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Orientador: Jose Camillo Novello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T10:29:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_DulcineiaAparecida_M.pdf: 6490147 bytes, checksum: 1944efedfaa4d4911af346759c02f352 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Venenos de serpentes contêm uma ampla variedade de enzimas. As proteases purificadas de veneno são geralmente dassificadas por sua estrutura em: serinoproteases e metaloproteases, e apresentam potente efeito na ativação ou inibição da coagulação sangüínea, agindo na hemostasia, trombose, fibrinólise e agregação plaquetária. A presente dissertação teve por objetivo purificar e caracterizar a serinoprotease Uruprot do veneno de Bothrops altematus, uma serpente da família Viperidae. Uruprot foi purificada em dois passos cromatográficos: Sephadex G75 e DEAE 5PW, em sistema HPLC. A homogeneidade de Uruprot foi monitorada em gel SDS-PAGE e em coluna de fase reversa C18. O gel de eletroforese em condições desnaturantes evidenciou uma banda com massa molecular aparente de 32 kDa na presença de 0,1 M de DTT, sugerindo que esta é formada por uma única cadeia polipeptídica. A eletroforese de duas dimensões de Uruprot demonstrou ser seu ponto isoelétrico em torno de 4,6, confirmando massa molecular observada em SDS-PAGE. A análise da composição de aminoácidos de Uruprot apresentou alta concentração dos aminoácidos glicina, treonina, fenilalanina, isoleucina, serina e glutamina e baixos níveis de aminoácidos básicos como histidina e arginina, ratificando o resultado da 2D caracterizando um pl ácido. Uruprot teve reação positiva quando submetida à coloração para carboidrato, sugerindo a existência de carboidratos ligados covalentemente à sua estrutura. O estudo da homologia seqüencial da região N-terminal da seqüência consenso (WGGDECNINEHR-LVAI) indicou alto grau de homologia com as serinoproteinases: TVSPA (94%), KLE 11 (94%) e Ancrod (92%) entre outras. Uruprot não induziu a agregação em plaquetas lavadas, mas inibiu a indução da aglutinação de eritrócitos na presença de Ristocetina na concentração mínima de 1 O ~g/mL. O conjunto de resultados obtidos com Uruprot monstram fortes indícios de que essa pode desempenhar a função de ativadora do plasminogênio, entretanto o papel da atividade "in vivo" das serinoproteases de venenos em envenenamentos patológicos é pouco conhecido. Estudos adicionais são necessários para a obtenção de maiores informações sobre esse grupo de enzimas / Abstract: Snake venoms contain a high variety of toxic compounds and enzymes. Venom purified proteases are structurally dassified as serine proteases and metalloproteases, and showa potent effect on blood coagulation, acting on hemostasis, thrombosis, fibrinolysis and platelet aggregation. The aim of this work was the purification and characterization of a serine protease from the venom of Bothrops altematus snake, called Uruprot. Uruprot was purified in a two step chromatography: Sephadex G-75 and DEAE 5PW both in HPLC system. Its homogenity was monitored in SDS-PAGE and reversedphase C18 chromatography. In denaturing conditions, 0,1 M DTT, a band of 32 kDa apparent molecular mass was evidenced, suggesting that the protein consists in one polypeptidic chain. The two dimensional electrophoresis of Uruprot showed its isoelectric point at about 4,6, confirming the apparent molecular mass observed in SDS-PAGE. Uruprot's amino acid analysis composition showed a high concentration of glycine, threonine, phenylalanine, isoleucine, serine and glutamine and low levels of basic amino aCids, as histidine and arginine, ratifying the result obtained from bidimensional electrophoresis wich showed an acid pl. Uruprot showed a positive reaction when submitted to carbohydrate coloration indicating the presence of carbohydrate covalentely bound to its structure. The N-terminal sequence homology study showed a consensus sequence (WGGDECNINEHR-LVAI) and indicated a high homology with serine proteinase TSV-PA (94%), KLE 11 (94%), Ancrod (92%), and others. Uruprot did not induce platelet aggregation but inhibits erytrocytes agglutination in the presence of ristocetin, in a minimum concentration of 10llg/mL. Ali the results obtained indicates that Uruprot is a serine protease plasminogen activator, however, the role of "in vivo" activity of venom serine proteases in envenomation remains unclear. Additional studies are necessary to provide more information about this enzyme grou / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Michiko Sakate / Resumo: O presente trabalho teve por objetivo avaliar os aspectos clínico, laboratorial, histopatológico e tratamento na intoxicação experimental com o veneno da serpente Crotalus durissus terrificus em cães. Foram utilizados 21 cães, adultos, sem raça definida, divididos em três grupos com sete animais: grupo I - somente veneno; grupo II - veneno + cinco ampolas de soro antiofídico + fluidoterapia; grupo III - veneno + cinco ampolas de soro antiofídico + fluidoterapia + alcalinização da urina. O veneno da serpente Crotalus durissus terrificus liofolizado e reconstituído em solução salina foi inoculado pela via subcutânea, na dose de 1mg/kg de peso vivo, na face lateral da coxa do membro posterior esquerdo dos cães dos grupos I, II e III. Os animais foram submetidos às avaliações clínica, hematológica, hemostática, urinálise, bioquímica sérica, hemogasometria, pressão arterial sistólica, eletrocardiograma e mielograma. Três animais de cada grupo foram eutanasiados e foram colhidas amostras do tecido muscular para avaliação histopatológica. Os resultados mostraram a eficácia da soroterapia na neutralização do veneno e mostrou que o veneno da serpente Crotalus durissus terrificus provoca alterações clínica, hematológica, hemostática, de urinálise, hemogasométrica, da pressão arterial sistólica, do mielograma e histopatológica nos cães. Não houve evidências de alterações eletrocardiográficas e bioquímica. / Abstract: This work evaluated the clinical, laboratorial, histological and treatment in the experimental intoxication with the venom of the Crotalus durissus terrificus snake in dogs. Twenty-one adults (mixed breed) dogs divided in three groups with seven animals were used: group I - only venom; group II - venom + five bladders of anti-ophidic serum + fluid therapy; group III - venom + five bladders of anti-ophidic serum + fluid therapy + alkalization of the urine. The lyophilized venom of the Crotalus durissus terrificus snake was reconstituted in saline solution and inoculated subcutaneous, in the dose of 1mg/kg B.W., in the lateral face of the left thigh of the dogs of the groups I, II and III. The animals were submitted to clinical, hematological evaluation, hemostatic, urinalysis, biochemical, blood gas analysis, systolic arterial pressure, electrocardiogram and mielograma. Three animals of each group were eutanasied and samples from the muscular tissue and popliteal lymphonode were collected for hitopatological evaluation. The results showed the effectiveness of the serum therapy in the neutralization of the venom and it showed that the venom of the Crotalus durissus terrificus snake causes clinical, hematological, hemostatic, of urinary, hemogasometric changes, of the systolic arterial pressure, of the mielograma and histopathological in the dogs. There were no evidences of alterations eletrocardiografic and biochemical alterations. / Doutor

Orientador: Julia Prado Franceschi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-27T10:30:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_RejaneMariaLirada_D.pdf: 35252135 bytes, checksum: d8fa4a7fb76a10643309ff440ecc76fc (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Este trabalho trata do estudo farmacológico do veneno de Bothrops leucurus, conhecida como jararaca-do-rabo-branco. Objetivou-se caracterizar suas atividades bioquúnicas e imunobiológicas, como forma de avaliar o grau de soroproteção conferido pelos anti-venenos produzidos no Brasil e anti-B. leucurus, produzido na Argentina. Utilizou-se venenos de duas regiões geográficas da Bahia (Região Metropolitana do Salvador - RMS e Sul/Sudeste baiano - SB) e de machos e remeas, a fim de se estabelecer possíveis variações geográficas e sexuais. Procedeu-se a determinação da dosagem protéica, perfil cromatográfico e eletroforético, das atividades tóxica, proteolítica, edemaciante, hemorrágica, necrosante, defibrinante, pró-coagulante, miotóxica e sobre a junção neuromuscular, caracterização imunoquúnica e neutralização das atividades biológicas da peçonha, frente aos soros antibotrópico-crotálico (SABC) do Instituto Butantan (IB), Instituto Vital Brazil (IVB), Fundação Ezequiel Dias (FUNED) e Soro anti- B. leucurus do Instituto Carlos Malbrán. O perfil eletroforético do veneno caracterizou-se pela presença de 4 bandas e o perfil cromatográfico por 7 picos, sendo semelhantes nos diferentes pools. Houve variação regional e sexual, nas atividades biológicas, já que o veneno das serpentes do SB apresentou atividades tóxica, hemorrágica, necrosante e miotóxica maior que da RMS, no entanto, a atividade coagulante desta última foi maior que o da primeira. O veneno das remeas foi mais coagulante que o dos machos. Todas as amostras induziram mionecrose, caracterizada por "balonização", vacuolização, lesões "delta", hipercontração, condensação das miofibrilas e áreas de degeneração muscular. As amostras, em concentrações a partir de 50 J.!glrnl,inibirama transmissão neuromuscular, de maneira dose-dependente e irreversível(com exceção do veneno dos machos), devido às suas ações pós-juncionais. Na dose de 10 µg/ml,veneno de machos e remeas induziu aumento na amplitude das respostas musculares, demonstrando ação pré-sináptica. A peçonha de espécimens da RMS foi mais potente em provocar 50% do bloqueio da resposta contrátil que os da SB, assim como o veneno das remeas foi mais potente que dos machos. Observou-se inibição da resposta acetilcolínica nas preparações tratadas com 50 e 100 µg/mldas diferentes amostras e da amplitude da resposta muscular, de maneira dose-dependente e irreversível, com variação geográfica e sexual. O ELISA demonstrou que todos os pools apresentaram títulos de anticorpos frente a todos os anti-soros testados, sendo maiores frente ao soro específico, com exceção do pool da RMS, cuja titulação do soro específico foi equivalente a do SABC do IB. Dentre os soros inespecíficos,o do IB foi o que apresentou maior titulação, seguido do SABC da FUNED e do IVB. Houve variação na capacidade neutralizante dos soros frente às amostras, e o SABC/IB apresentou maior reatividade cruzada frente ao veneno de machos e da RMS. Os SABCIFUNED e IVB foram melhor reconhecidos pelo veneno de machos, da RMS e SB. O Westemblot demonstrou que o veneno desta espécie apresentou reação cruzada tanto frente ao soro anti-B. leucurus quanto ao SABC do IB e que a reação foi mais intensa quando utilizou-se o soro específico. Todos os anti-venenos foram capazes de neutralizar as atividades hemorrágica, necrosante e hemolítica das duas amostras de veneno, apesar da variação regional observada nesta soroneutralização / Abstract: The present work was a phannacological study of the action Bothrops leucurus venoro, popular known as "white-tailed lancehead". Venom effects (males and females from 1v1RSand South/Southeast region - SSR, Bahia, Brazil) were examined to establish geographical and sexual variability. The venom was characterized based on biochemical (total protein content, chromatographic and electrophoretic pattern), biological (lethal - LDso, proteolytic, venom-induced oedema - ED3o, haemorrhagic - MHD, necrotizing - MND, procoagulant - MCD, defibrinogenating- MDD, myotoxic and neurotoxic activities), imunochemical (ELISA, Westemblot) properties and neutralization of the toxic activities (haemorrhage, necrosis and coagulation). The antibothropic antivenom was provided Instituto Butantan, Instituto Vital Brazil and Fundação Ezequiel Dias (Brazil) and anti-Bothrops leucurus antivenom provided Instituto Malbrán (Argentina). The electrophoretic pattem showed 4 bands and chromatographic pattem 7 peaks without sexual and geographical variability. Lethal, haemorrhagic, necrotizing and myotoxic activities are more intense in snakes proceeding of the SSR than MRS. The coagulant activity of the female's venom is more coagulant than male. All samples induced myonecrosis characterized by swollen, vacuolization, "delta" lesions, myofilament hypercontraction and areas of the muscular damage. Results indicated that by indirect stimulation, B. leucurus venom induced neuromuscular blockade dose-dependent and is irreversible under concentration upper of 50 µg/ml, with exception of the male's venom (upper 100 µg/ml). This occurred probably due to postsynaptic action (depolarizing the cellular membrane, characterized for the severe contracture in 100 µg/ml e 200µg/ml concentrations) of the venom proceeding of the 1v1RSand SSR regions and moderated contracture in 200 µg/ml concentration of the males and females venoro. A males and females venom-induced effect on presynaptic activity was suggested by the marked increase in the twitch tension in 10 µg/ml concentration. The female's B. leucurus venom and proceeding of the 1v1RS region were more potent than male's venom of the SSR region in provocked 50% of the neuromuscular blockade (P<0.05) / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Michiko Sakate / Banca: Regina Kiomi Takahira / Banca: Rosa Maria Barilli Nogueira / Resumo: O presente trabalho avaliou os aspectos clínicos, laboratoriais e histopatológicos da intoxicação experimental por Bothrops jararaca e Crotalus durissus terrificus em ratos Wistar e comparou o tratamento entre soro antiofídico isolado e o soro antiofídico associado ao extrato de Mikania glomerata. Os ratos foram distribuídos em 2 grupos: VB - veneno botrópico e VC- veneno crotálico. Os grupos foram divididos em 3 subgrupos G1 (controle), G2 (veneno + soro antiofídico), G3 (veneno + soro antiofídico + extrato de Mikania glomerata). O veneno das serpentes (10mg/kg) foi inoculado, via intramuscular, na face lateral da coxa do membro posterior esquerdo. O soro antiofídico foi administrado via intraperitonial e o extrato de Mikania glomerata foi administrado por gavage. Os animais foram submetidos a avaliações clínicas, hematológicas e bioquímica sérica em 3 momentos: (M1) 30 minutos após inoculação, (M2) 6 horas após inoculação e (M3) 24 horas após inoculação. A histopatologia foi realizada somente no momento M3. Nos grupos VB e VC, foram observados hipotermia, edema de membro esquerdo, e no grupo VB, foram observadas incoagulabilidade sangüínea e diminuição nos valores de número de hemácias, hemoglobina, proteína plasmática total e volume globular. Nos dois grupos, houve aumento de leucócitos, neutrófilos e diminuição de linfócitos. Também foi observada elevação nos valores de uréia, creatinina e creatina quinase. Os achados histopatológicos incluem: degeneração, edema, congestão e hemorragias renais e musculares, necrose de coagulação, degeneração hidrópica renal e necrose tubular aguda. A principal ação da Mikania glomerata foi a redução ou prevenção de lesões musculares no veneno botrópico e a redução ou prevenção de lesões musculares e renais como observadas à histopatologia, nos animais do grupo crotálico. / Abstract: This study has evaluated clinical, laboratorial and histopathologic aspects of experimental poisoning by Bothrops jararaca and Crotalus durissus terrificus in Wistar rats and has compared the treatment between antiophidian serum and antiophidian serum plus the extract of Mikania glomerata. The rats were distributed in two groups: BV - Bothrops venom and CV - Crotalus venom. The groups were splited in 3 subgroups: G1 (control), G2 (venom + antivenon), G3 (venom + antivenin + extract of Mikania glomerata). The snake venoms (10mg/kg) were inoculated for via intramuscular, on a lateral face of the left posterior limb. The antivenin was applied intraperitoneal and the extract of Mikania glomerata was given by gavage. The animals were submitted to clinical and laboratory evaluations in 3 moments: (M1) 30 minutes after inoculation, (M2) 6 hours after inoculation and (M3) 24 hours after inoculation. Histopathology examination was performed only at M3. Rats from both groups (BV and CV) presented hypothermia, noticeable left limb edema. Also in the group BV, blood incoagulability and decrease in red blood cell counts, hemoglobin, total plasma protein and packed cell volume were detected. Both groups showed leukocytosis, neutrophilia and lymphopenia. It was also verified increases in urea, creatinine and creatine kinase. Degeneration, edema, congestion, kidney and muscle hemorrhages, coagulation necrosis, kidney hydropic degeneration and acute tubular necrosis were found on histopathologic results. The main effect of the extract of Mikania glomerata was to reduce or prevent muscle lesions for the Bothrops venom and to reduce or prevent muscle and kidney lesions as showed by histophalologic examination in animals from Crotalus group. / Mestre

Orientador: Márcia Gallacci / Banca: Roberto de Lucia / Banca: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Vidal Haddad Junior / Banca: Maeli Dal Pai-Silva / Resumo: As fosfolipases A2 (PLA2s) que apresentam substituição do resíduo de aspartato pelo de lisina na posição 49, PLA2s Lys49 homólogas, são importantes componentes miotóxicos dos venenos de serpentes da família Viperidae. Estas proteínas induzem severa mionecrose através de um mecanismo cálcio-independente. Tradicionalmente, as PLA2s Lys49 são classificadas como miotoxinas não-neurotóxicas, visto que não causam paralisia quando injetadas in vivo, mesmo em doses elevadas. No entanto, vários estudos in vitro demonstram que as PLA2s Lys49 dos venenos de serpentes do gênero Bothrops induzem bloqueio neuromuscular em preparações isoladas. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi avançar no conhecimento do mecanismo da ação paralisante in vitro destas toxinas. Para tanto, foram caracterizadas as atividades da MjTX-II, isolada do veneno da Bothrops moojeni, em preparações frênico-diafragma de camundongos, através de estudos miográfico, eletrofisiológico e morfológico. Os efeitos desta toxina foram comparados com os da PrTX-I e da BthTX-I, isoladas do veneno da Bothrops pirajai e da Bothrops jararacussu, respectivamente. Além disto, foi avaliada a capacidade da suramina e do extrato aquoso de Casearia sylvestris em neutralizarem as ações destas toxinas. Os resultados obtidos mostraram que a MjTX-II, da mesma forma que a BthTX-I e a PrTX-I, induziu efeitos miotóxico e bloqueador neuromuscular na preparação frênico-diafragma de camundongos. O estudo eletrofisiológico revelou a atividade despolarizante das três toxinas na membrana da fibra muscular, bem como a habilidade da MjTX-II em induzir aumento na freqüência dos potenciais de placa motora terminal em miniatura. A pré-incubação com e extrato aquoso de Casearia sylvestris neutralizou as atividades miotóxica e bloqueadora neuromuscular das três toxinas. De forma similar, a pré-incubação com ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Phospholipases A2 (PLA2s) with a lysine substituting for the highly conserved aspartate 49, Lys49 PLA2 homologues, are important myotoxic components in venoms from snakes of Viperidae family. These proteins induce conspicuous myonecrosis by a catalytically-independent mechanism. Traditionally, the Lys49 PLA2 homologues are classified as non-neurotoxic myotoxins given their inability to cause paralytic effect when injected in vivo, even at relatively high doses. However, a series of in vitro studies has shown that several Lys49 PLA2 homologues from Bothrops snake venoms induce neuromuscular blocking activity on nerve-muscle preparations in vitro. Therefore, the aim of this work was to advance in the understanding of the mechanisms underlying the in vitro paralyzing action of these proteins. Thus, we characterized the activities of MjTX-II, from Bothrops moojeni venom, in mice phrenic-diaphragm preparation by means of myographical, electrophysiological and morphological approaches. The effects of this toxin were compared with those of PrTX-I and BthTX-I, from Bothrops pirajai and Bothrops jararacussu venoms, respectively. Besides this, we evaluated the ability of suramin and the aqueous extract of Casearia sylvestris in neutralizing the actions of these toxins. The results showed that the MjTX-II, as well as BthTX-I and PrTX-I, induced myotoxic and neuromuscular blocking activities in phrenic-diaphragm preparation of mice. The electrophysiological study revealed the depolarizing activity of these toxins in the muscle fiber membrane and the ability of MjTX-II to increase the frequency of miniature endplate potentials. The pre-incubation with the aqueous extract of Casearia sylvestris neutralized both myotoxic and neuromuscular blocking activities of all toxins. Similarly, the pre-incubation with suramin neutralized the activities of MjTX-II. Taken together, these findings suggest that the ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Jose Camillo Novello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T20:22:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_DanielaDiogenesde_M.pdf: 3678329 bytes, checksum: b2979d9021832e5cf620da29d174d33d (MD5) Previous issue date: 1979 / Resumo: As lectinas constituem um grupo de proteínas que possuem a capacidade de se ligarem especificamente e reversivelmente a determinados carboidratos. Identificadas em vegetais e animais, são também encontradas em venenos ofídicos. Quando isoladas de venenos de serpentes, essas proteínas ligam-se a 'beta¿-galactosídeos e induzem aglutinação de eritrócitos, agregação de plaquetas e são mitogênicas para linfócitos. Uma lectina específica para 'beta¿galactosídeos foi purificada do veneno de Bothrops jararacussu através de cromatografia de afinidade em D-galactose, e foi denominada BjcuL. A análise do perfil de massa molecular em SDS-PAGE a 15% mostrou que BjcuL é um homodímero composto de subunidades de 15kDa. Quando submetido à coloração para carboidratos após SDS-PAGE, a proteína mostrou reação negativa, sugerindo que BjcuL não é uma glicoproteína. BjcuL aglutina eritrócitos tripsinizados de porco e boi, em concentrações mínimas de 0,5 'mu¿g/ml e 2,0 'mu¿g/ml, respectivamente. A hemaglutinaçao de eritrócitos porcinos induzida por 4,0 'mu¿g/ml de BjcuL é inibida especificamente por lactose 0,8 mM, galactose 3,2 mM e rafinose 3,2 mM. EDTA 0,2 mM e EGTA 0,1 mM também inibem a atividade hemaglutinante de BjcuL, o que revela a dependência de cátions divalentes. A associação das subunidades da lectina de B. jararacussu é essencial para sua atividade hemaglutinante, pois BjcuL reduzida com DTT não exibem esta atividade sobre eritrócitos porcinos... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Lectins are polyvalent carbohydrate-binding proteins which agglutinate red blood cells. Identified in plants and animals, have also been found in snake venoms. These proteins bind to lactose moieties and induce agglutination of erythocytes, aggregation of platelets and are mitogenic to lymphocytes. A galactose-specific lectin in Bothrops jararacussu venom (BJcuL) was adsorbed on a immobilized D-galactose column and eluted with 0.1 M lactose. On SDS-PAGE, under reducing conditions (0.1 M DTT), the fraction eluted showed a single band of 15 kDa, and under non reducing conditions, a major band of 30 kDa. This protein appeared not to be a glycoprotein because it gave negative reaction to the Schiff¿s reagent following treatment with periodate. Trypsined erythrocytes from pig and cow were agglutinated by BJcuL, with end points of approximately 0.5 'mu¿g/ml and 2.0 'mu¿g/ml, respectively. The hemagglutination of trypsined pig erythrocytes induced by 4.0 'mu¿g/ml of BJcuL was inhibited specifically in the presence of 0.8 mM lactose, 3.2 mM galactose, 3.2 mM raffinose. BJcuL demonstrated a requirement for divalent cation, since 0.2 mM EDTA or 0.1 mM EGTA, completely inactivated the lectin induced hemagglutination activity. The association of subunits via interchain disulfide bonds is essencial for lectin activity, since DTT-reduced BJcuL showed no hemagglutination activity against pig erythrocytes... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Albetiza Lobo de Araujo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-27T18:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guimaraes_AlessandradeQueiroz_M.pdf: 16488672 bytes, checksum: 60d60725663ca1fee278966dc0ff2ea0 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: É bem conhecida a capacidade dos venenos de serpentes do gênero Bothrops induzirem intensos efeitos locais, tais como edema, hemorragia e necrose. Neste trabalho investigou-se os possíveis mediadores da resposta inflamatória local (edema) e hemorrágica induzida pelo veneno de Bothrops lanceolatus (VBL) em ratos. O edema foi induzido por injeção subplantar de VBL (12,5 - 100 ~g/pata) e quantificado com hidropletismógrafo. Em todas as doses testadas, a resposta edematogênica foi máxima aos 15 minutos, caindo, progressivamente, até desaparecer após 24 horas. As drogas metisergida, ciproheptadina, dexametasona, HOE 140 e associação HOE 140 -metisergida reduziram significativamente a atividade edematogênica induzida pelo VBL (50 ~g), o que não ocorreu com a indometacina e mepiramina. O efeito edematogênico pareceu ser independente da presença de aminas biogênicas ou outras substâncias de baixo peso molecular no veneno, uma vez que a diálise não alterou significativamente este quadro. Investigando a atividade hemorrágica, tratamos o VBL com EDTA. O tratamento inibiu a atividade hemorrágica, bem como reduziu significativamente o edema. Nos animais iIljetados com VBL tratado com EDT~ o edema residual mostrou-se mediado pela serotonina, histamina, bradicinina e possivelmente, metabólitos do ácido araquidônico. A análise histopatológica das patas injetadas com o VBL demonstrou aumento da região dérmica e dos espaços intercelulares, característicos do edema, além da presença de moderado fufiltrado inflamatório e intensa hemorragia. O tratamento prévio dos animais com dexametasona reduziu o infiltrado celular e o edema, sem interferência na atividade hemorrágica. O estudo das patas injetadas com VBL tratado com EDTA demonstrou redução do número de hemáceas extravasculares e do edema, sem aparente alteração do infiltrado leucocitário. Além dos efeitos locais, a injeção subplantar do VBL provocou alterações sistêmicas detectadas nos rins. Os túbulos distais apresentaram diâmetro aumentado; nos túbulos proximais, restos celulares provavelmente de natureza protéica, foram vistos ao lado de vasos sangüíneos congestos. Nos corpúsculos renais houve aumento do espaço capsular de filtração, além de alterações na lobulação do tufo de capilares. O tratamento do veneno com EDTA reverteu alguns dos efeitos glomerulares e tubulares produzidos pelo envenenamento, o que não se observou em animaispré-tratados com dexametasona. "' uo soro anti-VBL parcialmente purificado previamente incubado com o VBL eliminou completamente a atividade hemorrágica e parcialmente a atividade edematogênica do veneno, não demonstrando eficácia superior quando os resultados foram comparados àqueles obtidos com o soro anti-VBL total. A inoculação intravenosa soro anti-VBL total ou parcialmente purificado, imediatamente após injeção do VBL, foi ineficaz na neutralização dos dois fenômenos / Abstract: Phannacological modulation of the rat hind-paw edema induced by subplantar injections of Bothrops lanceolatus venom (BLV) was investigated. The edema induced by subplantar injections of 12.5; 25; 50; 75 and 100 Ilg of BLV was quantified by hydroplethysmography. Wrth all of the venom doses tested, the edematogenic response were maximal within 15 min and disappeared over 24 h. Edema is not due to the presence of edematogenic amines or other small molecules, since dialysis did not change the edema. Part of edema induced by BLV is due to hemorrhagic components (metalloproteinases) since prior incubation of BLV 50 Ilg and 5 mM EDTA for 30 min at room temperature, caused a partia! inhibition of its edematogenic activity. However, liberation of phannacological active substance at the site of injection such as arachidonate metabolites, serotonin and bradykinin may play an important role in the BLV-induced edematogenic effect, since dexamethasone, methysergide and HOE 140 reduced significantlythe edema formation. Histological examination showed that BLV (50 Ilg) caused a marked edema and hemorrhage, characterized by extensive intercellular spaces and presence of extra vascular red blood cells. In addition, there was infiltration of inflammatory cells, particularly neutrophils. The chelating agent EDTA reduced moderately the edema, reduced partially the hemorrhage, but did not affect the presence of inflammatory cells at tOOsite of venom injection. The ability of antiserum to Bothrops lanceolatus venom and of a partially I purified antibody fraction ftom this serum in neutralizing tOOlocal effects produced by BLV in rats was a1so investigated. Preincubation-type experiments showed that BLVinduced edema was neutra1ized by globulin-rich fraction 2 h, or more, afier venom administration. Macroscopically, the hemorrhagic activity was completely neutralized. When BLV-antiserum and the globulin-rich fraction were administered i.v. afier venom injection, no significant edema and hemorrhage neutralization was observed. BLVantiserum and globulin rich fraction neutraIized the venom-induced edema and hemorrhage to similar extents. This finding indicated that the globulin-rich fraction obtained by ammonium sulfate precipitation offers no significant advantages in neutralization compared to the unfractionated antiserum / Mestrado / Mestre em Farmacologia

OGATA, Miriam Camargo Guarnieri, também é conhecido(a) em citações bibliográficas por: GUARNIERI, Miriam Camargo / Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-10-05T20:11:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Rafaela Mota Gonzaga.pdf: 2557106 bytes, checksum: 947b0b8999788f6e9f90333ff5ea6877 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-11-14T19:23:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Rafaela Mota Gonzaga.pdf: 2557106 bytes, checksum: 947b0b8999788f6e9f90333ff5ea6877 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-14T19:23:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Rafaela Mota Gonzaga.pdf: 2557106 bytes, checksum: 947b0b8999788f6e9f90333ff5ea6877 (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / CAPES / Crotalus durissus cascavella é uma subespécie endêmica da região Nordeste do Brasil, cuja peçonha difere das demais subespécies do país pela ausência de crotamina e alta concentração de fosfolipases A₂ (PLA₂) ácidas. Neste estudo, duas novas PLA₂s ácidas, denominadas Cdca-I-PLA₂ e Cdca-II-PLA₂, foram purificadas da peçonha de C. d. cascavella através de duas e três etapas cromatográficas, respectivamente. A pureza e homogeneidade de ambas fosfolipases foram determinadas por SDS-PAGE e espectrometria de massa, apresentando uma banda única e massa de 14.247 Da (Cdca-IPLA₂) e 14.418 Da (Cdca-II-PLA₂). Ambas fosfolipases foram ativas sobre 4-nitro-3- ácido octanoil benzóico, apresentando atividade específica de 11,51 ± 0,50 U/mg e 26,75 ± 0,15 U/mg, Km = 0,2280 mM e 0,3993 mM e Vmax = 13,15 nmol×min⁻¹mg⁻¹ e 39,68 nmol×min⁻¹mg⁻¹, respectivamente. Ambas não apresentaram atividade sobre BApNA. A Cdca-I-PLA₂ apresentou atividade hemaglutinante na dose de 15 μM, enquanto a Cdca- II-PLA₂ apresentou atividade sobre substrato fluorogênico de trombina nas doses de 15 μM e 30 μM. As Cdca-I-PLA₂ e Cdca-II-PLA₂ reduziram a agregação plaquetária induzida por colágeno, adrenalina e ácido araquidônico, porém as duas enzimas (20 μM) não reduziram a agregação quando ADP foi utilizado como agonista. Cdca-I-PLA₂ apresentou atividade dose resposta como agonista de agregação em plaquetas lavadas e reduziu significativamente a atividade agregante plaquetária da trombina. Cdca-I-PLA₂ apresentou maior atividade anticoagulante, prolongando os tempos de protrombina (TP; 30 μM; R = 22) e tromploplastina parcial ativada (TTPa; 30 μM; R = 10), porém não promoveu alteração do tempo de trombina (TT) na dose de 10 μM. Cdca-II-PLA₂ prolongou discretamente o TP (30 μM; R = 2) e TTPa (30 μM; R = 1,5) e significativamente o TT (20 μM; R = 7). Desta forma, nossos resultados sugerem que a Cdca-I-PLA₂ é uma quimerolectina anticoagulante com importante atividade sobre agregação plaquetária, enquanto Cdca-II-PLA₂ possui alta atividade enzimática, inibe tanto a agregação plaquetária quanto a coagulação, agindo como inibidor de trombina por meio da sua ligação com o fibrinogênio. / Crotalus durissus cascavella is ana endemic subspecie from Northeast region of Brazil, whose venom differs from the other subspecies of the country due to the absence of crotamine and high concentration of acidic phospholipase A₂ (PLA₂). In this study, two new acidic PLA₂s, named Cdca-I-PLA₂ and Cdca-II-PLA₂, were purified from C. d. cascavella venom by two and three chromatographic steps, respectively. The purity and homogeneity of both phospholipases were determined by SDS-PAGE and mass spectrometry, showing a single band and molecular mass of 14.247 Da (Cdca-I-PLA₂) and 14.418 Da (Cdca-II-PLA₂). Both PLA₂s were active on 4-Nitro-3-(octanoyloxy) benzoic, presenting specific activity of 11,51 ± 0,50 U/mg and 26,75 ± 0,15 U/mg, Km = 0,2280 mM and 0,3993 mM and Vmax = 13,15 nmol×min⁻¹mg⁻¹ and 39,68 nmol×min⁻¹mg⁻¹, respectively. Both had no activity on BApNA. The Cdca-I-PLA₂ showed hemagglutinating activity at the dose of 15 μM, while Cdca-II-PLA₂ showed activity on fluorogenic thrombin substrate at the doses of 15 μM e 30 μM. The Cdca-I-PLA₂ and Cdca-II-PLA₂ reduced platelet aggregation induced by collagen, adrenaline and arachidonic acid, but the two enzymes (20 μM) did not reduce aggregation when ADP was used as an agonist. Cdca-I-PLA₂ showed dose response activity as agonist of aggregation in washed platelets and significantly reduced thrombin platelet aggregation activity. Cdca-I-PLA₂ presented higher anticoagulant activity, prolonging prothrombin time (PT; 30 μM; R = 22) and activated partial thromboplastin time (aPTT; 30 μM; R = 10), but did not promote a change in thrombin time (TT) at a dose of 10 μM. Cdca-IIPLA₂ prolonged discreetly the PT (30 μM; R = 2) and the aPTT (30 μM; R = 1.5) and significantly prolonged the TT (20 μM; R = 7). Thus, our results suggest that Cdca IPLA₂ is an anticoagulant chimerolectin with important activity on platelet aggregation, while Cdca-II-PLA₂ has high enzymatic activity, inhibit both platelet aggregation and cloagulation, acting as thrombin inhibitor through its biding to fibrinogen.

Orientador: Stephen Hyslo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-01T18:31:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valerio_AmandaAbdalla_M.pdf: 13631091 bytes, checksum: 614bd6add75c50691b0684d8afeade9b (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Peçonhas de serpentes contêm enzimas que quebram ligações fosfáticas (ATPases, 5'-nucleotidases, fosfatases e fosfodiesterases ou PDE) e que agem sobre ácidos nucléicos (PDE, DNase e RNase). Nesse trabalho, purificou-se e caracterizou-se a PDE da peçonha de Bothrops alternatus. A PDE foi isolada da peçonha, usando-se uma combinação de cromatografias de gel filtração e troca iônica. Em SDS-PAGE, a enzima é constituída de uma única cadeia polipeptídica com uma massa molecular de 105 kDa, a qual foi inalterada pela presença do ß- mercaptoetanol, indicando assim que a proteína não possui subunidades. A enzima foi reconhecida por anti-soro botrópico comercial, tanto no ELlSA como no immunoblotting. A enzima purificada era desprovida de nucleotidase, fosfatase alcalina e atividade proteolítica. O pH ótimo da PDE foi de 7.5 a 9.5, com temperatura ótima de 60°C. Houve perda rápida de atividade, após 1 minuto a 70°C. O Kmda enzima foi de 2.69 mM. A atividade da PDE foi potencializada pelo cobalto e, em grau menor pelo cálcio, enquanto que o cobre, manganês, zinco, EDTA and ß-mercaptoetanol foram inibitórios. Esses resultados mostram que esta enzima é pertence à família de proteínas da PDE isoladas de outras peçonhas ofídicas / Abstract: A phosphodiesterase was purified from the venom of the snake Bothrops alternatus by a combination of gel filtration and ion exchange chromatographies. In SDS-PAGE, the enzyme gave a single band with a molecular mass of 105 kDa which was unaltered in the presence of ß -mercaptoethanol, indicating that the protein contained no subunits. There were no contaminating 5'-nucleotidase, alkaline phosphatase and protease activities. The enzyme was recognized by commercial bothropic antiserum and gave a single band in immunoblotting. The enzyme had a pH optimum in the range of 7.5-9.5 and the optimum temperature was 60°C, with activity being rapidly lost within 1 min at 70°C. The Kmof the enzyme was 2.69 mM. PDE activity was potentiated by cobalt and, to a lesser extent, by calcium, whereas copper, manganese, zinc, EDTA and ß-mercaptoethanol were inhibitory. These properties show that this enzyme is very similar to that isolated from other snake venoms.4 / Mestrado / Mestre em Farmacologia