Orientador: Henrique Ferreira / Coorientador: José Belasque Júnior / Banca: Franklin Behlau / Banca: Luís Octávio Regasini / Resumo: O cancro cítrico asiático, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), é uma das doenças mais importantes dos Citrus e de ocorrência mundial. Esta doença constitui um grande risco para a citricultura brasileira uma vez que os sintomas podem diminuir o valor de mercado das frutas, e, por vezes, até impedir a sua comercialização. Neste trabalho determinamos a influência da temperatura no crescimento e fisiologia de Xac, com especial atenção à temperatura da morte bacteriana e sua influência sobre a competência infecciosa da bactéria. Descobrimos que a taxa de crescimento de Xac é de forma geral influenciada por altas temperaturas. Notamos uma diminuição do crescimento quando bactérias foram submetidas a temperaturas superiores àquela considerada ótima para cultivo controlado (30 ºC). Bactérias expostas a temperaturas de até 37 ºC foram perfeitamente competentes para infectar o hospedeiro citros, além de recobrarem perfil de crescimento padrão quando retornadas a temperatura de 30 ºC. Tratamentos com temperaturas superiores a 40 ºC promovem alterações fisiológicas irreversíveis e acima de 42 ºC não foi possível resgatar células capazes de induzir sintomas de cancro cítrico, sendo, pois, designadas temperatura de morte. Temperaturas diferentes de 30 ºC promoveram aumento de tamanho celular, sugestivo de perturbação de processos essenciais de replicação/segregação cromossômica e/ou divisão celular. Para investigar a influência do tratamento térmico em tais processos, submetemos linhagens de Xac com marcação para centrômero e septo bacterianos a tratamentos com diferentes temperaturas, seguindo-se avaliação por microscopia de fluorescência. Tratamento... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Asiatic citrus canker, caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), is one of the most important Citrus diseases and occurs worldwide. This disease poses a major risk to the Brazilian citrus industry since the symptoms may decrease the market value of the fruit, and restrict its commercialization. In this work we have determined the influence of temperature on growth and physiology of Xac, with special attention to the temperature of bacterial death and its influence on the bacterial infectious competence. We have found that the growth rate of Xac was generally affected by high temperatures. We have noticed a decrease of bacterial growth when exposed to temperatures higher than that considered optimal for controlled cultivation (30 ºC). Bacteria exposed to temperatures up to 37 ºC were fully competent to infect the citrus host, and regain ability to grow when temperature was returned to 30 ºC. Treatments at temperatures above 40 ºC promote irreversible physiological chances. Above 42 ºC it has not been possible to recover viable cells that could produce symptoms of citrus canker, and therefore, it was designated death temperature. Temperatures different from 30 ºC caused an increase in cell size, suggesting disturbance on essential biological processes, as chromosomal replication/segregation and/or cell division. To investigate the influence of heat treatment in such processes, we have submitted mutant Xac strains, marked for bacterial centromere and septum, to treatments at different temperatures, followed by fluorescence microscopy analysis. Treatment at 37 ° C for 6 hours did not affect... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-28Bitstream added on 2014-06-13T20:56:16Z : No. of bitstreams: 1 jaciani_fj_me_jabo.pdf: 302453 bytes, checksum: 1fb27cbd11729232d8b900ef7c2e8c3c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A caracterização da estrutura genética de populações clonais de patógenos bacterianos tem sido feita, entre outros métodos, por “Southern blot” empregando-se como sondas seqüências de inserção ou genes avr. O presente trabalho objetivou o desenvolvimento de oligonucleotídeos iniciadores e sondas de DNA baseadas em genes de patogenicidade para estudo da diversidade genética de isolados de Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii e Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis. Observou-se a presença dos genes avrXacE1, avrXacE2 e lrp em todos isolados das subsp. citri e aurantifolii e a ausência do gene avrXacE2 no isolado da subsp. citrumelonis. Os perfis de restrição gerados por PCR-RFLP não revelaram polimorfismo nos genes amplificados e o uso de genes avr como sondas para “Southern blot” mostrou-se efetiva na diferenciação das espécies de Xanthomonas patogênicas a citros e na identificação de relativo polimorfismo entre isolados da mesma espécie. A diversidade haplotípica foi maior com o gene avrXacE1. Com exceção à sonda correspondente ao gene lrp, o número de haplótipos identificados (17) variou de acordo com a endonuclease utilizada em “Southern blot”. Os isolados da subsp. citri apresentaram um maior número de cópias dos genes avr em comparação com isolados das subsp. aurantifolii e citrumelonis. O estado de São Paulo, que adota uma campanha de erradicação do cancro cítrico, apresentou a menor diversidade haplotípica, provavelmente em decorrência do curto período em que o patógeno interage com o hospedeiro. / The genetic structure of clonal populations of bacterial pathogens has been characterized, among other methods, by Southern blot using insertion sequences or avr genes as probes. The present work aimed the development of DNA primers and probes based on pathogenicity genes to study the genetic diversity of Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, and Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis strains. The presence of avrXacE1, avrXacE2 and leucine rich protein (lrp) genes was observed in all citri and aurantifolii strains, as well as the absence of the avrXacE2 gene in citrumelonis isolate. The restriction profiles generated by PCR-RFLP did not show polymorphism in the amplified genes and the use of avr genes as Southern blot probes showed to be effective to differentiate Xanthomonas species pathogenic to citrus and to identify a relative polymorphism between strains belonging to the same species. The haplotype diversity was higher with the avrXacE1 gene. Excepting the probe corresponding to lrp gene, the number of haplotypes identified (17) varied according to the endonuclease used on Southern blot. The strains of the citri species presented a higher number of copies of the avr genes compared to aurantifolii and citrumelonis. The state of São Paulo, that adopts a campaign of eradication of the citrus canker, presented the smaller haplotype diversity, probably as result of the short period where the pathogen interacts with the host.

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: José Belasque Júnior / Banca: Rui Pereira Leite / Banca: Nelson Arno Wulff / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Jackson Antônio Marcondes de Souza / Resumo: Um dos objetivos do presente estudo foi avaliar a diversidade genética de isolados brasileiros de X. citri subsp. citri (Xcc) com base em genes efetores do Sistema de Secreção Tipo III (avrXacE1, avrXacE2, avrXacE3, avrBs2, hpaF, XAC3090 e pthA4). Um total de 49 haplótipos foi identificado entre os 157 isolados analisados por "Southern blot", e o maior polimorfismo genético observado nas análises com a sonda PthA4. Esses efetores estão amplamente distribuídos na população do patógeno e podem ser úteis para uma melhor compreensão da interação patógeno-hospedeiro. Outro objetivo desse trabalho foi a caracterização patogênica e genética de isolados de X. fuscans subsp. aurantifolii tipos B e C (Xfa-B e Xfa-C). Observou-se pequena agressividade dos isolados de Xfa-B e grande variação na patogenicidade de Xfa-C. Os isolados de Xfa-C produtores de pigmento escuro em meio de cultura foram menos agressivos que os isolados não produtores. Alguns isolados de Xfa-C foram patogênicos também a limões, limas ácidas, citrumelo 'Swingle' e tangerinas. Os isolados de Xfa-B e Xfa-C foram diferenciados pelas técnicas de AFLP, BOX e ERIC-PCR, com relativa diversidade entre isolados do mesmo patótipo, e análises da sequência do gene gyrB revelaram alta similaridade desses isolados com espécies de Xanthomonas patogênicas a outros hospedeiros (X. fuscans subsp. fuscans e X. axonopodis pvs. anacardii, dieffenbachiae, rhynchosiae, sesbaniae e vignicola). No presente estudo também foi descrito o primeiro relato de X. alfalfae (Xa) no Brasil. Os isolados investigados demonstraram limitada patogenicidade e agruparam-se geneticamente com X. alfalfae subsps. alfalfae e citrumelonis e X. axonopodis pvs. allii, cassiae, desmodii, patelii e ricini / Abstract: In the present study, as one of the objectives, is showed the genetic diversity of Brazilian strains of X. citri subsp. citri (Xcc) based on effector genes of the Type III Secretion System (avrXacE1, avrXacE2, avrXacE3, avrBs2, hpaF, XAC3090 e pthA4). A total of 49 haplotypes were identified from 157 Xcc strains by Southern blot analysis using the cited genes as DNA probes. The highest polymorphism was observed with the PthA4. Those bacterium genes are extensively present in the Xcc population and can be used to a better comprehension of the Xcc-plant interaction. As a second objective, we present the genetic and pathogenic characterization of X. fuscans subsp. aurantifolii types B and C strains (Xfa-B e Xfa-C). In the pathogenic testes carried out Xfa-B presented a very limited pathogenicity, weaker than Xfa-C. Strains of this last pathotype presented a relatively high degree of pathogenicity variation, and those Xfa-C strains producers of dark pigment on culture medium were less pathogen than those not producers. Also some Xfa-C strains are pathogens to limes, lemons, Swingle citrumelo, and mandarins. Strains of Xfa-B and C were clearly differentiated by the molecular techniques AFLP, BOX and ERIC-PCR. Sequences of the gyrB gene revealed a high similarity of Xfa strains and other pathovars of Xanthomonas not pathogens of citrus. Finally, we presented the first detection of X. alfalfa (Xa) in Brazil, detected on a single Swingle citrumelo tree in São Paulo state. The Brazilian Xa strains showed a very limited pathogenicty, similar of a X. alfalfa subsp. citrumelonis / Doutor

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Julio Cezar Franco de Oliveira / Banca: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Shaker Chuck Farah / Banca: Celso Eduardo Benedetti / Resumo: O presente trabalho teve como principal objetivo realizar estudos funcionais na bactéria Xac, estudando o possível envolvimento dos genes copA, copB e cutC no mecanismo de resistência a cobre nesta bactéria. Estes estudos funcionais envolveram: análise da expressão dos genes durante o crescimento na presença de cobre por Northern e Western blots e por eletroforese bi-dimensional, produção e purificação das proteínas recombinantes e produção de anticorpos, inativação de um dos genes (copA) para avaliar a participação da proteína CopA no mecanismo de resistência a cobre e análise da interação das proteínas de resistência a cobre com outras proteínas de Xac através do ensaio de duplo híbrido de leveduras. Os resultados obtidos mostraram que a linhagem mutante infecta a planta, mas os sintomas são mais retardados na presença do metal, quando comparada à linhagem selvagem. O crescimento das células mutantes na ausência e presença de cobre in planta indicou maior sensibilidade ao cobre pelas células mutantes. Na tentativa de verificar se as proteínas CopA, CopB e CutC interagem com outras proteínas de Xac, um ensaio de duplo híbrido de leveduras foi realizado. Através deste ensaio, algumas proteínas foram identificadas, as quais necessitam de estudos de caracterização adicionais. / Abstract: Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causal agent of the citrus canker, a serious disease that affects the most commercial citrus cultivars causing serious economic impacts. Symptoms include canker lesions, leading to abscission of fruit and leaves and general tree decline. By sequencing the genome of this bacterium (ONSA Network, FAPESP, Brazil), a better knowledge of this microorganism and its molecular interactions with the host might be elucidated. For this, we analyzed the gene expression during growth in the presence of copper by Northern and Western blots, 2D-electrophoresis, production and purification of the CopA, CopB, and CutC recombinant proteins, inactivation of the copA gene to evaluate the participation of CopA protein in the copper resistance mechanism, and protein-protein interactions assays by the yeast two-hybrid assay. Results showed that the mutant strain infects the plant, but the lesions formation was retarded in the presence of copper. The mutant strain showed more sensitivity to copper than the wild type strain during growth in planta. In order to verify whether the CopA, CopB, and CutC proteins interact with other proteins of Xac, a yeast two-hybrid assay was performed. By this assay, some proteins were identified, which need further characterizations. / Doutor

Orientador: Antonio Carlos Maringoni / Banca: Renate Krause Sakate / Banca: Julio Rodrigues Neto / Resumo: O presente trabalho teve por objetivo avaliar a produção e a sensibilidade de 48 isolados de Xanthomonas axonopodis pv. citri e de 14 isolados de Xanthomonas spp. à bacteriocinas. Estudos foram realizados para verificar o efeito da temperatura, tempo de incubação e do tipo do meio de cultura sobre a produção de bacteriocina por isolados de X. axonopodis pv. citri. Todos isolados de X. axonopodis pv. citri não foram sensíveis às bacteriocinas produzidas por eles, não sendo essas afetadas pelo meio BDA, nutriente ágar + NaCl e YPDA, nos diferentes tempos e temperaturas de incubação. Porém, isolados de X. axonopodis pv. passiflorae foram sensíveis às bacteriocinas produzidas por 25 isolados de avaliados e o isolado de X. campestri pv. campestris e o de X. axonopodis pv. manihotis apresentaram sensibilidade variável. Dos 25 isolados de X. axonopodis pv. citri apenas cinco não foram inibidos pelas bacteriocinas produzidas por dois isolados de X. axonopodis pv. passiflorae. As bacteriocinas produzidas pelos isolados de X. axonopodis pv. citri (FDC-806) e de X. axonopodis pv. passiflorae (Mar 2850-A) foram termolábeis e resistentes à lisozima e sensíveis a DNAse. A bacteriocina produzida pelo isolado de X. axonopodis pv. passiflorae foi resistente à ação de proteinase K, tripsina e RNAse enquanto que a produzida pelo isolado de X. axonopodis pv. citri foi sensível a essas enzimas. / Abstract: The objective of this work was to evaluate the production and sensitivity of 48 Xanthomonas axonopodis pv. citri strains and 14 Xanthomonas spp. strains to bacteriocins. A number of studies were carried out to verify the effect of temperature, incubation time, and type of culture medium on bacteriocine yield by X. axonopodis pv. citri strains. None of the X. axonopodis pv. citri strains were sensitive to the bacteriocins produced by themselves, and were not affected by the PDA, nutrient agar + NaCl, and YPDA media, at the different incubation times and temperatures studied. However, X. axonopodis pv. passiflorae and strains were sensitive to the bacteriocins produced by the 25 Xac strains evaluated, while a X. campestri pv. campestris and X. axonopodis pv. manihotis strains showed variable sensitivity. Of the 25 X. axonopodis pv. citri strains, only five were not inhibited by the bacteriocins produced by the two X. axonopodis pv. passiflorae strains. The bacteriocins produced by X. axonopodis pv. citri (FDC-806) and X. axonopodis pv. passiflorae (Mar 2850-A) were thermolabile and resistant to lysozyme and sensitive to DNAse. The bacteriocin produced by the X. axonopodis pv. passiflorae was resistant to the action of proteinase K, trypsin and RNAse, while the bacteriocin produced by the X. axonopodis pv. citri isolate was sensitive to those enzymes. / Mestre

Resumo: A citricultura é uma atividade agro-industrial de suma importância para o Estado de São Paulo e para o Brasil. Com uma área plantada em torno de aproximadamente 1 milhão de hectares o país mantém a posição de maior produtor mundial de citros. Desse total, 77% encontram-se localizados na região Sudeste. O sistema citrícola representa 4,47% das exportações de produtos do agronegócio nacional, sendo que o suco de laranja concentrado representa 72% do valor dessas exportações. Entretanto, todo este potencial econômico vem sendo prejudicado por várias doenças dentre elas uma denominada Cancro Cítrico, a qual é causada por um fitopatógeno bacteriano denominado Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). Com o objetivo de analisar os feitos da interação entre essa bactéria e seu hospedeiro natural, utilizou-se a técnica de Análise da Transcrição Reversa em Tempo Real (qRT-PCR) para quantificar a expressão dos genes que compõem o SSTT, SSTQ, algumas ORFs hipotéticas e as quatro cópias do gene pthA. Para tanto, realizou-se um estudo prévio com 10 genes candidatos visando identificar os mais adequados para serem usados como genes de referência no processo de normalização de dados em experimentos dessa natureza. O experimento contou com quatro replicatas biológicas e duas replicatas técnicas. Com base nos resultados, verificou-se que os genes rpoB e rpoC parecem ser os mais indicados para a normalização de dados em experimentos de expressão gênica por qRT-PCR que envolvam analises intergrupos. A maioria dos genes que compõem o SSTT se mostraram induzidos quando a bactéria esteve em contato com seu hospedeiro, com destaque para os genes hrpXct e hrpB4, o que sugere que este sistema tenha um importante papel na patogenicidade dessa bactéria. Por outro lado, os resultados e o estudo da expressão gênica evidenciaram que... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The citrus is an agro-industrial activity of great importance for the State of São Paulo and Brazil. With a planted area around 1 million hectares the country maintains its position of world's leading producer of citrus. Of these, 77% are located in the Southeast. The citrus system represents 4.47% of national agribusiness exportation, being the orange juice concentrate responsible for 72% of the value of these exports. However, all this economic potential is being hampered by diseases among them one called citrus canker, which is caused by a phytopathogenic bacterium known as Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). With the aim of analyzing the achievements of the interaction between this bacterium and its natural host, we used the technique of Real- Time Reverse Transcription Analysis (qRT-PCR) to quantify the expression of genes that comprise the SSTT, SSTQ, some hypothetical ORFs and the four copies of the gene pthA. Thus, a preliminary study with 10 candidate genes were conducted to identify the most suitable ones for use as reference in the process of data standardization in such experiments. The experiment had four biological replicates and two technical replicates. Based on the results, it was found that the rpoB and rpoC genes seem to be the most suitable for the standardization of data in experiments of gene expression by qRT-PCR analysis involving intergroup. Most of the genes that comprise the SSTT was induced when the bacterium was in contact with its host, with emphasis on the genes... (Complete abstract, click electronic access below) / Orientador: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Leandro Marcio Moreira / Banca: Luiz Roberto Furlan / Mestre

Orientadores: Marcos Antonio Machado, Alexandre Morais do Amaral / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T05:44:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Baptista_JulianaCristina_M.pdf: 1606790 bytes, checksum: 2559d8ff6d67422a6685a6a8d5a31cd6 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), e responsável por consideráveis prejuízos para a produção de laranja, no Brasil e no mundo. A doença e altamente agressiva para a planta de citros, provocando, entre outros, lesões em folhas e frutos, com redução tanto na qualidade de frutos quanto na produtividade. Devido a sua importância, recentemente a bactéria teve seu genoma completamente seqüenciado, onde foram identificados, por homologia de seqüência de proteínas, varias ORFs ("open reading frames") associadas ao processo de infecção. Dentre elas, varias seqüências que teoricamente codificam para proteínas envolvidas na degradação da parede celular vegetal, o que pode ser um indicativo de que a bactéria utiliza mecanismos relacionados a este evento durante o seu processo infeccioso e de adaptação. Entretanto, não ha ate o momento informação experimental a respeito da funcionalidade de seqüências em Xac que permitam a degradação da parede celular. O objetivo principal deste trabalho foi identificar funcionalmente, em Xac, através de ensaios in Vectra e in vitro, genes envolvidos na produção ou transporte de proteínas relacionadas a degradação de celulose e com isso analisar a sua relevância na capacidade infectiva ou adaptativa da bactéria. Para tal, foram produzidos mutantes a partir de inserções aleatórias de transposon e sitio-dirigidas, estabelecendo-se uma coleção de linhagens, cujo fenótipo e genótipo foram avaliados por ensaios biológicos e sequenciamento. Verificou-se que o operon xps do sistema de secreção do tipo II e funcional em Xac e que os genes XAC0028, XAC0029, XAC2374, XAC3516 e XAC4231 participam da degradação de celulose / Abstract: The citrus canker, caused by the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), is responsible for considerable losses for the orange production, in Brazil and abroad. The disease is highly aggressive for citrus plants, resulting, among others, in injuries on leaves and fruits, with a reduction in the quality of fruits as much as in the productivity. Due to its importance, recently the bacterium had its genome completely sequenced and a number of open reading frames (ORFs) where identified by homology with protein sequences and annotated as associated to the infection process. Amongst them, some sequences that theoretically code for proteins involved in the degradation of the plant cell wall, which may indicate that the bacterium uses mechanisms related to this event during the process of adaptation and infection. However, there is no experimental data regarding such sequences to prove their real function during the pathogenesis of Xac. The main objective of this work was to identify functionally, in Xac, through in vitro and in vivo assays, genes involved in the production or transport of proteins related to the degradation of cellulose and, therefore, to analyze its relevance in the capacity of adaptation and infection of the bacterium. During the investigation, a collection of mutant strains of Xac was produced by random and site-directed mutagenesis, which were analyzed through the identification of leaf lesions and their action on degradation of artificial cellulose in plate as well as the growth in leaves. Through tests of mutagenesis and in vitro assays, this study shows that the xps operon that is present in Xac and encodes a type II secretion system machinery is functional and the genes XAC0028, XAC0029, XAC2374, XAC3516 and XAC4231 participate in cellulose degradation. In summary, for the first time it was experimentally demonstrated that Xac is capable in hydrolizing cellulose / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T23:20:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cernadas_RaulAndres_D.pdf: 2626366 bytes, checksum: 35442a2f5cdd8214cd7309ecd63c7954 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A forma mais agressiva de cancro cítrico, cancrose A, é causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), que ataca qualquer variedade ou espécie de citros. Além de Xac, Xanthomonas axonopodis pv aurantifolii (Xaa) causa um tipo mais leve da doença, cancrose C, restrita ao limão Galego (Citrus aurantifolii). Na laranja Pêra (Citrus sinensis), Xaa provoca uma resposta de defesa que impede o desenvolvimento dos sintomas do cancro incluindo a ruptura da epiderme que é fundamental à disseminação da bactéria. Neste trabalho, abordamos a patogenicidade diferencial entre Xac e Xaa na laranja Pêra para estudar a expressão gênica na planta associada ao desenvolvimento dos sintomas (hipertrofia e hiperplasia celular) e à resposta de defesa. O projeto apresenta a identificação e caracterização de genes expressos diferencialmente em resposta à infecção por Xac e Xaa responsáveis pelo cancro cítrico. A partir de três estratégias independentes (Display diferencial de PCR, Hibridação subtrativa suprimida e micro arranjos de DNA) detalhou-se o perfil transcricional de folhas de laranja infiltradas com Xaa, Xac ou água como controle. Mais de 120 genes candidatos foram validados através de PCR quantitativo em tempo real ou hibridação Northern. Os genes diferencialmente expressos a 6 ou 48 hs após da infecção (hai) aparecem agrupados em categorias funcionais como: remodelamento de parede celular, divisão e expansão celular, tráfego de vesículas, resposta de defesa, metabolismo de nitrogênio e carbono e sinalização de hormônios como auxina, giberelina e etileno. Inicialmente, tanto Xaa quanto Xac induzem respostas de defesa associadas com ataque de patógenos incluindo a produção de espécies reativas de oxigênio e lignificação da parede celular. Notavelmente, a mudança no perfil transcricional mostra que Xac suprime as defesas da planta entre 6 e 48 hai, ao mesmo tempo em que induz genes relacionados com o metabolismo da parede celular, divisão celular e trafego de vesículas, entre outros. A conseqüência dessa manipulação transcricional no hospedeiro por parte de Xac dá origem à um estado fisiológico típico de expansão celular (hipertrofia). O inibidor de trafego de vesículas, Brefeldina A, atrasou o desenvolvimento dos sintomas do cancro, indicando que essa atividade está mais relacionada com hipertrofia celular do que com respostas de defesa. No perfil transcricional de folhas infectadas com Xaa destaca-se a ativação de uma via de sinalização por proteína quinase ativada por patógeno, envolvendo também fatores de transcrição do tipo WRKY, assim como elementos de resposta a etileno. Tanto Xac quanto Xaa parecem modular a transcrição de genes relacionados com sinalização e transporte de auxinas e biosíntese de giberelina. O tratamento de folhas de laranja com, ácido naftalenoacético (NAA) e ácido giberélico (GA3) demonstrou que esses hormônios induzem a expressão de genes de remodelamento de parede celular, biosíntese de giberelina e sinalização de auxina. Além disso, o inibidor de biosíntese de giberelina (Chlorocoline Chloride) diminuiu significativamente a expressão de genes induzidos por NAA sugerindo que exista uma regulação cruzada entre auxina e giberelina que controla a expressão de genes relacionados com divisão e expansão celular em citros. Finalmente, duas regiões promotoras de genes que codificam proteínas relacionadas com patogenicidade (PR-1 e PR-5) foram isoladas e caracterizadas. Esses genes são fortemente induzidos por Xaa e Xac em 6 e 48 hai. Substancialmente, existem elementos similares com o "upa box" nas regiões promotoras de PR-1 e PR-5. Mediante experimentos de Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) demonstrou-se que a proteína PthA4 de Xanthomonas é capaz de ligar-se no "upa box" presente nos promotores de PR-1 e PR-5. Tanto o promotor de PR-1 quanto o de PR-5 dirigem a expressão transitória do gene repórter uidA em N. benthamiana mediante Agro infiltração. / Resumo: A forma mais agressiva de cancro cítrico, cancrose A, é causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), que ataca qualquer variedade ou espécie de citros. Além de Xac, Xanthomonas axonopodis pv aurantifolii (Xaa) causa um tipo mais leve da doença, cancrose C, restrita ao limão Galego (Citrus aurantifolii). Na laranja Pêra (Citrus sinensis), Xaa provoca uma resposta de defesa que impede o desenvolvimento dos sintomas do cancro incluindo a ruptura da epiderme que é fundamental à disseminação da bactéria. Neste trabalho, abordamos a patogenicidade diferencial entre Xac e Xaa na laranja Pêra para estudar a expressão gênica na planta associada ao desenvolvimento dos sintomas (hipertrofia e hiperplasia celular) e à resposta de defesa. O projeto apresenta a identificação e caracterização de genes expressos diferencialmente em resposta à infecção por Xac e Xaa responsáveis pelo cancro cítrico. A partir de três estratégias independentes (Display diferencial de PCR, Hibridação subtrativa suprimida e micro arranjos de DNA) detalhou-se o perfil transcricional de folhas de laranja infiltradas com Xaa, Xac ou água como controle. Mais de 120 genes candidatos foram validados através de PCR quantitativo em tempo real ou hibridação Northern. Os genes diferencialmente expressos a 6 ou 48 hs após da infecção (hai) aparecem agrupados em categorias funcionais como: remodelamento de parede celular, divisão e expansão celular, tráfego de vesículas, resposta de defesa, metabolismo de nitrogênio e carbono e sinalização de hormônios como auxina, giberelina e etileno. Inicialmente, tanto Xaa quanto Xac induzem respostas de defesa associadas com ataque de patógenos incluindo a produção de espécies reativas de oxigênio e lignificação da parede celular. Notavelmente, a mudança no perfil transcricional mostra que Xac suprime as defesas da planta entre 6 e 48 hai, ao mesmo tempo em que induz genes relacionados com o metabolismo da parede celular, divisão celular e trafego de vesículas, entre outros. A conseqüência dessa manipulação transcricional no hospedeiro por parte de Xac dá origem à um estado fisiológico típico de^expansão celular (hipertrofia). O inibidor de trafego de vesículas, Brefeldina A, atrasou o desenvolvimento dos sintomas do cancro, indicando que essa atividade está mais relacionada com hipertrofia celular do que com respostas de defesa.No perfil transcricional de folhas infectadas com Xaa destaca-se a ativação de uma via de sinalização por proteína quinase ativada por patógeno, envolvendo também fatores de transcrição do tipo WRKY, assim como elementos de resposta a etileno. Tanto Xac quanto Xaa parecem modular a transcrição de genes relacionados com sinalização e transporte de auxinas e biosíntese de giberelina. O tratamento de folhas de laranja com, ácido naftalenoacético (NAA) e ácido giberélico (GA3) demonstrou que esses hormônios induzem a expressão de genes de remodelamento de parede celular, biosíntese de giberelina e sinalização de auxína. Além disso, o inibidor de biosíntese de giberelina (Chlorocoline Chloridè) diminuiu significativamente a expressão de genes induzidos por NAA sugerindo que exista uma regulação cruzada entre auxina e giberelina que controla a expressão de genes relacionados com divisão e expansão celular em citros. Finalmente, duas regiões promotoras de genes que codificam proteínas relacionadas com patogenicidade (PR-1 e PR-5) foram isoladas e caracterizadas. Esses genes são fortemente induzidos por Xaa e Xac em 6 e 48 hai. Substancialmente, existem elementos similares com o "upa box" nas regiões promotoras de PR-1 e PR-5. Mediante experimentos de Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) demonstrou-se que a proteína PthA4 de Xanthomonas é capaz de ligar-se no "upa box" presente nos promotores de PR-1 e PR-5. Tanto o promotor de PR-1 quanto o de PR-5 dirigem a expressão transitória do gene repórter uidA em N. benthamiana mediante Agro infiltração / Abstract: The most aggressive form of the citrus canker disease is caused by the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), which can infect all commercial varieties or species of citrus. In addition to Xac, Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii (Xaa) causes a weaker form of the disease, known as cancrose C, which is restricted to Mexican Lime (Citrus aurantifolii). In sweet orange (Citrus sinensis), Xaa triggers a defense response that halts the canker-symptoms development including the epidermal rupture, which is essential for bacterial dissemination. In this work, we approached the differential pathogenicity existing between Xac and Xaa in order to survey the host gene expression associated with symptoms development (cellular hypertrophy and hyperplasia) and defense response in sweet orange. The project presents the identification and initial characterization of differentially expressed genes in response to the infection with the citrus canker pathogens, Xac and Xaa. Three independent strategies were conducted in order to have a detailed transcriptional profiling of orange leaves infected with Xaa, Xac or water as mock control (Differential Display PCR, Suppression Subtractive Hybridization and GeneChip Microarrays). More than 120 candidate genes were validated through quantitative real time PCR or Northern blot. The differentially expressed genes at 6 or 48 hours after infection (hai) were grouped into functional categories: cell-wall remodeling, cell division and expansion, vesicle trafficking, carbon and nitrogen metabolism or hormone signaling, auxin, gibberellin and ethylene. Initially, both Xaa and Xac elicit a defense response associated with pathogen attack that includes the production of reactive oxygen species (ROS) and cell-wall lignification. Notably, the changes in the transcriptional profiles show that Xac suppresses the plant defenses between 6 and 48 hai and at the same time it induces genes related to the cell-wall metabolism, cell division and vesicle trafficking among others. The consequence of this host manipulation by Xac originates a physiological state very similar to that of cell expansion (hypertrophy). The vesicle trafficking inhibitor, Brefeldin A, delayed the development of canker symptoms indicating that this activity is more related to the cellular enlargement than to the defense responses. The transcriptional profile of Xaa-infiltrated leaves highlights the activation of amitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway related to pathogen attack with the involvement of other components of defense responses like WRKY-transcriptional factors and ethylene-response elements. Both Xac and Xaa appear to modulate the transcription of genes related to auxin signaling and transport and gibberellin biosynthesis. Treatments of orange leaves with 1- naphthylphthalamic acid (NAA) . / Abstract: The most aggressive form of the citrus canker disease is caused by the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), which can infect all commercial varieties or species of citrus. In addition to Xac,Xanlhomonas axonopodis pv. aurantifolii (Xaa) causes a weaker form of the disease, known as cancrose C, which is restricted to Mexican Lime {Citrus aurantifolii). In sweet orange {Citrus sinensis), Xaa triggers a defense response that halts the canker-symptoms development including the epidermal rupture, which is essential for bacterial dissemination. In this work, we approached the differential pathogenicity existing between Xac and Xaa in order to survey the host gene expression associated with symptoms development (cellular hypertrophy and hyperplasia) and defense response in sweet orange. The project presents the identification and initial characterization of differentially expressed genes in response to the infection with the citrus canker pathogens, Xac and Xaa. Three independent strategies were conducted in order to have a detailed transcriptional profiling of orange leaves infected with Xaa, Xac or water as mock control (Differential Display PCR, Suppression Subtractive Hybridization and GeneChip Microarrays). More than 120 candidate genes were validated through quantitative real time PCR or Northern blot. The differentially expressed genes at 6 or 48 hours after infection (hai) were grouped into functional categories: cell-wall remodeling, cell division and expansion, vesicle trafficking, carbon and nitrogen metabolism or hormone signaling, auxin, gibberellin and ethylene. Initially, both Xaa and Xac elicit a defense response associated with pathogen attack that includes the production of reactive oxygen species (ROS) and cell-wall lignification. T Notably, the changes in the transcriptional profiles show that Xac suppresses the plant defenses between 6 and 48 hai and at the same time it induces genes related to the cell-wall metabolism, cell division and vesicle trafficking among others. The consequence of this host manipulation by Xac originates a physiological state very similar to that of cell expansion (hypertrophy). The vesicle trafficking inhibitor, Brefeldin A, delayed the development of canker symptoms indicating that this activity is more related to the cellular enlargement than to the defense responses. The transcriptional profile of Xaa-infiltrated leaves highlights the activation of a mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway related to pathogen attack with the involvement of other components of defense responses like WRKY-transcriptional factors and ethylene-response elements. Both Xac and Xaa appear to modulate the transcription of genes related to auxin signaling and transport and gibberellin biosynthesis. Treatments of orange leaves with 1-naphthylphihalamic acid (NAA) e Gihherellic Acid (GKi) demonstrated that these hormones induce the expression of genes related to cell-wall remodeling, gibberellin biosynthesis and auxin signaling. Moreover, the gibberellin-biosynthesis inhibitor (Chlorocoline Chloride) decreased significantly the expression of auxin-induced genes suggesting a cross-talk regulation between auxin and gibberellin controlling the expression of citrus genes associated with cell division and expansion. Finally, two promoter regions of the pathogenesis related (PR) genes, PR-I and PR-5.2, were isolated and characterized. These genes are strongly up-regulated by Xaa and Xac at 6 or 48 hai. Substantially, there are "upd" box-like motifs in the promoter regions of both PR-I and PR-5.2. By means of Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) we have demonstrated that PthA4 from Xac is capable of binding the "upd" box-like regions found in PR-1 e PR-5 promoters. Furthermore, both of the isolated promoters (PR-1 and PR-5) address the transient expression of the reporter gene uidA in JV. bethamiana leaves through agro infiltration / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O cancro cítrico (Xanthomonas axonopodis pv. citri) é uma das mais importantes doenças dos citros e seu controle é feito com medidas de exclusão e erradicação do patógeno. As chances de detecção de plantas doentes diminuem em pomares com baixa incidência da doença. Considerando-se as dificuldades da diagnose visual do cancro cítrico e as vantagens de uma tecnologia que possa melhorar o processo de detecção desta doença no campo, procurou-se identificar características espectroscópicas únicas de uma planta com esta doença. Os objetivos do presente trabalho foram verificar as características espectroscópicas de folhas com cancro cítrico e correlacioná-las às alterações na eficiência fotossintética do tecido foliar doente e relacionar severidade da doença à eficiência fotossintética. Os perfis espectroscópicos e a eficiência fotossintética de plantas das espécies Citrus sinensis (?Hamlin?), Citrus reticulata (?Ponkan?) e Citrus limonia (?Cravo?) foram avaliados antes e após a inoculação com Xanthomonas axonopodis pv. citri. O modelo y = (1 - x) ?, onde y representa a assimilação líquida relativa de CO2 e x, a severidade da doença, foi ajustado aos dados por meio de regressão não-linear. O modelo monomolecular foi ajustado à relação entre assimilação líquida relativa de CO2 e razões espectroscópicas da região do vermelho, também por regressão não-linear. Concluiu-se que a doença afeta a eficiência fotossintética de ?Ponkan? e ?Hamlin?. Em ?Hamlin?, a doença não apenas reduz a área foliar, mas também reduz a fotossíntese do tecido verde remanescente. Há relação positiva entre as razões espectroscópicas da região do vermelho e a fotossíntese nas variedades testadas. / Citrus canker (Xanthomonas axonopodis pv. citri) is one of the most important diseases of citrus. Regulatory control is applied by means of exclusion and eradication of the pathogen. Possibilities of detection of infected trees decrease in orchards with low disease incidence. Considering the difficulties in visual diagnosis of citrus canker and the advantages of a technology that can improve the process of its detection in the field, single spectroscopic characteristics of a plant with this disease was searched. The objectives of the present work were to verify the spectroscopic characteristics of leaves with citrus canker and to correlate them to photosynthetic efficiency of these diseased leaves, and to relate disease severity to photosynthetic efficiency. Spectroscopic profiles and photosynthetic efficiency of Citrus sinensis (?Hamlin?), Citrus reticulata (?Ponkan?) and Citrus limonia (?Cravo?) were assessed before and after the inoculation with Xanthomonas axonopodis pv. citri. The model y = (1 - x) ?, in which y represents relative net assimilation of CO2 and x, disease severity, was fitted to the data by nonlinear regression. The monomolecular model was fitted to the relationships between relative net assimilation of CO2 and spectroscopic reasons of the red region, also by nonlinear regression. It was concluded that the disease affects the photosynthetic efficiency of ?Ponkan? and ?Hamlin?. In ?Hamlin?, the disease not only reduces the amount of leaf area, but also reduces the photosynthesis of the remaining green leaf tissue. There is a positive relationship between spectroscopic reasons of the red region and photosynthesis in ?Hamlin?, ?Ponkan?, and ?Cravo?.

A doença cancro cítrico é considerada uma das mais importantes doenças da citricultura devido ao seu poder de proliferação nas fazendas, e aos danos causados às plantas e frutos. Os prejuízos causados pela presença da doença são consideravelmente preocupantes, pois as principais medidas de controle pelos órgãos responsáveis envolvem a erradicação de plantas infectadas e demais plantas vizinhas, inviabilizando economicamente grandes áreas produtivas. A legislação brasileira exige um extenso protocolo de atividades que necessita ser realizado antes da confirmação do diagnóstico. Atrasos na confirmação do diagnóstico favorecem a proliferação da doença. Assim, qualquer esforço em acelerar esta detecção deve com certeza ter um grande impacto nesta área. Esta é a motivação de nosso trabalho, onde aplicamos a técnica de espectroscopia por imagens de fluorescência em folhas de culturas cítricas com a intenção de avaliar a capacidade de diagnóstico desta técnica em plantas assintomáticas contaminadas no laboratório com cancro cítrico. O objetivo é determinar o instante de tempo mínimo necessário entre a infecção e o diagnóstico preciso da doença. Este estudo foi aplicado para experimentos envolvendo amostras destrutivas e não-destrutivas. Os resultados mostram a possibilidade de aplicar tal técnica na detecção de cancro cítrico. / The citrus canker disease is considered one of the most important citrus diseases due to its ability to spread on farms, and to damage plants and fruits. The damage, caused by the citrus canker, can be devastating, because the main control actions involve the eradication of infected plants and other plants nearby, causing large economic losses. Brazilian law requires an extensive testing protocol to confirm the diagnosis. Delays in diagnosis tests allows the spread of the disease. Therefore, any effort to accelerate this procedure will have a major impact in this area. This is the motivation of our work, where we apply the fluorescence imaging spectroscopy technique on citrus leaves with the goal to evaluate the diagnostic capability of this technique in asymptomatic plants infected with citrus canker in the laboratory. The goal is to determine the minimum time delay between infection and accurate diagnosis of the disease. This study was applied to experiments involving non-destructive and destructive samples. The results show the possibility of applying this technique in the detection of citrus canker.