Sendo uma patologia prevenível e tratável, o importante na toxoplasmose congênita é o diagnóstico precoce, fundamental para intervenção terapêutica imediata. Em Cascavel-PR a soroepidemiologia da toxoplasmose foi avaliada em 334 soros de gestantes, com prevalência de 54% e risco de 2,5%aa de infecção aguda. Para monitorar e instrumentar o pré-natal através da triagem de gestantes soronegativas por acompanhamento mensal foi desenvolvido um teste imunocromatográfico para detecção de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii. (TIC-toxo). Conjugados de ouro coloidal com diferentes extratos antigênicos do agente e os reagentes controle e teste da reação foram preparados e avaliados por imunofiltração e controles intraexperimentais, incluindo microscopia eletrônica, sendo. selecionados na padronização o conjugado de ouro de 6nm recoberto com 2,5 ug/A 540nm de ouro de extrato antigênico alcalino de T. gondii, na linha teste da membrana, a Proteína A de S.aureus e na linha controle, o anticorpo anti-T. gondii,. No ensaio foram testadas 70 amostras de soro em duplicata, sendo 35 reagentes e 35 não reagentes, comparando com ELISA comercial, ELISA in house e IFI. Sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e eficiência do TIC-Toxo foram, respectivamente: 88,6% (IC 72,3-96,3), 80,0% (IC 62,5-90,9), 81,6% (IC 65,1-91,7), 87,5% (IC 70,1-95,9) e 0,8429, havendo concordância e reprodutibilidade (Kappa=0,712171) entre o TIC-toxo e os métodos clássicos. O teste desenvolvido é rápido, de baixo custo, de fácil execução em única etapa para uso ambulatorial, precedendo a confirmação laboratorial, na triagem de gestantes ou grupos específicos, permitindo especialmente, o manejo adequado das gestantes de Cascavel em risco de toxoplasmose congênita. / As preventable and treatable condition, the main goal in congenital toxoplasmosis is early diagnosis, essential for adequate therapy. We study seroepidemiology of toxoplasmosis in 344 sera samples from pregnant women of Cascavel, PR, Brazil. By consistent serology, we demonstrate 54% prevalence and a 2.5% risk of acute infection/year, using several approaches. For supply the antenatal office care, it would be important a quick immunochromatographic assay for detection of anti T.gondii</I. IgG antibodies (TIC-Toxo), to be applied in the follow up of pregnant women at risk of infection. To develop the TIC-Toxo assay, we evaluate and standardize the gold particle conjugate adsorbed with several types of tachyzoite extracts, aside to specific reagents for the control and test area of the strip test, by immunofiltration assays, with several quality control steps including electron microscopy. Those analysis provide data for defining the reagents for mass production of TIC-Toxo, constructed with 6 nm colloidal gold conjugate recovered with 2.5ug/A540 of alcaline extract from T.gondii tachyzoites, with S.aureus Protein A at test dot and anti-T.gondii antiserum at control dot. Seventy sera samples were blind tested, 35 positive and 35 negative, comparing to ELISA and IFA assays. Sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and accuracy were respectively: 88,6% (IC 72,3-96,3), 80,0% (IC 62,5-90,9), 81,6% (IC 65,1-91,7), 87,5% (IC 70,1-95,9) e 0,8429, with good agreement of TIC-Toxo and other assays (Kappa=0,712171), with good intra and inter test reproducibility. This TIC-Toxo is a quick, low cost, one step assay and easily performed, to be used for prenatal ambulatory diagnosis of toxoplasmosis, preceding the laboratorial confirming diagnosis and allowing adequate care of pregnant women or others selected groups at risk of acute toxoplasmosis and fetal congenital disease, specially at Cascavel-Pr.

Successful pregnancy is related to Th2 immune response profile, including molecules encoded by the major histocompatibility complex (MHC); however, Toxoplasma gondii infection induces Th1 immune response that is associated with adverse pregnancy outcome. To investigate the influence of MHC haplotype in pregnancy outcome in T. gondii-infected animals, congenic mice, C57BL/KsJ and CB10-H2 females, were orally infected with ME-49 strain on the first day of pregnancy and sacrificed on 8 and 18 days post-infection. C57BL/KsJ showed higher number of parasites in the lungs at 8dI, irrespective of pregnancy, compared with CB10-H2; and both CB10-H2 and C57BL/KsJ showed high number of parasites in the brain at 18dI, irrespective of pregnancy. Parasites were not found in the uterus/placenta in both lineages of mice irrespective of the day of infection and there was no difference in abortion rate of infected mice, although CB10-H2 mice presented higher histological damage compared with C57BL/KsJ at 8 and 18 days of pregnancy and infection. Infection of non-pregnant C57BL/KsJ increased mast cell infiltration in the uterus, and gestation decreased this cell numbers. Furthermore, C57BL/KsJ presented higher IFN-&#947; levels systemically on 8dI; and TNF and IL-6 on 8 and 18dI compared with CB10-H2, despite gestation or not. Additionally, in the uterus/placenta of CB10-H2, pregnancy increased FOXP3 and under infection IL-10, IL-13 and IL-17 expression levels. Our data suggest that both genetic background and MHC haplotypes are essential to protect against reabsorption rate and abortion in congenital toxoplasmosis. / O sucesso da gestação está relacionado com um perfil de resposta imunológica tipo Th2 e envolvimento de vários mecanismos para manutenção da tolerância materno-fetal, incluindo as moléculas codificadas pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Entretanto, a infecção por Toxoplasma gondii induz um perfil de resposta tipo Th1 que é associada aos resultados prejudiciais da gestação. Para investigar a influência do haplotipo do MHC na toxoplasmose congênita, fêmeas de camundongos congênicos, C57BL/KsJ (H-2d) e CB10-H2 (H-2b) foram oralmente infectadas com 5 cistos da cepa ME-49 no primeiro dia de gestação e sacrificadas aos 8 e 18 dias após a infecção. As fêmeas C57BL/KsJ apresentaram alto número de parasitos nos pulmões aos 8dI, comparadas às fêmeas CB10-H2 e ambas as linhagens apresentaram alto número de parasitos no cérebro aos 18dI, independentemente da gestação. Não foram encontrados parasitos no útero/placenta em nenhuma das linhagens, independente do tempo de infecção e não houve diferença no índice de aborto dentre as fêmeas infectadas, apesar da linhagem CB10-H2 ter apresentado maiores danos histológicos comparada à C57BL/KsJ aos 8 e 18 dias de gestação e infecção. A infecção nas fêmeas C57BL/KsJ não-gestantes provocou aumento na migração de mastócitos para o útero enquanto que a gestação diminui tal migração. Além disso, camundongos C57BL/KsJ apresentaram altos níveis sistêmicos de IFN-&#947; aos 8dI e TNF e IL-6 aos 8 e 18dI comparados aos CB10-H2 gestantes e não-gestantes. Ainda, no útero/placenta das fêmeas CB10-H2 a gestação aumentou os níveis de expressão de FOXP3 e, sob a infecção, houve aumento no nível de expressão de IL-10, IL-13 e IL-17. Nossos resultados sugerem que, tanto o background genético como o haplotipo do MHC sejam essenciais na proteção contra os índices de reabsorção fetal e aborto nos casos de toxoplasmose congênita. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

O genótipo e a carga parasitária constituem dois dos principais fatores associados à patogênese na toxoplasmose congênita. Na Europa e nos EUA, o genótipo II é o mais prevalente em infecções congênitas, enquanto que na América do Sul existem evidências apontando uma maior frequência de genótipos atípicos ou recombinantes, associados a casos mais graves. A carga parasitária também parece atuar como fator de risco independente associado ao prognóstico fetal. Os objetivos do estudo foram padronizar uma amplificação quantitativa (qPCR) com iniciadores do gene B1 para avaliar a carga parasitária; determinar o genótipo parasitário por multiplex-nested-PCR-RFLP dos marcadores 5\'-SAG2, 3\'-SAG2, SAG3 e GRA6, seguido de sequenciamento para confirmação da RFLP e análise de mutações; e verificar se existiria associação entre a carga parasitária e os genótipos parasitários nas mesmas gestações. Foram analisadas 76 amostras de líquido amniótico de gestações com toxoplasmose e 31 amostras controle. A qPCR apresentou LOD de 10 parasitos/mL, detectou as 76 amostras de estudo e nenhum controle. As cargas parasitárias variaram de 222 a 808.328 parasitos/mL. Houve duas amostras com valores acima de 104 parasitos/mL, apesar de todas as gestantes serem tratadas. Na genotipagem, SAG3 amplificou 55 amostras (54 tipo III e uma tipo II); 5\' e 3\'-SAG2 amplificaram 54 amostras (todas tipo I), e GRA6, amplificou 20 amostras (todas tipo III). A única amostra com genótipo parasitário SAG3-tipo II foi a que apresentou mais mutações (n=4), carga parasitária de 958 parasitos/mL, porém o recém-nascido foi assintomático. Houve diferença do número de amostras amplificadas por SAG3, e 5\' e 3\'-SAG2 em relação a GRA6 (McNemar, p<0,001). Os sequenciamentos confirmaram 100% dos resultados de RFLP, e foram encontradas 24 amostras com e 52 sem mutações, não existindo diferenças entre as cargas parasitárias dos dois grupos (Mann-Whitney, p= 0,085). Mais de uma mutação foi observada em cinco amostras. Foram detectadas 37 mutações no estudo: 26 heterozigotas/sinônimas e 11 homozigotas/sinônimas, não havendo regiões hot spot. Quanto à correlação clínico-laboratorial, dos 76 recém-nascidos, todos apresentaram IgM positiva ao nascimento, e 75 eram assintomáticos. O único recém-nascido sintomático apresentava tríade de Sabin e uma das duas cargas parasitárias mais elevadas do estudo (309.574 parasitos/mL), porém o genótipo não foi discriminante e não havia mutações. A outra amostra com carga parasitária acima de 104 parasitos/mL pertencia a recém-nascido assintomático, com genótipo não discriminante, e sem mutações. O estudo concluiu que a técnica de Real Time PCR (qPCR) foi padronizada com sucesso, usando os iniciadores B22 e B23 do gene B1 do parasito, podendo ser empregada na rotina diagnóstica. Além disso, foi possível realizar a genotipagem das amostras incluídas no estudo, com melhor desempenho de SAG3 e 5\' e 3\'-SAG2. O sequenciamento confirmou a confiabilidade da técnica de RFLP, e encontrou frequência elevada de mutações, todas sinônimas, sem regiões hot spot, e aparentemente sem associação com a carga parasitária. Houve elevada variabilidade das cargas parasitárias, porém grande homogeneidade dos genótipos parasitários, não tendo sido observada associação entre a carga parasitária e os genótipos de T. gondii no estudo. / The genotype and the parasite load are two of the main factors associated with pathogenesis in congenital toxoplasmosis. In Europe and the USA, genotype II is the most prevalent in congenital infections, while in South America there is evidence pointing to a higher frequency of atypical or recombinant genotypes associated with more severe cases. The parasite load also appears to act as an independent risk factor associated with fetal prognosis. The study objectives were to standardize a quantitative amplification (qPCR) with B1 gene primers to assess the parasite load; determine the genotype by multiplex-nested-PCR-RFLP of 5\' and 3\'-SAG2, SAG3 and GRA6 markers, followed by sequencing to confirm RFLP and analyze mutations, verifying whether there is association between parasite load and parasite genotypes in the same pregnancies. We analyzed 76 amniotic fluid samples from pregnancies with toxoplasmosis and 31 controls. The qPCR presented LOD of 10 parasites/mL, detected the 76 study samples and no control. Parasite loads ranged from 222 to 808,328 parasites/mL. There were two samples with values above 104 parasites/mL, despite all pregnant women be treated. In genotyping, SAG3 amplified 55 samples (54 type III and 1 type II); 5 \'and 3\'-SAG2 amplified 54 samples (all type I); and GRA6, amplified 20 samples (all type III). The only sample with genotype SAG3-type II showed the highest number of mutations (n=4), parasite load of 958 parasites/mL, but the newborn was asymptomatic. There were differences in the number of samples amplified by SAG3, and 5 \'and 3\'-SAG2 over GRA6 (McNemar test, p <0.001). Sequencing confirmed 100% of the RFLP results; and found 24 samples with and 52 without mutations, with no difference between the parasite load of these two groups (Mann-Whitney, p= 0.085). More than one mutation was observed in five samples. A total of 37 mutations were detected in this study: 26 heterozygotes/synonymous and 11 homozygous/synonyms, with no hot spot regions. Regarding the clinical-laboratory correlation, among the 76 newborns, all showed positive IgM at birth, and 75 were asymptomatic. The only symptomatic newborn presented the Sabin\'s triad and one of the two higher parasite loads in the study (309,574 parasites/mL). However, the genotype was not discriminant and no mutations were detected. The other sample with parasite load above 104 parasites/mL belonged to an asymptomatic newborn with a non-discriminating genotype, and no mutations. The study concluded that the Real Time PCR (qPCR) was successfully developed with primers B22 and B23 of the parasite B1 gene, and can be used in routine practice. Moreover, it was possible to perform the samples genotyping, with better performance of SAG3 and 5 \'and 3\'-SAG2. Sequencing results confirmed the RFLP reliability, and found a high frequency of mutations, all synonymous, with no hot spot regions, and apparently not associated with the parasite load. There was a high variability in parasite load, however great homogeneity of parasite genotypes, with no association between the parasite load and T. gondii genotypes in the study.

Introduction. La toxoplasmose oculaire (TO) est la première cause d’uvéite postérieure. L’évolution de cette pathologie dépend d’une balance entre la régulation de la réponse immunitaire et la limitation de la prolifération parasitaire.Méthodes. Le but de nos travaux est de déterminer le spectre des cytokines dans l’humeur aqueuse de patients une To ou une autre inflammation intraoculaire (uvéite d’étiologies virales ou secondaires à des maladies inflammatoires systémiques et endophtalmie bactérienne). Pour mieux appréhender les mécanismes immunitaires mis en jeu lors d’une TO, des dosages de transcrits par RT-PCR et de protéines inflammatoires par immunoessaimultiplexe sont réalisés à partir de modèles murins de TO. Enfin, l’effet de l’injection intraoculaire d’anticorps (AC) anti-IL-17A sur l’inflammation intraoculaire et la prolifération parasitaire est étudié.Résultats. Les spectres de cytokines observés dans l’humeur aqueuse diffèrent nettement en fonction de la cause de l’inflammation. Plus particulièrement, IL-17A semble jouer un rôle primordial dans la pathogénicité de la TO humaine et murine. Chez la souris infectée, l’inflammation intraoculaire et le nombre de parasites intraoculaires sont diminués parl’administration d’AC anti-IL-17A. Les niveaux d’ARNm de T-bet et Foxp3, ainsi que la concentration en IFN-γ (marqueurs de l’immunité cellulaire de type Th1 et Treg), sont augmentés après l’injection d’AC anti-IL-17A.Discussion. Les AC anti-IL-17A modèrent la réponse inflammatoire intraoculaire et limitent la prolifération parasitaire en antagonisant les cellules Th17, probablement via l’induction des cellules Th1 et Treg, secrétant IL-10 et IL-27. Ces résultats préliminaires suggèrent une nouvelle approche thérapeutique in vivo lors d’une toxoplasmose oculaire. / Purpose. Toxoplasmosis is the most common cause of posterior uveitis in immunocompetent subjects. Taking into account the opposing needs of limiting parasite multiplication and minimizing tissue destruction, the immune imbalance implies especially Th17 and T regulatory (Treg) cells.Methods. In a prospective clinical study of acute intraocular inflammation including ocular toxoplasmosis, viral uveitis, systemic inflammatory disease related uveitis and bacterial endophthalmitis we evaluated the cytokine pattern in aqueous humors of affected patients. To further study the immunological mechanisms involved during ocular toxoplasmosis, weevaluated the intraocular inflammation, the parasite load and the immunological response characterized on mRNA and protein level in a mouse model. To evaluate the role of IL-17A, anti IL-17A monoclonal antibodies (mAbs) were administered concomitantly with the parasite.Results. Cytokines networks are different, depending on the cause of intraocular inflammation. In OT, we observed severe ocular inflammation and cytokine patterns comparable to human cases, including IL-17A production. Neutralizing IL-17A decreased intraocular inflammation and parasite load in mice. Detailed studies revealed upregulation of Treg and Th1 pathways. When IFN-γ was neutralized concomitantly, the initial parasite multiplication rate was partially restored.Conclusions. Local IL-17A production plays a central role in pathology of OT. The balance of Th17 and Th1 responses (especially IFN-γ) is crucial for the outcome of infection. These data open new in vivo therapeutic approaches by repressing inflammatory pathways using intravitreal injection of IL-17A mAbs.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Chapter I - Toxoplasmosis is a zoonosis caused by the intracellular parasite Toxoplasma gondii, which infects a range of hosts, including about one-third of the world\'s human population. One of the most severe manifestations of this infection in humans corresponds to congenital toxoplasmosis, which occurs when there is placental transmission of the parasite to the fetus in cases of primary maternal infection during pregnancy. Congenital infection may cause abortions or fetal losses, as well as severe ocular and/or cerebral sequelae in newborns. The serological screening of pregnant women and newborns is mainly based on the detection of IgG and IgM antibodies to T. gondii and constitutes an important measure to be adopted in programs to control this infection, despite the limitations in the antibody detection and interpretation of results. Chapter II - A total of 173 pairs of serum samples from mothers with suspected primary toxoplasmosis during pregnancy and their newborns, obtained from the Department of Pediatrics and Neonatology of Clinical Hospital of the Federal University of Uberlândia (HC-UFU) from 2006 to June 2014, was analyzed by ELISA for the detection of IgG, IgM and IgA anti-T. gondii, and the results were correlated with clinical data obtained from research in the clinical records of each patient. It was concluded that (i) prenatal serological screening is very important for the identification of pregnant women exposed to toxoplasmosis during pregnancy; (ii) maternal treatment reduces congenital transmission of T. gondii; (iii) neonatal serologic screening, associated with analysis of clinical parameters, allows the identification of vertically infected newborns, mainly through simultaneous detection of IgM and IgA antibodies; and (iv) serological follow-up of newborns is important in clarifying doubtful situations, especially in cases of asymptomatic newborns that present suggestive serology of congenital infection. Chapter III - Different antigenic fractions derived from soluble antigen of tachyzoites of T. gondii (STAg) were obtained from sequential precipitation with increasing concentrations of ammonium sulfate and used in immunoblotting technique to detect IgG antibodies and its subclasses (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) present in paired serum samples from mothers with presumptive serology of recent toxoplasmosis during pregnancy and their newborns. It was concluded that the use of antigenic fractions obtained from STAg precipitation in the diagnosis of human toxoplasmosis proved to be interesting to detect IgG and its subclasses, allowing differentiation between positive and negative samples, but it was not a good alternative for the diagnosis of congenital toxoplasmosis, presenting results considered inferior to the STAg, due to the lower frequency of recognized antigenic bands and the absence of differential recognition of antigens by sera of newborns. Chapter IV - The amino acid sequences of sixteen immunodominant antigens of T. gondii were used to perform B cell linear epitope prediction using a software-based approach. A total of 22 epitopes of antigens from surface (SRS), rhoptries (ROP), micronemes (MIC) and dense granules (GRA) of T. gondii were identified, and 15 residues from their amino acid sequences were used to synthesize peptides chemically linked to bovine serum albumin backbone, and the diagnostic performance of these synthetic peptides was evaluated in ELISA to detect specific IgG antibodies in sera of patients with suspected acute toxoplasmosis (G1) or chronic (G2). It was concluded that synthetic peptides designed from B cell linear epitope prediction constitute promising antigens in serological assays to diagnose toxoplasmosis and differentiate acute from chronic phases of toxoplasmosis, representing an alternative to the use of native or recombinant antigens. / Capítulo I - Toxoplasmose é uma zoonose causada pelo parasita intracelular Toxoplasma gondii, que infecta diferentes hospedeiros, incluindo cerca de um terço da população humana mundial. Uma das manifestações mais graves da infecção por este parasita em humanos corresponde à toxoplasmose congênita, quando há transmissão placentária do parasita para o feto durante infecção materna primária na gestação. A infecção congênita pode causar abortos ou perdas fetais, além de sequelas graves em recém-nascidos (RNs), principalmente oculares e/ou cerebrais. A triagem sorológica de gestantes e RNs, baseada principalmente na detecção de anticorpos IgG e IgM anti-T. gondii constitui-se em importante medida a ser adotada em programas de controle desta infecção, apesar das limitações na detecção dos anticorpos e na interpretação dos resultados. Capítulo II - Um total de 173 pares de amostras de soros de mães com suspeita de toxoplasmose primária na gestação e seus respectivos RNs, provenientes do Setor de Pediatria e Neonatologia do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia (HC-UFU) no período de 2006 a junho de 2014, foi analisado por ELISA para a detecção de anticorpos IgG, IgM e IgA anti-T. gondii, e os resultados obtidos foram correlacionados com dados clínicos obtidos a partir de pesquisa nos prontuários clínicos de cada paciente. Concluiu-se que (i) a triagem sorológica pré-natal é de grande relevância na identificação de gestantes expostas à toxoplasmose durante a gestação; (ii) o tratamento materno reduz a transmissão congênita de T. gondii; (iii) a triagem sorológica neonatal, aliada à análise de parâmetros clínicos permite identificar RNs verticalmente infectados, principalmente por meio da detecção conjunta de anticorpos IgM e IgA; e (iv) o acompanhamento sorológico de RNs é importante no esclarecimento de situações duvidosas, principalmente em casos de RNs assintomáticos, mas com sorologia sugestiva de infecção congênita. Capítulo III - Diferentes frações antigênicas derivadas do antígeno solúvel de taquizoítas de T. gondii (STAg) foram obtidas a partir de precipitação sequencial em concentrações crescentes de sulfato de amônio e utilizadas na técnica de immunoblotting para a detecção de anticorpos IgG total e suas subclasses (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) presentes em amostras pareadas de soros de mães com sorologia presuntiva de toxoplasmose recente na gestação e seus respectivos RNs. Concluiu-se que a utilização destas frações antigênicas de STAg no diagnóstico da toxoplasmose humana se mostrou interessante na detecção de anticorpos IgG e suas subclasses, permitindo diferenciação entre amostras positivas e negativas, mas não se mostrou uma boa alternativa no diagnóstico da toxoplasmose congênita, com resultados inferiores aos do STAg, em função da menor frequência de bandas antigênicas reconhecidas e da ausência de reconhecimento diferencial de antígenos pelos soros dos RNs, em relação aos soros maternos. Capítulo IV - As sequências de aminoácidos de 16 antígenos imunodominantes de T. gondii foram usadas para a predição de epítopos lineares de células B usando ferramentas de bioinformática. Um total de 22 epítopos de antígenos de superfície (SRS), roptrias (ROP), micronemas (MIC) e grânulos densos (GRA) de T. gondii foram identificados e utilizados para a síntese de peptídeos com 15 resíduos de aminoácidos, os quais foram quimicamente conjugados ao esqueleto proteico da albumina sérica bovina (BSA), e o desempenho diagnóstico destes peptídeos sintéticos foi avaliado por ELISA para a detecção de anticorpos IgG em soros de pacientes com suspeita de toxoplasmose aguda (G1) ou crônica (G2). Concluiu-se que peptídeos sintéticos obtidos a partir da predição de epítopos lineares de células B constituem antígenos promissores em ensaios sorológicos para o diagnóstico da toxoplasmose e para a diferenciação das fases aguda e crônica da infecção, representando uma alternativa ao uso de antígenos nativos ou recombinantes. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

O genótipo e a carga parasitária constituem dois dos principais fatores associados à patogênese na toxoplasmose congênita. Na Europa e nos EUA, o genótipo II é o mais prevalente em infecções congênitas, enquanto que na América do Sul existem evidências apontando uma maior frequência de genótipos atípicos ou recombinantes, associados a casos mais graves. A carga parasitária também parece atuar como fator de risco independente associado ao prognóstico fetal. Os objetivos do estudo foram padronizar uma amplificação quantitativa (qPCR) com iniciadores do gene B1 para avaliar a carga parasitária; determinar o genótipo parasitário por multiplex-nested-PCR-RFLP dos marcadores 5\'-SAG2, 3\'-SAG2, SAG3 e GRA6, seguido de sequenciamento para confirmação da RFLP e análise de mutações; e verificar se existiria associação entre a carga parasitária e os genótipos parasitários nas mesmas gestações. Foram analisadas 76 amostras de líquido amniótico de gestações com toxoplasmose e 31 amostras controle. A qPCR apresentou LOD de 10 parasitos/mL, detectou as 76 amostras de estudo e nenhum controle. As cargas parasitárias variaram de 222 a 808.328 parasitos/mL. Houve duas amostras com valores acima de 104 parasitos/mL, apesar de todas as gestantes serem tratadas. Na genotipagem, SAG3 amplificou 55 amostras (54 tipo III e uma tipo II); 5\' e 3\'-SAG2 amplificaram 54 amostras (todas tipo I), e GRA6, amplificou 20 amostras (todas tipo III). A única amostra com genótipo parasitário SAG3-tipo II foi a que apresentou mais mutações (n=4), carga parasitária de 958 parasitos/mL, porém o recém-nascido foi assintomático. Houve diferença do número de amostras amplificadas por SAG3, e 5\' e 3\'-SAG2 em relação a GRA6 (McNemar, p<0,001). Os sequenciamentos confirmaram 100% dos resultados de RFLP, e foram encontradas 24 amostras com e 52 sem mutações, não existindo diferenças entre as cargas parasitárias dos dois grupos (Mann-Whitney, p= 0,085). Mais de uma mutação foi observada em cinco amostras. Foram detectadas 37 mutações no estudo: 26 heterozigotas/sinônimas e 11 homozigotas/sinônimas, não havendo regiões hot spot. Quanto à correlação clínico-laboratorial, dos 76 recém-nascidos, todos apresentaram IgM positiva ao nascimento, e 75 eram assintomáticos. O único recém-nascido sintomático apresentava tríade de Sabin e uma das duas cargas parasitárias mais elevadas do estudo (309.574 parasitos/mL), porém o genótipo não foi discriminante e não havia mutações. A outra amostra com carga parasitária acima de 104 parasitos/mL pertencia a recém-nascido assintomático, com genótipo não discriminante, e sem mutações. O estudo concluiu que a técnica de Real Time PCR (qPCR) foi padronizada com sucesso, usando os iniciadores B22 e B23 do gene B1 do parasito, podendo ser empregada na rotina diagnóstica. Além disso, foi possível realizar a genotipagem das amostras incluídas no estudo, com melhor desempenho de SAG3 e 5\' e 3\'-SAG2. O sequenciamento confirmou a confiabilidade da técnica de RFLP, e encontrou frequência elevada de mutações, todas sinônimas, sem regiões hot spot, e aparentemente sem associação com a carga parasitária. Houve elevada variabilidade das cargas parasitárias, porém grande homogeneidade dos genótipos parasitários, não tendo sido observada associação entre a carga parasitária e os genótipos de T. gondii no estudo. / The genotype and the parasite load are two of the main factors associated with pathogenesis in congenital toxoplasmosis. In Europe and the USA, genotype II is the most prevalent in congenital infections, while in South America there is evidence pointing to a higher frequency of atypical or recombinant genotypes associated with more severe cases. The parasite load also appears to act as an independent risk factor associated with fetal prognosis. The study objectives were to standardize a quantitative amplification (qPCR) with B1 gene primers to assess the parasite load; determine the genotype by multiplex-nested-PCR-RFLP of 5\' and 3\'-SAG2, SAG3 and GRA6 markers, followed by sequencing to confirm RFLP and analyze mutations, verifying whether there is association between parasite load and parasite genotypes in the same pregnancies. We analyzed 76 amniotic fluid samples from pregnancies with toxoplasmosis and 31 controls. The qPCR presented LOD of 10 parasites/mL, detected the 76 study samples and no control. Parasite loads ranged from 222 to 808,328 parasites/mL. There were two samples with values above 104 parasites/mL, despite all pregnant women be treated. In genotyping, SAG3 amplified 55 samples (54 type III and 1 type II); 5 \'and 3\'-SAG2 amplified 54 samples (all type I); and GRA6, amplified 20 samples (all type III). The only sample with genotype SAG3-type II showed the highest number of mutations (n=4), parasite load of 958 parasites/mL, but the newborn was asymptomatic. There were differences in the number of samples amplified by SAG3, and 5 \'and 3\'-SAG2 over GRA6 (McNemar test, p <0.001). Sequencing confirmed 100% of the RFLP results; and found 24 samples with and 52 without mutations, with no difference between the parasite load of these two groups (Mann-Whitney, p= 0.085). More than one mutation was observed in five samples. A total of 37 mutations were detected in this study: 26 heterozygotes/synonymous and 11 homozygous/synonyms, with no hot spot regions. Regarding the clinical-laboratory correlation, among the 76 newborns, all showed positive IgM at birth, and 75 were asymptomatic. The only symptomatic newborn presented the Sabin\'s triad and one of the two higher parasite loads in the study (309,574 parasites/mL). However, the genotype was not discriminant and no mutations were detected. The other sample with parasite load above 104 parasites/mL belonged to an asymptomatic newborn with a non-discriminating genotype, and no mutations. The study concluded that the Real Time PCR (qPCR) was successfully developed with primers B22 and B23 of the parasite B1 gene, and can be used in routine practice. Moreover, it was possible to perform the samples genotyping, with better performance of SAG3 and 5 \'and 3\'-SAG2. Sequencing results confirmed the RFLP reliability, and found a high frequency of mutations, all synonymous, with no hot spot regions, and apparently not associated with the parasite load. There was a high variability in parasite load, however great homogeneity of parasite genotypes, with no association between the parasite load and T. gondii genotypes in the study.