O aumento da incidência de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiplas drogas tornou urgente a necessidade de novos agentes terapêuticos para o tratamento da tuberculose. A via do ácido chiquímico é essencial para a sobrevivência deste organismo, o que torna suas enzimas interessantes alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos. A enzima corismato sintase (MtCS) foi identificada no genoma de M. tuberculosis por homologia de seqüência. Esta enzima catalisa a síntese NADH- e FMN-dependente de ácido corísmico, precursor de aminoácidos aromáticos, naftoquinonas, menaquinonas e micobactinas. Este trabalho descreve a clonagem, super-expressão e purificação até a homogeneidade da MtCS recombinante. As medidas das atividades das reações de corismato sintase e de NADH:FMN oxidoredutase comprovaram a bifuncionalidade da MtCS. A atividade de flavina redutase foi caracterizada, mostrando a existência de um complexo estável entre FMNOX e MtCS. Efeitos isotópicos primários de deutério e de solvente foram realizados, e sugerem etapas distintas para a transferência do próton e para a transferência do hidreto, com o último contribuindo mais fortemente para a etapa limitante da reação. Os resultados descritos aqui auxiliarão no desenho racional de novos agentes contra tuberculose. / The emergence of multi-drug resistance Mycobacterium tuberculosis has created an urgent need for new agents to treat tuberculosis. The enzymes of shikimate pathway are attractive targets to the development of these agents, since experimental evidence that this pathway is essential for M. tuberculosis has been reported. Chorismate synthase (MtCS) has been identified by sequence homology in the genome of M. tuberculosis. This enzyme catalyzes the NADH- and FMN-dependent synthesis of chorismate, a precursor of aromatic amino acids, naphthoquinones, menaquinones, and mycobactins. In the present work, we describe MtCS cloning, overexpression and purification of recombinant protein to homogeneity. The bifunctionality of MtCS was determined by measurements both chorismate synthase and NADH:FMN oxidoreductase activities. The flavin reductase activity was characterized, showing the existence of a stable complex between FMNox and MtCS. Primary deuterium and solvent kinetic isotope effects are described and suggest distinct steps for hydride and proton transfers, with the former being more rate-limiting. These results should pave the way for the rational design of antitubercular agents.

A formação de espiguetas multiflora é uma característica complexa devido à sua expressividade variável. Os mecanismos genéticos e moleculares que controlam o caráter espiguetas multiflora ainda não são completamente compreendidos em aveia. Os objetivos deste estudo foram: i) caracterizar duas populações de linhagens recombinantes de aveia para o caráter espiguetas multiflora; ii) determinar o número de genes que controla o caráter espiguetas multiflora em aveia e, iii) identificar, clonar, sequenciar e caracterizar sequências codificantes associadas a genes candidatos ao controle da formação de espiguetas multiflora em aveia. As populações de aveia “UFRGS 01B7114-1-3 x UFRGS 006013-1” e “URS Taura x UFRGS 017004-2” foram avaliadas para o caráter espiguetas multiflora, em duas épocas de semeadura, no ano de 2014. A formação de espiguetas normais, multiflora e mosaico, em cada um dos terços da panícula e na panícula inteira foi analisada. Pares de primers específicos para o gene AP2 foram desenvolvidos a partir do alinhamento de sequências homólogas de diferentes espécies de gramíneas Pares de primers para os genes Vrn1 e AGL6 também foram utilizados para amplificar e clonar sequências de aveia. A expressão das espiguetas multiflora ao longo da panícula foi alterada nas populações avaliadas em função da época de semeadura. A semeadura tardia aumentou a formação de espiguetas multiflora e reduziu o número de espiguetas mosaico, nas duas populações. A análise genética indicou a presença de um gene maior controlando o caráter espiguetas multiflora em aveia hexaploide. A análise molecular revelou a presença de duas variações alélicas dos genes Vrn1 e AP2 nos genótipos URS Taura e UFRGS 017004-2, indicando que o gene AP2 deve estar conservado em aveia. Uma sequência do gene AGL6 também foi isolada nestes genitores. A existência de polimorfismos moleculares nos genes Vrn1, AP2 e AGL6 pode ser determinante para a expressão do caráter espiguetas multiflora. Estudos complementares poderão confirmar a associação destes genes com a formação de espiguetas multiflora em aveia. / The formation of multiflorous spikelet is a complex character due to its variable expressivity. Genetic and molecular mechanisms that control the character multiflorous spikelet are not fully understood in oats. The objectives of this study were: i) to characterize two populations of recombinants oat lines to the character multiflorous spikelet; ii) to determine the number of genes controlling the character multiflorous spikelet in oats; and iii) to identify, clone, sequence and characterize coding sequences associated with candidate genes to control the formation of multiflorous spikelet in oats. The character multiflorous spikelet was evaluated in the oat populations “UFRGS 01B7114-1-3 x UFRGS 006013-1” and “URS Taura x UFRGS 017004-2”, in two sowing dates, in the year of 2014. The formation of normal, multiflorous and mosaic spikelets was analyzed in each third of the panicle and in the whole panicle. Specific primer pairs for the gene AP2 were developed from the alignment of homologous sequences from different grass species. Specific primer pairs for the genes Vrn1 and AGL6 were also utilized for amplifying and cloning oat sequences. The expression of multiflorous spikelets along the panicle was dependent on the sowing date in each evaluated population. The late sowing increased the formation of multiflorous spikelet and decreased the number of mosaic spikelets, in both populations. Genetic analysis indicated the presence of one major gene controlling the character multiflorous spikelet in hexaploid oat. Molecular analysis revealed the presence of two allelic variants of the genes Vrn1 and AP2 in the genotypes URS Taura and UFRGS 017004-2, indicating that AP2 might be conserved in oats. One sequence of the gene AGL6 was also isolated in these genotypes. The existence of molecular polymorphisms in the genes Vrn1, AP2 and AGL6 can be crucial for the expression of the character multiflorous spikelet. Further studies may confirm the association of these genes with the formation of multiflorous spikelets in oats.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-04-12T17:42:29Z No. of bitstreams: 1 2009_MarcianoRegisRubini.pdf: 2622231 bytes, checksum: f773aa263b3bbdea97f0aa7e2286386a (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-03T21:06:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_MarcianoRegisRubini.pdf: 2622231 bytes, checksum: f773aa263b3bbdea97f0aa7e2286386a (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-03T21:06:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_MarcianoRegisRubini.pdf: 2622231 bytes, checksum: f773aa263b3bbdea97f0aa7e2286386a (MD5) Previous issue date: 2009-08 / Neste trabalho foram realizados estudos pioneiros de Biologia Molecular com o fungo Penicillium echinulatum linhagem 9A02S1 (DSM 18942), que resultaram no primeiro isolamento e caracterização de um cDNA correspondente ao gene egl1, codificador da endoglicanase 1 (EGL1). O cDNA egl1 foi obtido a partir de uma biblioteca construída sob condições de indução do sistema celulolitico deste fungo. Sua sequência, de 1161 pares de bases, exibe alto grau de identidade com genes de endoglicanases fúngicas da família 5A. Este codifica uma proteína predita de 387 resíduos de aminoácidos, com massa molecular de 41,1 kDa, ponto isoelétrico teórico de 4,99 e um sitio potencial de N glicosilação. A proteína predita possui três diferentes domínios: um domínio catalítico, um domínio de ligação à celulose (CBD) altamente conservado, e uma região de conexão entre os dois domínios (hinge). A partir da seqüência predita de aminoácidos de EGL1 foi possível realizar a modelagem tridimensional, utilizando-se proteínas existentes em banco de dados (PDB). Tal proteína apresenta propriedades estruturais similares às endoglicanases da família 5A. O cDNA egl1 foi clonado em um vetor de expressão de Pichia pastoris, pPIC9. Após a transformação, clones recombinantes exibindo maior atividade enzimática foram selecionados, utilizando-se micro-fermentações em placa Deep Well. Após a seleção do melhor clone produtor, foram avaliadas as propriedades bioquímicas da enzima recombinante, bem como a otimização das condições de cultivo e posterior caracterização de sua cinética enzimática. A enzima recombinante expressa em P. pastoris apresenta características de particular interesse para a utilização em processos indústriais: uma atividade ótima na faixa de pH 5,0 – 9,0, temperatura ótima a 60°C, exibindo alta termoestabilidade a 70°C após uma hora de pré-incubação, sendo a atividade da EGL1 recombinante fortemente estimulada pela adição do íon cálcio na reação. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / This work describes the pioneering molecular biology studies with the fungus Penicillium echinulatum lineage 9A02S1 (DSM 18942), which resulted in the first isolation and characterization of a cDNA corresponding to an egl1 gene, encoding a endoglucanase 1 (EGL1). The egl1 cDNA was obtained from a library constructed under induction conditions of the cellulolytic system of this fungus. The cDNA sequence is 1,161 base pairs long, showing high identity scores with genes of fungal endoglicanases family 5A. It encodes a predicted protein of 387 amino acid residues, with molecular mass of 41.1 kDa, theoretical isoelectric point of 4.99 and a potential site of N-glycosylation. The predicted protein has three different domains: a catalytic domain, a highly conserved carbohydrate binding domain (CBD), and a region linking the two domains (hinge). From the predicted amino acid sequence of EGL1 it was possible to perform a three-dimensional modeli, using protein sequences deposited in data bank (PDB). The solved structure revealed that this protein displays structural properties similar to those observed in family 5A endoglucanases. The egl1 cDNA was cloned in a Pichia pastoris expression vector, pPIC9. Following transformation, recombinant clones with higher enzymatic activity were selected, using microfermentations in Deep Well plates. After selecting the best producer clone, we evaluated the biochemical properties of recombinant enzyme, as well as the optimization of culture conditions and subsequent characterization of the enzyme kinetics. The recombinant EGL1 secreted by the recombinant P. pastoris revealed characteristics of particular interest for industrial applications: an optimal activity over a broad range pH (5.0 – 9.0) and an optimal temperature of 60°C. The recombinant EGL1 showed high thermostability at 70°C after 1 h of pre-incubation, and the activity of recombinant EGL1 was strongly stimulated by the addition of calcium ion in the reaction.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-06-01T14:07:26Z No. of bitstreams: 1 2010_ValquiriaAliceMichalczechenLacerda.pdf: 1778305 bytes, checksum: 30a61c667aee974c75ac4c6915715f22 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2011-06-03T20:22:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_ValquiriaAliceMichalczechenLacerda.pdf: 1778305 bytes, checksum: 30a61c667aee974c75ac4c6915715f22 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-03T20:22:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_ValquiriaAliceMichalczechenLacerda.pdf: 1778305 bytes, checksum: 30a61c667aee974c75ac4c6915715f22 (MD5) / Após a fecundação natural ou a clonagem por transferência nuclear, um padrão epigenético preexistente deve sofrer uma reprogramação correta para garantir o desenvolvimento embrionário. Contudo, essa reprogramação é ineficiente na clonagem, pois o carioplasto possui um padrão metilação do DNA diferente dos gametas. Acredita-se num aumento da eficiência da clonagem de mamíferos se os carioplastos utilizados possuírem um DNA hipometilado. Este é o primeiro estudo a utilizar a procaína como agente desmetilante no cultivo in vitro em linhagem celular de fibroblastos de bovinos. Os objetivos foram avaliar os efeitos da procaína no cultivo in vitro sobre a viabilidade celular, avaliar a integridade cromossômica e analisar o padrão de metilação no DNA para as regiões diferencialmente metiladas (DMRs) dos genes imprinting IGF2 e XIST, por tratamento com bissulfito de sódio seguido de seqüenciamento, em linhagem celular de Bos taurus indicus. O cultivo celular com a procaína apresentou crescimento celular e a suplementação com 0,1 e 0,5 mM levou a um aumento no número de células viáveis em relação ao grupo controle e ao tratamento com 2,0 mM (P≤0,05). A quantidade de células totais foi menor apenas para o grupo com suplementação de 2,0 mM (P≤0,01). A citogenética não mostrou diferença entre os grupos. O padrão de metilação não foi diferente para as DMRs dos genes avaliados. Existe um efeito benéfico nas células que receberam os tratamentos com 0,1 mM ou 0,5 mM de procaína, por existir um aumento da quantidade de células viáveis sem apresentar anomalias cromossômicas. Há a possibilidade de ter ocorrido uma desmetilação global, que não foi detectada nas regiões analisadas. A suplementação do meio de cultivo com procaína aumentou a viabilidade de fibroblastos in vitro de bovinos, sem alterar a integridade cromossômica. Isso é importante, pois os próximos estudos poderão contribuir, por exemplo, com um aumento dos índices da transferência nuclear de célula somática, maior obtenção de mamíferos transgênicos e possivelmente de células-tronco a partir de células diferenciadas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / After natural fertilization and cloning by nuclear transfer, an epigenetic pattern must be reprogrammed to guarantee viable embryo development. This is the first study to use procaine as a demethylation agent in in vitro culture of of cattle fibroblast cell line. The aim was to investigate the effects of procaine in fibroblast cell line, to evaluate the chromosome integrity and to analyze DNA methylation patterns for DMRs of IGF2 and XIST genes imprinting, by bisulphite tratament followed by sequencing, in Bos taurus indicus. The cell culture with procaine was viable and the supplementation with 0.1 and 0.5 mM led to an increase in the number of cells with intact membrane in comparison to control group and to the treatment with 2.0 mM (P ≤ 0.05). The amount of total cells was lower only for the group supplemented with 2.0 mM (P ≤ 0.01). Cytogenetics showed no difference between groups The methylation pattern was not different for the DMR genes evaluated. We notice a beneficial effect on cells that received treatments with 0.1 mM or 0.5 mM procaine, because there is an increase in number of viable cells which did not present chromosomal abnormalities. It may have occurred a global demethylation, which was not detected in the analyzed regions. Supplementation of medium culture with procaine increased the viability of in vitro culture of bovine fibroblasts, with no alteration in chromosomal integrity. The results obtained here may contribute to increase the levels of cloning and transgenic mammals and possibly stem cells from differentiated cells.

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Jadiana Paiva Dantas (jadi@bce.unb.br) on 2011-06-29T23:42:04Z No. of bitstreams: 1 2009_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 4029652 bytes, checksum: b826daae737141b32d0d9e55a96db197 (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-04T18:29:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 4029652 bytes, checksum: b826daae737141b32d0d9e55a96db197 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-04T18:29:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 4029652 bytes, checksum: b826daae737141b32d0d9e55a96db197 (MD5) / A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é uma doença pandêmica que atinge diversos países no mundo todo. Atualmente, não existe uma vacina eficiente contra o vírus da imunodeficiência (HIV) devido a habilidade do vírus de escapar do sistema imune. Contudo, estudos recentes têm utilizado glicoproteínas do envelope do HIV como potencial alvo para o desenvolvimento de uma vacina capaz de inibir a entrada do vírus na célula hospedeira. Recentemente, nosso grupo selecionou fragmentos de anticorpos (Fabs) de uma biblioteca combinatória de anticorpos de pacientes com osteosarcoma direcionados para um peptídeo sintético de um epítopo neutralizante da gp41. No presente trabalho, foram clonados os Fabs anti-gp41-HIV em vetor de expressão de Pichia pastoris. Após a obtenção das clonagens dos Fabs nesse vetor as respectivas sequências foram confirmadas. A levedura Pichia pastoris tem sido largamente utilizada para a produção de proteínas recombinantes com sucesso. O nível de expressão obtido para os Fabs na levedura Pichia pastoris foi muito baixo. Esses Fabs demonstraram possuir um bom índice de adaptação de códon para a expressão em Pichia pastoris. Dessa forma, ajustes no protocolo de expressão deverão ser realizados. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) is a pandemic deficiency through out the continent. At the moment there is not an efficient vaccine against immunodeficiency virus (HIV) due the virus efficient escape of from the immune system. However, recent studies have used glycoprotein of HIV as a potential target to development a vaccine to inhibit the virus entry into host cells. Recently, our group selected antibody fragments (Fabs) from an antibody combinatorial library of osteosarcoma patients directed to a synthetic biotinilated peptide gp41 neutralizing epitope (576 to 619 amino acids residues). In this work, the Fabs anti-gp41-HIV into a Pichia pastoris were cloned into expression vector. Three Fabs were cloned into this vector with correct sequence. Pichia pastoris has been used extensively and successfully to express recombinant proteins. Unfortunately, the recombinant proteins were expressed in low levels. However, this Fabs showed to have a good codon adaptation index to be expressed in Pichia pastoris, thus adjustment in the protocol must be performed.

O aumento da incidência de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiplas drogas tornou urgente a necessidade de novos agentes terapêuticos para o tratamento da tuberculose. A via do ácido chiquímico é essencial para a sobrevivência deste organismo, o que torna suas enzimas interessantes alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos. A enzima corismato sintase (MtCS) foi identificada no genoma de M. tuberculosis por homologia de seqüência. Esta enzima catalisa a síntese NADH- e FMN-dependente de ácido corísmico, precursor de aminoácidos aromáticos, naftoquinonas, menaquinonas e micobactinas. Este trabalho descreve a clonagem, super-expressão e purificação até a homogeneidade da MtCS recombinante. As medidas das atividades das reações de corismato sintase e de NADH:FMN oxidoredutase comprovaram a bifuncionalidade da MtCS. A atividade de flavina redutase foi caracterizada, mostrando a existência de um complexo estável entre FMNOX e MtCS. Efeitos isotópicos primários de deutério e de solvente foram realizados, e sugerem etapas distintas para a transferência do próton e para a transferência do hidreto, com o último contribuindo mais fortemente para a etapa limitante da reação. Os resultados descritos aqui auxiliarão no desenho racional de novos agentes contra tuberculose. / The emergence of multi-drug resistance Mycobacterium tuberculosis has created an urgent need for new agents to treat tuberculosis. The enzymes of shikimate pathway are attractive targets to the development of these agents, since experimental evidence that this pathway is essential for M. tuberculosis has been reported. Chorismate synthase (MtCS) has been identified by sequence homology in the genome of M. tuberculosis. This enzyme catalyzes the NADH- and FMN-dependent synthesis of chorismate, a precursor of aromatic amino acids, naphthoquinones, menaquinones, and mycobactins. In the present work, we describe MtCS cloning, overexpression and purification of recombinant protein to homogeneity. The bifunctionality of MtCS was determined by measurements both chorismate synthase and NADH:FMN oxidoreductase activities. The flavin reductase activity was characterized, showing the existence of a stable complex between FMNox and MtCS. Primary deuterium and solvent kinetic isotope effects are described and suggest distinct steps for hydride and proton transfers, with the former being more rate-limiting. These results should pave the way for the rational design of antitubercular agents.

Orientadores: Reginaldo Bruno Gonçalves, Daniel Saito / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-16T03:29:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cruz_SergioEduardoBragada_D.pdf: 4484196 bytes, checksum: 41cbfe2b81d194ae03d4070bbe8108b8 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Há um consenso que outros micro-organismos além de Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Tannerella forsythia (Tf) e Treponema denticola (Td) estariam correlacionados às periodontites, inclusive algumas espécies ainda não identificadas. Nosso objetivo foi estudar as microbiotas subgengivais de indivíduos com periodontite crônica generalizada (PCG) e periodontite agressiva generalizada (PAG) para avaliar diferenças entre suas microbiotas. MATERIAL E MÉTODOS-Foram selecionados 15 indivíduos com PCG e 14 com PAG. Coletou-se amostra do biofilme subgengival de uma bolsa periodontal profunda (BP-PS ? 7mm) e uma moderada (BM - PS entre 5 e 6 mm) de cada indivíduo. Foi preparado e analisado, por meio de DGGE, o perfil bacteriano entre os grupos. A similaridade e a análise de cluster do padrão de UTO's foram verificadas utilizando-se coeficiente de Jaccard e a construção do dendrograma realizada por UPGMA. Realizou-se também análise clonal direta de 10 amostras de BP de cada grupo e as sequências foram agrupadas em táxons com similaridade >97%. RESULTADOS-DGGE - No perfil de DGGE foi observada uma tendência para a formação de grupos em BP, mas não em BM, com a presença de dois grupos maiores e distintos de oito indivíduos tanto para PCG como PAG, com variação de similaridade intra-grupo entre 53,6-68,4% e 50,2-64,7%, respectivamente. Análise clonal - Foram identificados 109 táxons conhecidos a partir de 987 clones. Ao todo 44 gêneros bacterianos, 28 gêneros comuns aos dois grupos, nove que se apresentaram apenas para PCG e sete para PAG. Entre os dois grupos foram observados 34 táxons comuns, sendo 42 específicos para PAG e 37 para PCG. A espécie Tf foi detectada em 90% dos indivíduos com PCG e 80% com PAG, Pg foi detectada em 70% com PCG e 50% com PAG e Td foi detectada em 40% com PCG e 30% PAG. A espécie Aa foi encontrada em somente 20% de PCG e 30% de PAG. A espécie Filifactor alocis foi observada em altas taxas e prevalência em PCG (58 clones, 90%) e PAG (91 clones, 90%). As espécies encontradas exclusivamente por grupo com prevalência acima de dois pacientes foram: PCG: Treponema lecithinolyticum, Selenomonas dianae, Prevotella pleuritidis, Dialister pneumosintes; e para PAG: Fusobacterium nucleatum ss vincentii, Veillonella parvula, Peptococcus sp. Cepa GEA8, Streptococcus gordonii, Lautropia mirabilis, Gemella sanguinis, Afipia broomeae. Para os filotipos, PCG: Peptostreptococcaceae sp. Clone-MCE10_174, Fusobacterium sp. C-I035, Veillonellaceae sp. C-JS031; PAG: Peptostreptococcaceae sp. C-PUS9170, Treponema sp. CG093. Apesar de não haver exclusividade entre grupos, é de nota os filotipos Synergistes sp. clone W028 (80% e 60%) e o clone D084 (70% e 10%) em PCG e PAG, respectivamente. O filotipo Bacteroidetes sp. AU126 foi encontrado tanto em PCG (60%) como PAG (30%). CONCLUSÃO - O presente trabalho demonstrou por meio de DGGE uma tendência a um perfil microbiano comum entre a maioria das amostras estudadas, entretanto, sem seu completo delineamento como dois grupos distintos microbiologicamente. A análise clonal, apesar de algumas espécies específicas entre grupos, demonstrou pequenas diferenças, sem, entretanto, delinear grupos microbiologicamente específicos. / Abstract: There is an agreement that not only the already known periodontopathogens, Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Tannerella forsythia (Tf) and Treponema denticola (Td) would be involved in periodontitis, but also some others micro-organisms not-yet-identified. The scope of this study is to compare the subgingival microbiota in generalized chronic periodontitis (GCP) or generalized aggressive periodontitis (GAP) subjects. MATERIAL AND METHODS - 15 subjects with GCP and 14 with GAP were enrolled. One subgingival biofilm sample from a periodontal deep pocket (DP) with PD ? 7mm and one from a moderate pocket (MP) with PD from 5 to 6 mm were harvested from each subject. The microbial profiles (OTU's) were compared between groups by DGGE and the similarity OTU profile was analyzed by Jaccard coefficient and the dendrogram and cluster analyses were made by UPGMA. The direct clonal analysis of the 16SrDNA from 10 samples of each group from DP was made. The sequences were grouped in clusters of taxa with > 97% similarity. RESULTS - DGGE - It was observed in the profile a tendency for eight subjects from each group to assemble as clusters in the DP, but not for the MP samples, with similarities between 53.6-68.4% (GCP) and 50.2-64.7% (GAP). Clonal analyses - One-hundred-and-nine already recognized taxa were obtained from 987 clones. From a total of 44 bacterial genera, 28 were common for both groups; nine were exclusive to PCG and seven to PAG subjects. It was found 34 common taxa between GCP and GAP, 37 were specific for GCP and 42 for GAP. The Tf species was found in 90% from GCP subjects and 80% from GAP subjects, Pg was found in 70% from GCP and in 50% from GAP and Td was detected in 40% from GCP and 30% from GAP. The Aa species were found in only 20% GCP subjects and in 30% from GAP. Filifactor alocis species were detected in high prevalence in both GCP (58 clones, 90%) and PAG (91 clones, 90%). The species which were detected exclusively in each group, with 20% prevalence or more were, for GCP: Treponema lecithinolyticum, Selenomonas dianae, Prevotella pleuritidis, Dialister pneumosintes; and GAP: Fusobacterium nucleatum ss vincentii, Veillonella parvula, Peptococcus sp. Cepa GEA8, Streptococcus gordonii, Lautropia mirabilis, Gemella sanguinis, Afipia broomeae. In relation to phylotypes, PCG: Peptostreptococcaceae sp. Clone-MCE10_174, Fusobacterium sp. C-I035, Veillonellaceae sp. C-JS031; PAG: Peptostreptococcaceae sp. C-PUS9170, Treponema sp. C-G093. Despite not been found exclusively for neither GCP nor GAP, the phylotypes Synergistes sp. clone W028 (80% e 60%) and clone D084 (70% e 10%) had a notable presence in GCP and GAP, respectively. The phylotype Bacteroidetes sp. AU126 was found in GCP (60%) and GAP (30%) groups. CONCLUSION - The present study demonstrated by DGGE a slight tendency to the clustering of the microbial profile of some GCP and GAP subjects, although these were not well delineated. The clonal analyses showed some differences, but also could not show GCP and GAP as microbiologic distinct profiles. / Doutorado / Microbiologia e Imunologia / Doutor em Biologia Buco-Dental

Orientador: Jose Camillo Novello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:20:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kassab_BaykiHussein_D.pdf: 1712667 bytes, checksum: 635db4ddccf22f18ef236c2bbd4e53b9 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: As lectinas presentes nos venenos ofídicos são classificadas como lectinas tipo-C e são formadas por cadeias polipeptídicas relativas ao CRD (carbohydrate recognition domain) livre, sem domínios adicionais. BJcuL é uma lectina presente no veneno da serpente Bothrops jararacussu, isolada e caracterizada em nosso laboratório. Trata-se de um homodímero, com grande afinidade à galactose e apresenta atividades tóxica sobre células tumorais e endoteliais. Este trabalho teve como proposta: (1) determinar a seqüência completa do cDNA da lectina do veneno da serpente Bothrops jararacussu; (2) desenvolver um sistema de expressão, solubilização e purificação para a produção de BJcuL recombinante; (3) comparar a atividade da BJcuL recombinante com a nativa. Concomitante ao trabalho acima, foi também de nosso interesse: (4) investigar o efeito de BJcuL nativa sobre células tumorais do cólon quanto a proliferação/viabilidade, e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). O cDNA-BJcuL foi isolado da biblioteca de cDNA a partir da glândula de veneno de B. jararacussu. A seqüência do cDNA-BJcuL (GenBank acesso No. AY388642); apresentou uma região codificadora de aminoácido correspondente a BJcuL nativa e com um elevado grau de identidade com outras lectinas do tipo-C. O cDNA-BJcuL foi amplificado por PCR e ligado ao vetor de pET15b e usado para transformar E. coli BL21 (DE3). Uma proteína ,insolúvel e inativa, de 18,5 kDa foi expressa após a adição de 1 mM de IPTG. A rBJcuL foi desnaturada com 6 M de uréia, purificada e renaturada em coluna de afinidade, seguida de diálise e cromatografia em gel. A eficiência no processo de renaturação foi confirmada através de ensaios biológicos, dicroísmo circular e análise dos peptídios de rBJcuL. As células tumorais do cólon HT-29 D4 e Caco-2, após a adesão, foram incubadas com BJcuL (0 - 10 mM com 5% de FBS) por diferentes períodos (24, 48 e 72h). Ensaios de proliferação foram feitos usando o Kit BrdU-Elisa e uma interessante diminuição na incorporação de BrdU foi observada em ambas as células. BJcuL (2,5 µM) foi capaz de inibir aproximadamente 50% da proliferação em Caco-2 e 30% em HT-29 D4 em 24h. Este efeito, aparentemente não foi relacionado ao tênue desequilíbrio celular de ROS, cerca de 20% na presença de 2,5 µM de BJcuL, medido em fluorímetro (excitação em 490 nm e emissão a 538 nm) após a adição da sonda DCFH-DA. Ensaios com o reagente MTT confirmaram que BJcuL apresenta fraca citotoxicidade e não é capaz de diminuir a viabilidade dessas células. Com base nos resultados obtidos, buscamos desenvolver um estudo mais detalhado da estrutura molecular de BJcuL e suas funções, por meio da clonagem, seqüenciamento e expressão de rBJcuL, na intenção de fornecer dados para o esclarecimento das particularidades estruturais dessas proteínas / Abstract: Snake venom lectins are classified as C-type lectins and their molecular structure consist in at least one carbohydrate recognition domain - CRD per subunit. BJcuL is a lectin from Bothrops jararacussu snake venom, which have been isolated and characterized in our laboratory. The lactose-binding BJcuL is a homodimer, and show toxic activity on cancer cells and endothelial cell lines. The aim of this work was: (1) to determine the complete cDNA sequence that encode the lectin from B. jararacussu snake venom; (2) to develop a methodology for the expression, solubilization, and purification of recombinant BJcuL; (3) to compare recombinant and native BJcuL activity. In addition to the work described we have investigated (4) native BJcuL effect on colon tumor cells concerning the proliferation and reactive oxygen species production (ROS). The cDNA-encoding BJcuL has been isolated of the cDNA phage library, constructed from B. jararacussu venom glands. The mature protein-coding region was amplified by PCR with specific oligonucleotides, and subcloned into the pET-15b vector to express the recombinant BJcuL in Escherichia coli BL21 (DE3). The deduced amino acid sequence exhibits a high degree of sequence identity with c-type lectins (CTLs) and c-type lectin-like domains (CTLDs). An insoluble and inactive 18.5-kDa protein was overexpressed after 1.0 mM IPTG induction. The recombinant BJcuL was recovered and denatured in a buffer with 6 M urea and purified on a nickel-affinity column. Protein refolding was carried out on this column, during procedure purification, followed by dialysis against CTBS and then by gel filtration for separation of the active dimmer. The refolding process of rBJcuL and the analysis of its structure were confirmed by biological assay, circular dichroism and Maldi-Tof. HT-29 D4 and Caco-2 cells, after adhesion, were treated with BJcuL (0 - 10 mM with 5%FBS) in 24, 48 and 72h. Proliferation assays were performed using BrdU-Elisa kit. An interesting decrease in BrdU incorporation was observed for both cells. At 2.5 µM BJcuL inhibited cell proliferation by approximately 50% for Caco-2 and 30% for HT-29 D4 in 24 h. This effect apparently was unrelated to subtle (20%) cellular redox imbalance induced by 2.5 µM BJcuL. In addiction, BJcuL showed a weak cytotoxic effect on these cell lines, since MTT assay did not show any decrease in cell viability. Together with the results presented, we are interested in a more detailed study of the molecular structure of BJcuL and its functions, through cloning and expression of rBJcuL, intending to clarify the structural particularities of these proteins / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T22:45:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendonca_Sergiode_D.pdf: 5307853 bytes, checksum: de9b6f00c4099ec1ab0d2f50163feb4e (MD5) Previous issue date: 1999 / Doutorado / Genetica / Doutor em Ciências Biológicas

Orientadores : Yoko Bomura Rosato , Spartaco Astolfi Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T22:27:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stripecke_Renata_M.pdf: 3003802 bytes, checksum: 8c424cedc5aad86a1d83c9a594fd7733 (MD5) Previous issue date: 1988 / Resumo: A bactéria Xanthomonas campestris é um fitopatógeno que produz a goma xantana, de grande importância econômica, devido ao seu variado potencial de utilização na Indústria e na agricultura. Com o objetivo de se verificar a expressão de um gene de amilase exógeno em X.campestris, estabeleceu-se um sistema de clonagem para esta bactéria. Este sistema constituiu-se no plasmídio promíscuo pMFY40 ao qual se inseriu o gene da alfa-emllese de Bacillus subtilis, resultando no plesmídio pAP1. Este plesmídio possui aproximadamente 14.0 Kb, á mobilizável por plasmídios ¿helper¿ e razoavelmente estável, em condições de fermentação, em X. campestris. O pAP1 foi introduzido por transformação e por conjugação em duas linhagens de campestris, uma delas originalmente amilolítica (REF) e outra não-amilolítica (280), mas que é uma boa produtora de goma. Após se verificar a secreção da enzima em meio sólido pelos recombinantes, analisou-se o consumo de amido e a produção de açúcar redutor em meto líquido. Verificou-se que a linhagem 280/pAPl foi capaz de degradar o amido do meio e que a linhagem REF/pAPl teve seu caráter amiolítico amplificado. A produção de xantana em meios contendo diferentes com posições de substratos foi verificada através da viscosidade da goma, para se analisar as potencialidades da substituição do substrato tradicional, que é a sacarose, pelo amido. Foi observado um acréscimo de produção nas linhagens contendo o pAPl em meio com 2X de amido e em meto com 1X de amido e IX de sacarose. Apesar da substituição total da sacarose pelo amido ser Inviável para a fermentação pela linhagem 280/pAP1, verificou-se que a composição de IX de sacarose e de 1X de amido Já fornece bons resultados / Abstract: Xanthomonas campestris Is a phytopathogenlc bacteria. Which produces the xanthan-gum a biopolimer of economical Importance due to lts great poss1b111tles of ut111zat1on ln the Industry and In the agriculture. A cloning system for the analysis of expression of the extracellular amylase was established. The alfa-amylase gene from Bacillus subtilis was introduced in the promiscuous plasmid pMFY40, giving rise to the hybrid plasmid pAP1. This plasmid contains approximately 14.0 Kb, is mobilizable by helper plasmid and is reasonably stable, in fermenting conditions, in X.campetris. The plasmid pAP1 has been introduced by transformation and by conjugation into two strains of X. campestris one of them originally amylolytlc (REF), and the other not amylolytic (280) but a very good gum producer. Besides the observation of the enzyme production by the recombinants in solid media, the starch consumption and the reducing-sugar production in liquid media were also analysed. It was verified that the strain 280/pAP1 was able to degradate the starch of the media and that the strain REF/pAP1 had its amylolytic character amplified. The xanthan production in media containing different substrates compositions was analysed to evaluate the potentialities of the substitution of the traditional substrate, sucrose, by starch. The strains bearing the plasmid pAP1 showed viscosity enhancement of the media containing 2% starch and also 1% starch plus 1% sucrose. Although the total substitution of sucrose by starch was not successful for the fermentation of 280/pAP1, good results were observed in the media containing 1% starch plus 1% sucrose / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências