A doença cancro cítrico é considerada uma das mais importantes doenças da citricultura devido ao seu poder de proliferação nas fazendas, e aos danos causados às plantas e frutos. Os prejuízos causados pela presença da doença são consideravelmente preocupantes, pois as principais medidas de controle pelos órgãos responsáveis envolvem a erradicação de plantas infectadas e demais plantas vizinhas, inviabilizando economicamente grandes áreas produtivas. A legislação brasileira exige um extenso protocolo de atividades que necessita ser realizado antes da confirmação do diagnóstico. Atrasos na confirmação do diagnóstico favorecem a proliferação da doença. Assim, qualquer esforço em acelerar esta detecção deve com certeza ter um grande impacto nesta área. Esta é a motivação de nosso trabalho, onde aplicamos a técnica de espectroscopia por imagens de fluorescência em folhas de culturas cítricas com a intenção de avaliar a capacidade de diagnóstico desta técnica em plantas assintomáticas contaminadas no laboratório com cancro cítrico. O objetivo é determinar o instante de tempo mínimo necessário entre a infecção e o diagnóstico preciso da doença. Este estudo foi aplicado para experimentos envolvendo amostras destrutivas e não-destrutivas. Os resultados mostram a possibilidade de aplicar tal técnica na detecção de cancro cítrico. / The citrus canker disease is considered one of the most important citrus diseases due to its ability to spread on farms, and to damage plants and fruits. The damage, caused by the citrus canker, can be devastating, because the main control actions involve the eradication of infected plants and other plants nearby, causing large economic losses. Brazilian law requires an extensive testing protocol to confirm the diagnosis. Delays in diagnosis tests allows the spread of the disease. Therefore, any effort to accelerate this procedure will have a major impact in this area. This is the motivation of our work, where we apply the fluorescence imaging spectroscopy technique on citrus leaves with the goal to evaluate the diagnostic capability of this technique in asymptomatic plants infected with citrus canker in the laboratory. The goal is to determine the minimum time delay between infection and accurate diagnosis of the disease. This study was applied to experiments involving non-destructive and destructive samples. The results show the possibility of applying this technique in the detection of citrus canker.

O cancro cítrico é uma doença que afeta diversas espécies de Citrus, cujo agente causal é Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC). O genoma desta fitobactéria consiste de um cromossomo de ~5 Mpb e dois plasmídeos, que juntos codificam 4313 CDS (seqüências codificadoras), das quais 2710 apresentam similaridade com proteínas conhecidas. Neste trabalho realizamos uma análise comparativa detalhada do genoma de XAC com genomas de três fitopatógenos, Xanthomonas campestris campestris, Xylella fastidiosa 9a5c e Xylella fastidiosa temecula. Com esta análise identificamos genes espécie e gênero-específicos, potencialmente relevantes para adaptação aos seus respectivos nichos ou hospedeiros, além de ilhas de inserção e deleção genômica putativas. Também identificamos vias metabólicas relacionadas com osmoproteção/osmorregulação e com degradação de compostos aromáticos em XAC, que possivelmente são determinantes na eficácia de sua interação com o hospedeiro. Analisamos o nível de expressão de 9 CDS após crescimento de XAC em diferentes concentrações de glicose e verificamos que este açúcar modula positivamente a expressão de CDS relacionadas à síntese de goma e ao sistema de osmoproteção. Além disso, descrevemos a construção de microarranjos de DNA representando 2760 CDS de XAC, constituindo-se uma nova ferramenta para estudos de genômica comparativa e expressão gênica deste fitopatógeno. / Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) is the bacterial pathogen that causes citrus canker disease in several species of Citrus plants. XAC genome consists of a main cromosome of ~5 Mpb and two plasmids that together encode 4313 CDS (coding sequences). Approximately 63% of the CDS have assigned biological functions. In this work, we present a detailed genomic comparison between the genomes of XAC and of three other phytopathogens, X. campestris campestris, Xylella fastidiosa 9a5c and X. fastidiosa Temecula. Based on this analysis, we identified species and genus-specific genes that might be relevant for adaptation to their niches and hosts. We mapped putative insertion/deletion regions in the XAC genome possibly related to gene gains and losses during the divergence of the four bacterial lineages. We have identified the metabolic pathways related to osmoprotection/osmoregulation and aromatic compound degradation important for XAC efficient host colonization and interaction. Expression levels of 9 CDS were analyzed after XAC growth under different glucose concentrations revealing that this sugar upregulates the expression of CDS related to gum synthesis and to osmoregulation. In addition, we describe here the construction of a DNA microarray representing 2760 CDS of XAC as a new tool for comparative genomic and gene expression studies in this phytopathogen.

O cancro cítrico, causado pela bactéria Gram negativa Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é considerado uma das principais doenças da citricultura nacional e mundial, devido à susceptibilidade do hospedeiro e por não existirem métodos de controle eficientes. Dados da literatura relatam que alguns genes de bactérias fitopatogênicas possuem uma seqüência consenso de nucleotídeos (TTCGC...N15...TTCGC) denominada “PIP box" ou “plant-inducible-promoter box", localizada na região promotora e responsável pela ativação da expressão de fatores de patogenicidade e virulência quando o patógeno entra em contato com a planta hospedeira. O objetivo deste trabalho foi mapear e investigar no genoma da Xac a expressão de genes contendo seqüências do tipo “PIP box", a 5’ da ORF ou internamente na região codificadora, através da técnica de macroarranjo. Com auxílio de uma ferramenta de bioinformática (script PERL), 208 seqüências consenso para o elemento cis-regulatório “PIP box" foram mapeados no genoma da Xac, e clones contendo seqüências codificadoras associadas aos promotores do tipo “PIP box" foram recuperados do banco de clones gerado pelo projeto de seqüenciamento da bactéria e validados por seqüenciamento. Os DNAs plasmidiais representando cada clone foram preparados e imobilizados em membranas de náilon (macroarranjo), as quais foram hibridadas com sondas de cDNAs marcadas com [a33P] dCTP e obtidas a partir de RNA total extraído da bactéria em estádio não infectante (cultivada em meio de cultura Caldo Nutriente – meio CN) e da bactéria infectante (cultivada por 12 horas ou 20 horas em meio XAM1 indutor de patogenicidade e virulência, ou coletada por exsudação 3 dias ou 5dias após inoculação em folhas de laranjeira). A análise da expressão dos genes contendo promotores “PIP box" putativos revelou 67 genes diferencialmente expressos quando a bactéria teve o seu programa de infecção disparado (indução “in vitro" ou “in vivo"). A validação dos resultados de macroarranjo foi realizada para alguns dos genes por meio de RT-PCR semi-quantitativo e a funcionalidade da seqüência “PIP box" para alguns promotores foi demonstrada através do gene repórter GUS. Os genes com expressão diferencial foram classificados segundo a função biológica das respectivas proteínas codificadas e estão envolvidos em processos tão distintos quanto sistema de secreção tipo III, metabolismo de membrana e parede celular, sistema de captação de ferro, metabolismo de açúcares e degradação da parede vegetal, transdução de sinais, metabolismo de flagelo, formação de biofilme e adesividade, metabolismo de ácidos nucléicos, transportadores de membrana, metabolismo energético e resposta a estresse ambiental. O possível papel destas modificações para a interação planta-patógeno e a instalação do cancro cítrico é discutida. / The citrus canker, caused by the bacterial pathogen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), is considered worldwide as one of the most important disease of citrus crop due to the lack of resistance in citrus plants and to the absence of efficient methods to control the disease. It was already shown that several genes involved in virulence and pathogenicity in plant pathogenic bacteria have a consensus nucleotide sequence (TTCGC…N15…TTCGC) named plant-inducible-promoter box or PIP box, located in the promoter region of the genes, which are responsible to activate the expression of genes during the host-bacteria interaction. The aim of this work was to map in Xac genome the genes containing the PIP box sequence in the promoter region, or internal to the ORF sequence, and analyze their expression during plant infection using the macroarray technique. Using a PERL script, 208 PIP box consensus sequence associated to genes were found in the Xac genome and clones containing all these genes and their PIP box sequences were recovered from a Xac genome clone bank and reconfirmed by sequencing. The plasmidial DNA containing the gene and the PIP box from each clone were purified, immobilized onto a nylon membrane (macroarray) and hybridized with [a33P] dCTP-labeled cDNAs synthesized from Xac total RNA isolated from bacteria in non-infecting (grown in NB nutrient medium) and infecting (grown for 12 or 20 hours in XAM1 medium that mimics the environment of the plant intercellular space (“in vitro") or for 3 or 5 days in orange plant leaves (“in vivo") conditions. The gene expression profile resulting from the array analysis revealed that 67 genes were differentially expressed during the temporal course of the infection. The results were validated through the analysis of expression profile for some genes using semi-quantitative RT-PCR and the PIP box functionality for some promoters was demonstrated using GUS as reporter gene. The differentially expressed genes were classified regarding the biological function of the encoded protein and related to several relevant processes as type III secretion system, membrane and cellular wall metabolism, iron uptake, sugar metabolism and host cell wall degradation, signal transduction, flagellum metabolism, biofilm formation and adhesiveness, nucleic acid metabolism, membrane transporters, energetic metabolism and stress response. The possible roles of these modifications for the bacteria-plant interaction and disease installation are discussed.

O cancro cítrico é uma das doenças mais temidas da citricultura devido ao seu poder de proli-feração nas fazendas, aos danos causados às plantas e aos frutos e à forma de combate adota-da pelos órgãos responsáveis através da erradicação das plantas contaminadas e de outras em sua vizinhança. No Brasil, um dos principais motivos que minimiza a eficiência da erradicação do cancro cítrico é a confirmação do diagnóstico, que necessita ser realizada em alguns laboratórios credenciados. A análise de muitas amostras em conjunto com o tempo gasto com o transporte aumenta a chance de proliferação da doença no campo. Neste trabalho aplicamos técnicas de espectroscopia da fluorescência em folhas de culturas cítricas na intenção de pro-por um método de diagnóstico do cancro cítrico a ser realizado na fazenda e com resposta em tempo real. As amostras experimentais são folhas de variedades cítricas sadias e contaminadas com cancro ou outras doenças. Iniciamos o trabalho aplicando espectroscopia da fluorescência no laboratório. Os resultados provaram a viabilidade do método, mas revelou uma enorme sobreposição de dados ao tentar discriminar o cancro de outra doença. Análises com-plementares nos revelaram que os experimentos deveriam ser feitos no campo, identificando plantas contaminadas e tomando a fluorescência de folhas sadias como referência. A espec-troscopia da fluorescência no campo foi feita com um espectrômetro portátil. O resultado nos possibilitou propor critérios de discriminação do cancro baseado em figuras de mérito. O melhor critério apresentou 79% de acertos, com 88% de sensibilidade e 68% de especificidade. Concluímos que os valores poderiam ser melhores se a espectroscopia fosse realizada com imagens, pois as variações do espectro ocorrem devido ao posicionamento da fibra na lesão do cancro. Passamos a estudar a espectroscopia das imagens da fluorescência com um sistema baseado em um espectrógrafo. Os resultados provaram a viabilidade do estudo e revelaram particularidades espaciais e espectrais das doenças. Infelizmente essa instrumentação só pode ser usada no laboratório, por isso optamos por desenvolver outro sistema mais simples e robusto, a base de uma roda de filtros com filtros passa-banda. Os re-sultados revelaram novas particularidades espaciais e espectrais das amostras, porém nos revelou a necessidade de um processamento de imagem para obter análises quantitativas. O sistema de imagens com filtro ainda foi usado em outro experimento complementar onde as imagens forneceram resultados quantitativos, provando a funcionalidade da técnica. / Citrus canker is one of the most feared diseases of citrus due to its dissemination in the farms, the damage caused to plants and fruits and how to combat adopted by national government through the eradication of infected plants and others in your neighborhood. In Brazil, one of the main reasons that minimizes the effectiveness of citrus canker`s eradication is the confir-mation of the diagnosis by specialized laboratories. The time spent to transport and to analyses many samples increases the chance of canker spreading in the field. In our work we apply spectroscopic techniques of fluorescence in leaves of citrus crops with the aim to propose a method for diagnosis of citrus canker to be held on the farm and real-time response. The expe-rimental samples are leaves of healthy citrus varieties and contaminated with canker or other diseases. We began the work by applying fluorescence spectroscopy in the laboratory. The results proved the feasibility of the method, but showed a huge overlap of data to try to dis-criminate cancer from other diseases. Further analysis revealed that those experiments should be done in the field, focusing to identify infected plants and taking the fluorescence of healthy leaves as a reference. Fluorescence spectroscopy in the field was made with a portable spectrometer. The result allowed us to propose some criteria for canker discrimination based on figures of merit. The best criteria presents 79% correct tests, with 88% sensitivity and 68% specificity. We conclude that these values could be better if the spectroscopy was performed with images, because the variations of the spectrum are due to the positioning of the fiber over the canker lesion. We study the spectroscopy of fluorescence images with a system based on a spectrograph. The results proved its feasibility and revealed spatial and spectral particular features of the diseases. Unfortunately, this instrumentation can only be used in the laborato-ry, so we decided to develop another system more simple and robust. The new system is based on a filter wheel with band-pass filters. The results revealed new spatial and spectral characteristics of the samples, but revealed the need for an image processing for quantitative analysis. This imaging system was still used in another supplementary experiment where the images have provided quantitative results, proving the functionality of the technique.

Buscou-se produzir híbridos somáticos entre laranjas doces (Citrus sinensis) com tangerinas, mexericas (C. reticulata, C. reshni, C. sunki, C. deliciosa), tangores (C reticulata x C. sinensis) ou tangelo ‘Orlando’ (C. reticulata x C. paradisi), além da avaliação da resistência do híbrido somático laranja ‘Hamlin’ (C. sinensis) + mexerica ‘Montenegina’ (C. deliciosa) a Xanthomonas axonopodis cv. citri e Xylella fastidiosa. Foram utilizados como fonte de protoplastos calos embriogênicos e folhas coletadas de plântulas germinadas in vitro e de plantas cultivadas em casa-de-vegetação. Após o isolamento, protoplastos provenientes de calos e/ou suspensões embriogênicas foram fundidos quimicamente por polietilenoglicol (PEG) com protoplastos não embriogênicos oriundos de mesofilo foliar. Os calos provenientes da fusão foram induzidos a formação de embriões somáticos para posterior germinação e regeneração de plantas. As plantas regeneradas foram individualizadas, enraizadas ou microenxertadas e aclimatizadas em casa-de-vegetação. A confirmação da hibridação somática foi feita por análise morfológica, análise do DNA com marcadores moleculares do tipo RAPD, determinação da ploidia com a contagem do número de cromossomos e/ou citometria de fluxo. Foram obtidos dois híbridos somáticos do genitor embriogênico laranja ‘Hamlin’ com os genitores não embriogênicos mexerica ‘Montenegrina’ e tangerina ‘Dancy’. Ambos híbridos somáticos obtidos podem apresentar características complementares dos genitores, podendo ser utilizados diretamente como copa e em programas de melhoramento de copa de citros. O híbrido somático laranja ‘Hamlin’ com mexerica ‘Montenegrina’ foi avaliado mostrando resistência a Xanthomonas axonopodis cv. citri e a Xylella fastidiosa. / This research aimed to produce new somatic hybrid combinations between sweet orange (Citrus sinensis) with mandarins (C. reticulata, C. reshni, C. Sunki, C. deliciosa), tangors (C reticulata x C. sinensis) or ‘Orlando’ tangelo (C. reticulata x C. paradisi), and also evaluate the somatic hybrid ‘Hamlin’ sweet orange (Citrus sinensis) + ‘Montenegrina’ mandarin (Citrus deliciosa) for resistance to Xanthomonas axonopodis pv. citri and Xylella fastidiosa. Protoplast sources included embryogenic calli or suspension-culture derived calli, and leaves collected from plants cultivated in vitro or in screenhouses. After protoplast isolation, embryogenic protoplasts were chemically fused by polyethylene glycol (PEG) with mesophyll-derived non-embriogenic protoplasts. Fusion-derived calli were further cultured to embryo induction, germination, and plant regeneration. Regenerated plants were individually rooted or micrografted, and further acclimated in screenhouse. Somatic hybridization was confirmed by analysis of leaf morphology, molecular analysis by RAPD markers, ploidy determination by chromosome counting or flow cytometry. The producion of the somatic hybrids ‘Hamlin’ sweet orange + ‘Montenegrina’ mandarin and ‘Hamlin’ sweet orange + ‘Dancy’ mandarin was confirmed. These hybrids may have complementary traits from both progenitor and be used directly as scion cultivars or as parental lines in scion improvement programs. ‘Hamlin’ sweet orange + ‘Montenegrina’ mandarin somatic hybrid was resistant to Xanthomonas axonopodis pv. citri and Xylella fastidiosa.

Submitted by GABRIELLE VIEIRA null (gabriellevieir@gmail.com) on 2018-04-05T12:53:30Z No. of bitstreams: 1 Metabólitos secundários de fungos da Antártica com ação antimicrobiana em Xanthomonas spp.pdf: 8795008 bytes, checksum: 0df6b298004d2d27c6a56a8a8367648b (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br) on 2018-04-05T14:02:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vieira_g_me_rcla.pdf: 8781866 bytes, checksum: e535d140907c0db6ece0255e817ca841 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-05T14:02:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vieira_g_me_rcla.pdf: 8781866 bytes, checksum: e535d140907c0db6ece0255e817ca841 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As bactérias do gênero Xanthomonas afetam culturas agrícolas de grande importância econômica no Brasil. O controle destas doenças realizado pela utilização de produtos químicos, entre outras práticas, causa impactos negativos na saúde e ao meio ambiente. Isso torna a busca de alternativas sustentáveis de combate a estas doenças cada vez mais importante. Uma possível alternativa aos produtos químicos que tem despertado grande interesse é a aplicação de metabólitos secundários. Suspeita-se que fungos que vivem em ambientes extremos como a Antártica podem produzir metabólitos secundários ainda desconhecidos. Dessa maneira, este projeto teve como objetivo principal investigar a potencial atividade de metabólitos secundários produzidos por 33 fungos isolados do solo contra três espécies de Xanthomonas economicamente importantes para a agricultura do país. Para tanto, foram utilizados fungos coletados em solo em expedição à Antártica (2013) no âmbito do INCT Criosfera, que estão preservados junto à Central de Recursos Microbianos da UNESP. Os extratos (n=66) foram testados contra Xanthomonas patogênicas das culturas de tomate (Xanthomonas euvesicatoria), frutas cítricas (Xanthomonas citri subsp. citri) e maracujá (Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae). Do total de extratos brutos submetidos a bioensaio contra os fitopatógenos, 18 (27,27%) apresentaram taxa de inibição ≥ 90%. Os extratos com potencial inibitório tiveram origem em fungos identificados por sequenciamento da região ITS4 e ITS5 como pertencentes ao filo Ascomycota, gênero Pseudogymnoascus. Alguns extratos ativos foram purificados utilizando diversas técnicas cromatográficas por fracionamento bioguiado como cromatografia por exclusão molecular, cromatografia em coluna em fase normal, cromatografia em coluna de fase reversa e cromatografia líquida de alta eficiência por interação hidrofílica. As frações obtidas foram testadas frente à Xanthomonas citri subsp. citri. Duas frações, obtidas por cromatografia líquida de alta eficiência, C2F2 e C2F5 apresentaram atividade inibitória contra o fitopatógeno. / Bacteria of the genus Xanthomonas affect agricultural crops of great economic importance in Brazil. Control of these diseases is made by the use of chemicals, among other practices, that causes negative impacts on human health and the environment. This makes the search for sustainable alternatives to combat these diseases increasingly important. A possible alternative to chemicals that have aroused great interest is the application of secondary metabolites. It is suspected that fungi living in extreme environments such as Antarctica may produce secondary metabolites as of yet unknown. Therefore this study had as main objective investigate the potential activity of secondary metabolites produced by 33 fungi isolated from the soil against three economically important Xanthomonas species. For this purpose fungi previously collected in the Antarctic expedition (2013) under the INCOS Criosfera and preserved at the Microbial Resource Center of UNESP were utillized. The extracts produced by the 33 isolates (n = 66) were tested against pathogenic Xanthomonas of tomato crops: Xanthomonas euvesicatoria; citrus: Xanthomonas citri subsp. citri; and of passion fruit culture, Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae. From the total of extracts submitted to bioassay against phytopathogens, 18 (27.27%) presented inhibition rate ≥ 90%. The extracts with inhibitory potential were produced by fungi identified through sequencing of the ITS4 and ITS5 regions as belonging to the Ascomycota phylum, genus Pseudogymnoascus. Some active extracts were purified using chromatography techniques by bioguided fractionation such as solid phase chromatography by molecular exclusion, normal phase column chromatography, reverse phase column chromatography, and high performance liquid chromatography by hydrophilic interaction . The fractions obtained by cromatography were tested for antibacterial activity in Xanthomonas citri subsp. citri. Two fractions, obtained by high performance liquid chromatography, C2F2 and C2F5, showed inhibitory activity against the phytopathogen. / FAPESP: 2015/20629-6.

Orientador: José Carlos Barbosa / Banca: Sílvio Aparecido Lopes / Banca: Eduardo Sanches Stuchi / Banca: Antônio Baldo Geraldo Martins / Banca: Rita de Cássia Panizzi / Resumo: A distribuição espacial do cancro cítrico em talhões com laranjeira 'Natal' enxertada em limoeiro 'Cravo' com 3 anos de idade foi estudada utilizando a geoestatística. Foram utilizados 13 talhões mapeados pelo Fundecitrus (Fundo de Defesa da Citricultura), com 595 ou 1080 plantas cada, infectados naturalmente com Xanthomonas citri subsp. citri, em uma única propriedade, no Estado de São Paulo. A severidade da doença em cada planta foi avaliada por meio de uma escala com os seguintes níveis: 0 - sem folhas com sintomas; 1 - de 1 a 5 folhas com sintomas; 2 - de 6 a 10 folhas com sintomas; 3 - de 11 a 20 folhas com sintomas; 4 - de 21 a 50 folhas com sintomas e 5 - > 50 folhas com sintomas. Nestes talhões, as coordenadas correspondentes à posição das plantas contaminadas foram obtidas com um GPS, permitindo mapear a doença no talhão. A distribuição espacial foi avaliada por ajuste de semivariogramas e interpolação dos dados por krigagem. A distribuição de plantas com cancro cítrico no talhão mostrou-se agregada, com raio de agregação de 30 a 45 m. Os mapas de krigagem mostraram que os focos da doença ocorreram mais frequentemente nos limites dos talhões. Quando a nota média de severidade da doença foi menor que 0,04, o semivariograma apresentou efeito pepita puro, indicando que não houve dependência espacial / Abstract: The spatial distribution of citrus canker in areas with orange 'Natal' grafted on 'Rangpur' lime with three years of age were studied using geostatistics. We used 13 plots mapped by Fundecitrus (Citrus Defense Fund), with 595 or 1080 individual plants, naturally infected with Xanthomonas citri subsp. citri that were on the same property in the State of São Paulo. Disease severity in each plant was assessed using a scale with the following levels: 0 - no leaf with symptoms, 1 - 1 - 5 leaves with symptoms; 2 - 6 -10 leaves with symptoms; 3 - 11 - 20 leaves with symptoms; 4 - 21 - 50 leaves with symptoms and 5 - > 50 leaves with symptoms. In these plots, the coordinates corresponding to the position of symptomatic of infected plants was obtained with a GPS, allowing mapping the symptomatic plants in the block. The spatial distribution was evaluated by fitting of semivariograms and kriging interpolation of the data. The distribution of plants with citrus canker in the block was aggregated, with aggregate radius of 30 - 45 meters. Kriging maps showed that the foci of diseased plants stood on the edge of the blocks. When the average grade of severity was less than 0.04, the semivariogram showed pure nugget effect, indicating that no spatial dependence / Doutor

Submitted by FLÁVIA CAMPOS FREITAS VIEIRA (flavia.camposfv@yahoo.com.br) on 2018-06-28T14:09:18Z No. of bitstreams: 1 Tese_Flávia_Vieira_2018.pdf: 8871588 bytes, checksum: e1ee1b7f2e2e7170f04d44c1a1e76d6a (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-06-29T18:42:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vieira_fcf_dr_jabo.pdf: 8871588 bytes, checksum: e1ee1b7f2e2e7170f04d44c1a1e76d6a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-29T18:42:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vieira_fcf_dr_jabo.pdf: 8871588 bytes, checksum: e1ee1b7f2e2e7170f04d44c1a1e76d6a (MD5) Previous issue date: 2018-06-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os citros são um grupo de espécies vegetais, com alto potencial produtivo, porém, acometido por várias doenças. Do gênero de bactérias Xanthomonas, três espécies são patogênicas a citros: Xanthomonas citri subsp. citri, agente causal do cancro cítrico, uma das doenças de maior preocupação da citricultura; X. fuscans subsp. aurantifolii tipos B e C, que causam a cancrose; e X. alfalfae subsp. citrumelonis, responsável por causar a mancha bacteriana dos citros. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi a análise e descrição, em nível anatômico e ultraestrutural, dos processos de infecção de bactérias do gênero Xanthomonas, causadoras de doenças em citros, a correlação do fenótipo da interação XfaC-citros com o transcriptoma e a análise dos fatores de virulência das estirpes estudadas. O processo de infecção das estirpes Xac306, Xac636, Xac828, Xacm1510, XfaC1632 e XfaC1630 em lima ácida ‘Galego’ e/ou laranja doce ‘Hamlin’, foi avaliado em diferentes períodos de infecção, pelas técnicas de microscopia de luz e eletrônicas de varredura e transmissão. As seguintes características relacionadas a virulência das estirpes foram avaliadas: formação in vitro de biofilme, produção de goma, motilidade “swimming” e auto agregação celular. Os resultados mostraram que Xac306 é a estirpe mais agressiva dentre as demais, visto pelos sintomas e pela intensidade das alterações anatômicas no tecido de ‘Hamlin’ e ‘Galego’. O processo de infecção em lima ácida ‘Galego’ foi semelhante em todas as estirpes de Xanthomonas estudadas, pois induziram hiperplasia e hipertrofia, porém, em diferentes intensidades, sendo que as alterações provocadas pelas estirpes Xac828 e Xacm1510 não resultaram no rompimento da epiderme; todas as estirpes produziram goma, envolvendo as bactérias e favorecendo a colonização no ambiente intercelular. A microscopia de luz permitiu identificar alterações na anatomia de lima ácida ‘Galego’ infectada e a diferença de susceptibilidade entre as variedades de citros inoculadas com Xac306 e estirpes de XfaC. As microscopias eletrônicas de varredura e transmissão permitiram a identificação de aspectos em comum às estirpes, independente da variedade cítrica. A HR induzida por estirpes de XfaC foi caracterizada pela microscopia eletrônica de transmissão. Com a análise de microscopia, não foi possível estabelecer uma relação direta entre os testes de formação in vitro de biofilme, produção de goma e motilidade “swimming” das estirpes. A análise dos dados de transcriptoma revelou que a resposta de defesa de laranja ‘Hamlin’ contra XfaC foi uma resposta rápida e eficiente que levou a indução de HR, que em última instância, conteve a infecção pela morte celular programada no local da infecção. Esse trabalho ampliou o conhecimento da área sobre o comportamento de diferentes estirpes de Xanthomonas causadoras de doenças em citros, fornecendo informações sobre sua interação com o hospedeiro suscetível e a resposta de defesa de XfaC em interação incompatível. / Citrus are a diverse group of plant species, with high yield potential, but affected by several diseases. The bacteria genus Xanthomonas has three species pathogenic to citrus: Xanthomonas citri subsp. citri, causal agent of citrus canker, one of the most important diseases of citrus crop; X. fuscans subsp. aurantifolii types B and C, causing citrus cancrosis; and X. alfalfae subsp. citrumelonis, which causes citrus bacterial spot. Therefore, the goal of this work was to analyze and describe, at the anatomical and ultrastructural level the infectious processes of Xanthomonas causing diseases in citrus, the correlation of the XfaC-citrus interaction phenotype with the transcriptome and the comparative analysis of virulence related factors, in order to elucidate morphophysiological traits of host-pathogen interaction. The infection process of Xac306, Xac636, Xac828, Xacm1510, XfaC1632 and XfaC1630 strains in 'Galego' Mexican lime and 'Hamlin' sweet orange were evaluated at different points of infection by light microscopy and scanning and transmission electron microscopy. The following virulence related characteristics of the strains were evaluated: in vitro biofilm formation, gum production, swimming motility and cellular auto aggregation. The results showed that Xac306 is the most aggressive strain among the others, due to the intensity of the symptoms and anatomical alterations in 'Hamlin' and 'Galego' tissue. The infection process in the susceptible host ('Galego' Mexican lime) was similar for all Xanthomonas strains studied, since they induced hyperplasia and hypertrophy, however in different intensities, and the alterations caused by Xac828 and Xacm1510 strains did not result in epidermis rupture; all strains produce gum, involving bacteria and assisting colonization in the intercellular environment. Light microscopy was able to identify anatomical alterations in 'Galego' Mexican lime infected tissue and the susceptibility differences between citrus varieties inoculated with Xac306 and XfaC strains. The scanning and transmission electron microscopies was able to identify common traits to the strains, regardless of the citrus variety. The HR induced by XfaC strains was characterized by transmission electron microscopy. We could not stablish a direct relation between the in vitro biofilm formation, gum production and "swimming" motility of the strains with the microscopy analysis. The transcriptome analysis revealed that 'Hamlin' defense response against XfaC is a quick and effective response that led to an HR induction, which ultimately contained the infection, by programmed cell death at the site of infection. This work expanded our knowledge about the behavior of different Xanthomonas strains causing citrus diseases, providing information on its interaction with the susceptible host and the defense response of XfaC in an incompatible interaction.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-01Bitstream added on 2014-06-13T18:54:08Z : No. of bitstreams: 1 tezza_rid_me_jabo.pdf: 2155126 bytes, checksum: 33a07381689b0811f980f19b4c0fc487 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Com o seqüenciamento completo do genoma do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), em 2002, inúmeras possibilidades de estudo foram viabilizadas, dando margem à busca de novas formas de controle do cancro cítrico, baseadas em alvos moleculares. Estudos dessa natureza têm mostrado a existência de genes que somente são expressos quando a bactéria está se desenvolvendo in planta. Sabe-se que essa regulação é dependente da região promotora e sua identificação pode possibilitar avanços significativos na busca do controle dessa doença. Apesar do crescente avanço das técnicas experimentais in vitro em biologia molecular, identificar um número significante de promotores ainda é uma tarefa difícil e dispendiosa. Os métodos computacionais existentes enfrentam a falta de um número adequado de promotores conhecidos para identificar padrões conservados entre as espécies. Logo, um método para predizê-Ios em qualquer organismo procariótico ainda é um desafio. O Modelo Oculto de Markov é um modelo estatístico aplicável a muitas tarefas em biologia molecular. Entre elas, predição e mapeamento de seqüências promotoras no genoma de um procarioto. Neste trabalho, estudou-se o mapeamento in silico de promotores gênicos de todo o genoma da Xac e em 68% dos genes a localização de um promotor foi indicada. A análise comparativa com dados experimentais de proteômica mostrou que 72% das proteínas expressas identificaram-se com elementos desta lista de promotores, o que corresponde a 27% do total de genes do genoma. À partir destes dados foi possível levantar um rol de informações sobre estes candidatos a promotores incitando a novos estudos moleculares. / With the complete genome sequencing of the phytopathogen Xanthomonas axonopodis pv. Citri (Xac), in 2002, several study possibilities were made practical and then creating the search of new citrus canker control ways, based in molecular aims. This kind of studies has shown the genes existences that are only expressed when the bacteria are developing itself in plant. It has been known that this regulation is promoter region dependent and its identification can allow significant advances in the search of this disease control. Although increasing advance of in vitro experimental techniques in molecular biology, identifying a meaningful number of promoters is still a hard and expensive task. The existents computer science methods face the need of a proper number of known promoters to identify conserved patterns among the species. Therefore, a method to predict them in any prokaryote organism is still a challenge. The Hidden Markov Model (HMM) is a statistic model applicable in many tasks in molecular biology. Among them, prediction and mapping of the promoters sequences in prokaryotic genome. In this work, which has studied the genic promoters in silico mapping of the whole Xac genome, in 68% of the genes the promoter localization was indicated. The proteomic experimental data comparative analysis showed that 72% of the expressed proteins identified with elements from the promoters list, which corresponds 27% of the genome genes total. According to these data it was possible to generate an information roll about these promoters candidates inciting new molecular studies.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-06Bitstream added on 2014-06-13T20:54:13Z : No. of bitstreams: 1 ferreira_cb_me_jabo.pdf: 3799793 bytes, checksum: f1b3670130a5947eeee6d1e3151f9b69 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Fundecitrus / Dentro da comercialização de frutas, a citricultura é a mais importante. Representa para muitos países, dentre eles, os EUA e o Brasil, uma importante atividade econômica. Porém, esta atividade, vem sofrendo com inúmeras doenças e/ou pragas como a doença do Cancro Cítrico Asiático causada pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri). Deste modo, com o objetivo do estudo do genoma funcional da X. citri, um banco de mutantes deste microorganismo foi obtido por meio de inserção aleatória do transposon Tn5, nas quais foram selecionados 53 mutantes que apresentaram, de forma superficial, alterações fenotípica em relação à X. citri selvagem. Para uma avaliação mais precisa, eles passaram por uma nova confirmação de suas alterações fenotípicas, onde foram inoculados em folhas de Citrus sinensis (Laranjeira pêra-Rio) e Citrus limonia (limoeiro cravo) e monitorados durante 16 dias, e aqueles que apresentaram as maiores alterações em relação à selvagem, tiveram confeccionadas para si curvas de crescimento in vivo. Conseguiu-se, desta forma, avaliar quantitativamente o processo patogênico, relacionar seus sintomas com dados numéricos e ainda descobrir detalhes até então não conhecidos. O mapeamento, dos respectivos loci mutados, foi realizado por seqüenciamento de DNA a partir do transposon, demonstrando que a metodologia empregada para a obtenção dos mutantes foi eficiente, conseguiu também revelar diversas proteína ainda hipotéticas, e outras, até então, não considerados como implicados no processo patogênico, como, uma Integrase, Fe-S oxidoredutase, Helicase IV, Receptor Dependente de Ton-B, entre outros / Concerning the commercialization of fruits, the citrus production is the most important. It represents for many countries, amongst them, U.S.A. and Brazil, an important economic activity. However, this activity has been suffering with many illnesses and/or plagues as the illness from the Asiatic citrus canker caused by the Xanthomonas citri subsp. citri bacterium (X. citri). In this way, from a bank of mutants of X. citri, gotten by means of random insertion of commercial one derived from transposon Tn5, had been selected 53 mutants that had presented, of superficial form, some type of phenotype alteration in relation to the wild X. citri. To a more necessary evaluation, each one of them passed for a new confirmation of its phenotype alterations, where they had been inoculated in leafs of Citrus sinensis ('Pera' sweet orange) and Citrus limonia ('Rangpur' lime) and monitored during 16 days, and those that had presented the biggest alterations in relation to the savage, had confectioned for itself in planta growth curves. We obtain, in such a way, to evaluate quantitatively the pathogenic process, to relate its symptoms with numerical data and still to discover not known details until then. The mapping of respective locus mutated was carried through by sequencing of DNA from transposon, demonstrating that the methodology used for the attainment of the mutants was efficient and still to disclose diverse genes still hypothetical, and others, until then, not considered as implied in the pathogenic process, as, Integrase, Fe-S oxidoredutase, Helicase IV, TonB-dependent receptor, among others