Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-09-23Bitstream added on 2014-06-13T19:23:56Z : No. of bitstreams: 1 rosa_j_dr_jabo.pdf: 2608907 bytes, checksum: b7b01ebc553dff94742210a39847a17e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundecitrus / A distribuição espacial do cancro cítrico em talhões com laranjeira ‘Natal’ enxertada em limoeiro ‘Cravo’ com 3 anos de idade foi estudada utilizando a geoestatística. Foram utilizados 13 talhões mapeados pelo Fundecitrus (Fundo de Defesa da Citricultura), com 595 ou 1080 plantas cada, infectados naturalmente com Xanthomonas citri subsp. citri, em uma única propriedade, no Estado de São Paulo. A severidade da doença em cada planta foi avaliada por meio de uma escala com os seguintes níveis: 0 - sem folhas com sintomas; 1 - de 1 a 5 folhas com sintomas; 2 - de 6 a 10 folhas com sintomas; 3 - de 11 a 20 folhas com sintomas; 4 - de 21 a 50 folhas com sintomas e 5 - > 50 folhas com sintomas. Nestes talhões, as coordenadas correspondentes à posição das plantas contaminadas foram obtidas com um GPS, permitindo mapear a doença no talhão. A distribuição espacial foi avaliada por ajuste de semivariogramas e interpolação dos dados por krigagem. A distribuição de plantas com cancro cítrico no talhão mostrou-se agregada, com raio de agregação de 30 a 45 m. Os mapas de krigagem mostraram que os focos da doença ocorreram mais frequentemente nos limites dos talhões. Quando a nota média de severidade da doença foi menor que 0,04, o semivariograma apresentou efeito pepita puro, indicando que não houve dependência espacial / The spatial distribution of citrus canker in areas with orange 'Natal' grafted on ‘Rangpur’ lime with three years of age were studied using geostatistics. We used 13 plots mapped by Fundecitrus (Citrus Defense Fund), with 595 or 1080 individual plants, naturally infected with Xanthomonas citri subsp. citri that were on the same property in the State of São Paulo. Disease severity in each plant was assessed using a scale with the following levels: 0 - no leaf with symptoms, 1 – 1 - 5 leaves with symptoms; 2 – 6 -10 leaves with symptoms; 3 – 11 - 20 leaves with symptoms; 4 – 21 - 50 leaves with symptoms and 5 - > 50 leaves with symptoms. In these plots, the coordinates corresponding to the position of symptomatic of infected plants was obtained with a GPS, allowing mapping the symptomatic plants in the block. The spatial distribution was evaluated by fitting of semivariograms and kriging interpolation of the data. The distribution of plants with citrus canker in the block was aggregated, with aggregate radius of 30 - 45 meters. Kriging maps showed that the foci of diseased plants stood on the edge of the blocks. When the average grade of severity was less than 0.04, the semivariogram showed pure nugget effect, indicating that no spatial dependence

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: José Belasque Júnior / Banca: Lúcia Maria Carareto Alves / Banca: Franklin Behlau / Resumo: As bactérias pertencentes ao gênero Xanthomonas constituem um dos grupos de fitopatógenos mais importantes na natureza, com capacidade de infectar aproximadamente 120 tipos diferentes de plantas monocotiledôneas e 270 dicotiledôneas. A bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) é o agente causal do cancro cítrico, uma das principais doenças dos citros. Restrita à Flórida, a mancha bacteriana dos citros, causada por Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis (Xacm), afeta principalmente o citrumelo 'Swingle'. A bactéria Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii (Xfa) é o agente causal das cancroses B e C, encontradas apenas na América do Sul. As técnicas mais utilizadas na diferenciação e caracterização dos patógenos bacterianos, hibridização DNA-DNA (DDH) e sequenciamento da região do DNA que codifica o RNA ribossomal 16S (rRNA 16S), são onerosas, trabalhosas, lentas e de resultados restritos, não permitindo a comparação dos resultados obtidos entre diferentes estudos laboratoriais. Por isso, a técnica de análise de sequências multilocus (MLSA), considerada rápida, barata e confiável, tem sido recomendada para a caracterização e delimitação de espécies de patógenos bacterianos, tais como as do gênero Xanthomonas, permitindo o estabelecimento das relações filogenéticas por meio de genes housekeeping. Portanto, o objetivo do trabalho foi caracterizar os isolados de Xanthomonas (Xcc-A, Xfa-B, Xfa-C e Xacm) por meio da técnica MLSA. Foram utilizados 27 isolados de Xanthomonas patogênicas a citros, sendo quatro de X. citri subsp. citri (Xcc), três de X. fuscans subsp. aurantifolli B (Xfa-B), dezenove de X. fuscans subsp. aurantifolli C (Xfa-C) e um de X. alfalfae subsp. citrumelonis (Xacm). Os genes atpD, dnaK e fusA foram utilizados como genes housekeeping e para a reação da PCR... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bacteria belonging to the genus Xanthomonas are one of the main groups of phytopathogens in nature, capable to infecting about 120 different monocots and 270 dicots plants. Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) is the causal agent of bacterial citrus canker, one of the major diseases of citrus. Restricted to Florida, citrus bacterial spot, caused by Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis (Xacm), affects mainly citrumelo 'Swingle'. Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii (Xfa) is the causal agent of canker B and C, found only in South America. The most widely used techniques for the differentiation and characterization of bacterial pathogens, DNA-DNA hybridization (DDH) and analysis of DNA sequences coding for small subunit ribosomal RNAs (16S rRNA), are costly, cumbersome, slow and give limited results, do not allowing the interlaboratorial comparisons of the results. Therefore, the technique of multilocus sequence analysis (MLSA), which is considered fast, cheap and reliable, has been recommended for characterization and delineation of species of bacterial pathogens, such as the genus Xanthomonas, allowing the establishment of phylogenetic relationships between them through housekeeping genes. Therefore, the objective of this study was to characterize strains of Xanthomonas (Xcc-A, Xfa-B, Xfa-C and Xacm) using the MLSA technique. We used 27 strains of Xanthomonas pathogenic to citrus, being four Xcc, three Xfa-B, 19 Xfa- C and one Xacm. The PCR reaction was performed using the specific primers to amplify the atpD, dnaK and fusA genes. PCR products were purified, sequenced and the sequences were analyzed using the software CodenCode Aligner version 3.7.1. Phylogenetic analysis was performed using Maximum Likelihood based on the model of Tamura-Nei and using the software MEGA 5. Analyses ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by JELENA PURIC (jelena0puric@gmail.com) on 2018-04-16T12:39:06Z No. of bitstreams: 1 Jelena Puric Dissertação de Mestrado.pdf: 2830343 bytes, checksum: 555cfd034f96e02e12c50107d2077d5f (MD5) / Rejected by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br), reason: Prezada Jelena, Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: 1) A folha de aprovação está em local errado. No arquivo enviado, está em primeiro lugar, antes da capa. O correto de acordo com as normas vigentes é que a folha de aprovação venha após a ficha catalográfica (que o seu arquivo também não tem) e venha antes do Resumo. 2) Falta a ficha catalográfica, que deve ser solicitada pelo site da biblioteca da Unesp de Rio Claro e inserida após a folha de rosto no arquivo pdf e no verso da folha de rosto na versão impressa. O documento enviado não foi excluído. Para revisá-lo e realizar uma nova tentativa de envio, acesse: https://repositorio.unesp.br/mydspace Agradecemos a compreensão e aguardamos o envio do novo arquivo. Atenciosamente, Biblioteca Campus Rio Claro Repositório Institucional UNESP on 2018-04-16T14:20:27Z (GMT) / Submitted by JELENA PURIC (jelena0puric@gmail.com) on 2018-04-16T14:31:14Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Jelena Puric.pdf: 2938364 bytes, checksum: b7379106bbe1a2cdf5ce930d5337096b (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br) on 2018-04-16T18:28:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 puric_j_me_rcla.pdf: 2383486 bytes, checksum: e2cb2e6c5d3d71426040a339c65c55ce (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-16T18:28:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 puric_j_me_rcla.pdf: 2383486 bytes, checksum: e2cb2e6c5d3d71426040a339c65c55ce (MD5) Previous issue date: 2018-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este trabalho teve como objetivo obter extratos contendo metabólitos secundários de fungos filamentosos isolados de sedimentos marinhos da Antártica e avaliar sua potencial atividade antibacteriana em Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas euvesicatoria e Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (bactérias fitopatogênicas que causam doenças em cítricos, pimenta e tomate, e maracujá, respectivamente). Entre os 90 extratos brutos intracelulares e extracelulares obtidos a partir de fungos, 19 mostraram a capacidade de impedir o crescimento de X. citri subsp. citri e X. euvesicatoria in vitro e 22 mostraram a capacidade de dificultar o crescimento de X. axonopodis pv. passiflorae in vitro. Os extratos extracelulares inibiram em média 97,12% de X. citri subsp. citri, 95,94% de X. euvesicatoria e 96,58% de X. axonopodis pv. passiflorae a 3,0 mg / mL. / This work aimed to obtain extracts containing secondary metabolites from filamentous fungi isolated from marine sediments from Antarctic and assess their potential antibacterial activity on Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas euvesicatoria and Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (phytopathogenic bacteria causing diseases in citrus, pepper and tomato, and passionfruit, respectively). Among the 90 raw intracellular and extracellular extracts obtained from fungi, 19 showed the ability to hamper the growth of Xanthomonas citri subsp. citri and X. euvesicatoria in vitro and 22 showed the ability to hamper the growth of X. axonopodis pv. passiflorae in vitro. The extracellular extracts inhibited on average 97,12% of Xanthomonas citri subsp, 95,94% of X. euvesicatoria and 96,58% of X. axonopodis pv. passiflorae at 3,0 mg/mL.

Submitted by Lúcia Bonci Cavalca (l.bonci@hotmail.com) on 2018-04-26T18:08:18Z No. of bitstreams: 1 CAVALCA, LB versão repositorio.pdf: 11866412 bytes, checksum: 0a27e5a7f7f756cb88de16361ad78a27 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Santulo Custódio de Medeiros null (asantulo@rc.unesp.br) on 2018-04-26T19:16:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cavalca_lb_me_rcla.pdf: 11841916 bytes, checksum: 0d52662f4653c6d3695e6b3ab334549d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-26T19:16:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cavalca_lb_me_rcla.pdf: 11841916 bytes, checksum: 0d52662f4653c6d3695e6b3ab334549d (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A cultura de citros é uma das mais importantes do Brasil, sendo a citricultura brasileira a maior do mundo; ainda assim, a produção nacional sofre com pragas e doenças, como cancro cítrico, que afetam sua produtividade. O cancro cítrico é causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) e tem sido controlado com o uso de estratégias integradas como a eliminação de plantas contaminadas e pulverização de bactericidas cúpricos. O uso de compostos à base de cobre, porém, representa um risco ambiental devido à sua toxicidade e efeito cumulativo, fazendo necessária a investigação de outros compostos com potencial no tratamento fitossanitário contra a doença. Neste estudo avaliamos a atividade bactericida do galato de hexila contra Xac, seu potencial protetivo e curativo no combate ao cancro cítrico, sua fitotoxicidade e predisposição em induzir resistência bacteriana. O composto provocou retardo e diminuição no crescimento populacional de Xac e inibição de seu crescimento in vitro, levando à morte total da população na concentração de 100μg⋅mL-1. A bactéria não foi capaz de desenvolver resistência a Gal-6 ao longo de 31 dias e exibiu taxa de mutantes naturalmente resistentes ao composto menor que 1⋅10-6 para a concentração de 50μg⋅mL-1. A capacidade de germinação de sementes e desenvolvimento de plântulas de rúcula e tomate não foi alterada por Gal-6. A aspersão de galato de hexila em plantas de laranja doce inoculadas com Xac reduziu em até 35% a incidência de sintomas de cancro cítrico, e em até 80% sua severidade. O composto também alterou o comprimento celular de Xac e permeabilidade de membrana. Galato de hexila mostrou-se um bactericida eficaz contra Xanthomonas citri subsp. citri tanto in vitro quanto in planta, além de apresentar baixa fitotoxicidade e baixa probabilidade de indução de resistência em Xac, visto que o composto parece atuar tanto sobre a estrutura física da membrana, quanto sobre o processo de segregação cromossômica/divisão celular bacteriana. / Citrus culture is one of the most important agricultural activities in Brazil, being the country also the biggest producer in the world; nevertheless, this business struggles with pests and diseases, as citrus canker, that affects its profitability. Citrus canker is caused by the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) and is controlled by using integrated strategies such as elimination of contaminated plants and spraying of cupric bactericides. Using products with copper, however, brings an environmental risk, given 8 its toxicity and cumulative effect, making necessary the research of other compounds with potential to be used as a resource in the phytosanitary treatment against the disease. We evaluated hexyl galate's (Gal-6) bactericidal activity versus Xac and its potential in the preventive and curative treatments against the disease, also Gal-6 phytotoxicity and likeliness to induce bacterial resistance. The compound caused delay and decrease in Xac population growth and in vitro growth inhibition, leading to the total death of the population when at 100 μg⋅mL-1. The bacterium was not able to develop resistance to Gal-6 over 31 days and exhibited a rate of naturally-resistant mutants to the compound of less than 1⋅10-6 at the concentration of 50μg⋅mL-1. Seed germination and seedling development of arugula and tomato were not altered by Gal- 6. Spraying orange plants infected by Xac with hexyl gallate reduced the incidence of citrus canker symptoms by up to 35% and their severity by up to 80%. The compound also altered Xac cell length and membrane permeability. Hexyl gallate proved to be an effective bactericide against Xanthomonas citri subsp. citri both in vitro and in plant, exhibiting low phytotoxicity and low inclination to induce resistance in Xac, given that the compound appears to act on both the physical structure of the membrane and the process of chromosomal segregation/ bacterial cell division.

Resumo: Com o seqüenciamento completo do genoma do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), em 2002, inúmeras possibilidades de estudo foram viabilizadas, dando margem à busca de novas formas de controle do cancro cítrico, baseadas em alvos moleculares. Estudos dessa natureza têm mostrado a existência de genes que somente são expressos quando a bactéria está se desenvolvendo in planta. Sabe-se que essa regulação é dependente da região promotora e sua identificação pode possibilitar avanços significativos na busca do controle dessa doença. Apesar do crescente avanço das técnicas experimentais in vitro em biologia molecular, identificar um número significante de promotores ainda é uma tarefa difícil e dispendiosa. Os métodos computacionais existentes enfrentam a falta de um número adequado de promotores conhecidos para identificar padrões conservados entre as espécies. Logo, um método para predizê-Ios em qualquer organismo procariótico ainda é um desafio. O Modelo Oculto de Markov é um modelo estatístico aplicável a muitas tarefas em biologia molecular. Entre elas, predição e mapeamento de seqüências promotoras no genoma de um procarioto. Neste trabalho, estudou-se o mapeamento in silico de promotores gênicos de todo o genoma da Xac e em 68% dos genes a localização de um promotor foi indicada. A análise comparativa com dados experimentais de proteômica mostrou que 72% das proteínas expressas identificaram-se com elementos desta lista de promotores, o que corresponde a 27% do total de genes do genoma. À partir destes dados foi possível levantar um rol de informações sobre estes candidatos a promotores incitando a novos estudos moleculares. / Abstract: With the complete genome sequencing of the phytopathogen Xanthomonas axonopodis pv. Citri (Xac), in 2002, several study possibilities were made practical and then creating the search of new citrus canker control ways, based in molecular aims. This kind of studies has shown the genes existences that are only expressed when the bacteria are developing itself in plant. It has been known that this regulation is promoter region dependent and its identification can allow significant advances in the search of this disease control. Although increasing advance of in vitro experimental techniques in molecular biology, identifying a meaningful number of promoters is still a hard and expensive task. The existents computer science methods face the need of a proper number of known promoters to identify conserved patterns among the species. Therefore, a method to predict them in any prokaryote organism is still a challenge. The Hidden Markov Model (HMM) is a statistic model applicable in many tasks in molecular biology. Among them, prediction and mapping of the promoters sequences in prokaryotic genome. In this work, which has studied the genic promoters in silico mapping of the whole Xac genome, in 68% of the genes the promoter localization was indicated. The proteomic experimental data comparative analysis showed that 72% of the expressed proteins identified with elements from the promoters list, which corresponds 27% of the genome genes total. According to these data it was possible to generate an information roll about these promoters candidates inciting new molecular studies. / Orientadora: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Poliana Fernanda Giachetto / Mestre

O cancro cítrico é uma das doenças mais temidas da citricultura devido ao seu poder de proli-feração nas fazendas, aos danos causados às plantas e aos frutos e à forma de combate adota-da pelos órgãos responsáveis através da erradicação das plantas contaminadas e de outras em sua vizinhança. No Brasil, um dos principais motivos que minimiza a eficiência da erradicação do cancro cítrico é a confirmação do diagnóstico, que necessita ser realizada em alguns laboratórios credenciados. A análise de muitas amostras em conjunto com o tempo gasto com o transporte aumenta a chance de proliferação da doença no campo. Neste trabalho aplicamos técnicas de espectroscopia da fluorescência em folhas de culturas cítricas na intenção de pro-por um método de diagnóstico do cancro cítrico a ser realizado na fazenda e com resposta em tempo real. As amostras experimentais são folhas de variedades cítricas sadias e contaminadas com cancro ou outras doenças. Iniciamos o trabalho aplicando espectroscopia da fluorescência no laboratório. Os resultados provaram a viabilidade do método, mas revelou uma enorme sobreposição de dados ao tentar discriminar o cancro de outra doença. Análises com-plementares nos revelaram que os experimentos deveriam ser feitos no campo, identificando plantas contaminadas e tomando a fluorescência de folhas sadias como referência. A espec-troscopia da fluorescência no campo foi feita com um espectrômetro portátil. O resultado nos possibilitou propor critérios de discriminação do cancro baseado em figuras de mérito. O melhor critério apresentou 79% de acertos, com 88% de sensibilidade e 68% de especificidade. Concluímos que os valores poderiam ser melhores se a espectroscopia fosse realizada com imagens, pois as variações do espectro ocorrem devido ao posicionamento da fibra na lesão do cancro. Passamos a estudar a espectroscopia das imagens da fluorescência com um sistema baseado em um espectrógrafo. Os resultados provaram a viabilidade do estudo e revelaram particularidades espaciais e espectrais das doenças. Infelizmente essa instrumentação só pode ser usada no laboratório, por isso optamos por desenvolver outro sistema mais simples e robusto, a base de uma roda de filtros com filtros passa-banda. Os re-sultados revelaram novas particularidades espaciais e espectrais das amostras, porém nos revelou a necessidade de um processamento de imagem para obter análises quantitativas. O sistema de imagens com filtro ainda foi usado em outro experimento complementar onde as imagens forneceram resultados quantitativos, provando a funcionalidade da técnica. / Citrus canker is one of the most feared diseases of citrus due to its dissemination in the farms, the damage caused to plants and fruits and how to combat adopted by national government through the eradication of infected plants and others in your neighborhood. In Brazil, one of the main reasons that minimizes the effectiveness of citrus canker`s eradication is the confir-mation of the diagnosis by specialized laboratories. The time spent to transport and to analyses many samples increases the chance of canker spreading in the field. In our work we apply spectroscopic techniques of fluorescence in leaves of citrus crops with the aim to propose a method for diagnosis of citrus canker to be held on the farm and real-time response. The expe-rimental samples are leaves of healthy citrus varieties and contaminated with canker or other diseases. We began the work by applying fluorescence spectroscopy in the laboratory. The results proved the feasibility of the method, but showed a huge overlap of data to try to dis-criminate cancer from other diseases. Further analysis revealed that those experiments should be done in the field, focusing to identify infected plants and taking the fluorescence of healthy leaves as a reference. Fluorescence spectroscopy in the field was made with a portable spectrometer. The result allowed us to propose some criteria for canker discrimination based on figures of merit. The best criteria presents 79% correct tests, with 88% sensitivity and 68% specificity. We conclude that these values could be better if the spectroscopy was performed with images, because the variations of the spectrum are due to the positioning of the fiber over the canker lesion. We study the spectroscopy of fluorescence images with a system based on a spectrograph. The results proved its feasibility and revealed spatial and spectral particular features of the diseases. Unfortunately, this instrumentation can only be used in the laborato-ry, so we decided to develop another system more simple and robust. The new system is based on a filter wheel with band-pass filters. The results revealed new spatial and spectral characteristics of the samples, but revealed the need for an image processing for quantitative analysis. This imaging system was still used in another supplementary experiment where the images have provided quantitative results, proving the functionality of the technique.

Buscou-se produzir híbridos somáticos entre laranjas doces (Citrus sinensis) com tangerinas, mexericas (C. reticulata, C. reshni, C. sunki, C. deliciosa), tangores (C reticulata x C. sinensis) ou tangelo ‘Orlando’ (C. reticulata x C. paradisi), além da avaliação da resistência do híbrido somático laranja ‘Hamlin’ (C. sinensis) + mexerica ‘Montenegina’ (C. deliciosa) a Xanthomonas axonopodis cv. citri e Xylella fastidiosa. Foram utilizados como fonte de protoplastos calos embriogênicos e folhas coletadas de plântulas germinadas in vitro e de plantas cultivadas em casa-de-vegetação. Após o isolamento, protoplastos provenientes de calos e/ou suspensões embriogênicas foram fundidos quimicamente por polietilenoglicol (PEG) com protoplastos não embriogênicos oriundos de mesofilo foliar. Os calos provenientes da fusão foram induzidos a formação de embriões somáticos para posterior germinação e regeneração de plantas. As plantas regeneradas foram individualizadas, enraizadas ou microenxertadas e aclimatizadas em casa-de-vegetação. A confirmação da hibridação somática foi feita por análise morfológica, análise do DNA com marcadores moleculares do tipo RAPD, determinação da ploidia com a contagem do número de cromossomos e/ou citometria de fluxo. Foram obtidos dois híbridos somáticos do genitor embriogênico laranja ‘Hamlin’ com os genitores não embriogênicos mexerica ‘Montenegrina’ e tangerina ‘Dancy’. Ambos híbridos somáticos obtidos podem apresentar características complementares dos genitores, podendo ser utilizados diretamente como copa e em programas de melhoramento de copa de citros. O híbrido somático laranja ‘Hamlin’ com mexerica ‘Montenegrina’ foi avaliado mostrando resistência a Xanthomonas axonopodis cv. citri e a Xylella fastidiosa. / This research aimed to produce new somatic hybrid combinations between sweet orange (Citrus sinensis) with mandarins (C. reticulata, C. reshni, C. Sunki, C. deliciosa), tangors (C reticulata x C. sinensis) or ‘Orlando’ tangelo (C. reticulata x C. paradisi), and also evaluate the somatic hybrid ‘Hamlin’ sweet orange (Citrus sinensis) + ‘Montenegrina’ mandarin (Citrus deliciosa) for resistance to Xanthomonas axonopodis pv. citri and Xylella fastidiosa. Protoplast sources included embryogenic calli or suspension-culture derived calli, and leaves collected from plants cultivated in vitro or in screenhouses. After protoplast isolation, embryogenic protoplasts were chemically fused by polyethylene glycol (PEG) with mesophyll-derived non-embriogenic protoplasts. Fusion-derived calli were further cultured to embryo induction, germination, and plant regeneration. Regenerated plants were individually rooted or micrografted, and further acclimated in screenhouse. Somatic hybridization was confirmed by analysis of leaf morphology, molecular analysis by RAPD markers, ploidy determination by chromosome counting or flow cytometry. The producion of the somatic hybrids ‘Hamlin’ sweet orange + ‘Montenegrina’ mandarin and ‘Hamlin’ sweet orange + ‘Dancy’ mandarin was confirmed. These hybrids may have complementary traits from both progenitor and be used directly as scion cultivars or as parental lines in scion improvement programs. ‘Hamlin’ sweet orange + ‘Montenegrina’ mandarin somatic hybrid was resistant to Xanthomonas axonopodis pv. citri and Xylella fastidiosa.

O cancro cítrico, causado pela bactéria Gram negativa Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é considerado uma das principais doenças da citricultura nacional e mundial, devido à susceptibilidade do hospedeiro e por não existirem métodos de controle eficientes. Dados da literatura relatam que alguns genes de bactérias fitopatogênicas possuem uma seqüência consenso de nucleotídeos (TTCGC...N15...TTCGC) denominada “PIP box” ou “plant-inducible-promoter box”, localizada na região promotora e responsável pela ativação da expressão de fatores de patogenicidade e virulência quando o patógeno entra em contato com a planta hospedeira. O objetivo deste trabalho foi mapear e investigar no genoma da Xac a expressão de genes contendo seqüências do tipo “PIP box”, a 5’ da ORF ou internamente na região codificadora, através da técnica de macroarranjo. Com auxílio de uma ferramenta de bioinformática (script PERL), 208 seqüências consenso para o elemento cis-regulatório “PIP box” foram mapeados no genoma da Xac, e clones contendo seqüências codificadoras associadas aos promotores do tipo “PIP box” foram recuperados do banco de clones gerado pelo projeto de seqüenciamento da bactéria e validados por seqüenciamento. Os DNAs plasmidiais representando cada clone foram preparados e imobilizados em membranas de náilon (macroarranjo), as quais foram hibridadas com sondas de cDNAs marcadas com [a33P] dCTP e obtidas a partir de RNA total extraído da bactéria em estádio não infectante (cultivada em meio de cultura Caldo Nutriente – meio CN) e da bactéria infectante (cultivada por 12 horas ou 20 horas em meio XAM1 indutor de patogenicidade e virulência, ou coletada por exsudação 3 dias ou 5dias após inoculação em folhas de laranjeira). A análise da expressão dos genes contendo promotores “PIP box” putativos revelou 67 genes diferencialmente expressos quando a bactéria teve o seu programa de infecção disparado (indução “in vitro” ou “in vivo”). A validação dos resultados de macroarranjo foi realizada para alguns dos genes por meio de RT-PCR semi-quantitativo e a funcionalidade da seqüência “PIP box” para alguns promotores foi demonstrada através do gene repórter GUS. Os genes com expressão diferencial foram classificados segundo a função biológica das respectivas proteínas codificadas e estão envolvidos em processos tão distintos quanto sistema de secreção tipo III, metabolismo de membrana e parede celular, sistema de captação de ferro, metabolismo de açúcares e degradação da parede vegetal, transdução de sinais, metabolismo de flagelo, formação de biofilme e adesividade, metabolismo de ácidos nucléicos, transportadores de membrana, metabolismo energético e resposta a estresse ambiental. O possível papel destas modificações para a interação planta-patógeno e a instalação do cancro cítrico é discutida. / The citrus canker, caused by the bacterial pathogen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), is considered worldwide as one of the most important disease of citrus crop due to the lack of resistance in citrus plants and to the absence of efficient methods to control the disease. It was already shown that several genes involved in virulence and pathogenicity in plant pathogenic bacteria have a consensus nucleotide sequence (TTCGC…N15…TTCGC) named plant-inducible-promoter box or PIP box, located in the promoter region of the genes, which are responsible to activate the expression of genes during the host-bacteria interaction. The aim of this work was to map in Xac genome the genes containing the PIP box sequence in the promoter region, or internal to the ORF sequence, and analyze their expression during plant infection using the macroarray technique. Using a PERL script, 208 PIP box consensus sequence associated to genes were found in the Xac genome and clones containing all these genes and their PIP box sequences were recovered from a Xac genome clone bank and reconfirmed by sequencing. The plasmidial DNA containing the gene and the PIP box from each clone were purified, immobilized onto a nylon membrane (macroarray) and hybridized with [a33P] dCTP-labeled cDNAs synthesized from Xac total RNA isolated from bacteria in non-infecting (grown in NB nutrient medium) and infecting (grown for 12 or 20 hours in XAM1 medium that mimics the environment of the plant intercellular space (“in vitro”) or for 3 or 5 days in orange plant leaves (“in vivo”) conditions. The gene expression profile resulting from the array analysis revealed that 67 genes were differentially expressed during the temporal course of the infection. The results were validated through the analysis of expression profile for some genes using semi-quantitative RT-PCR and the PIP box functionality for some promoters was demonstrated using GUS as reporter gene. The differentially expressed genes were classified regarding the biological function of the encoded protein and related to several relevant processes as type III secretion system, membrane and cellular wall metabolism, iron uptake, sugar metabolism and host cell wall degradation, signal transduction, flagellum metabolism, biofilm formation and adhesiveness, nucleic acid metabolism, membrane transporters, energetic metabolism and stress response. The possible roles of these modifications for the bacteria-plant interaction and disease installation are discussed.

O cancro cítrico é uma doença que afeta diversas espécies de Citrus, cujo agente causal é Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC). O genoma desta fitobactéria consiste de um cromossomo de ~5 Mpb e dois plasmídeos, que juntos codificam 4313 CDS (seqüências codificadoras), das quais 2710 apresentam similaridade com proteínas conhecidas. Neste trabalho realizamos uma análise comparativa detalhada do genoma de XAC com genomas de três fitopatógenos, Xanthomonas campestris campestris, Xylella fastidiosa 9a5c e Xylella fastidiosa temecula. Com esta análise identificamos genes espécie e gênero-específicos, potencialmente relevantes para adaptação aos seus respectivos nichos ou hospedeiros, além de ilhas de inserção e deleção genômica putativas. Também identificamos vias metabólicas relacionadas com osmoproteção/osmorregulação e com degradação de compostos aromáticos em XAC, que possivelmente são determinantes na eficácia de sua interação com o hospedeiro. Analisamos o nível de expressão de 9 CDS após crescimento de XAC em diferentes concentrações de glicose e verificamos que este açúcar modula positivamente a expressão de CDS relacionadas à síntese de goma e ao sistema de osmoproteção. Além disso, descrevemos a construção de microarranjos de DNA representando 2760 CDS de XAC, constituindo-se uma nova ferramenta para estudos de genômica comparativa e expressão gênica deste fitopatógeno. / Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) is the bacterial pathogen that causes citrus canker disease in several species of Citrus plants. XAC genome consists of a main cromosome of ~5 Mpb and two plasmids that together encode 4313 CDS (coding sequences). Approximately 63% of the CDS have assigned biological functions. In this work, we present a detailed genomic comparison between the genomes of XAC and of three other phytopathogens, X. campestris campestris, Xylella fastidiosa 9a5c and X. fastidiosa Temecula. Based on this analysis, we identified species and genus-specific genes that might be relevant for adaptation to their niches and hosts. We mapped putative insertion/deletion regions in the XAC genome possibly related to gene gains and losses during the divergence of the four bacterial lineages. We have identified the metabolic pathways related to osmoprotection/osmoregulation and aromatic compound degradation important for XAC efficient host colonization and interaction. Expression levels of 9 CDS were analyzed after XAC growth under different glucose concentrations revealing that this sugar upregulates the expression of CDS related to gum synthesis and to osmoregulation. In addition, we describe here the construction of a DNA microarray representing 2760 CDS of XAC as a new tool for comparative genomic and gene expression studies in this phytopathogen.

Orientador: Alessandra Alves de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T17:43:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caserta_Raquel_D.pdf: 28122729 bytes, checksum: f611b63be786134a0c9fbad9785006b0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A produção do suco de laranja concentrado é uma das commodities mais importantes para o agronegócio brasileiro, entretanto, os constantes problemas fitossanitários que afetam a citricultura vem aumentando os custos de produção e consequentemente a rentabilidade econômica deste setor. É urgente a busca por alternativas para solucionar os problemas fitossanitários da citricultura, nesse sentido, a utilização de transgenia mostra-se uma ferramenta promissora, pois possibilita a obtenção de plantas com genes exógenos que conferem resistência a doenças. Uma das doenças que afetam a citricultura brasileira é a clorose variegada dos citros (CVC), causada pela bactéria Xylella fastidiosa, onde todas as variedades de Citrus sinensis mostram-se suscetíveis a doença. Uma estratégia que vem sendo utilizada para resistência a X. fastidiosa que afeta a cultura de uva na Califórnia-EUA envolve a chamada "confusão do patógeno" onde utiliza-se genes do próprio patógeno visando a alteração da sinalização molecular entre as células bacterianas, interferindo em sua patogenicidade. Neste trabalho foram abordadas as transformações de Nicotiana tabacum e Citrus sinensis com o gene rpfF de X. fastidiosa causadora da CVC, envolvido na síntese de uma molécula sinalizadora que regula a expressão de genes associados a patogenicidade dessa bactéria. Eventos dos cultivares de laranja doce Hamlin e Pineapple transformados com rpfF foram desafiados com X. fastidiosa e, após avaliações nas fases inicial e avançada de sintomas, foi observada uma redução na incidência e na severidade de sintomas de CVC. A movimentação bacteriana ao longo de tais plantas também foi comprometida, sendo que a população bacteriana em pontos distantes do ponto de inoculação foi maior em plantas do tipo selvagem quando comparadas as transgênicas. Esses resultados sugerem que as moléculas produzidas pelas plantas transgênicas foram capazes de alterar o comportamento da bactéria, reduzindo sua patogenicidade. Outro fitopatógeno que ataca pomares brasileiros é Xanthomonas citri subsp. citri, que também apresenta o gene rpfF, e assim como em X. fastidiosa, é responsável pela sinalização molecular. Eventos transgênicos de Carrizo e Pineapple também foram desafiados com X. citri. Nesse patógeno, a interrupção da sinalização mediada por DSF, Diffusible Signal Factor - uma molécula de ácido graxo, reduz sua virulência, e interessantemente, sintomas de cancro cítrico foram reduzidos nas plantas transgênicas. Em folhas transgênicas não foi observado o aparecimento de pústulas, e biofilmes formados na área da inoculação foram alterados. Genes modulados por DSF em bactérias isoladas de plantas transgênicas foram reprimidos, sugerindo que a sinalização foi comprometida. Por fim, seiva das plantas transgênicas não ativou a expressão do promotor engA::GFP em Xanthomonas campestris biosensoras, indicando que a molécula produzida por essas plantas foi capaz de alterar a sinalização. Por outro lado, a seiva das plantas transgênicas ativou a expressão do hxfA::PhoA em X. fastidiosa biosensoras, indicando a funcionalidade dessa molécula para esse fitopatógeno. Portanto, em ensaios com X. citri, o DSF das plantas transgênicas atuou como antagonista, diminuindo a virulência da bactéria através da alteração da sinalização molecular. Esses resultados mostram que as moléculas sinalizadoras produzidas por plantas transformadas com rpfF de X. fastidiosa são promissoras na tentativa de controle de CVC e cancro cítrico / Abstract: The production of concentrate orange juice is one of the most important commodities for Brazilian agribusiness, however, the constant phytosanitary problems affecting the citrus industry is increasing production costs and consequently the economic profitability of this sector. It is urgent to search for alternatives to solve citrus phytosanitary problems, in this sense, the use of transgenesis shows a promising tool because it enables the production of plants with exogenous genes that confer resistance to diseases. One of the diseases that affect Brazilian citrus industry is the citrus variegated chlorosis (CVC), caused by the bacterium Xylella fastidiosa, where all varieties of Citrus sinensis are susceptible to this disease. One strategy that has been used for X. fastidiosa resistance that affects grape cultures in California-USA involves the so-called "pathogen confusion" that is related to the usage of genes of the pathogen itself aiming to change the molecular signaling between bacterial cells by interfering in its pathogenicity. In this work we will discuss the transformation of Nicotiana tabacum and Citrus sinensis with the rpfF gene isolated from X. fastidiosa causing the CVC, involved in the synthesis of a signaling molecule that regulates the expression of genes associated with pathogenicity of these bacteria. Transgenic events of Hamlin and Pineapple transformed with rpfF were inoculated with X. fastidiosa and after evaluations in early and advanced stages of symptoms, a reduction was observed in the incidence and severity of symptoms of CVC. Bacterial movement along these plants was also impaired, and the bacterial population analyzed far from the point of inoculation was higher in wild type plants compared to transgenic ones. These results suggest that the molecules produced by the transgenic plants were able to change the behavior of the bacteria, reducing its pathogenicity. Another pathogen that attacks Brazilian orchards is Xanthomonas citri subsp. citri, which also features rpfF gene, and as in X. fastidiosa is responsible for molecular signaling. Transformed plants of Carrizo and Pineapple were also challenged with X. citri. In this pathogen, the interruption of DSF-mediated signaling reduces its virulence, and interestingly, citrus canker symptoms were reduced in transgenic plants. In transgenic leaves there was no pustules development and alterations in biofilms formed in the area of inoculation were observed. Genes modulated by DSF in bacteria isolated from transgenic plants were repressed, suggesting that signaling was compromised. Finally, sap of transgenic plants did not activate the expression of the promoter engA::GFP in Xanthomonas campestris biosensors, indicating that the molecule produced by these plants was able to change the signaling. On the other hand, the sap of transgenic plants activated the expression of hxfA::PhoA in X. fastidiosa biosensors, indicating the functionality of this molecule for this pathogen. Therefore, in assays with X. citri, the DSF of transgenic plants acted as antagonist, decreasing the virulence of the bacteria by changing the molecular signaling. These results show that the signaling molecules produced by plants transformed with rpfF of X. fastidiosa are promising in the attempt to control CVC and citrus canker / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutora em Genética e Biologia Molecular