Orientador: Rui Ferreira Seabra Junior / Resumo: Os acidentes ofídicos constituem um relevante problema de saúde pública, a qual deve receber cuidados rápidos e eficientes. Em relação ao ofidismo, no Brasil, somente há poucos anos foi definida uma política abrangente que enfocasse as múltiplas questões relacionadas aos acidentes humanos provocados por animais peçonhentos. Os venenos de serpentes apresentam uma mistura de compostos inorgânicos (íons metálicos) e orgânicos, sendo ricos em moléculas biologicamente ativas. Dentre essas moléculas, peptídeos, proteínas e compostos de baixa massa molecular são frequentemente estudados por apresentarem grande potencial terapêutico. Essas moléculas, se bem conhecidas, podem ser utilizadas na investigação de mecanismo moleculares e celulares. Além disso, estabelecem interessantes modelos moleculares para o desenvolvimento de estratégias biotecnológicas aplicáveis na criação de ferramentas experimentais e/ou agentes terapêuticos para a pesquisa básica e aplicada. Diante disso, a elucidação dos peptídeos hipotensores presentes no veneno crotálico da subespécie Crotalus durissus terrificus é o objetivo do presente trabalho. Este estudo poderá promover a identificação de outras moléculas hipotensoras podendo conter princípios ativos mais eficientes para o tratamento de quadros clínicos de hipertensão, doença esta que acomete milhares de pessoas no mundo todo. No presente trabalho, a porção peptídica do veneno da serpente C.d.t., apresentou rendimento médio de 12,8% em relação ao veneno b... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The snakebites are an important public health problem, which must receive quick and efficient care. Regarding the ophidism, in Brazil, only a few years ago a comprehensive policy was defined that emphasized multiple issues related to human accidents caused by venomous animals. The snake venoms present a mixture of inorganic and organic compounds, being rich in biologically active molecules. Among these molecules, peptides, proteins and low molecular weight compounds are often studied by their ability therapeutic. Those molecules, when well known, may be used in the investigation of cellular and molecular mechanism. In addition, it provides interesting molecular models for the development of biotechnological strategies applicable in the creation of experimental tools and / or therapeutic agents for basic and applied research. Therefore, the elucidation of hypotensive peptides present in the venom of Crotalus durissus terrificus subspecies is the aim of this study, once this study may promote the identification of other hypotensive molecules may contain more effective active ingredients for the treatment of clinical conditions hypertension, this disease affecting millions of people in the world. In this study, the peptide portion of the venom of the snake Cdt, performed with an average yield of 12.8% compared to the venom under total protein precipitation conditions in the presence of trifluoro acetic acid to 0.1% (v / v) and, when subjected to purification strategy for reverse... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Resumo: A administração de soros heterólogos de origem eqüina constitui o único tratamento para os acidentes ofídicos, porém estes são capazes de induzir reações de hipersensibilidade. Novos processos de hiperimunização em animais alternativos vêm sendo desenvolvidos, juntamente à ferramentas de destoxificação dos venenos e novas alternativas de adjuvantes. No presente trabalho, foi utilizado veneno de Crotalus durissus terrificus nativo (VN) e irradiado com Co60 (VIr), em quatro diferentes protocolos de hiperimunização, para uma avaliação quinzenal do perfil imunológico dos grupos de ovinos pela técnica de ELISA. Os animais foram avaliados clinicamente todos os dias e pesados a cada 14 dias. Ao final, foram inspecionados em frigorífico para aprovação de consumo e os rins, analisados histologicamente. Os soros obtidos foram avaliados quanto à capacidade de neutralização por meio de testes "in vitro". O momento quatro (M4) apresentou o maior nível de titulação nos quatro grupos, porém o G1, inoculado com VN associado ao adjuvante incompleto de Freund (AIF), apresentou o maior nível quando comparados com os demais grupos, inoculados com VN associado à sílica nanoestruturada SBA-15 (G2), VIrr associado ao AIF (G3) e VIrr associado a SBA-15. Não houve diferença estatística entre os grupos em relação ao ganho de peso. Apenas um animal apresentou lesão no local de aplicação. Todos as carcaças obtiveram um carimbo de aprovação para consumo do Serviço de Inpeção Federa (SIF)l. Não houve alterações histológicas renais características de envenenamento crotálico. Os soros produzidos pelos quatro grupos foram capazes de neutralizar o efeito letal do veneno de Crotalus durissus terrificus, observados pelos testes de neutralização. O protocolo convencional de imunização utilizado no grupo um (G1) mostrou-se mais eficiente na neutralização do efeito letal quando comparados com os demais protocolos. / Abstract: The administration of heterologous antivenoms raised in horses is considered the only treatment for envenoming by venomous animals. However, it causes hypersensitivity reactions. New hyperimmunization processes in alternatives animals have been developed, associated to detoxication of venoms an new alternatives of adjuvants. In the present study it was used the natural (NV) and Co- 60-irradiated (IrrV) Crotalus durissus terrificus venom, in four differents protocols for a evaluation every fifteen days of the immunological response of the four ovine groups by the ELISA test. The clinical evaluation of the animals was performed and the weigth obteined every fourteen days, submited to a frigorific inspection and histological kidneys analysis. The neutralization capacity of the serum produced was evaluated in "in vitro" test. The fourth moment presented the major titles for all groups. However, the first group (G1), inoculated with NV associated with Freund's incomplet adjuvant (FIA) and aluminiun hidroxide presented the major titles when compared with the other ones, inoculated with NV associated to SBA-15 (G2), IrrV associated with FIA (G3) and IrrV associated with SBA-15 (G4). There was no estatistic difference between the groups concerning the weigth analysis. Only one animal presented lesion at the inoculation site. All the carcass obtained the consume aprovation stamp of the Federal Inspection Service (FIS). There was no kidney lesions on histological analysis. The four serum produced were able to neutralize the letal effect of Crotalus durissus terrificus venom, showed by the neutralization test. The convencional immunization protocol used for the first group (G1) showed more efficient neutralization capacity when compared with the others groups. / Orientador: Benedito Barravieira / Coorientador: Rui Seabra Ferreira Junior / Banca: Sony Dimas Bicudo / Banca: Nancy do Nascimento / Mestre

Orientador: Raghuvir K. Arni / Banca: Patrick Jack Spencer / Banca: Solange M. T. Serrano / Banca: José Ramón B. Abrego / Banca: Roberto da Silva / Resumo: / Abstract: / Doutor

Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Patrick Jack Spencer / Banca: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: João Ruggiero Neto / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Resumo: Corynebacterium pseudotuberculosis (C. pseudotuberculosis) é o agente etiológico da linfadenite caseosa (CLA), uma doença que afeta diferentes grupos de animais em todo o mundo, especificamente áreas de produção de ovinos e caprinos, que causam perdas econômicas significativas. Estas bactérias podem infectar humanos, e 25 casos de infecções em humanos foram relatados na literatura. Atualmente, não há nenhum tratamento eficiente para esta doença e também não existem estruturas cristalográficas de proteínas de C. pseudotuberculosis que possam ajudar a compreender melhor o mecanismo de ação desse patógeno. No presente estudo, foram expressas e purificadas proteínas-chave que desempenham papéis importantes no metabolismo deste patógeno. Três proteínas de C. pseudotuberculosis foram expressas e purificadas. Triose fosfato isomerase (TIM) é uma enzima ativa da via glicolítica, sendo uma das principais enzimas envolvidas no fornecimento de energia para o organismo. Esta enzima foi expressa purificada e cristalizada. Tiorredoxina redutase (TrxR) e Tioredoxina (Trx) participam do sistema tioredoxina (redox), em que o Trx atua como um substrato para o TrxR. Estas enzimas têm diversas funções nos organismos. Estas enzimas foram expressas, purificadas e caracterizadas. A estrutura cristalográfica da TIM foi determinada a 2,5 Å. Proteínas de veneno de serpente, também foram investigados neste estudo, e cinco proteínas diferentes do gênero Bothrops foram purificados e cristalizadas. A estrutura cristalina da Atroxlysin-I foi determinada a 1,8 Å de resolução e foi comparada com diferentes metaloproteinases-I que foram depositados no PDB / Abstract: Corynebacterium pseudotuberculosis (C. pseudotuberculosis) is the etiological agent of Caseous Lymphadenitis (CLA), a disease that affects different groups of animals worldwide, specifically sheep and goat production areas, which result a significant economic losses. These bacteria even infect humans; to date 25 different cases of infections in humans are reported in the literature. Currently, no efficient treatment for this disease is available neither a crystallographic structure of any protein from C. pseudotuberculosis that could assist in better understanding of the mechanism of action of this pathogen. In the present study, we have expressed and purified key proteins that play a major role in the metabolism of this pathogen. Plasmids of three different proteins from C. pseudotuberculosis were designed. Triose phosphate isomerase (TIM) is an active enzyme of glycolytic pathway, which is one of the main energy supplier enzymes for the organisms. This enzyme was expressed, purified and crystallized, the crystal structure was determined at 2.5 Å. Thioredoxin reductase (TrxR), and Thioredoxin (Trx) are the part of thioredoxin (redox) system, in which the thioredoxin act as a substrate for the TrxR. These enzymes have a diverse function in organisms. These enzymes were expressed, purified and characterized. Snake venom proteins were also investigated in this study; five different proteins from genus Bothrops were purified and crystallized. The crystal structure of Atroxlysin-I was determined at 1.8 Å resolutions and compared with different metalloproteinases-I, deposited to PDB / Doutor

Orientador : Lea Rodrigues Simioni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-18T19:26:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goularte_FatimaCristianeLopes_M.pdf: 4007858 bytes, checksum: b4080ac0aab1511f58f42ca1d7d05cce (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: O veneno de Micrurus nigrocinctus foi estudado in vitro sobre preparações neuromusculares isoladas de camundongo. À partir de tais experimentos e seus resultados, chegamos às seguintes conclusões: 1) o veneno de M. nigrocinctus induz importantes alterações miográficas, eletrofisiológicas e rnorfológicas sobre a preparação nervo frênico-diafragma de camundongo; 2) o bloqueio total da resposta contrátil do músculo diafragma mostra-se dose-dependente, e irreversível mediante a adição de droga anticolinesterásica e lavagens sucessivas da preparação; 3) A temperatura de incubação é um importante fator para o efeito bloqueador e miotóxico do veneno, sugerindo que uma PLA2 esteja envolvida nestes processos; 4) O soro anti- M. nigrocinctus é capaz de neutralizar in vitro a ação do veneno, tanto sobre a resposta muscular contrátil como sobre a miotoxicidade, mesmo quando for acrescentado após a adição do veneno; 5) As alterações ultraestruturais induzidas pelo veneno são acompanhadas por eleveção correspondente dos níveis de CK na solução do banho. Por outro lado, o aumento de CK é submaximal quando comparado com a liberação dessa enzima provocada pelo detergente Triton X-1OO; 6) A ocupação irreversível dos receptores pós-sinápticos pelo veneno parece ser a causa mais provável do bloqueio neuromuscular observado, pelo menos nas fases iniciais da intoxicação. Além disso, os resultados eletrofisiológicos e morfológicos também evidenciam uma ação pré-sináptica do veneno sobre a JNM, porém esta não seria a mais importante na gênese do bloqueio neuromuscular; 7) Embora tenha sido evidenciada urna ação do veneno sobre a JNM, como classicamente os venenos de serpentes corais são conhecidos, o presente estudo demonstrou que o veneno de M. nigrocinctus possui também um importante efeito miotóxico. Este efeito parece capaz de influenciar o desenvolvimento progressivo do bloqueio neuromuscular observado. / Abstract: In the isolated mouse diaphragrn, Micrurus nigrocinctus venom produces a dose-dependent blockade of the contractile response to electrical stimulation. This effect could not be reversed by repeated washing of the preparation or by the addition of an anticholinesterase. These observations suggest that, at least during the initial stages of poisoning, the mode of venom action involves binding of specific proteins to post-synaptic receptors. However, electrophysiological and morphological evidence suggests that the venom may also have a pre-synaptic action. Although the venom component responsible for this response has not yet been identified, the fact that the temperature at which the experiment was perforrned could greatly influence the neuromuscular blocking and myotoxic actions of the venom suggests that a neurotoxic PLA2 may be involved. Both the neuromuscular blocking action and the myotoxicity of the venom could be prevented by a specific M. Nigracinctus antivenam. This protective effect was maintained regardless af whether the antivenom was added before or after the venom. The muscle ultrastructural changes induced by the venom were accompanied by a corresponding increase in the release of creatine kinase into the incubation medium. This release was, however, submaximal when compared to that induced by the detergent Triton X-1OO. In conclusion, this work has demonstrated that, in addition to an action on the mammalian neuromuscular junction, M. Nigrocinctus venom also has. a pronounced myotoxic effect, which may well contribute to the progressive neuromuscular blockage seen with the venom. Both of the actions can effectively be prevented by a specific antivenom. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Benedito Barravieira / Coorientador: João Pessoa Araújo Júnior / Banca: Reinaldo José da Silva / Banca: Francisco Luis Franco / Resumo: / Abstract: / Mestre

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: Os acidentes ofídicos constituem um problema de saúde pública, afetando regiões de clima tropical e subtropical e áreas rurais e pobres de países da América Latina, África, Ásia e Oceania. No Brasil, o gênero Bothrops é responsável por cerca de 90% dos acidentes ofídicos notificados, cujo envenenamento é caracterizado por intensa mionecrose local ineficientemente neutralizada pela soroterapia. O veneno botrópico possui uma classe de proteínas miotóxicas estruturalmente semelhantes às fosfolipases A2 (PLA2), responsáveis por induzir lesões musculares por um mecanismo não-catalítico parcialmente explicado por diferentes hipóteses. Contudo, há evidências que os efeitos miotóxico e paralisante in vitro são decorrentes de sua atividade desestabilizadora de membranas e que atuam em sinergia com as PLA2 catalíticas no envenenamento. Neste estudo, foi desenvolvido um novo protocolo de purificação da miotoxina não-catalítica (PLA2 homólogas ou proteínas PLA2-like) botrópica BthTX-I, a qual foi avaliada em testes cristalográficos, calorimétricos, miográficos e morfológicos. Potenciais inibidores vegetais da classe dos cinamatos foram co-cristalizados com a BthTX-I e testados em inibir as lesões e paralisia musculares in vitro promovida pela toxina a fim de evoluir no conhecimento da relação estrutura/atividade das PLA2 homólogas miotóxicas. Dentre todos os compostos testados, os ácidos chicórico e caftárico apresentaram-se como excelentes inibidores da BthTX-I. Contudo, foi possível ap... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Snakebites are a public health problem, concerning tropical and subtropical regions, rural and poor areas of Latin America, Africa, Asia and Oceania countries. In Brazil, Bothrops genus accounts for about 90% of reported snakebites, whose envenomation is characterized by intense local myonecrosis inefficiently neutralized by antivenom. A class of myotoxic proteins found in Bothrops venoms which is structurally similar to phospholipases A2 (PLA2), is responsible for inducing muscle injuries by a non-catalytic mechanism, partially explained by different hypotheses. However, there are evidences that myotoxic and in vitro paralyzing effects are due to their destabilizing-membrane activity and they act in synergy with the catalytic PLA2 myotoxins in envenomation. In this study, it was developed a new protocol for purification of a non-catalytic botropic myotoxin (PLA2 homologues or PLA2-like proteins) BthTX-I, which was evaluated by crystallographic, calorimetric, myographic and morphologic assays. Potential plant inhibitors of cinnamates class were co-crystallized with BthTX-I and tested to inhibit in vitro paralysis and muscle injuries promoted by the toxin. Among all the compounds tested, the chicoric and caftaric acids presented excellent BthTX-I inhibition characteristiscs. However, only chicoric acid (CA) we were able to perform crystallographic experiments, which presented different structural characteristics compared to other ligands and bothropic toxins. According to the ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Rui Seabra Ferreira Junior / Coorientador: João Ferreira de Lima Neto / Banca: Fernanda da Cruz Landim Alvarenga / Banca: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Resumo: O estudo avaliou a viabilidade in vitro do biomaterial "Selante de Fibrina derivado de veneno de serpente" (SF), como arcabouço para células tronco mesenquimais (CTMs) de ratos. O SF é um material caracterizado como adesivo biológico, e foi produzido e fornecido pelo Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos, CEVAP, Brasil. As CTMs foram coletadas a partir da medula óssea de fêmures e tíbias de ratos e foram caracterizadas por meio de citometria de fluxo com auxilio de marcadores positivos: CD 44 e CD 90 (CTMs) e marcador negativo: CD 34 (células tronco hematopoiéticas). Cultivos foram induzidos para diferenciarem-se em linhagens específicas (osteogênico, condrogênico e adipogênico). Para avaliação do crescimento in vitro e a viabilidade celular em conjunto ao biomaterial foram utilizadas microscopia óptica de luz invertida, microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de varredura e transmissão. O SF em contato com as CTMs não induziu a diferenciação espontânea para as linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica. As diferentes técnicas de avaliação microscópica utilizadas mostraram que o SF foi capaz de realizar a captura e manutenção das CTMs e houve interação das células com o interior e superfície do biomaterial. Portanto, a coleta, o cultivo e a caracterização das CTMs de ratos foram possíveis. O SF mostrou-se eficiente como arcabouço biológico e interagiu com as células tronco mesenquimais mantendo-as viáveis, oferecendo-se como uma ferramenta de uso clínico-cirúrgico alternativa para processos regenerativos visando terapias mais eficientes / Abstract: This study evaluated the in vitro viability of biomaterial Fibrin Sealant (FS) derived from snake venom as a scaffold for rat mesenchymal stem cells (MSCs). The FS is characterized as a biological adhesive material, and is produced and was supplied by the Center for the Study of Venoms and Venomous Animals, CEVAP, Brazil. MSCs were collected from the bone marrow of femurs and tibias of rat and were characterized using flow cytometry with CD 44 and CD 90 positive markers (MSC) and CD34 negative marker (mononuclear stem cells). Cultivations were induced to differentiate into specific cell lineage (osteogenic, chondrogenic and adipogenic). To evaluate the in vitro growth and cell viability with the biomaterial were used inverted light optical microscopy, fluorescence microscopy and scanning electron microscopy and transmission. The SF did not cause the spontaneous differentiation in contact with MSCs to osteogenic, chondrogenic and adipogenic lineage. Different microscopy techniques showed that the SF was able to accomplish the capture and maintenance of MSCs and there was interaction with the cell interior and surface of the biomaterial. Finally, the collection, cultivation and characterization of rat MSCs were possible. The SF was effective as a biological scaffold and interacted with the MSCs keeping them viable offering itself as a tool for clinical and surgical alternative providing clinical and surgical therapies more efficient for regenerative processes / Mestre

In this work a new metalloproteinase (BthMP) was purified from the snake venom of Bothrops moojeni. This enzyme was homogeneous by native and SDSPAGE it showed polypeptide chain of 23,5 kDa, pI = 7,1 and N-terminal blocked. BthMP is comprised of high proteolytic activity on casein, fibrin and bovine fibrinogen, but no coagulating, esterase, phospholipase A2 activities, and lightly hemorrhagic; it was inhibited by EDTA, EGTA and 1,10-phenanthroline and maintained its activity on pH of 7,0 at 9,0 and temperature of 5 to 40°C. Assays with metal ions showed that Ca++ is an activator, whereas Zn++ and Hg++ inhibited about 50 and 80%, respectively. The edema evidenced the important role of the toxin in the inflamatory activity of the venom. BthMP also caused uncloting, and provoked histological alterations in gastrocnemius muscle of mice inducing hemorrhage, necrosis and leucocytic infiltrate. The molecular mass and the inhibition assays suggest that the metalloproteinase BthMP belongs to class P-I SVMPs. / Neste trabalho uma nova metaloproteinase (BthMP) foi purificada do veneno da serpente Bothrops moojeni. A protease é homogênea em PAGE-SDS e nativa, apresentou uma única cadeia polipeptídica de 23,5 kDa, pI = 7,1 e Nterminal bloqueado. BthMP é provida de alta atividade proteolítica sobre a caseína, fibrina e fibrinogênio bovino; foi inibida por EDTA, EGTA e 1,10- fenantrolina e manteve sua atividade em pH de 7,0 a 9,0 e temperatura de 5 a 40°C. Ensaios com íons metálicos mostraram que Ca++ é ativador, enquanto Zn++ e Hg++ inibiram cerca de 50 e 80%, respectivamente. BthMP é desprovida de atividades coagulante, esterásica, fosfolipásica e fracamente hemorrágica quando comparada ao veneno bruto. O edema induzido pela metaloprotease evidenciou o importante papel da toxina na atividade inflamatória do veneno. BthMP também causou incoagulabilidade sanguínea, e provocou alterações histológicas em músculo gastrocnêmio de camundongos induzindo hemorragia, necrose e infiltrado leucocitário. A massa molecular e os ensaios de inibição com EDTA e 1,10-fenantrolina sugerem que a metaloproteinase BthMP pertence à classe P-I das SVMPs. / Mestre em Genética e Bioquímica

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: As fosfolipases A2 (PLA2s) são um dos maiores constituintes protéicos do veneno botrópico e um dos responsáveis pela necrose muscular, consequência esta não eficazmente neutralizada pela administração do soro antiofídico. Estas proteínas são tóxicas através do rompimento ou perturbação da membrana celular em um mecanismo catalítico dependente de cálcio e outro independente, sendo este último não totalmente elucidado. Usualmente, estas toxinas são obtidas diretamente do veneno das serpentes, sendo sua purificação um desafio pela co-existência de diferentes isoformas. O objetivo desta tese foi compreender o mecanismo miotóxico independente de cálcio através de estudos estruturais e propor nova metodologia que trate de dados cristalográficos de toxinas provenientes de amostras impuras, chamada SEQUENCE SLIDER. Para tanto, cristalografia e outras técnicas biofísicas, como espalhamento de raios X a baixo ângulo, serão utilizados para estudar três miotoxinas ofídicas em estado nativo e complexado com produtos naturais e inibidores. Nós propusemos medidas locais e globais para caracterizar e relacionar a estrutura dessas toxinas a função. Com o SEQUENCE SLIDER, pudemos elucidar as estruturas de toxinas inéditas cuja sequência era parcialmente conhecida. Esta nova metodologia proposta consiste em avaliar diferentes cadeias laterais contra o coeficiente de correlação em espaço real calculado a partir dos dados cristalográficos. Em paralelo, desenvolvemos o SEQUENCE SLIDER no âmbito do... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor