Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Letras, Departamento de Linguística, Português e Línguas Clássicas, Programa de Pós-Graduação em Linguística, 2014. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2014-11-10T20:01:37Z No. of bitstreams: 1 2014_JaneAdrianaRamosOttoniDeCastro.pdf: 1610923 bytes, checksum: 480c1a2d14f7a4f206b21775037636da (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-11-11T17:03:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_JaneAdrianaRamosOttoniDeCastro.pdf: 1610923 bytes, checksum: 480c1a2d14f7a4f206b21775037636da (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-11T17:03:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_JaneAdrianaRamosOttoniDeCastro.pdf: 1610923 bytes, checksum: 480c1a2d14f7a4f206b21775037636da (MD5) / O foco do presente trabalho é o estudo descritivo e explicativo de um determinado tipo de complementação oracional no latim, presente desde o período arcaico e produtivo até depois do período clássico, a estrutura Accusativus cum Infinitivo (AcI). Segundo Serbat (1986, p.174), o uso da construção AcI declina lentamente até o meio do primeiro milênio. A estrutura AcI é uma oração completiva, que ocorre sem conjunção ou preposição, sendo seu sujeito flexionado no Caso acusativo, e o verbo no infinitivo, o qual manifesta flexão de tempo/ aspecto/ voz. É enquadrada nas possibilidades de complementação de predicados do tipo epistêmicos (verba sciendi), de predicados declarativos (verba declarandi) e de predicados jussivos (verba jubendi), além de estruturas ditas impessoais. Seguindo vários estudos, atribuímos a ampla distribuição de AcI à presença da flexão de tempo/ aspecto/ voz no infinitivo. O estudo tem como principal questão de pesquisa identificar os fatores que determinam a flexão em Acusativo do sujeito do infinitivo. Partimos da hipótese de que o caso Acusativo é um caso default, cuja manifestação é associada ao traço [+atual] em T ou [+durativo] em Asp, conforme demonstram os “usos particulares” dessa categoria. Tal propriedade morfossintática permite que AcI manifeste o traço [+definido] em T, uma propriedade crucial dessa estrutura. Adotando o quadro teórico gerativista, propomos que AcI pode ser realizada tanto como um CP, quanto como um TP, em determinados contextos sintáticos. Isso permite explicar as estruturas em que o sujeito acusativo é licenciado internamente à oração complemento e as estruturas em que é licenciado por uma categoria funcional no domínio da matriz. Investigamos ainda os fatores que determinam a perda da oração AcI nas línguas românicas, rejeitando a hipótese corrente que a relaciona à perda da flexão do infinitivo (para tempo/ aspecto/ voz), uma vez que é possível demonstrar que formais verbais inovadoras passam a codificar tais informações. Diante disso, sugere-se que o desaparecimento de AcI se deve à reanálise do sistema pronominal, que leva ao surgimento da formas pronominais de 3a pessoa, bem como ao alinhamento de todos os pronomes como clíticos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The goal of the present study is to examine a certain type of complement clause in Latin, which is productively used back to the archaic period (3rd century B.C.), up to the post-classical period, namely the Accusativus cum Infinitivo (AcI) construction. According to Serbat (1986, p.174), the occurrence of AcI decreases slowly until the first half of the first millennium. The AcI structure is a completive clause that is found without an introductory complementizer or preposition, its subject being inflected for the accusative case, while the infinitival verb manifests tense/ aspectual/ voice inflection. The AcI is one of the possible complements of epistemic predicates (sciendi), declarative predicates (declarandi) and jussive predicates (jubendi), as well as impersonal structures. Following previous studies, we account for the pervasive distribution of AcI alluding to the presence of tense/ aspect/ voice inflection on the infinitive. The main research question is thus to determine the formal conditions licensing the accusative inflection on the subject of the infinitive. We assume that the accusative is a default case, we argue that its manifestation is associated with the feature [+actual] on T or [+durative] on Asp, as can be inferred from the particular uses of the accusative. The former property interacts with the fact that AcI manifests the feature [+definite] on T, which is crucially found when it is a complement of dicendi verbs. Adopting the framework of the generative theory, we propose that the AcI construction may be realized either as a CP, or as a TP, depending on whether the accusative subject is licensed either internally to the completive clause or by a functional head of the matrix clause. We further investigate the conditions determining the loss of the AcI clause in the Romance languages, rejecting the current hypothesis that relates it to the loss of (tense/ aspect/ voice) inflection on the infinitive, as it is possible to show that the innovative verbal forms also encode tense and aspect properties. Given this, we suggest that the loss of AcI is due to the reanalysis of the pronominal system, by which 3rd person forms arise, forming with 1st and 2nd person forms a paradigm of pronominal clitics.

Introdução: Evidências sugerem o envolvimento do Sistema Complemento (SC) na patogenia da esquizofrenia (SZ) e do Transtorno de Humor Bipolar (THB). O SC é um sistema efetor importante na imunidade inata, sendo o Complemento 3 (C3) uma proteína central nas três vias distintas que podem levar a sua ativação. Objetivos: Comparar níveis de C3 e C4 entre pacientes com SZ crônicos estabilizados, pacientes com THB eutímicos e controles saudáveis pareados por sexo e idade. Metodologia: Recrutamos 53 pacientes com SZ, 20 pacientes com THB eutímicos e 80 voluntários saudáveis. Os pacientes preencheram critérios do DSM-IV para diagnóstico, e as condições psiquiátricas foram determinadas pelas escalas BPRS e CGI para SZ, e YMRS e HAMD para THB. Foram coletados 5 ml de sangue sem anticoagulante de cada participante, e os níveis de C3 e C4 foram quantificados no soro pelo método de nefelometria. As análises descritivas foram apresentadas como média ± DP ou mediana e valores de p <0,05 foram considerados significativos. As relações entre as variáveis foram avaliadas através da correlação de Spearman. Resultados: C3 foi significativamente maior em pacientes com SZ quando comparada com controles (p<0.011) ou eutímicos (p<0.011). Níveis de C3 não foram diferentes nos controles em comparação com pacientes com THB eutímicos (p=0.998). Não houve diferença significativa nos níveis séricos de C4 entre os três grupos (p=0.164). Nenhuma correlação foi encontrada em pacientes com SZ entre dose de antipsicóticos e C3 (p=0.613) ou C4 (p=0.668). Conclusões: Nossos resultados sugerem a ativação do sistema complemento na SZ, indicado pelo aumento dos níveis de C3. Tal ativação provavelmente está ocorrendo pela via alternativa, uma vez que não houve aumento significativo nos níveis de C4.

Uma criança brasileira (LAS) vítima de infecções recidivantes e vasculite, cujos pais são consangüíneos em segundo grau apresentou 0,15 µg/mL de C3 plasmático e atividades hemolíticas nulas pelas vias clássica e alternativa, já outras proteínas do complemento e Igs estavam normais (exceto IgG4, que foi indetectável). Diferentemente de sua mãe os fibroblastos da criança não foram capazes de sintetizar as cadeias a e b de C3, como observado por SDS-PAGE. O probando possui dois alelos C3S, assim como seu irmão mais novo e saudável, enquanto a mãe é FS. A migração de leucócitos, em resposta ao soro do probando ativado com LPS foi menor que a obtida com soro normal e estatisticamente semelhante àquela gerada por SHN inativado a 56oC (SHNi). A ingestão e a morte de C. albicans, opsonizadas por soro do probando, por fagócitos normais foram semelhantes às dos fungos opsonizados por SHNi. Nós concluimos que, em conseqüência da incapacidade de sintetizar C3, o probando não é capaz de exercer as funções imunológicas dependentes do complemento, resultando em uma maior susceptibilidade a infecções. / A brasilian child (LAS) victim of recurrent infections whose parents have second degree consanguinity presented 0.15 µg/mL of serum C3 and no hemolytic activities either after activation of the classical or alternative pathways. His mother presented C3 alpha and beta chains of normal sizes, while LAS's fibroblasts did not secrete any C3 as observed by SDS-PAGE. The proband possesses two C3S alleles, like his younger and healthy brother whereas his mother is FS. Leukocyte migration across nitrocellulose membrane in response to the proband's LPS-activated serum was less intense than that obtained in response to normal serum. Phagocytosis and killing of C. albicans opsonized with the proband's serum was comparable to fungi opsonized with inactivated serum, incdicating that chemotactic and opsonic activities of the proband's serum are greatly diminished. We colclude that as a consequence of C3 deficiency the proband's complement system is uncapable of performing it's normal effector functions resulting in greater susceptibility to infections.

Orientadores: Renata de Oliveira Mattos Graner, Flávia Sammartino Mariano Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-26T11:30:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_ThaisRossinide_M.pdf: 1438459 bytes, checksum: a127a667898930e41649ac3faebb8d1a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Streptococcus sanguinis é uma espécie pioneira comensal das superfícies dos dentes, que também está envolvida na endocardite infecciosa. Sua alta prevalência na cavidade oral indica capacidade de adaptar-se e sobreviver a diversos fatores de defesa presentes nesse nicho. Para se adaptar ao ambiente e a fatores do hospedeiro, as bactérias utilizam-se de sistemas reguladores de transcrição de dois componentes (SDC), que modulam a regulação de genes em respostas a diferentes estímulos. Neste estudo avaliou-se o papel do SDC VicRK e CovR, na susceptibilidade de S. sanguinis a opsonização pelo sistema complemento. Para isso, foram analisados os níveis de deposição de C3b / iC3b na presença de soro em um total de sete cepas clínicas de S. sanguinis, e as frequências de fagocitose por polimorfonucleares (PMNs) do sangue humano foram comparados entre as cepas S. sanguinis SK36 e mutantes knockout de vicK (SKvic) e covR (SKcov), genes estes que codificam componentes VicK e CovR, respectivamente. A cepa de S. mutans U159 foi utilizada como referência. Resumidamente, as cepas foram incubadas com soro humano a 2 ou 20% por 30 min (37 ° C, 10% de CO2), lavadas, e a presença de C3b associada à superfície foi detectado utilizando anticorpos anti-C3b humano (conjugado com FITC), sendo quantificadas por citometria de fluxo. Para avaliar as frequências de fagocitose por PMNs, as cepas foram incubadas com sangue humano durante tempos de 5, 15, 30 e 60 min (37 ° C, 10% de CO2), fixadas e coradas com Giemsa. PMNs com bactérias intracelulares, foram contados utilizando um microscópio de luz (1000 x) e os resultados expressos em relação a análise de um total de 200 PMNs. Resultados: As percentagens de deposição de C3b em SKvic, SKcov e SK36 foram de 11,3 (± 2,61), 40,2 (± 1,46) e 37,9% (± 3,97), respectivamente. Percentagem de superfície C3b foi significativamente menor em cepas de S. sanguinis em comparação a cepa de S.mutans (Kruskal Wallis, p <0,05), e em SKvic em comparação a cepa SK36 (Kruskal Wallis, p <0,05). As frequências médias de fagocitose por PMNs não foram afetadas, e foram 88, 99,3 e 99% em SKvic, SKcov e SK36, respectivamente. Conclusão: a inativação do VicK, mas não de CovR, reduz a deposição de C3b em S. sanguinis SK36. Cepas de S. sanguinis também são menos suscetíveis a deposição de C3b em comparação a S. mutans / Abstract: Streptococcus sanguinis is a commensal pioneer species of the tooth surfaces, which is also involved in infectious endocarditis. Its high prevalence in the oral cavity indicates ability to survive to several host defense factors present in the oral niches. To sense and respond to environmental and host factors, bacteria apply regulatory two-component systems (TCSs), which modulate gene transcription in response to different stimuli. This study evaluated the role of TCS VicRK and CovR in S. sanguinis susceptibility to opsonization by the complement system. To this aim, a total of seven S. sanguinis strains were analyzed, and levels of deposition of C3b/iC3b on the present of serum, and the frequencies of phagocytosis by polymorphonuclear (PMNs) in human blood were compared between parent S. sanguinis strain SK36 and knockout mutants of vicK (SKvic) and covR (SKcov) (genes encoding VicK and CovR components, respectively). S. mutans strain U159 was used as reference. Briefly, strains were incubated with 2 or 20% of human serum during 30 min (37°C, 10%CO2), washed, and the presence of surface-associated C3b was detected using anti-human C3b antibodies (FITC conjugated), which were quantified by flow cytometry. To assess the frequencies of phagocytosis by PMN, strains were incubated with human blood during 5, 15, 30 and 60 min (37°C, 10% CO2), fixed and stained with Giemsa. PMN with intracellular bacteria were counted using a light microscope (1000 x) and expressed in relation to a total of 200 PMN analyzed. Results: The percentages of C3b deposition on SKvic, SKcov and SK36 were 11.3 (± 2.61), 40.2 (± 1.46) and 37.9% (± 3.97), respectively. Percentage of surface C3b was significantly lower in S. sanguinis strains compared to S. mutans (Kruskal Wallis, p < 0.05), and in SKvic compared to SK36 (Kruskal Wallis, p < 0.05). The mean frequencies of phagocytosis by PMN was not affected, and were 88, 99.3 and 99% in SKvic, SKcov and SK36, respectively. Conclusion: the inactivation of the vicK, but not of covR, reduces the deposition of C3b in S. sanguinis SK36. S. sanguinis strains are also less susceptible to C3b deposition compared to S. mutans / Mestrado / Microbiologia e Imunologia / Mestra em Biologia Buco-Dental

A Leptospira é o agente etiológico da leptospirose, uma das mais importantes zoonoses, considerada um grande problema de saúde pública mundial. São observados aproximadamente um milhão de casos mundialmente a cada ano, principalmente em países em desenvolvimento com clima ameno ou tropical, sendo 5% a 10% fatais. As leptospiras são bactérias espiroquetas de vida extracelular, com capacidade de multiplicar-se e disseminar-se em vários tecidos. A presença desse microrganismo no hospedeiro ativa os mecanismos de defesa tanto da resposta imune inata quanto da resposta adaptativa, entre eles: a ativação do Sistema Complemento, a fagocitose e a produção de anticorpos específicos. Dados da literatura demonstraram que algumas espécies patogênicas são resistentes à ação do Sistema Complemento, enquanto que as espécies não patogênicas são sensíveis, uma vez que são rapidamente eliminadas na presença de soro humano normal (SHN). Neste estudo, expandimos o número de espécies de leptospiras estudadas, sendo: sete estirpes patogênicas e duas não patogênicas, com a finalidade de aprofundar o nosso conhecimento sobre a susceptibilidade e resistência dos diferentes sorovares à ativação de Sistema Complemento. Nos ensaios de sobrevivência, os sorovares das espécies patogênicas mostraram-se resistentes em todas as condições avaliadas.Os dois sorovares daespécie não patogênica (L. biflexa sorovar Andamana e sorovar Patoc) mostraram-se susceptíveis à ação do Sistema Complemento em presença do SHN, como esperado.Quando incubadas com SHN+EDTA 10 mM porcentagem de sobrevida foi semelhanteao SHNi e ao SHN+EGTA 10 mM em menor medida.Ensaios de sobrevivência com soros depletados de C1q, de FD, e soro deficiente de MBLsugerem que a Via Clássica, com menor contribuição e, principalmente, a Via das Lectinas foram importantes para eliminar os sorovares não patogênicos. A interação das proteínas C3, C5, C6, C7, C8 e C9 com a superfície das espécies patogênicas e não patogênicas foi avaliada por Western Blot e ELISA. Diante dos resultados obtidos, não observamos diferenças significativas na deposição de C3 entre as espécies aqui estudadas.Foi observado maior deposição das proteínas C5, C8 e C9 na bactéria não patogênica sorovar Andamana quando comparada a alguns sorovares patogênicos.Em relação às proteínas C6 e C7, houve uma maior deposição em ambas as estirpes sensíveis ao soro, sorovar Andamana e sorovar Patoc, quando comparadas com as sete estirpes patogênicas estudadas. Os sorovares não patogênicos, apesar de pertencer à mesma espécie (L. biflexa), tiveram uma interação diferenciada com os componentes do Complemento, observando uma maior deposição no sorovar Andamana, em relação ao sorovar Patoc. Nosso trabalho sugere que a Via das Lectinas é a melhor via de ativação para eliminar as leptospiras não patogênicas, a Via Clássica contribui minimamente, e por fim, a Via Alternativa não possui relevância na morte das mesmas. As leptospiras patogênicas não são afetadas pelo Sistema Complemento. / Leptospira is the etiological agent of leptospirosis, one of the most important zoonoses and a major public health problem worldwide. There are one million cases worldwide observed each year, especially in developing countries with mild or tropical climate, being 5% to 10% fatal. Leptospires are spirochetes of extracellular life, with the ability to multiply and spread in various tissues. The presence of this microorganism can activate host defense mechanisms of both the innate immune response and the adaptive response, among them: activation of the Complement System, phagocytosis and production of specific antibodies. Literature data show that there are pathogenic species that are resistant to the action of the Complement System, whereas species that are non - pathogenic are sensitive, since they are rapidly eliminated in the presence of normal human serum (NHS). In this study, we expanded the number of leptospira species studied: seven pathogenic strains and two non-pathogenic strains, in order to deepen our knowledge about the susceptibility and resistance of different serovars to Complement System activation. The serovars of the pathogenic species proved to be resistant in all conditions evaluated. The two non-pathogenic serovars (L. biflexa serovar Andamana and serovar Patoc) were susceptible to the action of the Complement System in the presence of NHS as expected. When incubated with 10 mM NHS+EDTA, the survival percentage was similar to the incubation with iNHS and, to a lesser extent, to 10 mM NHS+EGTA. Survival tests with serum depleted from C1q, FD and MBL deficient serum suggest that the Classical Pathway, with a lower contribution, and the Lectin Pathway were important to eliminate the nonpathogenic serovars. Western Blot and ELISA evaluated interactions between the C3, C5, C6, C7, C8 and C9 proteins and the surface of the pathogenic and non-pathogenic species. In view of the results obtained, we didnt observed anything significant in the deposition of C3 among the species studied here. A higher deposition of C5, C8 and C9 proteins was observed in the nonpathogenic bacterium Andamana when compared to some pathogenic serovars. Regarding the C6 and C7 proteins, a greater deposition in both serum-sensitive strains, serovar Andamana and serovar Patoc, when compared to the seven pathogenic strains studied. Non-pathogenic serovars, although belonging to the same species (L. biflexa), had different interactions with the components of the Complement, observing a greater deposition in the Andamana serovar, in relation to the serovar Patoc. Our work suggests that the Lectin Pathway is the best route of activation to eliminate nonpathogenic leptospires. Classical Pathway contributes minimally and, finally, the Alternative Pathway has no relevance in the death of these pathogens. Pathogenic leptospires are not affected by the Complement System.

Introdução: Empiema pleural em geral decorre de complicação de pneumonias e, se não identificado e tratado precocemente, pode ocasionar aumento morbidade ou mesmo mortalidade. A identificação de marcadores no líquido pleural de efusões parapneumônicas que mostrem a presença ou a evolução precoce para empiema tem significância clínica. Neste cenário, dosagens das concentrações de frações ativadas do complemento no líquido pleural podem ajudar no diagnóstico precoce do empiema. Objetivos: Comparar as concentrações de frações ativadas do complemento (C3a, C5a e C5b9) em efusões pleurais induzidas em ratos por inoculação intrapleural de bactérias ou por irritante químico estéril (terebentina). Métodos: Trinta e nove ratos Wistar machos, peso médio de 414g (290 a 546g), realizaram anestesia geral com isofluorano inalatório por máscara, e toracocentese no 4º espaço intercostal com abocath conectado a oscilômetro de pressão para confirmar posição intrapleural. Os animais foram divididos em 3 grupos: SA (n=17) - inoculação de Staphylococcus aureus; SP (n=12) - inoculação de Streptococcus pneumoniae; C (n=10) – inoculação de terebintina (efusão pleural estéril, controle). Doze horas após a inoculação intrapleural foi coletado liquido pleural por toracocentese, sob controle ecográfico, e realizadas dosagens de C3a, C5a e C5b9 pelo método ELISA. Resultados: A dosagem de C3a foi de 1066,82 μg/ml (937,29 – 1196,35 μg/ml) no grupo SA, 1188,28 μg/ml (1095,65 – 1280,92 μg/ml) no SP, e de 679,13 μg/ml (601,29 – 756,98 μg/ml) no C (p<0,001). A dosagem de C5a foi de 55.727 ng/ml (41,22 – 70,23 ng/ml) no grupo SA, 520.107 ng/ml (278,92-761,3 ng/ml) no SP, e de 5.268 ng/ml (1,68 – 8,85 ng/ml) no C (p<0,001). A dosagem de C5b9 foi de 15,02 ng/ml (13,1 – 16,94 ng/ml) no SA, de 16,63 ng/ml (14,37 – 18,9 ng/ml) no SP, e de 14,05 ng/ml (9,8 – 18,29 ng/ml) no C (p=0,692). A avaliação das curvas ROC demonstrou área sob a curva de 0,987 (IC95% 0,953-1) para o C3a; 1 para C5a (1-1) e 0,757 (0,523-0,990). Conclusões: As frações ativadas dos complementos C3a e C5a foram significativamente maiores nos empiemas induzidos experimentalmente por inoculação intrapleural de Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae do que com aquelas observadas após inoculação intrapleural de terebentina. A dosagem elevada destas frações ativadas do complemento foi útil para o diagnóstico do empiema pleural induzido em ratos. / Background Pleural empyema is a well-known complication of pneumonia. If treatment is delayed, empyema may increase morbidity and mortality in affected patients. Therefore, the identification of empyema biomarkers in parapneumonic pleural effusion is desirable. Previous research has suggested complement activation products as candidate empyema markers. Objective To compare the levels of complement activation products C3a, C5a, and C5b9 in pleural effusion induced by Staphylococcus aureus (SA), Streptococcus pneumoniae (SP), or turpentine (control). Method Thirty-nine male Wistar rats (mean weight 414g; 290-546g) were allocated as follows: 17 animals in the SA group, 12 in the SP group, and 10 in the control group. Bacteria or turpentine were injected into the pleural space. After 12h, intrapleural fluid was collected using ultrasound-guided thoracentesis. Levels of complement activation products were determined using ELISA kits. Results Two SA and 1 SP animals died before 12h. Mean levels were as follows: C3a: 1066.82 μg/mL (937.29-1196.35 μg/mL) in SA, 1188.28 μg/mL (1095.65-1280.92 μg/mL) in SP, and 679.13 μg/mL (601.29-756.98 μg/mL) in controls (p<0.001); C5a: 55.727 ng/mL (41.22-70.23 ng/mL) in SA, 520.107 ng/mL (278.92-761.3 ng/mL) in SP, and 5.268 ng/mL (1.68-8.85 ng/mL) in controls (p<0.001); C5b9: 15.02 ng/mL (13.1-16.94 ng/mL) in SA, 16.63 ng/mL (14.37-18.9 ng/mL) in SP, and 14.05 ng/mL (9.8-18.29 ng/mL) in controls (p=0.692). ROC analysis revealed an area under the curve of 0.987 (95%CI: 0.953-1) for C3a; 1 (1-1) for C5a; and 0.757 for C5b9 (0.523-0.990). Conclusions In the present rat model, complement activation fragments C3a and C5a accurately detected infected pleural effusion.

Introdução: Empiema pleural em geral decorre de complicação de pneumonias e, se não identificado e tratado precocemente, pode ocasionar aumento morbidade ou mesmo mortalidade. A identificação de marcadores no líquido pleural de efusões parapneumônicas que mostrem a presença ou a evolução precoce para empiema tem significância clínica. Neste cenário, dosagens das concentrações de frações ativadas do complemento no líquido pleural podem ajudar no diagnóstico precoce do empiema. Objetivos: Comparar as concentrações de frações ativadas do complemento (C3a, C5a e C5b9) em efusões pleurais induzidas em ratos por inoculação intrapleural de bactérias ou por irritante químico estéril (terebentina). Métodos: Trinta e nove ratos Wistar machos, peso médio de 414g (290 a 546g), realizaram anestesia geral com isofluorano inalatório por máscara, e toracocentese no 4º espaço intercostal com abocath conectado a oscilômetro de pressão para confirmar posição intrapleural. Os animais foram divididos em 3 grupos: SA (n=17) - inoculação de Staphylococcus aureus; SP (n=12) - inoculação de Streptococcus pneumoniae; C (n=10) – inoculação de terebintina (efusão pleural estéril, controle). Doze horas após a inoculação intrapleural foi coletado liquido pleural por toracocentese, sob controle ecográfico, e realizadas dosagens de C3a, C5a e C5b9 pelo método ELISA. Resultados: A dosagem de C3a foi de 1066,82 μg/ml (937,29 – 1196,35 μg/ml) no grupo SA, 1188,28 μg/ml (1095,65 – 1280,92 μg/ml) no SP, e de 679,13 μg/ml (601,29 – 756,98 μg/ml) no C (p<0,001). A dosagem de C5a foi de 55.727 ng/ml (41,22 – 70,23 ng/ml) no grupo SA, 520.107 ng/ml (278,92-761,3 ng/ml) no SP, e de 5.268 ng/ml (1,68 – 8,85 ng/ml) no C (p<0,001). A dosagem de C5b9 foi de 15,02 ng/ml (13,1 – 16,94 ng/ml) no SA, de 16,63 ng/ml (14,37 – 18,9 ng/ml) no SP, e de 14,05 ng/ml (9,8 – 18,29 ng/ml) no C (p=0,692). A avaliação das curvas ROC demonstrou área sob a curva de 0,987 (IC95% 0,953-1) para o C3a; 1 para C5a (1-1) e 0,757 (0,523-0,990). Conclusões: As frações ativadas dos complementos C3a e C5a foram significativamente maiores nos empiemas induzidos experimentalmente por inoculação intrapleural de Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae do que com aquelas observadas após inoculação intrapleural de terebentina. A dosagem elevada destas frações ativadas do complemento foi útil para o diagnóstico do empiema pleural induzido em ratos. / Background Pleural empyema is a well-known complication of pneumonia. If treatment is delayed, empyema may increase morbidity and mortality in affected patients. Therefore, the identification of empyema biomarkers in parapneumonic pleural effusion is desirable. Previous research has suggested complement activation products as candidate empyema markers. Objective To compare the levels of complement activation products C3a, C5a, and C5b9 in pleural effusion induced by Staphylococcus aureus (SA), Streptococcus pneumoniae (SP), or turpentine (control). Method Thirty-nine male Wistar rats (mean weight 414g; 290-546g) were allocated as follows: 17 animals in the SA group, 12 in the SP group, and 10 in the control group. Bacteria or turpentine were injected into the pleural space. After 12h, intrapleural fluid was collected using ultrasound-guided thoracentesis. Levels of complement activation products were determined using ELISA kits. Results Two SA and 1 SP animals died before 12h. Mean levels were as follows: C3a: 1066.82 μg/mL (937.29-1196.35 μg/mL) in SA, 1188.28 μg/mL (1095.65-1280.92 μg/mL) in SP, and 679.13 μg/mL (601.29-756.98 μg/mL) in controls (p<0.001); C5a: 55.727 ng/mL (41.22-70.23 ng/mL) in SA, 520.107 ng/mL (278.92-761.3 ng/mL) in SP, and 5.268 ng/mL (1.68-8.85 ng/mL) in controls (p<0.001); C5b9: 15.02 ng/mL (13.1-16.94 ng/mL) in SA, 16.63 ng/mL (14.37-18.9 ng/mL) in SP, and 14.05 ng/mL (9.8-18.29 ng/mL) in controls (p=0.692). ROC analysis revealed an area under the curve of 0.987 (95%CI: 0.953-1) for C3a; 1 (1-1) for C5a; and 0.757 for C5b9 (0.523-0.990). Conclusions In the present rat model, complement activation fragments C3a and C5a accurately detected infected pleural effusion.

Introdução: Empiema pleural em geral decorre de complicação de pneumonias e, se não identificado e tratado precocemente, pode ocasionar aumento morbidade ou mesmo mortalidade. A identificação de marcadores no líquido pleural de efusões parapneumônicas que mostrem a presença ou a evolução precoce para empiema tem significância clínica. Neste cenário, dosagens das concentrações de frações ativadas do complemento no líquido pleural podem ajudar no diagnóstico precoce do empiema. Objetivos: Comparar as concentrações de frações ativadas do complemento (C3a, C5a e C5b9) em efusões pleurais induzidas em ratos por inoculação intrapleural de bactérias ou por irritante químico estéril (terebentina). Métodos: Trinta e nove ratos Wistar machos, peso médio de 414g (290 a 546g), realizaram anestesia geral com isofluorano inalatório por máscara, e toracocentese no 4º espaço intercostal com abocath conectado a oscilômetro de pressão para confirmar posição intrapleural. Os animais foram divididos em 3 grupos: SA (n=17) - inoculação de Staphylococcus aureus; SP (n=12) - inoculação de Streptococcus pneumoniae; C (n=10) – inoculação de terebintina (efusão pleural estéril, controle). Doze horas após a inoculação intrapleural foi coletado liquido pleural por toracocentese, sob controle ecográfico, e realizadas dosagens de C3a, C5a e C5b9 pelo método ELISA. Resultados: A dosagem de C3a foi de 1066,82 μg/ml (937,29 – 1196,35 μg/ml) no grupo SA, 1188,28 μg/ml (1095,65 – 1280,92 μg/ml) no SP, e de 679,13 μg/ml (601,29 – 756,98 μg/ml) no C (p<0,001). A dosagem de C5a foi de 55.727 ng/ml (41,22 – 70,23 ng/ml) no grupo SA, 520.107 ng/ml (278,92-761,3 ng/ml) no SP, e de 5.268 ng/ml (1,68 – 8,85 ng/ml) no C (p<0,001). A dosagem de C5b9 foi de 15,02 ng/ml (13,1 – 16,94 ng/ml) no SA, de 16,63 ng/ml (14,37 – 18,9 ng/ml) no SP, e de 14,05 ng/ml (9,8 – 18,29 ng/ml) no C (p=0,692). A avaliação das curvas ROC demonstrou área sob a curva de 0,987 (IC95% 0,953-1) para o C3a; 1 para C5a (1-1) e 0,757 (0,523-0,990). Conclusões: As frações ativadas dos complementos C3a e C5a foram significativamente maiores nos empiemas induzidos experimentalmente por inoculação intrapleural de Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae do que com aquelas observadas após inoculação intrapleural de terebentina. A dosagem elevada destas frações ativadas do complemento foi útil para o diagnóstico do empiema pleural induzido em ratos. / Background Pleural empyema is a well-known complication of pneumonia. If treatment is delayed, empyema may increase morbidity and mortality in affected patients. Therefore, the identification of empyema biomarkers in parapneumonic pleural effusion is desirable. Previous research has suggested complement activation products as candidate empyema markers. Objective To compare the levels of complement activation products C3a, C5a, and C5b9 in pleural effusion induced by Staphylococcus aureus (SA), Streptococcus pneumoniae (SP), or turpentine (control). Method Thirty-nine male Wistar rats (mean weight 414g; 290-546g) were allocated as follows: 17 animals in the SA group, 12 in the SP group, and 10 in the control group. Bacteria or turpentine were injected into the pleural space. After 12h, intrapleural fluid was collected using ultrasound-guided thoracentesis. Levels of complement activation products were determined using ELISA kits. Results Two SA and 1 SP animals died before 12h. Mean levels were as follows: C3a: 1066.82 μg/mL (937.29-1196.35 μg/mL) in SA, 1188.28 μg/mL (1095.65-1280.92 μg/mL) in SP, and 679.13 μg/mL (601.29-756.98 μg/mL) in controls (p<0.001); C5a: 55.727 ng/mL (41.22-70.23 ng/mL) in SA, 520.107 ng/mL (278.92-761.3 ng/mL) in SP, and 5.268 ng/mL (1.68-8.85 ng/mL) in controls (p<0.001); C5b9: 15.02 ng/mL (13.1-16.94 ng/mL) in SA, 16.63 ng/mL (14.37-18.9 ng/mL) in SP, and 14.05 ng/mL (9.8-18.29 ng/mL) in controls (p=0.692). ROC analysis revealed an area under the curve of 0.987 (95%CI: 0.953-1) for C3a; 1 (1-1) for C5a; and 0.757 for C5b9 (0.523-0.990). Conclusions In the present rat model, complement activation fragments C3a and C5a accurately detected infected pleural effusion.

La presente tesis es el resultado de la investigación emprendida en base al proyecto que se ha formulado para estudiar el proceso de complementación sentencial en el español de Lima. Los datos de la presente tesis son los resultados de las entrevistas. Tales datos están constituidos por las oraciones con complementación que fueron seleccionadas del conjunto de enunciados proporcionados por 48 informantes, 24 varones y 24 mujeres, que fueron agrupados según cuatro rangos de edad. Las oraciones del corpus se caracterizan por presentar complementación sentencial en función de sujeto y de objeto directo tanto con verbos finitos como con verbos no finitos. El análisis ha permitido establecer la caracterización lingüística en los aspectos morfológico, sintáctico y semántico de las oraciones con complementación, a fin de plantear posteriormente la explicación correspondiente.

A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial, com maior incidência nas regiões tropicais. As bactérias que causam a doença pertencem ao gênero Leptospira, família Leptospiracea e ordem Spirochaetales. A leptospirose é mantida na natureza pela colonização persistente dos túbulos renais proximais dos animais portadores. Uma estratégia adotada por estas espiroquetas para sobreviver à ação do sistema imune inato do hospedeiro é a capacidade que possuem de interagir com os reguladores do sistema complemento Fator H (FH) e proteína de ligação a C4b (C4BP). O sistema complemento é um componente vital da imunidade inata, uma vez que desempenha um papel crucial na defesa do hospedeiro, particularmente contra bactérias Gram-negativas. Dados recentes gerados por nosso grupo mostraram que C4BP interage com a proteína de superfície LcpA de Leptospira. Com cerca de 20 kDa, essa proteína é capaz de se ligar a C4BP purificado ou solúvel no soro de maneira dose-dependente. Uma vez ligado à proteína, C4BP permanece funcional agindo como cofator de Fator I na clivagem de C4b. O presente estudo teve como principal objetivo avaliar a interação da proteína LcpA com FH humano, principal regulador solúvel da via alternativa do sistema complemento. A proteína LcpA e suas porções N-Terminal, Intermediária e CTerminal recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade a metal a partir da fração insolúvel. A interação dessas proteínas com FH foi avaliada por dois métodos distintos: ELISA e Western blot com overlay. Os resultados indicaram que a porção C-Terminal da proteína LcpA é responsável pela interação com FH. Curiosamente, C4BP também se liga a esse domínio da proteína. Uma vez que esses dois reguladores solúveis do sistema complemento interagem com o mesmo segmento da LcpA, realizaram-se, a seguir, ensaios de competição com o objetivo de avaliar se ambos compartilhariam os mesmos sítios de interação. Os dados mostraram que FH e C4BP devem se ligar a sequências distintas desta proteína. Com o objetivo de se avaliar a funcionalidade de FH ligado à LcpA, realizou-se um ensaio para investigar sua atividade de co-fator de Fator I na clivagem de C3b. Produtos de degradação de 46 kDa e 43 kDa da cadeia &#945;&#39; de C3b foram detectados, indicando que FH permanece funcional. Em se tratando de uma proteína com funções relacionadas ao processo de evasão ao sistema imune inato, decidiu-se realizar ensaios de desafio em modelo de hamster com a finalidade de se avaliar seu potencial imunoprotetor. Os três ensaios realizados indicaram que a proteína não é capaz de conferir proteção. Os ensaios de ELISA visando à avaliação dos títulos de anticorpos mostraram que LcpA não é imunogênica, fato que explica os resultados dos ensaios de desafio observados. Portanto, embora interaja com moléculas do hospedeiro e pareça contribuir para o processo de evasão ao sistema imune inato, essa proteína de membrana não se mostrou promissora como candidato vacinal contra leptospirose. / Leptospirosis is a zoonosis of global distribution, with higher incidence in tropical areas. The bacteria that cause the disease belong to the genus Leptospira, family Leptospiracea and order Spirochaetales. Leptospirosis is maintained in nature by persistent colonization of proximal renal tubules of carrier animals. One strategy adopted by these spirochetes to escape from host´s innate immune system is the ability to interact with the complement regulators Factor H (FH) and C4b Binding Protein (C4BP). The complement system is a vital component of the innate immune system, being crucial for host´s defense, particularly against Gram-negative bacteria. According to our recent published data, C4BP interacts with the leptospiral surface protein LcpA. This 20 kDa outer membrane protein binds both purified and serum C4BP in a dose-dependent manner. Once bound, C4BP remains functional acting as a cofactor for Factor I in the cleavage of C4b. In the present study we evaluated the interaction of LcpA with human FH, the main soluble regulator of the alternative pathway of complement. The intact protein as well as its N-terminal, intermediate and C-terminal portions were purified by metal-affinity chromatography from the insoluble pellet. The interaction of these proteins with FH was evaluated by two distinct methods: ELISA and Western blot overlay. Our results indicate that the C-terminal domain of LcpA mediates interaction with FH, and also with C4BP. Since both complement regulators interact with the same fragment of LcpA, we next performed competition assays to assess if they would share binding sites. According to our data, FH and C4BP have distinct binding sites on LcpA. Cofactor activity of FH bound to immobilized LcpA was confirmed by detecting the C3b &#945;&#39; chain cleavage fragments of 46 and 43 kDa upon incubation with Factor I, thus indicating that it remains functionally active. Given the LcpA´s role in host´s innate immune evasion, we also evaluated its vaccine potential in a hamster model. Data from three challenge assays indicated that the protein can not afford protection. Low ELISA antibody titers of hamsters immunized with LcpA were observed, which strongly suggests that this protein is not immunogenic. In conclusion, LcpA interacts with host´s molecules and seems to contribute to the bacterial immune evasion. Nevertheless, this outer membrane protein is not a promising vaccine candidate against leptospirosis.