Orientador : Oswaldo Garcia Junior / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T15:20:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Novo_MariaTeresaMarques_M.pdf: 3770876 bytes, checksum: e759cfa99a47f8a9dc0e976ada11184e (MD5) Previous issue date: 1993 / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Ciências Biológicas

SOUSA, B. L. Caracterização parcial de uma pro-lectina funcional de sementes de Dioclea grandiflora Benth expressa em Escherichia coli. 2010. 93 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2010. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-10-20T20:48:10Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_blsousa.pdf: 6849680 bytes, checksum: 105bc7b39cebfb37c4461101abe896ef (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-20T13:08:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_blsousa.pdf: 6849680 bytes, checksum: 105bc7b39cebfb37c4461101abe896ef (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-20T13:08:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_blsousa.pdf: 6849680 bytes, checksum: 105bc7b39cebfb37c4461101abe896ef (MD5) Previous issue date: 2010 / The pro-lectin from Dioclea grandiflora presented active when expressed in recombinant (r-pro-DGL) in the cytoplasm of the model prokaryotic Escherichia coli. Obtained in soluble form from the pET32a vector, the recombinant protein presented apparent mass (25 kDa) and sequence (obtained by mass spectrometry) identical to the natural precursor, being unusually functional compared with other lectins of the pulses expressed heterologously having a specific activity of 134 217 728 (HU / mg). Unlike its counterpart wild r-Pro-DGL not specifically recognize glucose, and only weakly inhibited by mannose. Due to the high sequence homology among the forerunners in the subtribe lectins Diocleinae and galactose-binding lectin belonging to other tribes of legumes, there is the hypothesis that post-translational processing of this peculiar subtribe could influence decisively on the fine specificity of these proteins. However, the pro-r-DGL showed no affinity for galactose or lactose, showing that the topology of the binding site and the conformation of the loops that structure, the main specificity determinants of the monosaccharides. Thus, it can be stated that in the subtribe lectins precursors Diocleinae presents deglicosilados active while being still able to form oligomers and to establish cross-links between cell membranes. / A pro-lectina de sementes de Dioclea grandiflora apresentou-se ativa quando expressa de forma recombinante (r-pro-DGL) no citoplasma do modelo procariótico Escherichia coli. Obtida de forma solúvel a partir do vetor pET32a, a proteína recombinante apresentou massa aparente (25 kDa) e sequência (obtida por espectrometria de massas) idênticas ao precursor natural, mostrando-se atipicamente funcional em comparação a outras lectinas de leguminosas expressas de forma heteróloga, possuindo uma atividade específica de 134.217.728 (U.H./mg). Diferentemente de sua contraparte silvestre a r-pro-DGL não reconheceu especificamente glicose, sendo apenas fracamente inibida por manose. Em decorrência da alta homologia de sequência entre os precursores de lectinas na subtribo Diocleinae e lectinas ligantes de galactose pertencentes a outras tribos de leguminosas, há a hipótese de que o processamento pós-traducional peculiar dessa subtribo poderia influir de forma decisiva sobre a especificidade fina dessas proteínas. Entretanto, a r-pro-DGL não apresentou afinidade por galactose ou lactose, demonstrando ser a topologia do sítio de ligação, bem como a conformação das alças que os estruturam, os principais fatores determinantes da especificidade a monossacarídeos. Assim, pode-se afirmar que precursores de lectinas na subtribo Diocleinae apresentam-se ativos enquanto deglicosilados, sendo ainda capazes de formar oligômeros e estabelecer ligações cruzadas entre membranas celulares.

SILVA, B. H. M. Clonagem, sequenciamento e modelagem molecular por homologia da sequência parcial de uma vicilina de genótipos de feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] contrastantes em relação à resistência ao caruncho Callosobruchus maculatus. 2014. 51 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-12-03T12:02:29Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_bhmsilva.pdf: 2047999 bytes, checksum: 5b8c51e3c9bf10451a2d551396875637 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-13T14:47:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_bhmsilva.pdf: 2047999 bytes, checksum: 5b8c51e3c9bf10451a2d551396875637 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-13T14:47:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_bhmsilva.pdf: 2047999 bytes, checksum: 5b8c51e3c9bf10451a2d551396875637 (MD5) Previous issue date: 2014 / The cowpea bean [Vigna unguiculata (L.) Walp.] is a legume with high protein levels, largely cultivated and consumed in the Northeast of Brazil. Due to your economic importance, there are several studies that search resistant forms of cultivars of this kind of bean, as they is often attacked by different kinds of pests and predators. One of the most common is the weevil Callosobruchus maculatos. With the discovery of resistant cultivars for this insect many questions emerged about what biological component of the plant was responsible for such defensive action. Some studies suggest that this resistance is due to vicilin, which are reserve nutritious proteins, present in the seeds of cowpea. In this work, regions belonging to the vicilin gene of two contrasting cultivars in relation to resistence to weevil were sequenced, one resistant (IT81D-1053) and a susceptible (EPACE-10). These sequences, which come from several clones, were analyzed and thereby deducting its three-dimensional structure was made through a homology modeling using as template one 7S globulin from adzuki bean (Vigna angularis) identified as 2EA7 in the PDB database. Sequence analysis revealed that there are two regions highly variable in sequence from the vicilin gene, and these regions are rich in glutamine. Previous studies suggest that resistance to weevil occurs in the fact that the vicilin can bind to chitin and such glutamine rich regions are potentially chitin binding due to the high ability to form hydrogen bonds between the residues of glutamine and residues of N-acetylglucosamine. The structural analysis also supports this assumption, because the region rich in glutamine is very exposed, in relation to the protein surface, which facilitates the interaction of these amino acid residues with chitin. However more refined studies are needed to have a certainty of how is this interaction between vicilin and chitin, and if these same proteins are in fact fundamental in the resistance against the weevil. / O feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] é uma leguminosa com alto teor de proteínas, muito consumida e cultivada na região Nordeste do Brasil. Devido a sua importância econômica, existem vários estudos que procuram formas de cultivares resistentes desta espécie de feijão, pois esta é muito atacada por diversos tipos de pragas e predadores. Um dos mais comuns é o caruncho Callosobruchus maculatos. Com a descoberta de cultivares resistentes a este inseto, questionou-se sobre o componente biológico da planta responsável por tal ação defensiva. Alguns estudos sugerem que essa resistência ocorre devido as vicilinas, que são proteínas de reserva nutritiva, presentes nas sementes do feijão-de-corda. No presente trabalho, foram sequenciadas regiões pertencentes ao gene de vicilina de dois cultivares contrastantes em relação ao ataque do caruncho, sendo um resistente (IT81D-1053) e outro suscetível (EPACE-10). Essas sequências, advindas de vários clones, foram analisadas e com isso foi feita a dedução de sua estrutura tridimensional através de uma modelagem por homologia, utilizando como molde uma globulina 7S de feijão-azuki (Vigna angularis) identificada como 2EA7 no banco de dados PDB. A análise das sequências revelou que há duas regiões bastante variáveis na sequência do gene da vicilina, sendo essas regiões ricas em glutamina. Estudos anteriores sugerem que a resistência ao gorgulho se dá no fato de que as vicilinas conseguem se ligar a quitina, e tais regiões são potencialmente ligantes a quitina devido a grande capacidade de formar ligações de hidrogênio entre os resíduos de glutamina e os resíduos de N-acetilglucosamina. A análise estrutural também corrobora esta hipótese, pois a região rica em glutamina é bastante exposta, em relação à superfície proteica, o que facilita a interação destes resíduos de aminoácidos interagirem com a quitina. Entretanto estudos mais refinados são necessários para se ter uma maior certeza de como se dá esta interação entre vicilinas e a quitina, e se de fato essas proteínas são mesmo fundamentais na resistência contra o caruncho.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:31:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 320339.pdf: 2205000 bytes, checksum: da7248619a58600198bc8e13a2b84fa8 (MD5) Previous issue date: 2013 / O Trypanosoma (Herpetosoma) rangeli é um protozoário hemoflagelado de ciclo heteroxênico. Apesar de não ser patogênico para o hospedeiro mamífero, incluindo seres humanos, infecções por este parasito podem dificultar o diagnóstico da doença de Chagas. Vários aspectos relativos ao curso da infecção do T. rangeli no hospedeiro mamífero são controversos, incluindo o mecanismo de invasão e multiplicação celular neste hospedeiro. A enzima Oligopeptidase B (OpB) está fortemente relacionada com o processo de invasão celular e patogenicidade de vários tripanosomatídeos, sendo um alvo promissor para o desenvolvimento de quimioterápicos. A OpB de T. rangeli é codificada por uma ORF de 2.139 pb que é traduzida para um polipeptídeo de 713 aminoácidos com 80.2 kDa de massa molecular. A sequência aminoacídica da OpB de T. rangeli, que corresponde a família das prolil endopeptidases, apresenta similaridade de 89,9% com T. cruzi, 86% com T. brucei e 85,5% com T. evansi, estando o domínio catalítico característico da família bastante conservado entre estes organismos. A OpB é expressa nas formas epimastigotas e tripomastigotas de T. rangeli, sendo sua atividade mensurada através da emissão de fluorescência resultante da mobilização de Ca+2 da célula hospedeira em ensaios in vitro. Os extratos proteicos das formas tripomastigotas de T. rangeli apresentaram uma emissão de fluorescência estatisticamente significativa (p < 0,01) em relação aos controles. O tratamento dos extratos proteicos com o soro anti-OpB reduziu a emissão da fluorescência de todos os extratos, no entanto, apenas para os extratos das formas tripomastigotas de T. cruzi essa redução foi significativa. A OpBr teve uma emissão de fluorescência próxima do basal revelando ausência de atividade da proteína recombinante. A avaliação da expressão da OpB durante a interação parasitos/célula hospedeira mostrou um aumento significativo (p < 0,01) da expressão da OpB em T. rangeli após trinta minutos de interação em relação aos parasitos que não entraram em contato com as células. Estes resultados demonstram o envolvimento da OpB no processo de interação do T. rangeli com a célula do hospedeiro mamífero, constituindo um importante alvo de estudo para o esclarecimento do processo de interação parasito/célula. <br>

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2009-11-27T17:48:52Z No. of bitstreams: 1 2007_CristianeTeresinhaCitadin.PDF: 832748 bytes, checksum: 688c6b38f2c1ae4b194876b2ad829e89 (MD5) / Rejected by Joanita Pereira(joanita), reason: Elna, está faltando o "Abstract" Joanita on 2009-11-27T17:50:34Z (GMT) / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2009-11-27T18:02:10Z No. of bitstreams: 1 2007_CristianeTeresinhaCitadin.PDF: 832748 bytes, checksum: 688c6b38f2c1ae4b194876b2ad829e89 (MD5) / Approved for entry into archive by Joanita Pereira(joanita) on 2009-11-27T19:36:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_CristianeTeresinhaCitadin.PDF: 832748 bytes, checksum: 688c6b38f2c1ae4b194876b2ad829e89 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-27T19:36:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_CristianeTeresinhaCitadin.PDF: 832748 bytes, checksum: 688c6b38f2c1ae4b194876b2ad829e89 (MD5) Previous issue date: 2007 / Ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 são moléculas presentes em óleos que têm fundamental importância na manutenção da saúde humana, e precisam ser ingeridos na alimentação. Atenção especial é dada aos ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa (LCPUFAs) ômega-3 como o ácido eicosapentaenóico (EPA) e o ácido docosahexaenóico (DHA) devido à sua influência na prevenção e modulação de certas condições patológicas como a obesidade e doenças cardiovasculares e pela sua essencialidade no desenvolvimento do cérebro e retina. A principal fonte desses LCPUFAs são peixes, em especial os de águas marinhas frias e profundas. Estudos têm mostrado que esses óleos presentes nos peixes provêm da ingestão de organismos que constituem o zooplâncton, os quais têm as microalgas produtoras de LCPUFAs como seu principal alimento. Dentre as microalgas produtoras de altos perfis de EPA e DHA estão as diatomáceas, que, por esse motivo, se destacam para o estudo da rota biossintética de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 como uma fonte de genes. Com o objetivo de contribuir com o avanço do conhecimento de rotas de biossíntese de LCPUFAs, reportamos a análise parcial do genoma funcional da diatomácea Thalassiosira fluviatilis. Para tanto, foram confeccionadas duas bibliotecas de cDNA das diatomáceas produtoras de altos perfis de LCPUFAs, Thalassiosira fluviatilis e Chaetoceros muelleri e temos como meta futura realizar análise comparativa do genoma funcional das duas microalgas junto a outras informações de genoma funcional de algas já reportadas. Adicionalmente, buscando gerar ferramentas moleculares que possam ser utilizadas na produção de plantas oleaginosas capazes de produzir LCPUFAs por meio de transgenia, reportamos a clonagem e caracterização do gene codificador da enzima Δ6-dessaturase, a primeira enzima envolvida na biossíntese de EPA e DHA, responsável pela produção de ácido estearidônico, intermediário ao EPA produzido a partir do ácido α- linolenico. O cDNA usado para confeccionar a biblioteca de T. fluviatilis foi usado como template para amplificar e isolar o gene da Δ6-dessaturase por meio das técnicas de PCR e RACE. O gene obtido contém uma ORF de 1455 nucleotídeos, que codifica uma proteína putativa de 484 resíduos de aminoácidos. A seqüência total inclui uma região 3´ UTR de 120 nucleotídeos. A proteína predita apresenta um domínio citocromo b5 fusionado à extremidade N-terminal e três motivos histidina-box conservados como em outras dessaturases descritas, apresentando também alta identidade com a Δ6-dessaturase de Thalassiosira pseudonana. Ao todo foram seqüenciadas 1920 ESTs da biblioteca de cDNA de T. fluviatilis na extremidade 5´ e em seguida validadas e analisadas no programa Sistema Genoma. Dessas, 1090 foram validadas gerando 775 clusters, compreendendo 628 singletons e 147 contigs. Dentre os clusters, 165 apresentaram identidade com proteínas depositadas no GenBank, 109 apresentaram identidade com seqüências nucleotídicas de T. pseudonana e 36 clusters tiveram identidade com seqüências ESTs do GenBank. Um total de 579 clusters não apresentou identidade com nenhuma seqüência dentre os bancos e algoritmos analisados, sendo exclusivas de T. fluviatilis. Na mesma análise foram encontrados 7 genes de enzimas envolvidas com metabolismo de ácidos graxos sendo que 4 deles compreendem enzimas envolvidas na biossíntese de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, mostrando que é possível encontrar genes desta rota por meio do seqüênciamento massivo e gerando informações para entendimento da via de síntese de ácidos graxos ômega-3 dessa microalga. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Omega 3 polyunsaturated fatty acids are molecules found in oils that are of fundamental importance in the maintenance of human health, that need to be consumed by the humans. Special attention is given to the omega 3 long chain polyunsaturated fatty acids (LCPUFAs), like eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) due to their influence in the prevention and modulation of certain pathological conditions like obesity and cardiovascular diseases and by their essentiality to brain and retina development. The main sources of LCPUFAs are fishes, specially those of deep and cold marine waters. Several studies have demonstrated that these oils found in the fishes come from their zooplancton ingestion of organisms, which contain microalgae that produce large amounts of LCPUFAs. Among these microalgae are those of the diatomacea family, and due to these are good candidates for the study of the omega 3 biosynthetic pathway and corresponding genes. Here we report a partial functional genome analysis of the diatomacea Thalassiosira fluviatilis, with the objective of contributing to the further understanding of the biosynthetic pathway of LCPUFAs. To accomplish that, two cDNA libraries of two omega 3 diatomacea producers were constructed, Thalassiosira fluviatilis e Chaetoceros muelleri. It is our goal in the future to do a comparative functional genome analysis of the two microalgae with others reported in the literature. With the objective of generating molecular tools for molecular engineering of LCPUFAs in plants, we report the cloning and characterization of the gene encoding Δ6-desaturase, the first enzyme envolved in the synthesis of EPA and DHA, responsible for the production of the intermediate stearidonic acid from α- linolenic acid. T. fluviatilis cDNA, originally used to make the cDNA library, was used as a template to isolate and clone the gene encoding Δ6-desaturase using PCR and RACE approaches. The gene cloned has an ORF of 1455 nucleotides, encoding a putative protein of 484 aminoacid residues. The total sequence includes a 3´UTR of 120 nucleotides. The predicted protein has a cytochrome b5 domain fused at the N-terminal and three histidine-box conserved motifs as described in other desaturases; the predicted protein has also high identity with the Δ6-desaturase from Thalassiosira pseudonana. Regarding the analysis of the cDNA libray of T. fluviatilis, 1920 ESTs were ). Those, 1090 sequences were validated generating 775 clusters, comprehending 628 singletons and 147 contigs. Within the clusters, 165 presented identity with proteins deposited in the GenBank, 109 presented identity with nucleotide sequences of T. pseudonana and 36 clusters had identity with EST sequences from GenBank. A totality of 579 clusters did not have identity with any sequence within the bank and algorithms analyzed, being exclusives to T. fluviatilis. In the analysis were identified 07 genes envolved in the fatty acid metabolism, 04 of them been comprehending genes encoding enzymes envolved in the biosynthesis of omega 3 polyunsaturated fatty acids, indicating that it massive sequencing of EST is a good approach to cloning genes envolved in the omega 3 pathway in microalgae. sequenced starting from the 5´ end and the sequences validated and analyzed using the Program “Sistema Genoma” (www.genoma.embrapa.br).Those, 1090 sequences were validated generating 775 clusters, comprehending 628 singletons and 147 contigs. Within the clusters, 165 presented identity with proteins deposited in the GenBank, 109 presented identity with nucleotide sequences of T. pseudonana and 36 clusters had identity with EST sequences from GenBank. A totality of 579 clusters did not have identity with any sequence within the bank and algorithms analyzed, being exclusives to T. fluviatilis. In the analysis were identified 07 genes envolved in the fatty acid metabolism, 04 of them been comprehending genes encoding enzymes envolved in the biosynthesis of omega 3 polyunsaturated fatty acids, indicating that it massive sequencing of EST is a good approach to cloning genes envolved in the omega 3 pathway in microalgae.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by Aline Jacob (alinesjacob@hotmail.com) on 2010-01-06T22:52:25Z No. of bitstreams: 1 2007_RaimundoWagnerdeSouzaAguiar.pdf: 2643123 bytes, checksum: 4bfa3f7a8334f4585e9ea45cd73d4b58 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-01-06T23:23:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_RaimundoWagnerdeSouzaAguiar.pdf: 2643123 bytes, checksum: 4bfa3f7a8334f4585e9ea45cd73d4b58 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-06T23:23:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_RaimundoWagnerdeSouzaAguiar.pdf: 2643123 bytes, checksum: 4bfa3f7a8334f4585e9ea45cd73d4b58 (MD5) Previous issue date: 2007-02-23 / Os genes cry1Ca, cry2Ab e cry10Aa de diferentes estirpes brasileiras de Bacillus thuringiensis foram amplificados por PCR, clonados em um vetor de clonagem e seqüenciados. As análises das seqüências mostraram alta identidade com outros genes cry já descritos. Os genes foram removidos dos vetores de clonagem e introduzidos em um plasmídeo vetor de transferência (pSynXIVVI+X3) para construção de baculovírus recombinantes por recombinação homóloga. Os vírus recombinantes foram purificados por diluição seriada em placa de 96 poços e usados para infectar células de Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4) e larvas de Spodoptera frugiperda. A análise transcricional dos genes cry2Ab e cry10Aa foi realizada por RT-PCR, a partir de mRNA extraído de células de inseto infectadas (72 h p.i.), para confirmação da presença de um transcrito específico para os genes. Extratos de larvas infectadas (96 h p.i.) com os vírus vSyncry1Ca, vSyncry2Ab e vSyncry10Aa foram usados para purificação dos cristais das proteínas recombinantes por ultracentrifugação. Em SDS-PAGE, os extratos apresentaram polipeptídeos de aproximadamente 65, 65 e 74 kDa, correspondentes, respectivamente, ao tamanho das proteínas Cry1Ca, Cry2Ab e Cry10Aa. Estes mesmos cristais foram analisados por microscopia de luz e eletrônica e mostraram-se na forma de grandes cristais cubóides. A toxicidade dos cristais das proteínas recombinantes foram verificadas para larvas de segundo instar de S. frugiperda e Anticarsia gemmatalis (Cry1Ca, sendo a CL de 114,44 e 19,49 ng/mL, respectivamente), e a proteína 50 Cry2Ab recombinate foi tóxica para larvas de S. Frugiperda (CL de 3,40 g/mL). No 50 entanto, a proteína Cry10Aa recombinante foi altamente tóxica para larvas neonatas de de 7,12 g /mL. Neste trabalho, foi demonstrado que proteínas A. grandis com CL 50 Cry recombinants são similares às proteínas naturais, possuindo alta toxicidade para diferentes insetos-praga, o que confirma a utilidade do sistema de expressão baseado em baculovírus e células de inseto para o estudo de proteínas Cry. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The cry1Ca, cry2Ab and cry10Aa genes from different Brazilian strains of Bacillus thuringiensis were amplified by PCR, cloned into a plasmid cloning vector and sequenced. Sequence analysis showed high identity to previous known cry genes. The genes were removed from the cloning vector and introduced into a transfer vector (pSynXIVVI+X3) for the construction of recombinant baculoviruses by homologous recombination. The recombinant viruses were purified by serial dilution in 96 well plates and used to infect Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4) insect cells and Spodoptera frugiperda larvae. Transcritptional analysis of the cry2Ab and cry10Aa genes was carried out by RT-PCR, using mRNA extracted from infected insect cells (72 h p.i.), in order to confirm the presence of the gene specific transcript. Recombinant virus (vSyncry1Ca, vSyncry2Ab and vSyncry10Aa) infected insect extracts (96 h p.i.) were used for the purificaton of crystals, made of recombinant proteins, by ultracentrifugation. In SDS-PAGE, the insect extracts showed polypeptides of approximately 65, 65 and 74 kDa, corresponding, respectively to the sizes of the proteins Cry1Ca Cry2Ab e Cry10Aa. These same crystals were analysed by light and electron microscopy and showed the shape of big cuboidal crystals. Furthermore, the crystals preparations were toxic to second instar S. frugiperda and Anticarsia gemmatalis larvae, with a CL of 114,44 and 19,49 ng/mL, respectively (from 50 vSynCry1Ca-infected insect extracts), to second instar S. frugiperda, with a CL de 50 3,40 g/mL (from vSynCry2Ab-infected insect extracts) and neonate A. grandis larvae, of 7,12 g /mL (from vSynCry10Aa-infected insect extracts). This work with a CL 50 showed that recombinant Cry proteíns are similar to their natural couterpart, showing the high toxicity to different insect pests, which demonstrate the utility of the baculovirus expression system for the study of Cry proteins.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2011. / Submitted by wiliam de oliveira aguiar (wiliam@bce.unb.br) on 2011-06-27T18:16:44Z No. of bitstreams: 1 2011_VivianeFragosodeMoura.pdf: 5516564 bytes, checksum: 1b1c091113de81ab04eec5f549dae9a3 (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-06-27T20:33:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_VivianeFragosodeMoura.pdf: 5516564 bytes, checksum: 1b1c091113de81ab04eec5f549dae9a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-27T20:33:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_VivianeFragosodeMoura.pdf: 5516564 bytes, checksum: 1b1c091113de81ab04eec5f549dae9a3 (MD5) / A doença de Chagas, após 100 anos de sua descrição, ainda é considerada uma enfermidade negligenciada e de grande importância social, sendo destacada como uma das doenças mais endêmicas da América Latina. O cenário epidemiológico associado à ausência de quimioterapia adequada tem incentivado programas governamentais de prevenção e controle e influenciado grupos de pesquisadores a buscarem o desenvolvimento de novos fármacos. A linha de pesquisa do nosso grupo visa à identificação e caracterização molecular de proteases como potenciais alvos de drogas, Nesse sentido, este trabalho descreve o estudo de uma metionina aminopeptidase de T.cruzi (MAPTc). MAPTc é uma enzima putativa de 476 resíduos de aminoácidos com a massa molecular esperada de 47 kDa, sendo altamente conservada em cinetoplastídeos. O alinhamento de sequências protéicas de metionina aminopeptidases (MAPs) de humano e de T. cruzi demonstrou identidade reduzida, o que contribui para tornar a MAPTc um alvo promissor para desenvolvimento de drogas. A proteína recombinante foi expressa solúvel e inativa em E.coli BL 21(DE3) e purificada para produção de anticorpos em camundongos. Os soros obtidos após as imunizações foram utilizados nos experimentos de immunoblotting e imunocitolocalização na tentativa de confirmar a expressão da proteína. A expressão da proteína foi confirmada nas formas epimastigotas do parasita e a mesma parece estar localizada no citoplasma. Para verificar a atividade de MAPTc, foram realizados ensaios enzimáticos com o substrato fluorogênico MET-AMC. No entanto, não foram alcançados resultados satisfatórios nas condições testadas, indicando que a proteína recombinante foi produzida na sua forma inativa. Testes com TNP470, um inibidor conhecido de metionina aminopeptidases, em formas epimastigotas do parasito, não revelaram um efeito inibitório. Por fim, foi proposto um modelo para MAPTc baseado na estrutura cristalográfica da Metionina Aminopeptidase Humana tipo I, PDB 2B3H. / Chagas’ disease even after 100 years of its depiction is still considered a neglected disease of great social importance, being highlighted as one of the endemic diseases in Latin America. The absence of an appropriate chemotherapy and its epidemiology have motivated government programs to prevent its transmission and stimulated groups of researchers to pursue the development of new drugs with reduced side effects. Our research group aims the identification and molecular characterization of proteases as potential drug targets. In that sense, this master’s thesis describes the study of a methionine aminopeptidase of Trypanosoma cruzi (MAPTc). MAPTc is a putative enzyme of 476 amino acid residues with an expected molecular mass of 47 kDa and highly conserved in the kinetoplastids. Protein sequence alignment of human and T. cruzi methionine aminopeptidase (MAPs) showed reduced identity, which helps to make MAPTc a promising target for drug development. The recombinant protein was expressed in its soluble and inactive form in E.coli BL 21 (DE3). It was purified and employed in the production of antibodies in mice that were used to investigate MAPTc expression.In experiments of immunobloting and immunocytolocalization revealed that the protein is expressed by epimastigote forms and located in the cytoplasm of the parasite. Assays with fluorogenic substrate MET-AMC were performed to access the activity of MAPTc. However, no success was achieved under the conditions tested, suggesting that the recombinant protein was produced in its inactive form. Also, tests were performed with TNP470, a well-known inhibitor of methionine aminopeptidase, on epimastigote forms of the parasite. However, these tests did not show an inhibitory effect. Finally, a model was proposed to MAPTc based on the crystal structure of the human methionine aminopeptidase type I, PDB 2B3H.

O DNA de plasmídeos naturais de uma cepa de B. stearothermophilus foi clivado com a enzima de restrição Hind III e os fragmentos resultantes foram ligados com T 4 DNA ligase ao vetor pBR 322 (Bolívar et. al., 1977) que já havia sido previamente tratado com Hind III e fosfatase alcalina. A terça parte desta mistura de ligação foi usada para transformar células de E. coli HB 101. Foram obtidos cerca de 3.500 transformantes, dos quais 46% eram recombinantes. Duas cepas que mostraram caracter amilolítico consideravelmente maior que a doadora do gene continham o plasmídeo pBR 322 com uma inserção de 5.4 Kb. O mapa de restrição, tratamento com a enzima BAL 31 e, sucessivas subclonagens (Silva, E.F. et. al.,1986)mostraram que o gene que codifica e expressa a enzima amilolítica está contido em um fragmento de 2 Kb. A enzima produzida pelas células transformadas tem peso molecular de 60.000, é estabilizada por Ca+2, tem um ótimo de temperatura de 72ºC e retém 90% da atividade original após aquecimento a 85°C por 1 hora. Estes resultados, em conjunto com a análise dos produtos de hidrólise desta enzima em cromatografia de papel, sugerem que foi clonada a alfa - amilase de B. stearothermophilus em células de E. coli. Células de duas cêpas de B. subtilis, IA 289 e BD 241 foram transformadas respectivamente com os plasmídeos p USP 33.2 (Silva, E.F. et al., 1986;1987) e p BU 217 ami 2 (Silva, E.F. & Pueyo, M.T.,1988) para produzir em ambos os casos colônias fortemente amiloliticas. Os mecanismos pelos quais as 2 cêpas passaram a apresentar o fenótipo AMY + , são provavelmente diferentes. / The DNA of natural plasmids. from a B. stearothermophilus strain was cut with Hind III endonuclease and the resulting fragments were joined with T4 DNA ligase to the vector pBR 322 (Bolivar et al. , 1977), which had previously been treated with Hind III and alkaline phosphatase. One-third of the ligation mixture was used to transform E. coli HB 101 cells. It was obtained about 3.500 transformants, which included 46% recombinans. Two strains displayng amylolytic act ivity remarkably higher than the donor gene strain, harbored the plasmid pBR 322 with an insertion of 5.4 kb. The restriction map, Bal 31 treatment and successive subcloning (Silva, E.F, et al.,1986) showed that the entire gene which codifies and allows the expression of the amylolytic enzyme is contained in a 2 Kb fragment. The enzyme has a molecular weight of 60.000, is stabilized by Cata, has a temperature optimum at 72°C and retains 90% of the original activity after heating for 1h at 85°C. These features, together with the analysis of hydrolysis produts carried on paper chromatography , suggests that we succeded in cloning the amylase from B. stearothermophilus in E. coli cells. Cells from two B. subtilis strains, IQ 289 and BD 241 were transformed with the plasmid sp USP 33.2 (Silva E. F. et al., 1986 1987) and pBU 271 ami 2 (Silva, E. F. & Pueyo, M.T., 1988) , and produce in both strains, amyiolytic colonies. The methods in which the two strains have got the AMY + fenotype, may be very different.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-24Bitstream added on 2014-06-13T21:05:09Z : No. of bitstreams: 1 brito_gnb_dr_sjc.pdf: 2623888 bytes, checksum: 9b38ae1778541597981089a1c5d9b974 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os Transtornos alimentares (TA) como Anorexia Nervosa (AN) e Bulimia Nervosa (BN) são acompanhados de inúmeras alterações sistêmicas e bucais relacionadas ao comprometimento do estado nutricional e às práticas compensatórias inadequadas para o controle do peso. O objetivo deste estudo foi avaliar diversidade microbiológica existente na cavidade bucal de pacientes com estes transtornos, por meio de técnicas de cultivo e utilizando métodos moleculares independentes de cultivo. Foram incluídos no estudo 32 pacientes anoréxicos e 27 bulímicos, pareados com 59 indivíduos controle. Amostras de enxágüe bucal foram semeadas para a avaliação da prevalência de leveduras do gênero Candida, estafilococos, enterococos, estreptococcos do grupo mutans (EGM), lactobacilos, enterobactérias/pseudomonas. Espécies de Candida, estafilococos, enterococos, enterobactérias/pseudomonas foram identificadas pelo sistema API. Amostras de biofilme supragengival foram coletadas e utilizadas somente nos procedimentos moleculares. As contagens de microrganismos nos grupos foram comparadas por ANOVA/Mann-Whitney (5%). Houve diferença estatisticamente significantes (p<0,05) para as contagem de leveduras do gênero Candida, estafilococos, enterococos, EGM e lactobacilos entre o grupo TA e controle, mas não houve diferenças significativas para a prevalência de enterobactérias/pseudomonas (p=0,312). Pequena diferença entre os grupos foi observada na diversidade de espécies dos microrganismos estudados pelo método de cultivo. Avaliação molecular foi realizada pela ribotipagem por seqüenciamento do 16S rRNA bacteriano e regiões D1/D2 do 28S rRNA. Foram avaliados cerca de 3000 clones do grupo TA e 1500 clones do controle. Sessenta e duas espécies ou filotipos de bactérias foram detectados... / Eating disorders such as nervous Anorexia and Bulimia Nervosa have several clinical and oral alterations related to the nutritional state involvement and the inadequate compensatory practices for weight control. The aim of this study was to evaluate the microbial diversity in the oral cavity of patients with Anorexia Nervosa and Bulimia nervosa by cultivation techniques and cultivationindependent molecular methods. The study included 32 patients and 27 bulimic anorexics, matched with 59 control subjects. Oral rinse samples were cultured to assess the prevalence of Candida species, staphylococci, enterococci, streptococci mutans (EGM), lactobacilli, Enterobacteriaceae / Pseudomonas. Candida species, staphylococci, enterococci, Enterobacteriaceae / Pseudomonas were identified by API systems. Supragingival biofilm samples were collected and used only in molecular procedures. Counts of microorganisms in the groups were compared by ANOVA / Mann-Whitney (5%). There was a statistically significant (p <0.05) for the counting of yeasts, staphylococci, enterococci, and lactobacilli EGM between TA and control groups, but there were no significant differences in the prevalence of Enterobacteriaceae / Pseudomonas (p = 0.312). Few differences between the groups were observed in the species diversity of organisms studied by the method of cultivation. Molecular analysis was performed by ribotyping by sequencing the 16S rRNA bacterial and D1/D2 regions of 28S rRNA. About 3000 clones of the TA group and 1500 clones of control were evaluated. Sixty-two species or filotypes of bacteria were detected, with 22 identifications were found only in the study group, only 6 in the control group and 34 in both groups. Microorganisms related to caries and periodontal diseases... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Janete Apparecida Desidério / Banca: Vivian Boter Bergamasco / Banca: Jackson Antonio Marcondes de Souza / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito inseticida das proteínas Cry1Ia10 e Cry8 contra larvas de Anthonomus grandis Boheman (Coleoptera: Curculionidae), buscando por potencial sinérgico. Para tanto, o gene cry8 foi amplificado por PCR a partir de um clone previamente construído, obtendo-se um fragmento de aproximadamente 3531 pb e subclonado no vetor de expressão pET-SUMO. Para a expressão dos genes cry1Ia10 e cry8, os DNAs recombinantes foram inseridos em células de Escherichia coli BL21 (DE3) e induzidos por isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG), resultando em proteínas de 94 kDa e 143 kDa, respectivamente, visualizadas em SDS-PAGE. As proteínas foram quantificadas através do software ImageQuant TL 8.1" (GE Healthcare), para que fosse possível a realização dos cálculos de diluição nas respectivas concentrações incorporadas à dieta artificial, a fim de estimar a CL50 e CL90 das duas proteínas testadas sozinhas e em conjunto. Com base na sequência de aminoácidos de proteínas da classe Cry8, análises filogenéticas foram realizadas para investigar proximidade evolutiva da proteína Cry8 utilizada neste trabalho com as demais proteínas na mesma classe. Através dessas análises, sugerimos que a proteína em questão pertence à subclasse Cry8Pa devido a elevada proximidade filogenética e similaridade com a proteína Cry8Pa2. Observou-se que as proteínas Cry1Ia10 e Cry8 apresentaram ação inseticida contra larvas neonatas de A. grandis, obtendo-se as CL50 de 7,232 µg ml-1 e ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this work was to evaluate the insecticidal effect of Cry1Ia10 and Cry8 proteins against Anthonomus grandis Boheman larvae (Coleoptera: Curculionidae), searching for synergistic potential. To do so, the cry8 gene was amplified by PCR from a previously constructed clone, obtaining a fragment of approximately 3531 bp and subcloned into the pET-SUMO expression vector. For the expression of the cry1Ia10 and cry8 genes, the recombinant DNAs were inserted into Escherichia coli BL21 (DE3) and isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside (IPTG) cells, resulting in 94 kDa and 143 kDa proteins, respectively, visualized on SDS-PAGE. The proteins were quantified using ImageQuant TL 8.1 software (GE Healthcare) to allow the calculation of dilution in the respective concentrations incorporated into the artificial diet in order to estimate the LC50 and CL90 of the two proteins tested alone and together. Based on the amino acid sequence of Cry8 class proteins, phylogenetic analyzes were performed to investigate evolutionary proximity of the Cry8 protein used in this work with the other proteins in the same class. Through these analyzes, we suggest that the protein in question belongs to the subclass Cry8Pa due to its high phylogenetic proximity and similarity to the Cry8Pa2 protein. It was observed that the proteins Cry1Ia10 and Cry8 showed insecticidal action against neonatal larvae of A. grandis, obtaining the LC50 of 7.232 μg ml-1 and 4.422 μg ml-1 for Cry1Ia10 and Cry8 respectively. When combined the proteins at LC50 is reduced to 2,664 μg ml-1 and CL90 to 13,535 μg ml1 showed synergism, potentiating the insecticidal action of the same. This study concludes that A. grandis larvae are susceptible to Cry1Ia10 and Cry8 proteins and that the combination between them increa... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre