants acted as antagonist, decreasing the virulence of the bacteria by changing the molecular signaling. These results show that the signaling molecules produced by plants transformed with rpfF of X. fastidiosa are promising in the attempt to control CVC and citrus canker / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Xylella fastidiosa é o agente causal de uma série de doenças que ocorrem em plantas economicamente importantes como laranjeiras, videiras e cafeeiros, causando no Estado de São Paulo prejuízos relevantes à indústria citrícola. Esta bactéria Gram-negativa é restrita ao xilema das plantas e à porção anterior do trato digestório dos insetos vetores das famílias Cicadellidae e Cercopidae, conhecidos como cigarrinhas. Tentativas de elucidar os mecanismos de virulência e patogenicidade adotados por esta bactéria apontam a formação do biofilme como etapa fundamental para o estabelecimento da infecção e o consequente desenvolvimento da doença na planta, mas fatores adicionais parecem contribuir, tais como a produção de toxinas. As bacteriocinas são proteínas com atividade antibiótica contra cepas próximas à espécie produtora e que já foram associadas à virulência e patogenicidade de outras bactérias. Uma varredura in silico no genoma de X. fastidiosa 9a5c revelou 13 sequências codificadoras de microcinas putativas no cromossomo. Transcritos de todos esses genes foram detectados por RT-qPCR em culturas de X. fastidiosa 9a5c, e análises comparativas com genomas públicos (cepas Temecula1, Dixon, Ann-1, M23, M12, EB92-1 e GB514) e recém sequenciados por nosso grupo de pesquisa (cepas U24d, J1a12, 3124, Hib4, Pr8x e Fb7) revelaram que cada cepa possui seu próprio arsenal de bacteriocinas. Diferenças encontradas in silico entre os loci de bacteriocinas nas cepas foram demonstradas experimentalmente. Nossos resultados comprovam a variabilidade predita nos quatro clusters de bacteriocinas que identificamos, o que é esperado para genes relacionados à adaptação e patogenicidade. Destes loci, três foram detectados por RT-PCR como transcritos policistrônicos. Nossa tentativa de detectar essas proteínas em culturas de X. fastidiosa (através de sequenciamento de polipeptídeos por HPLC-MS/MS) foi capaz de identificar uma das bacteriocinas putativas e, portanto, o conjunto de nossas observações apóia a continuidade dos estudos para elucidar o papel das bacteriocinas na fisiopatologia de X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the causal agent of diseases that affect several economically important crops such as sweet orange trees, grapevines and coffee trees, causing in the State of São Paulo considerable losses mainly to the citrus industry. This Gram-negative bacterium is restricted to the plant xylem and to the upper gastrointestinal tract of its insect vectors, the sharpshooters from the Cicadellidae and Cercopidae families. Attempts to elucidate the virulence and pathogenicity pathways employed by this bacterium point the biofilm formation as a fundamental step for the establishment of the infection and the consequent development of the plant disease, but additional factors seem to contribute to these processes, such as the production of toxins. Bacteriocins are proteinaceous antibiotics that act against closely-related species and have been previously associated with virulence and pathogenicity in other bacteria. An in silico screening of the X. fastidiosa 9a5c genome revealed 13 coding sequences as putative microcins in the chromosome. Transcripts from all those genes were detected through RT-qPCR in X. fastidiosa 9a5c cultures, and comparative analyses on the public genomes (Temecula1, Dixon, Ann-1, M23, M12, EB92-1 and GB514) plus the ones recently sequenced by our group (U24d, J1a12, 3124, Hib4, Pr8x and Fb7) revealed that each strain possesses its own arsenal of bacteriocins. Differences found in silico among the loci in all strains were experimentally confirmed. Our results demonstrated the predicted variability in the four bacteriocins clusters as expected for adaptation and pathogenicity-related genes. Three out of the four bacteriocins loci were detected by RT-PCR as polycistronic transcripts. Our attempt to detect these proteins in X. fastidiosa cultures (using HPLC-MS/MS polypeptide sequencing) identified one of the putative bacteriocins, and therefore our observations warrant further efforts to elucidate the role of bacteriocins in the X. fastidiosa physiopathology.

O fitopatógeno Xylella fastidiosa coloniza o lúmen dos vasos do xilema de seus hospedeiros e o aparelho bucal do inseto-vetor. É responsável por doenças de extrema gravidade em videira, laranjeira, e oliveira, entre outras plantas de relevância econômica. Há evidência de especificidade entre cepas de X. fastidiosa e as diferentes espécies de plantas que colonizam, mas as bases moleculares desta interação são desconhecidas. O objetivo central deste trabalho foi elucidar o repertório completo de genes expressos e/ou diferencialmente expressos por diferentes cepas X. fastidiosa em meios e tempos de cultivo distintos e relacionar as respostas transcricionais a mecanismos de virulência, patogenicidade e especificidade ao hospedeiro. Foram sequenciados, analisados e comparados os transcritomas de cepas de laranjeiras (9a5c, J1a12, U24d e Fb7), de cafeeiro (3124), de hibisco (Hib4), ameixeira (Pr8x) e de videira (Temecula1), no início e fim da fase a exponencial de crescimento populacional em meio rico PWG e em meio mínimo PIM6, que mimetiza a seiva do xilema. Foi observado que a maioria dos genes de X. fastidiosa é expressa, ainda que, dependendo da cepa e da condição experimental, 40-80% dos transcritos sejam pouco abundantes. Por outro lado, foi verificado um conjunto de transcritos muito abundantes, uma parte deles comuns a todas as cepas, e que incluem os ncRNAs 6S e RNAse P, além de transcritos de microcinas, proteases, lipases, proteínas de resposta a estresse e proteínas de função desconhecida. Além da definição de perfis transcricionais, foram descritas as regiões 5\' e 3\' não-traduzidas dos transcritos. As estruturas de 545 e 386 operons expressos, respectivamente pelas cepas 9a5c e Temecula1, também foram mapeadas, e pela primeira vez foi obtido o perfil de sRNAs expressos por X. fastidiosa. As análises de expressão diferencial entre transcritomas das duas fases de crescimento no mesmo meio indicam que o estresse gerado pela limitação nutricional do meio PIM6 exigiu mudanças mais drásticas na expressão gênica do que no meio PWG. Foi também observado que diferentes cepas respondem de maneiras distintas a uma mesma condição, indicando que genes ortólogos são regulados de formas diferentes. Além disso, a transcritômica comparativa revelou diferenças relevantes na regulação gênica de cepas de hospedeiros vegetais distintos que podem estar relacionadas à especificidade ao hospedeiro. Por fim, as análises dos transcritomas evidenciaram vários genes candidatos que poderão ser futuramente investigados quanto ao seu papel na biologia e na virulência de X. fastidiosa. / The phytopathogenXylella fastidiosa colonizes the lumen of xylem vessels from its hosts and the mouth apparatus of the insect-vector. It is responsible for severe diseases in grapevine, orange and olive trees, among other plants of economic relevance. There is evidence for specificity between X. fastidiosa strains and the different plant species they colonize, but the molecular bases of this interaction are unknown. The main objective of this work was elucidate the complete repertoire of expressed and/or differentially expressed genes by different X. fastidiosa strains in distinct media and growth times and associate transcriptional responses to virulence mechanisms, pathogenicity and host specificity. Transcriptomes of orange strains (9a5c, J1a12, U24d and Fb7), coffee (3124), hibiscus (Hib4), plum (Pr8x) and grapevine (Temecula1), were sequenced, analyzed and compared from cells at the beginning and end stages of exponential growth phase in rich medium PWG and in minimum medium PIM6, which mimics xylem sap. It was observed that the majority of X. fastidiosa genes is expressed, although, depending of the strain and experimental condition, 40-80% of transcripts are less abundant. On the other hand, it was verified a set of more abundant transcripts, some of them shared by all strains, including 6S and RNAse P ncRNAs as well as transcripts for microcins, proteases, lipases, stress response proteins and proteins of unknown function. Besides the definition of transcriptional profiles, 5\' and 3\' untranslated regions of transcripts were described. The structure of 545 and 386 expressed operons, respectively for 9a5c and Temecula1 strains, were also mapped, and for the first time the expressed profile of sRNAs in X. fastidiosa was obtained. The differential expression analyzes between transcriptomes of two growth phases in the same medium indicate that the stress generated by nutritional limitation of PIM6 medium required more drastic changes in gene expression than PWG medium. It was also observed that different strains respond in distinct manners to a same condition, indicating that orthologous genes are regulated in different ways. Moreover, comparative transcriptomics revealed relevant differences in gene regulation of strain of distinct plant hosts that can be related to host specificity. Lastly, transcriptomic analyzes pointed to several gene candidates that could be further investigated for their roles in X. fastidiosa biology and virulence.

Com o objetivo de compreender os mecanismos que regulam a interação citros-Xf procurou-se identificar e caracterizar proteínas com acúmulo diferencial no apoplasto de folhas de Citrus sinensis var. Pêra infectadas com Xf, apresentando ou não sintomas de CVC, através de eletroforese bidimensional em géis de poliacrilamida desnaturante e espectrometria de massa (MALDI-ToF). O fluído intercelular (FI) foi extraído de folhas de laranjeira cultivadas em campos experimentais. A presença ou ausência do patógeno foi confirmada por amplificação, através de PCR, de fragmentos específicos de DNA da bactéria a partir de DNA total extraído do pecíolo da folha. Para avaliar a complexidade dos proteomas, e a sua variabilidade entre plantas de diferentes localidades, as proteínas foram separadas por eletroforese em géis de poliacrilamida desnaturantes. Os resultados indicam que o proteoma do FI de plantas de localidades diferentes são distintos, independente da presença de Xf e ou sintomas de CVC, e também independe do local onde as amostras foram coletadas. Para a identificação de proteínas com acúmulo diferencial no FI, quantidades iguais de proteínas do FI de folhas dos diferentes tratamentos foram separadas por eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida desnaturante. Proteínas foram com acúmulo diferencial selecionadas para o seqüenciamento da extremidade N-terminal. As proteínas mais abundantes e com aúmulo diferencial nas condições experimentais possuem massa molecular aparente de 41 kDa e pI variando de 4,1 a 5,5. Algumas proteínas de FI de folhas infectadas sem sintomas de CVC, massa molecular de 41kDa , pI 4,2 a 5 apresentaram aumento no acúmulo de proteínas variando de 89 a 129% relação aos FI de folhas de laranjeiras não-infectadas. Suas seqüências Nterminal, e os espectros de massa de seus peptídeos, após digestão com tripsina, são praticamente idênticos, indicando que elas são isoformas da mesma família de proteinas. As seqüências N-terminal dessas proteínas ou dos peptídeos gerados por clivagem com tripsina não apresentam homologia com proteínas/genes nos bancos de dados públicos, sugerindo que essas proteínas são específicas do apoplasto de folhas de laranjeiras e podem ter papel importante na regulação da interação citros-Xf. / In order to understand the mechanisms regulating the Xylella fastidiosacitrus (Citrus sinensis var. Pêra) interaction, proteins with differential accumulation in the apoplast of Xf-infected citrus leaves with or without disease symptoms as compared to non-infected leaves, were identified and characterized using 2D-PAGE and mass spectrometry (MALDI-ToF). The intercellular fluid (IF) was extracted by infiltration and centrifugation from field grown leaves segments. The presence of Xf in the leaves was determined by PCR-amplification of specific DNA fragments. SDS-PAGE was performed in a discontinuous system using equal amounts of IF proteins from non-infected and infected leaves with or without CVC symptoms collected from field grow plants at diferrent locations. Protein profiles were compared using discriminant analyses, based on the relative abundance of each protein. The results indicated that the IF proteome of plants from different localities are distinct, independent of the presence of Xf and/or CVC symptoms. Also, independent of the local where the samples were collected, the IF proteome of non-infected leaves and symptomatic infected leaves were distinct. Using 2D-PAGE it was possible to identify proteins with differential accumulation in the IF of symptomatic and asymptomatic Xf infected citrus leaves, as compared to noninfected controls. The must abundant proteins in the IF showing differential accumulation have apparent molecular mass of 41kDa and pI 4,2-5. The accumulation in the IF asymptomatic Xf infected citrus leaves were 89-129% higher than non-infected controls. Their N-terminal position and the mass spectra of their peptides, after trypsin digestion, are mostly identical, indicating that the are isoforms of the same proteins familiy. N-terminal sequences of the proteins and their internal peptides showed no homology to known genes/proteins in public database, suggesting that these proteins are apoplastic citros specifid proteins, and that they may have a important roles in regulating citrus-Xf interactions.