Orientador: Marcos Roberto de mattos Fontes / Resumo: Serpentes do gênero Bothrops representam cerca de 90% dos acidentes ofídicos que ocorrem no Brasil. Um componentes presente em venenos de serpentes são as fosfolipases A2 (PLA2s), que podem apresentar diversas atividades biológicas. Diversos estudos com PLA2s e PLA2s-homólogas de venenos de serpentes buscam melhor compreender o mecanismo da ação miotóxica, sugerindo diferentes sítios de ação. Neste trabalho, são apresentados estudos com PLA2s-homólogas do veneno de Bothrops moojeni, conhecida popularmente como caiçaca. A miotoxina II (MjTX-II) foi estudada na forma nativa, complexada com ácidos graxos e os inibidores ácido rosmarínico e suramina, enquanto a miotoxina I (MjTX-I) foi estudada em complexo com o ligante suramina. Para a obtenção dos dados, foram utilizadas diferentes técnicas biofísicas como espalhamento dinâmico de luz, calorimetria por titulação isotérmica e cristalografia de raios X. Estes estudos foram complementados com estudos funcionais por técnicas miográficas e estudos computacionais por dinâmica molecular realizados por outros membros do Laboratório de Biologia Molecular Estrutural. As estruturas cristalográficas da MjTX-II nativa e complexada com ácidos graxos revelaram particularidades para esta toxina, como a independência da ligação de ácidos graxos na estrutura para a sua ativação - alinhamento dos resíduos importantes para a atividade miotóxica. A estrutura da MjTX-II com o ácido rosmarínico revelou que o ligante interage com uma das regiões rela... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bothrops genus represents approximately 90% of the ophidian accidents that occur in Brazil. One of the compounds of the venom is the phospholipases A2 (PLA2s), which are proteins with a wide range of biological activities. Several studies with PLA2s and PLA2-homologues from snake venom were performed to better understanding the myotoxic mechanism, suggesting different activity sites. This work presents studies with PLA2s-homologues isolated from Bothrops moojeni, known in Brazil as caiçaca. The myotoxin II (MjTX-II) was studied in native, complexes to fatty acids, rosmarinic acid and suramin inhibitors. Myotoxin I (MjTX-I) was studied complexed to suramin. X-ray crystallography, dynamic light scattering and isothermal titration calorimetry were used to characterize the protein and complexes. Furthermore, functional studies by myographic techniques and computational studies using molecular dynamics were performed by other members of the Laboratory. Crystallographic structures of MjTX-II in native form and complexes to fatty acids reveals particularities for these toxin, such as the independence of the fatty acids binding for myotoxic residues alignment. The structure of MjTX-II complexed to rosmarinic acid showed that this ligand interact to a of regions related to myotoxic activity of toxin, which probably explaining its inbitory action demonstrated by myographic techniques and is according to previous proposed mechanism. Crystallographic data of the MjTX-II/suramin complex s... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Marcos Roberto de mattos Fontes / Resumo: Ainda nos dias de hoje, o envenenamento ofídico é um problema de saúde pública, afetando, sobretudo, regiões de clima tropical, subtropical, particularmente áreas rurais de países da África, Ásia, Oceania e América Latina. No Brasil, os gêneros de serpentes Bothrops e Crotalus são responsáveis por quase 95% dos acidentes ofídicos, enquanto o segundo gênero apresenta alta taxa de morbidade. O veneno das serpentes do gênero Bothrops contem fosfolipases A2 ácidas que causam uma considerada mionecrose e severas reações anticoagulantes. De outro lado, os venenos das serpentes do gênero Crotalus possuem o complexo crotoxina, o qual é formado pela crotoxina A (não catalítica) e a crotoxina B (PLA2 catalítica) que possui potente ação neurotóxica. As serpentes peçonhentas, grupo que inclui ambas as famílias citadas, utilizam esse veneno tanto para a captura de sua presa como para sua própria defesa. Inevitavelmente, essas serpentes terão contato com o seu próprio veneno, como por exemplo, na alimentação, pois as presas estarão envenenadas. Por tal fato, as serpentes peçonhentas apresentam alguns mecanismos de defesa, inclusive algumas proteínas encontradas em seu sangue que são chamadas de proteínas inibitórias de PLA2 (PLIs). Para entender melhor o mecanismo de inibição desses compostos plasmáticos, foi desenvolvido neste trabalho um novo protocolo de docking molecular que consiste em analisar as estruturas ao longo dos modos normais, docking molecular, simulação de dinâmica molecula... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nowadays, snake envenomation is a public health issue that mostly affects tropical and subtropical regions, particularly rural areas of countries from Africa, Asia, Oceania and Latin America. In Brazil, the Bothrops and Crotalus snake genre are responsible for approximately 95% of all snake bites, and the accidents caused by the latter have a relatively high mortality rate. The venom of Bothrops snakes contains a acid phospholipases A2 that causes drastic local myonecrosis and several anticoagulant reactions. On the other hand, the Crotalus genus snake venom contains the the crotoxin complex, which is formed by crotoxin A (non-catalytic) and crotoxin B (catalytic PLA2), that have up a strong neurotoxic action. Venomous snakes, including the two afore mentioned genre, use their venoms for capturing their prey and for their own defense. These snakes will inevitably get in contact with their own venom, for example, in alimentation, for the prey itself will be poisoned. For this fact, the poison snakes features in your blood the so-called PLA2 inhibiting proteins (PLIs). In order to understand the inhibition mechanism of these plasmatic components, it has developed in this study a new molecular docking protocol that consists in analyzing the structures using normal modes, molecular docking, molecular dynamics simulation and other bioinformatics tools. The results of this work was the proposition of a new flexible molecular docking protocol between two or more proteins and your... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CHAPTER I - The aqueous extract prepared from Schizolobium parahyba (Sp) leaves, a native plant from Mata Atlantica forest (Brazil), was tested to analyze its ability to inhibit some biological and enzymatic activities induced by Bothrops alternatus and Bothrops moojeni snake venoms. Sp chromatography in Sephadex LH 20 resulted in 3 fractions: F1 (methanolic fraction); F2 (methanol:water fraction, 1:1 v/v); and F3 (aqueous fraction). These fractions were analyzed in terms of its capacity of inhibit the venoms fibrinogenolytic activity. Sp inhibited 100% of lethality, blood incoagulability, hemorrhagic and indirect hemolytic activities for a 1:10 ratio (venom/extract, w/w), and coagulant activity in a 1:5 ratio (venom/extract, w/w) induced by venoms. Venoms fibrinogenolytic activity were also neutralized by Sp in a 1:10 ratio, resulting in total protection of Bβ chain and partial protection for the fibrinogen Aα chain. However, larger ratios of extract/proteins have caused a complete vanishing of all fibrinogen chains possibly caused by Sp precipitation. Interaction tests have demonstrated that for certain extract/proteins ratios Sp precipitates proteins non-specifically suggesting the presence of tannins, which are very likely responsible for the excellent inhibiting effects of the analyzed ophidian activities. Therefore, the fractioning of Sp was carried out aiming at separating these compounds that mask the obtained results. F1 inhibited 100% the venom fibrinogenolytic activity without presenting protein precipitation effect; F2 demonstrated only partial inhibition of these venoms activities. Finally, F3 did not inhibit fibrinogen proteolysis, but presented strong protein precipitating action. We conclude that Sp, together with tannins, also contains other compounds which can present specific toxin inhibition action of snake venoms. CHAPTER II - Do extrato aquoso liofilizado das folhas de Schizolobium parahyba foram isolados quatro compostos ativos, isoquercitrina, miricetina-3-O-glicosídeo, catequina e galocatequina, por cromatografia em Sephadex LH 20 seguido de HPLC semipreparativo em coluna C-18 e identificados por RMN do 1H e 13C. Essa é a primeira vez que estas substâncias são relatadas nesta espécie assim como suas atividades antiofídicas. Após isolamento foram todas testadas frente a atividade hemorrágica e fibrinogenolítica da peçonha de Bothrops alternatus (Bal). Na proporção 1:30 (Peçonha/fração, m/m) a isoquercitrina inibiu parcialmente a atividade hemorrágica; a miricetina-3-O-glicosideo e a catequina não foram capazes de inibir a hemorragia induzida pela Bal e a galocatequina, por sua vez, apresentou uma eficiente neutralização desta atividade da peçonha. Na proporção de 1:100 (Peçonha/fração, m/m) ficou evidenciado o efeito de inibição total da ação fibrinogenolítica da peçonha pela miricetina-3-O-glicosideo; a isoquercitrina não protegeu a proteólise da cadeia Aα do fibrinogênio e inibiu parcialmente a degradação da cadeia Bβ enquanto a catequina e a galocatequina inibiram parcialmente a degradação da cadeia Aα e totalmente a da cadeia Bβ. Dessa forma concluímos que a galocatequina e a miricetina-3-O-glicosideo são excelentes inibidores de toxinas hemorrágicas e fibrinogenolíticas respectivamente. Estudos vindouros como o de modelagem molecular e cristalização de raio-X usando toxinas isoladas e estas substâncias poderão ser de grande importância para o desenho de novas drogas auxiliares do tratamento com soro antiofídico ou para melhor elucidação da relação estruturafunção das toxinas destes venenos. / CAPÍTULO I - O extrato aquoso preparado das folhas de Schizolobium parahyba (Sp), uma planta nativa da Mata Atlântica (Brasil), foi testado para avaliar sua habilidade de inibir algumas atividades biológicas e enzimáticas induzidas pelas peçonhas brutas de Bothrops alternatus e Bothrops moojeni. Cromatografia de Sp em coluna de Sephadex LH 20 resultou em 3 frações: F1 (fração metanólica); F2 (fração metanol : água, 1:1 v/v) e F3 (fração aquosa). Estas frações foram analisadas quanto a capacidade de inibir a atividade Fibrinogenolítica das peçonhas. Sp inibiu em 100% a letalidade, a incoagulabilidade sanguínea, a atividade hemorrágica e hemolítica indireta na proporção de 1:10 (peçonha/extrato, m/m) e atividade coagulante na proporção de 1:5 (peçonha/extrato, m/m) induzidas pelas peçonhas. A atividade fibrinogenolítica das peçonhas também foi neutralizada por Sp na proporção de 1:10, resultando em proteção total da cadeia Bβ e parcial da Aα do fibrinogênio. No entanto, proporções maiores de peçonha/extrato mostraram desaparecimento de todas as cadeias do fibrinogênio numa possível precipitação causada por Sp. Os testes de interação extrato/proteínas demonstraram que em determinadas proporções de extrato/proteínas Sp precipita proteínas inespecificamente, sugerindo a presença de taninos, os quais muito provavelmente são os responsáveis pelo excelente efeito inibidor das atividades ofídicas analisadas. Assim, com o intuito de separar estes componentes que mascaram os resultados obtidos, foi realizado o fracionamento de Sp. F1 inibiu em 100% a atividade fibrinogenolítica das peçonhas e não apresentou efeito de precipitação de proteínas; F2 demonstrou inibição parcial desta atividade das peçonhas e F3 não inibiu a proteólise do fibrinogênio, mas apresentou forte ação precipitante de proteínas. Concluímos, assim que Sp, além de taninos, também contém outros compostos e que estes podem apresentar ação específica de inibição de toxinas de peçonhas de serpentes. CAPÍTULO II - Do extrato aquoso liofilizado das folhas de Schizolobium parahyba foram isolados quatro compostos ativos, isoquercitrina, miricetina-3-O-glicosídeo, catequina e galocatequina, por cromatografia em Sephadex LH 20 seguido de HPLC semipreparativo em coluna C-18 e identificados por RMN do 1H e 13C. Essa é a primeira vez que estas substâncias são relatadas nesta espécie assim como suas atividades antiofídicas. Após isolamento foram todas testadas frente a atividade hemorrágica e fibrinogenolítica da peçonha de Bothrops alternatus (Bal). Na proporção 1:30 (Peçonha/fração, m/m) a isoquercitrina inibiu parcialmente a atividade hemorrágica; a miricetina-3-O-glicosideo e a catequina não foram capazes de inibir a hemorragia induzida pela Bal e a galocatequina, por sua vez, apresentou uma eficiente neutralização desta atividade da peçonha. Na proporção de 1:100 (Peçonha/fração, m/m) ficou evidenciado o efeito de inibição total da ação fibrinogenolítica da peçonha pela miricetina-3-O-glicosideo; a isoquercitrina não protegeu a proteólise da cadeia Aα do fibrinogênio e inibiu parcialmente a degradação da cadeia Bβ enquanto a catequina e a galocatequina inibiram parcialmente a degradação da cadeia Aα e totalmente a da cadeia Bβ. Dessa forma concluímos que a galocatequina e a miricetina-3-O-glicosideo são excelentes inibidores de toxinas hemorrágicas e fibrinogenolíticas respectivamente. Estudos vindouros como o de modelagem molecular e cristalização de raio-X usando toxinas isoladas e estas substâncias poderão ser de grande importância para o desenho de novas drogas auxiliares do tratamento com soro antiofídico ou para melhor elucidação da relação estruturafunção das toxinas destes venenos. / Mestre em Genética e Bioquímica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CHAPTER II: Bothrops snake venoms contain proteins that contribute to the local and systemic effects seen after envenoming, such as edema, myonecrosis, coagulation disorders and hemorrhage. These effects can be triggered by the toxic action of metalloproteinases present in the bothropic venom. This study aimed to perform the purification, biochemical and functional characterization of a metalloproteinase called Moozincin, from Bothrops moojeni snake venom. Moozincin has approximate molecular mass of 28 kDa, displays relevant fibrinogenolytic activity and can be classified as a non-hemorrhagic fibrinogenolytic metalloprotease, in the class P-I. Moozincin was also able to induce edema, myonecrosis and hyperalgesia in experimental animals. Morphological analysis of the evolution of muscle injury revealed the occurrence of degenerative events and leukocyte infiltration already at three hours after application of Moozincin. These effects dominate until 48 hours after administration of the metalloprotease, when hemorrhagic effect was also demonstrated later in skeletal muscle, probably triggered by the action characteristic of metalloproteinases on vascular components and / or indirect action resulting from muscle injury. / CAPÍTULO II: As peçonhas de serpentes do gênero Bothrops contêm toxinas que contribuem com efeitos locais e sistêmicos vistos no envenenamento, como edema, mionecrose, distúrbios de coagulação e hemorragia. Grande parte desses efeitos pode ser desencadeada pela ação tóxica de metaloproteases presentes na peçonha botrópica. Este trabalho teve o objetivo de realizar a purificação e caracterização bioquímica e funcional de uma metaloprotease, denominada Moozincina, presente na peçonha da serpente Bothrops moojeni. A Moozincina tem massa molecular aproximada de 28 kDa e apresenta atividade fibrinogenolítica relevante, podendo ser classificada como uma metaloprotease fibrinogenolítica não-hemorrágica, pertencente à classe P-I. A Moozincina também foi capaz de induzir edema, hiperalgesia e mionecrose em animais experimentais. A análise morfológica da evolução da lesão muscular evidenciou a ocorrência de eventos degenerativos e infiltrado leucocitário já na terceira hora após a aplicação da toxina (Moozincina). Esses efeitos predominam até 48 horas após a administração da metaloprotease, quando também foi evidenciado efeito hemorrágico tardio no músculo esquelético, provavelmente desencadeado pela ação característica de metaloproteases sobre componentes vasculares e/ou por ação indireta decorrente da lesão muscular. CAPÍTULO III: Moozincina é uma metaloprotease recentemente isolada da peçonha da serpente Bothrops moojeni. No presente trabalho foi realizada a caracterização farmacológica de efeitos inflamatórios induzidos pela Moozincina. A aplicação intraplantar da Moozincina (5, 25 and 50 μg/pata) induziu edema e hiperalgesia na pata de ratos. Os efeitos edematogênico e hiperalgésico máximos foram observados 3 e 4 horas após a injeção da toxina, respectivamente. Alguns fármacos como dexametasona (2,5 mg/kg) e indometacina (8,0 mg/kg) reduziram significantemente o edema e a hiperalgesia, já a prometazina (15 mg/kg) e o ácido nordiidroguaiarético (100 mg/kg) reduziram apenas o efeito edematogênico, enquanto HOE-140 (10 μg/pata) e NG-monometil-I-arginina (100 μg/pata) reduziu apenas a hiperalgesia. Esses resultados demonstram a participação de metabólitos de ácido araquidônico em ambos os efeitos inflamatórios induzidos pela Moozincina. Além disso, a ativação de receptores H1 de histamina está especificamente relacionada ao edema e a ação de bradicinina e de óxido nítrico à hiperalgesia. / Mestre em Genética e Bioquímica