Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-11-06Bitstream added on 2014-06-13T19:12:06Z : No. of bitstreams: 1 cunha_rm_me_botib.pdf: 829808 bytes, checksum: 0d58883f9479527d834af5abe27ce09a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os acidentes botrópicos representam cerca de 87% dos envenenamentos ofídicos registrados no Brasil e se destacam pelas graves seqüelas que limitam a vida do acidentado. O principal efeito tóxico local destes é a mionecrose, que pode levar à perda tecidual permanente e à amputação. A mionecrose pode ser decorrente da isquemia do tecido muscular, causada por fatores hemorrágicos presentes nestes venenos (metaloproteases), ou da presença de miotoxinas (PLA2s) que afetam diretamente o tecido muscular. O método mais eficaz para o tratamento dos envenenamentos ofídicos é a soroterapia passiva. No entanto, esta é limitada devido à relativa ineficácia do soro em neutralizar a mionecrose dos venenos botrópicos, além de muitas comunidades não terem acesso à soroterapia. Estes fatores conduzem a busca de métodos alternativos, como o uso de extratos vegetais. Evidências mostram que o extrato aquoso da Casearia sylvestris, conhecida popularmente como “guaçatonga, é capaz de neutralizar efeitos tóxicos de venenos brutos e de suas miotoxinas isoladas. A Casearia sylvestris apresenta diversos outros efeitos terapêuticos como: anti-séptico, antiinflamatório, anestésico local, anti-tumoral, anti-úlcera e cicatrizante. Devido à escassez de estudos experimentais para avaliar a eficácia de extratos vegetais na redução dos danos locais ocasionados pelo envenenamento botrópico, torna-se importante avaliar a potencial atividade antiofídica da Casearia sylvestris. O presente estudo teve por objetivo investigar o uso do extrato aquoso da Casearia sylvestris, como terapêutica tópica dos efeitos locais do envenenamento botrópico experimental em camundongos. Foi avaliada a capacidade do extrato bruto da planta em neutralizar a mionecrose induzida pelo veneno da Bothrops jararacussu e/ou acelerar o processo de regeneração... / Bothrops accidents represent about 87% of snakebites recorded in Brazil and account for serious the consequences that affect the life of the victim with social and economic repercussions. Its main toxic effect is myonecrosis, which can lead to permanent tissue loss and amputation. Myonecrosis may result from muscle tissue ischemia, hemorrhage caused by factors present in these venoms (metalloproteases), or the presence of myotoxins (PLA2s) that directly affect muscle tissue. The most effective treatment is passive serotherapy. However, this is limited due the relative ineffectiveness of the serum to neutralize the myonecrosis of Bothrops venoms and the lack of access to serotherapy by many communities. These factors lead to alternative methods such as the use of plant extracts. Evidence shows that the aqueous extract of Casearia sylvestris, known popularly as guaçatonga, is able to neutralize the toxic effects of venom and their crude myotoxins isolated. Casearia sylvestris presents several other therapeutic effects such as, antiseptic, antiinflammatory, local anesthetic, anti-tumor, anti-ulcer and wound healing. Due to the scarcity of experimental studies to evaluate the efficacy of plant extracts in reducing the harm caused by Bothrops envenomation, it is important to evaluate the potential activity of antiophidic Casearia sylvestris as a complement to conventional serum therapy. The present study aimed to investigate the use of aqueous extract of Casearia sylvestris, topical therapy as complementary to local effects of Bothrops envenomation in experimental mice. We evaluated the ability of the crude extract of the plant to neutralize myonecrosis induced by the venom of Bothrops jararacussu and / or accelerate the process of muscle regeneration. The onset of myonecrosis and the regenerative process... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Coorientador: Débora Colombi / Banca: Consuelo L. Fortes-Dias / Banca: Marcelo Fossey / Banca: Paulo Eduardo M. Ribolla / Banca: João Renato Carvalho Muniz / Resumo: Ainda nos dias de hoje, o envenenamento ofídico é um problema de saúde pública, afetando sobretudo, regiões de clima tropical, subtropical e áreas rurais de países da África, Ásia, Oceania e América Latina. No Brasil, os gêneros de serpentes Bothrops e Crotalus são responsáveis por quase 90% dos acidentes ofídicos, sendo que os acidentes provocados por este último apresentam relativa alta taxa de mortalidade. O veneno das serpentes do gênero Bothrops possuem uma classe de fosfolipases A2, as Lys49-PLA2s, que não possuem atividade catalítica, mas são capazes de induzir a mionecrose por uma mecanismo não catalítico que não é totalmente conhecido. Com relação às fosfolipases A2 veneno das serpentes do gênero Crotalus, o complexo crotoxina, formado pela crotoxina A (não catalítica) e a crotoxina B (catalítica) pode constituir até cerca de 60% do veneno desses animais, como no caso da subespécie Crotalus durissus terrificus, e é uma potente neurotoxina que provoca um grande bloqueio da transmissão neuromuscular. Neste trabalho, utilizando diversas técnicas teóricas e experimentais, sobretudo cristalografia de raios X, são apresentados diversos resultados que visam aprofundar o conhecimento acerca do funcionamento destas proteínas. Com relação à crotoxina, é apresentado a estrutura cristalográfica da crotoxina B de Crotalus durissus colillineatus, a expressão heteróloga da isoforma CBa2 da crotoxina B de Crotalus durissus terrificus para a posterior produção de formas mutantes sítio-dirigidas e resultados da análise do espalhamento de raios X a baixo ângulo da crotoxina e de suas subunidades isoladas, gerando informações relevantes e inéditas acerca da oligomerização destas proteínas. No caso das Lys49-PLA2s isoladas do veneno botrópico, são apresentadas duas novas estruturas cristalográficas dessa classe de proteínas isolada da serpente amazônica B. brazili. A análise ... / Abstract: Snakebite is a very serious public health problem still today, affecting tropical and subtropical countries, especially the rural areas of Africa, Asia, Oceania and Latin America. In Brazil, Bothrops and Crotalus snake genus are responsible of almost 90% of snakebites. The venoms of Bothrops snakes have a class of phospholipases A2, known as Lys49-PLA2s, which do not have catalytic activity. However, they are able to induce myonecrosis by a non-catalytic mechanism that is not fully understood. In the venom of Crotalus snakes, a phospholipase A2, known as crotoxin constitutes about 60% of the venom from these animals. This protein is a potent neurotoxin that causes a large block of neuromuscular transmission formed by complexation of crotoxin A (non-catalytic) and crotoxin B (catalytic). In this work, it was used several theoretical and experimental techniques, in particular X-ray protein crystallography, to generate information to extend the knowledge of the action of these proteins. Regarding to crotoxin, the crystal structure of crotoxin B isolated from Crotalus durissus colillinetaus was solved and the heterologous expression of isoform CBa2 of crotoxin B from Crotalus durissus terrificus was performed, in order to, subsequently, produce site-directed mutants. Furthermore, it is presented small angle X-ray scattering experiments with the crotoxin and its isolated subunits that provided intriguing and novel information about the oligomerization of these proteins. Regarding to Lys49-PLA2s from Bothrops snakes, it is presented two new crystal structures of this class isolated from Amazonian snake B. brazili. The analysis of these structures and the structural comparison to other Lys49-PLA2s crystallographic structures generated new information about the position of hydrophobic residues in C-terminal portion of these proteins. This information led us to a new proposition of the mechanism of action of these proteins. It is also presented ... / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-28Bitstream added on 2014-06-13T18:50:16Z : No. of bitstreams: 1 salvador_ghm_me_botib_parcial.pdf: 205572 bytes, checksum: ea2da7983b8e624b8fb6f242a2874147 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-03-16T11:30:15Z: salvador_ghm_me_botib_parcial.pdf,Bitstream added on 2015-03-16T11:31:00Z : No. of bitstreams: 1 000709624.pdf: 1507151 bytes, checksum: e7624c11b3bf8ce0e311b5d40988f595 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis pela maioria dos acidentes ofídicos que ocorrem no Brasil. Uma das principais complicações deste tipo de acidente é o dano muscular, que muitas vezes pode evoluir para necrose. Estes danos podem estar relacionados à ação de fosfolipases A2 (Asp49- PLA2) e fosfolipases A2 homólogas (dentre as quais se encontram as Lys49-PLA2s) presentes nos venenos botrópicos. Esta complicação relacionada ao envenenamento ofídico não é atualmente contornada pela administração de soro antiofídico e, por isso, diversos trabalhos vêm sendo realizados na tentativa de se conhecer os sítios farmacológicos destas toxinas com o intuito de, no futuro, desenvolver tratamentos complementares à soroterapia. Neste trabalho, por meio de estudos utilizando a técnica de cristalografia de raios X, realizamos estudos comparativos entre a BmooPLA2-I e outras Asp49-PLA2s que inibem a agregação plaquetária e sugerimos que outras regiões além do sítio proposto anteriormente são responsáveis por esta atividade biológica. Estudos com a MjTX-II e outras Lys49-PLA2s também foram realizados e propuseram que moléculas de cadeia longa, como ácidos graxos e os polietilenoglicóis (PEGs), possuem contribuição direta para a cristalização destas toxinas. Além disso, estes compostos interagem com o sítio ativo, causando, em alguns casos, a hiperpolarização dos resíduos Cys29/Gly30 pelo Lys122, reforçando assim a teoria que propõe que a atividade catalítica das Lys49-PLA2s não é somente inibida pela presença da cadeia lateral da Lys49 junto ao loop de ligação de cálcio, mas também por outros fatores estruturais. Por fim, estudos com a MjTX-I revelaram que esta toxina é diferenciada das outras Lys49-PLA2s, visto que sua estrutura cristalográfica apresenta quatro moléculas na unidade... / Bothrops snakes are responsible for the most part of the snakebites that occur in Brazil. A major complication of this type of accident is muscle damage, which can often progress to necrosis. This damage may be related to the action of phospholipases A2 (Asp49-PLA2s) and homologue phospholipases A2 (including Lys49-PLA2s) present in Bothrops venoms. This complication related to snakebite is not currently solved by the administration of ophidic serum and, therefore, several studies have been conducted in attempt to understand the pharmacological sites of these toxins and to develop complementary treatments to serum therapy. In this work, we performed a comparative crystallographic study between BmooPLA2-I and other Asp49-PLA2s which present inhibitingplatelet aggregation activity using protein crystallography. The results suggest that some regions distinct from the site proposed by prior works could be responsible by this biological activity. Studies with MjTX-II and other Lys49-PLA2s were also performed and it was proposed that long-chain molecules, such as fatty acids and polyethylene glicols (PEGs), contribute to the crystallization of these toxins. Besides, these compounds interact with the active site, thus causing the hyperpolarization of the Cys29/Gly30 residues via Lys122. These findings reinforce the theory which establishes the catalytic activity of Lys49-PLA2s is not abolish only by the presence of the Lys49 sidechain close to the calcium binding loop, but also due to other structural features. Finally, studies with the MjTX-I revealed that this toxin is different from other Lys49-PLA2s since its crystal structure presents four molecules in the asymmetric unit and a distinct configuration of the myotoxic site as previously proposed for other Lys49-PLA2s. Other studies with MjTX-I using spectroscopy... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Roberto Morato Fernandez / Banca: Antonio Sérgio Kimus Braz / Resumo: Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis pela maioria dos acidentes ofídicos que ocorrem no Brasil. Uma das principais complicações deste tipo de acidente é o dano muscular, que muitas vezes pode evoluir para necrose. Estes danos podem estar relacionados à ação de fosfolipases A2 (Asp49- PLA2) e fosfolipases A2 homólogas (dentre as quais se encontram as Lys49-PLA2s) presentes nos venenos botrópicos. Esta complicação relacionada ao envenenamento ofídico não é atualmente contornada pela administração de soro antiofídico e, por isso, diversos trabalhos vêm sendo realizados na tentativa de se conhecer os sítios farmacológicos destas toxinas com o intuito de, no futuro, desenvolver tratamentos complementares à soroterapia. Neste trabalho, por meio de estudos utilizando a técnica de cristalografia de raios X, realizamos estudos comparativos entre a BmooPLA2-I e outras Asp49-PLA2s que inibem a agregação plaquetária e sugerimos que outras regiões além do sítio proposto anteriormente são responsáveis por esta atividade biológica. Estudos com a MjTX-II e outras Lys49-PLA2s também foram realizados e propuseram que moléculas de cadeia longa, como ácidos graxos e os polietilenoglicóis (PEGs), possuem contribuição direta para a cristalização destas toxinas. Além disso, estes compostos interagem com o sítio ativo, causando, em alguns casos, a hiperpolarização dos resíduos Cys29/Gly30 pelo Lys122, reforçando assim a teoria que propõe que a atividade catalítica das Lys49-PLA2s não é somente inibida pela presença da cadeia lateral da Lys49 junto ao loop de ligação de cálcio, mas também por outros fatores estruturais. Por fim, estudos com a MjTX-I revelaram que esta toxina é diferenciada das outras Lys49-PLA2s, visto que sua estrutura cristalográfica apresenta quatro moléculas na unidade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bothrops snakes are responsible for the most part of the snakebites that occur in Brazil. A major complication of this type of accident is muscle damage, which can often progress to necrosis. This damage may be related to the action of phospholipases A2 (Asp49-PLA2s) and homologue phospholipases A2 (including Lys49-PLA2s) present in Bothrops venoms. This complication related to snakebite is not currently solved by the administration of ophidic serum and, therefore, several studies have been conducted in attempt to understand the pharmacological sites of these toxins and to develop complementary treatments to serum therapy. In this work, we performed a comparative crystallographic study between BmooPLA2-I and other Asp49-PLA2s which present inhibitingplatelet aggregation activity using protein crystallography. The results suggest that some regions distinct from the site proposed by prior works could be responsible by this biological activity. Studies with MjTX-II and other Lys49-PLA2s were also performed and it was proposed that long-chain molecules, such as fatty acids and polyethylene glicols (PEGs), contribute to the crystallization of these toxins. Besides, these compounds interact with the active site, thus causing the hyperpolarization of the Cys29/Gly30 residues via Lys122. These findings reinforce the theory which establishes the catalytic activity of Lys49-PLA2s is not abolish only by the presence of the Lys49 sidechain close to the calcium binding loop, but also due to other structural features. Finally, studies with the MjTX-I revealed that this toxin is different from other Lys49-PLA2s since its crystal structure presents four molecules in the asymmetric unit and a distinct configuration of the myotoxic site as previously proposed for other Lys49-PLA2s. Other studies with MjTX-I using spectroscopy... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Richard John Ward / Banca: Roberto Morato Fernandez / Banca: João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa / Resumo: Neste trabalho foram realizados estudos estruturais experimentais e teóricos com a BthA-I e a BjussuMP-I, duas proteínas isoladas do veneno de Bothrops jararacussu. A proteína BthA-I é uma fosfolipase A2 (PLA2) ácida com elevada atividade catalítica e que possui a capacidade de inibir a agregação de plaquetas e reduzir a pressão arterial. Cristais da BthA-I nativa e de sua forma quimicamente modificada pelo pBPB (brometo de p-bromofenacila), um conhecido inibidor de a PLA2s que também é capaz de suprimir os mecanismos farmacológicos próprios desta proteína, foram obtidos e submetidos a experimentos de difração de raios-X. A estrutura cristalina da BthA-I foi elucidada a 1,9 Å de resolução e o processamento dos dados experimentais revelou a presença de dois monômeros na unidade assimétrica. A análise estrutural destes monômeros revelou que a BthA-I dimérica possui uma conformação oligomérica distinta das demais PLA2s, onde os sítios catalíticos da molécula encontram-se expostos ao solvente. Apesar das condições de cristalização da BthA-I nativa, é possível sugerir que a forma dimérica desta proteína seja aquela encontrada predominantemente in vivo. A determinação estrutural da BthA-I quimicamente modificada pelo pBPB a 1,85 Å de resolução revelou a presença inequívoca de moléculas de inibidor covalentemente ligadas aos resíduos His48, localizados nos sítios de ligação de substrato dos dois monômeros do complexo. Três regiões do complexo BthA-I/pBPB são estruturalmente alteradas pela ligação do inibidor: os loops de ligação de Ca++ e as regiões de β-wing C-terminais. Estas mudanças estruturais são provavelmente derivadas da conformação oligomérica apresentada pelo complexo, cuja disposição pode explicar a supressão das atividades farmacológicas da BthA-I... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this work were performed experimental and theoretical structural studies with BthA-I and BjussuMP-I, two proteins from the venom of Bothrops jararacussu. BthA-I, a high catalytic acidic phospholipase A2 (PLA2) with platelet aggregation inhibition, anticoagulant and hypotensive properties, was crystallized in its native form and complexed to pBPB (p-bromophenacyl bromide), a well-known inhibitor of PLA2s which also abolishes the biochemical activities of this protein. The crystal structure of BthA-I native was solved at 1.9 Å and the data processing showed two monomers in the unit cell. A novel dimeric conformation of this native protein with the active sites of the monomers exposed to the solvent was observed. Despite of the conditions used in the crystallization experiments, it is possible to suggest that the dimeric form must be predominantly found in vivo. The structural determination of BthA-I chemically modified by pBPB at 1.85 Å revealed the unambiguous identification of inhibitor molecules covalently bound to residues His48 in the substrate-binding clefts of both monomers of the complex. Three regions of BthA-I/pBPB complex are structurally altered by the binding of the inhibitor: the Ca++ -binding loops, the β-wings and the C-terminal regions. These structural changes are probably derived from the oligomeric state presented by the complex, which could explain the abolition of pharmacological activities of the pBPB-chemically modified BthA-I. A residue present in the "pancreatic" loops (Lys69), which is usually related to the anticoagulant effect of the BthA-I, is in the dimeric interface of the complex, supporting this hypothesis regarding the abolition of this and other activities caused by pBPB. The theoretical BjussuMP-I catalytic domain, a P-III metalloprotease, was built through folding recognition... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Patrick Spencer / Banca: Jose Ramon Beltran Abrego / Resumo: Os venenos de serpentes são constituídos por uma complexa mistura de substâncias que apresentam características e proporções variáveis de acordo com as diferentes espécies, distribuição geográfica dos indivíduos, variação ontogenética e sexual e alimentação. Essa variabilidade na composição dos venenos é de grande interesse na pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos, pois um elevado grau de variação aumenta o número de seus potenciais usos. De acordo com essas propriedades dos venenos de serpentes, no presente estudo procurou-se comparar algumas variações existentes nas frações do veneno de Bothrops leucurus, uma serpente da família Viperidae que se caracteriza por produzir um veneno com toxicidade variável devido a diferentes fatores. A toxicidade do veneno deve-se principalmente à sua fração proteica, constituída em sua maior parte por proteinases (metalo proteinases e serino proteinases), fosfolipases e L-aminoácido oxidases que apresentam efeitos potenciais no sistema homeostático, além de possuírem ação citotóxica, antimicrobiana e inflamatória. Neste estudo foram realizados ensaios cromatográficos para a purificação de algumas dessas enzimas e a caracterização das mesmas para a verificação de suas propriedades proteolíticas e fibrinogenolíticas, além do potencial antimicrobiano do veneno bruto. Foram purificadas duas metalo proteinases de 28 e 65 kDa, respectivamente, uma serino protease de 35 kDa, uma LAAO de 66 kDa e duas fosfolipases com 14 e 15kDa. Constatou-se que a metalo protease de 65 kDa apresentou a maior atividade fibrinogenolítica. Além disso, foi realizado o teste da mínima concentração inibitória com o veneno bruto para verificar seu efeito antimicrobiano contra uma bactéria gram-negativa e outra gram-positiva, sendo que nesta última, apresentou atividade inibitória / Abstract: The snake's venoms are constituted by a mixture of substances that exhibit character and variable proportion according to different species, geographic distribution of individuals, ontogenetic and sexual and feed variability. That variability on poisons compositions is of great interest on research and development of new drugs, because a high degree of variation increases the number of potential use. According to those properties of snake's poisons in the actual study it was sought to compare some variations existents on fractions of Bothrops leucurus venom, a snake of family Viperidae that is characterized by production of poison with variable toxicity due different factors. The poison toxicity should principally its protein fraction consisting mostly by proteinases (metalloproteinases and serine protease), phospholipases and L-aminoacid oxidases showing potential effects on homeostatic system, beyond having cytotoxic action, bactericidal and inflammatory. This study describe chromatographic separation of some enzymes and characterization of it and to verification of its proteolytic and fibrinogenolytic properties further the bactericidal potential of crude venom. Was purified two metalloproteinases of 28 and 65 kDa respectively, a serine protease of 35 kDa, a LAAO of 66 kDa and two phospholipases of 14 and 15kDa. It was found metalloproteinase of 65 kDa show a higher fibrinogenolytic activity. Futhermore crude venom was carried out the test of minimum inhibitory concentration with crude venom to check its antimicrobial effect against a gram-negative bacterium and other gram-positive, whereas in the latter showed inhibitory effect / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-11-25Bitstream added on 2014-06-13T20:22:03Z : No. of bitstreams: 1 motta_yp_dr_botfmvz.pdf: 1035450 bytes, checksum: 6aeb7583602a97ca559f4e1cd97d4ada (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente projeto teve como objetivo quantificar os níveis de citocinas moduladoras da inflamação, entre estas TNF-α, interleucina-1β (IL-1β), IL-6, IL-10 e INF-γ e comparar o efeito do tratamento convencional com o efeito do tratamento complementado com extrato da planta Mikania glomerata na intoxicação experimental por Bothropoides jararaca e Crotalus durissus terrificus. Foram usados ratos Wistar divididos em 5 grupos: C – controle, VC - veneno crotálico + soro antifidico, VB – veneno botrópico + soro antiofídico, VCM - veneno crotálico + soro antiofídico + Mikania glomerata e VBM - veneno botrópico + soro antiofídico + Mikania glomerata. As citocinas foram quantificadas no soro, homogenato da pata e na cultura de células esplênicas, pelo teste de ELISA em três momentos (M1- 30 minutos, M2- seis horas e M3- 24 horas após a inoculação do veneno). O veneno botrópico mostrou um potencial para estimular as citocinas inflamatórias como IL-6, IL-1β, TNF-α quando essas foram quantificadas no soro, no sobrenadante do homogenato da pata e nas culturas de células esplênicas. O tratamento com extrato da planta teve como principal efeito o retardo ou uma menor produção dessas citocinas. Os animais que receberam o veneno crotálico demonstraram principalmente um aumento ou diminuição de algumas citocinas como IL-10, IL-6 e IFN-γ quando quantificadas no soro, homogenato da pata e cultura de células esplênicas. O extrato da planta teve ação anti-inflamatória causando diminuição das citocinas inflamatórias e aumento de citocinas anti-inflamatórias. Assim pode-se concluir que os acidentes ofídicos são capazes de causar liberação de citocinas provocando lesões teciduais e a planta mostrou-se eficiente para diminuição de algumas dessas citocinas / This experiment aimed to quantify the pro-inflammatory cytokine levels, including TNF-α, interleukin-1β (IL-1β) and IL-6 as well as the anti-inflammatory ones such as IL-10 and INF-γ. It was also our objective to compare the effect of the conventional treatment to the treatment complemented with Mikania glomerata plant in the experimental intoxication using Bothropoides jararaca and Crotalus durissus terrificus venom. Wistar rats were randomly divided into 5 groups: C – control, VC – Crotalus venom + antivenom serum, VB – Bothrops venom + antivenom, VCM - Crotalus venom + antivenom + Mikania glomerata and VBM - Bothrops venom + antivenom + Mikania glomerata. Cytokines were quantified in the serum, paw homogenates, and spleen cell culture by ELISA test in three different moments (M1- 30 minutes, M2- 6 hours and M3- 24 hours after venom injection). Bothrops venom showed an ability to stimulate inflammatory cytokines such as IL-6, IL-1β, and TNF-α, when they were quantified in the serum, paw homogenate supernatant and spleen cell cultures. The plant extract, it was responsible for a delay or even a lowering in the cytokine production. The animals that received Crotalus venom displayed an increase or decrease of certain cytokines such as IL-10, IL-6 and IFN-γ when they were quantified in the serum, paw homogenate and spleen cell cultures. The plant extract, in this case, had an anti-inflammatory effect diminishing the inflammatory cytokines and increasing the anti-inflammatory ones. Therefore, it can be said that snakebites are capable of triggering the release of cytokines that will lead to tissue damage and the plant proved to be efficient in diminishing some of those cytokines

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-03-22Bitstream added on 2014-06-13T20:16:36Z : No. of bitstreams: 1 wilson_c_me_sjrp.pdf: 535059 bytes, checksum: 514dc7e27d5f6dc577b4bea8fe8ef6de (MD5) / Os venenos de serpentes são constituídos por uma complexa mistura de substâncias que apresentam características e proporções variáveis de acordo com as diferentes espécies, distribuição geográfica dos indivíduos, variação ontogenética e sexual e alimentação. Essa variabilidade na composição dos venenos é de grande interesse na pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos, pois um elevado grau de variação aumenta o número de seus potenciais usos. De acordo com essas propriedades dos venenos de serpentes, no presente estudo procurou-se comparar algumas variações existentes nas frações do veneno de Bothrops leucurus, uma serpente da família Viperidae que se caracteriza por produzir um veneno com toxicidade variável devido a diferentes fatores. A toxicidade do veneno deve-se principalmente à sua fração proteica, constituída em sua maior parte por proteinases (metalo proteinases e serino proteinases), fosfolipases e L-aminoácido oxidases que apresentam efeitos potenciais no sistema homeostático, além de possuírem ação citotóxica, antimicrobiana e inflamatória. Neste estudo foram realizados ensaios cromatográficos para a purificação de algumas dessas enzimas e a caracterização das mesmas para a verificação de suas propriedades proteolíticas e fibrinogenolíticas, além do potencial antimicrobiano do veneno bruto. Foram purificadas duas metalo proteinases de 28 e 65 kDa, respectivamente, uma serino protease de 35 kDa, uma LAAO de 66 kDa e duas fosfolipases com 14 e 15kDa. Constatou-se que a metalo protease de 65 kDa apresentou a maior atividade fibrinogenolítica. Além disso, foi realizado o teste da mínima concentração inibitória com o veneno bruto para verificar seu efeito antimicrobiano contra uma bactéria gram-negativa e outra gram-positiva, sendo que nesta última, apresentou atividade inibitória / The snake’s venoms are constituted by a mixture of substances that exhibit character and variable proportion according to different species, geographic distribution of individuals, ontogenetic and sexual and feed variability. That variability on poisons compositions is of great interest on research and development of new drugs, because a high degree of variation increases the number of potential use. According to those properties of snake’s poisons in the actual study it was sought to compare some variations existents on fractions of Bothrops leucurus venom, a snake of family Viperidae that is characterized by production of poison with variable toxicity due different factors. The poison toxicity should principally its protein fraction consisting mostly by proteinases (metalloproteinases and serine protease), phospholipases and L-aminoacid oxidases showing potential effects on homeostatic system, beyond having cytotoxic action, bactericidal and inflammatory. This study describe chromatographic separation of some enzymes and characterization of it and to verification of its proteolytic and fibrinogenolytic properties further the bactericidal potential of crude venom. Was purified two metalloproteinases of 28 and 65 kDa respectively, a serine protease of 35 kDa, a LAAO of 66 kDa and two phospholipases of 14 and 15kDa. It was found metalloproteinase of 65 kDa show a higher fibrinogenolytic activity. Futhermore crude venom was carried out the test of minimum inhibitory concentration with crude venom to check its antimicrobial effect against a gram-negative bacterium and other gram-positive, whereas in the latter showed inhibitory effect

Orientador: Michiko Sakate / Banca: Regina Kiomi Takahira / Banca: Maria Lúcia Gomes Lourenço / Banca: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Banca: Rosa Maria Barilli Nogueira / Resumo: O presente projeto teve como objetivo quantificar os níveis de citocinas moduladoras da inflamação, entre estas TNF-α, interleucina-1β (IL-1β), IL-6, IL-10 e INF-γ e comparar o efeito do tratamento convencional com o efeito do tratamento complementado com extrato da planta Mikania glomerata na intoxicação experimental por Bothropoides jararaca e Crotalus durissus terrificus. Foram usados ratos Wistar divididos em 5 grupos: C - controle, VC - veneno crotálico + soro antifidico, VB - veneno botrópico + soro antiofídico, VCM - veneno crotálico + soro antiofídico + Mikania glomerata e VBM - veneno botrópico + soro antiofídico + Mikania glomerata. As citocinas foram quantificadas no soro, homogenato da pata e na cultura de células esplênicas, pelo teste de ELISA em três momentos (M1- 30 minutos, M2- seis horas e M3- 24 horas após a inoculação do veneno). O veneno botrópico mostrou um potencial para estimular as citocinas inflamatórias como IL-6, IL-1β, TNF-α quando essas foram quantificadas no soro, no sobrenadante do homogenato da pata e nas culturas de células esplênicas. O tratamento com extrato da planta teve como principal efeito o retardo ou uma menor produção dessas citocinas. Os animais que receberam o veneno crotálico demonstraram principalmente um aumento ou diminuição de algumas citocinas como IL-10, IL-6 e IFN-γ quando quantificadas no soro, homogenato da pata e cultura de células esplênicas. O extrato da planta teve ação anti-inflamatória causando diminuição das citocinas inflamatórias e aumento de citocinas anti-inflamatórias. Assim pode-se concluir que os acidentes ofídicos são capazes de causar liberação de citocinas provocando lesões teciduais e a planta mostrou-se eficiente para diminuição de algumas dessas citocinas / Abstract: This experiment aimed to quantify the pro-inflammatory cytokine levels, including TNF-α, interleukin-1β (IL-1β) and IL-6 as well as the anti-inflammatory ones such as IL-10 and INF-γ. It was also our objective to compare the effect of the conventional treatment to the treatment complemented with Mikania glomerata plant in the experimental intoxication using Bothropoides jararaca and Crotalus durissus terrificus venom. Wistar rats were randomly divided into 5 groups: C - control, VC - Crotalus venom + antivenom serum, VB - Bothrops venom + antivenom, VCM - Crotalus venom + antivenom + Mikania glomerata and VBM - Bothrops venom + antivenom + Mikania glomerata. Cytokines were quantified in the serum, paw homogenates, and spleen cell culture by ELISA test in three different moments (M1- 30 minutes, M2- 6 hours and M3- 24 hours after venom injection). Bothrops venom showed an ability to stimulate inflammatory cytokines such as IL-6, IL-1β, and TNF-α, when they were quantified in the serum, paw homogenate supernatant and spleen cell cultures. The plant extract, it was responsible for a delay or even a lowering in the cytokine production. The animals that received Crotalus venom displayed an increase or decrease of certain cytokines such as IL-10, IL-6 and IFN-γ when they were quantified in the serum, paw homogenate and spleen cell cultures. The plant extract, in this case, had an anti-inflammatory effect diminishing the inflammatory cytokines and increasing the anti-inflammatory ones. Therefore, it can be said that snakebites are capable of triggering the release of cytokines that will lead to tissue damage and the plant proved to be efficient in diminishing some of those cytokines / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-09-10Bitstream added on 2014-06-13T18:20:27Z : No. of bitstreams: 1 gasparotto_vpo_me_botfm.pdf: 823732 bytes, checksum: 72bbebb42d3239b78a28393a5aa3b0b7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O estudo avaliou a viabilidade in vitro do biomaterial “Selante de Fibrina derivado de veneno de serpente” (SF), como arcabouço para células tronco mesenquimais (CTMs) de ratos. O SF é um material caracterizado como adesivo biológico, e foi produzido e fornecido pelo Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos, CEVAP, Brasil. As CTMs foram coletadas a partir da medula óssea de fêmures e tíbias de ratos e foram caracterizadas por meio de citometria de fluxo com auxilio de marcadores positivos: CD 44 e CD 90 (CTMs) e marcador negativo: CD 34 (células tronco hematopoiéticas). Cultivos foram induzidos para diferenciarem-se em linhagens específicas (osteogênico, condrogênico e adipogênico). Para avaliação do crescimento in vitro e a viabilidade celular em conjunto ao biomaterial foram utilizadas microscopia óptica de luz invertida, microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de varredura e transmissão. O SF em contato com as CTMs não induziu a diferenciação espontânea para as linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica. As diferentes técnicas de avaliação microscópica utilizadas mostraram que o SF foi capaz de realizar a captura e manutenção das CTMs e houve interação das células com o interior e superfície do biomaterial. Portanto, a coleta, o cultivo e a caracterização das CTMs de ratos foram possíveis. O SF mostrou-se eficiente como arcabouço biológico e interagiu com as células tronco mesenquimais mantendo-as viáveis, oferecendo-se como uma ferramenta de uso clínico-cirúrgico alternativa para processos regenerativos visando terapias mais eficientes / This study evaluated the in vitro viability of biomaterial Fibrin Sealant (FS) derived from snake venom as a scaffold for rat mesenchymal stem cells (MSCs). The FS is characterized as a biological adhesive material, and is produced and was supplied by the Center for the Study of Venoms and Venomous Animals, CEVAP, Brazil. MSCs were collected from the bone marrow of femurs and tibias of rat and were characterized using flow cytometry with CD 44 and CD 90 positive markers (MSC) and CD34 negative marker (mononuclear stem cells). Cultivations were induced to differentiate into specific cell lineage (osteogenic, chondrogenic and adipogenic). To evaluate the in vitro growth and cell viability with the biomaterial were used inverted light optical microscopy, fluorescence microscopy and scanning electron microscopy and transmission. The SF did not cause the spontaneous differentiation in contact with MSCs to osteogenic, chondrogenic and adipogenic lineage. Different microscopy techniques showed that the SF was able to accomplish the capture and maintenance of MSCs and there was interaction with the cell interior and surface of the biomaterial. Finally, the collection, cultivation and characterization of rat MSCs were possible. The SF was effective as a biological scaffold and interacted with the MSCs keeping them viable offering itself as a tool for clinical and surgical alternative providing clinical and surgical therapies more efficient for regenerative processes