The traditional quality culture in the pharmaceutical industry is driven by the regulatory process of marketing authorisation and manufacturing authorisation. These components of the South African regulatory control system are exclusively technically-orientated, with no managerial focus. This study identifies several quality management principles which could find general application in the pharmaceutical industry. The research compares the current regulatory control system with the total quality concept, and highlights the positive contribution which the total quality approach is able to make in terms of its field of reference; the strategic business value of quality; quality policy formulation; the quality organisational structure; enhanced operations management; and management's control over quality costs, in particular / Economic & Management Sciences / M.Com. (Business Economics)

The traditional quality culture in the pharmaceutical industry is driven by the regulatory process of marketing authorisation and manufacturing authorisation. These components of the South African regulatory control system are exclusively technically-orientated, with no managerial focus. This study identifies several quality management principles which could find general application in the pharmaceutical industry. The research compares the current regulatory control system with the total quality concept, and highlights the positive contribution which the total quality approach is able to make in terms of its field of reference; the strategic business value of quality; quality policy formulation; the quality organisational structure; enhanced operations management; and management's control over quality costs, in particular / Economic and Management Sciences / M.Com. (Business Economics)

Les liposomes sont des structures sphériques formés par l'auto-assemblage de molécules amphiphiles sous forme d'une bicouche. Cette bicouche sépare le volume intérieur du liposome du milieu extérieur, de la même manière que les membranes cellulaires. Les liposomes sont donc des modèles de membranes cellulaires et sont formulés pour étudier les processus biologiques qui font intervenir la membrane (transport de molécules à travers la membrane, effets des charges en surface, interactions entre la matrice lipidique et d'autres molécules, etc.). Parce qu'ils peuvent encapsuler une solution aqueuse en leur volume intérieur, ils sont aussi utilisés aujourd'hui comme nanovecteurs de principes actifs. Nous avons formulé des liposomes non-phospholipidiques riches en stérol que nous avons appelés stérosomes. Ces stérosomes sont composés d'environ 30 % d'amphiphiles monoalkylés et d'environ 70 % de stérols (cholestérol, Chol, et/ou sulfate de cholestérol, Schol). Quand certaines conditions sont respectées, ces mélanges sont capables de former une phase liquide ordonnée (Lo) pour donner, par extrusion, des vésicules unilamellaires. Certaines de ces nouvelles formulations ont été fonctionnalisées de manière à libérer leur contenu en réponse à un stimulus externe. En incorporant des acides gras dérivés de l’acide palmitique possédant différents pKa, nous avons pu contrôler le pH auquel la libération débute. Un modèle mathématique a été proposé afin de cerner les paramètres régissant leur comportement de libération. En incorporant un amphiphile sensible à la lumière (un dérivé de l’azobenzène), les liposomes formés semblent répondre à une radiation lumineuse. Pour ce système, il serait probablement nécessaire de tracer le diagramme de phase du mélange afin de contrôler la photo-libération de l’agent encapsulé. Nous avons aussi formulé des liposomes contenant un amphiphile cationique (le chlorure de cétylpyridinium). En tant que nanovecteurs, ces stérosomes montrent un potentiel intéressant pour la libération passive ou contrôlée de principes actifs. Pour ces systèmes, nous avons développé un modèle pour déterminer l’orientation des différentes molécules dans la bicouche. La formation de ces nouveaux systèmes a aussi apporté de nouvelles connaissances dans le domaine des interactions détergents-lipides. Aux nombreux effets du cholestérol (Chol) sur les systèmes biologiques, il faut ajouter maintenant que les stérols sont aussi capables de forcer les amphiphiles monoalkylés à former des bicouches. Cette nouvelle propriété peut avoir des répercussions sur notre compréhension du fonctionnement des systèmes biologiques. Enfin, les amphiphiles monoalkylés peuvent interagir avec la membrane et avoir des répercussions importantes sur son fonctionnement. Par exemple, l'effet antibactérien de détergents est supposé être dû à leur insertion dans la membrane. Cette insertion est régie par l'affinité existant entre le détergent et cette dernière. Dans ce cadre, nous avons voulu développer une nouvelle méthode permettant d'étudier ces affinités. Nous avons choisi la spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS) pour sa sensibilité. Les hypothèses permettant de déterminer cette constante d’affinité se basent sur l’incapacité du détergent à exalter le signal SERS lorsque le détergent est inséré dans la membrane. Les résultats ont été comparés à ceux obtenus par titration calorimétrique isotherme (ITC). Les résultats ont montré des différences. Ces différences ont été discutées. / Liposomes are spherical structures formed by the self-assembly of amphiphilic molecules to form bilayers. The bilayer separates the interior volume of the liposome from the external milieu, as do cellular membranes. Liposomes are cellular membrane models and are used to study biological processes that occur in relation with the membrane (molecular transport across the membrane, surface charge effects, interactions between the lipid matrix and other molecules, etc.). Because they can encapsulate an aqueous solution in their interior volume, they are also used as nanovectors of active agents. We have formulated non-phospholipid liposomes enriched in sterol that we have named sterosomes. These sterosomes are composed of approximately 30 % of monoalkylated amphiphiles and around 70 % of sterols (cholesterol, Chol, and/or cholesterol sulfate, Schol). Under certain conditions, these mixtures are able to form a liquid ordered phase (Lo) and unilamellar vesicles by extrusion. Some of these new formulations were functionalized in order to release their content in response to an external stimulus. By incorporating fatty acids (palmitic acid derivatives) with different pKas, we were able to control the pH at which the release starts. A mathematical model has been proposed in order to get insights on the parameters that control their release behavior. By incorporating a light-sensitive amphiphile (an azobezene derivative), liposomes seem to respond to an irradiation. For this system, it is probably necessary to plot the phase diagram of the mixture in order to control the photo-release of the encapsulated agent. We also have formulated liposomes containing a cationic amphiphile (cetylpyridinium chloride). As nanovectors, these sterosomes show an interesting potential for passive or active agent controlled release. For these systems, a model has been developed in order to study the orientation of the different molecules in the bilayer. The formation of these new formulations has also contributed to new knowledge in the detergent-lipid interaction field. Added to the numerous known effects of cholesterol (Chol) on biological systems, we must now add that sterols are also able to force monoalkylated amphiphiles to form bilayers. This new property can have an impact on our comprehension of biological system functioning. Finally, monoalkykated amphiphiles can interact with the membrane and have a negative impact on its functioning. For example, the antibactericidal effect of detergents is supposed to be due to their insertion in the membrane. This insertion is related to the affinity between the detergent and the membrane. Within this field, we wanted to develop a new method to investigate detergent-membrane affinities. We chose surface enhanced Raman Spectroscopy (SERS) due to its sensitivity. Hypotheses allowing the determination of affinity constants are based on the incapability of the detergent to enhance the SERS signal when the detergent is inserted in the membrane. Results were compared to those obtanined bi isothermal titration calorimetry (ITC). Differences were found and are discussed.

<p>A new kind of lipid/polymer composite particle, consisting of a biodegradable polymer matrix with well-defined lipid domains, has been created. The lipid used is the water-swelling lipid monoolein (MO), which forms a reversed bicontinuous cubic diamond structure in aqueous solutions. The polymer is poly(d,l-lactide-co-glycolide) (PLG), which degrades into water-soluble monomers through hydrolysis. This new particle might be a good alternative for encapsulation of active substances intended to be released over a longer period of time, i.e. sustained/retained/controlled release.</p><p>To prepare such particles can be difficult. Suitable phase behaviour and a solvent with the right properties are needed. For this reason, the phase behaviours of several different lipid/polymer/solvent/water systems have been explored. From the phase behaviour of a suitable system (i.e. MO/PLG/ethyl acetate/water), a route for formation of lipid/polymer composite particles has been deduced. Particles have been formed and distinct, water-swelling, lipid domains have been confirmed by characterization by means of confocal laser scanning probe microscopy (CLSM). </p><p>The sample preparation process has been automated and a method based on using a robotic liquid handler has been developed. Phase diagrams have been determined by examination of macroscopic behaviours and the microstructures of the phases have been studied by small- and wide-angle X-ray scattering (L₃, V₂, L_α, L), nuclear magnetic resonance self-diffusion (L, L₃), viscosimetry (L) and rheology (L). Several different theoretical models have been applied for interpretation of the results. For example, the swelling of the reversed bicontinuous cubic phases and the sponge phase have been modelled by applying the theory of infinite periodical minimal surfaces, the sponge phase has been shown to be bicontinuous according to the theory of interconnected rods and the phase behaviour of the polymer has been described by the Flory-Huggins theory. The main focus of this work (4/5) concerns phase studies in multicomponent systems from a physical-chemical point of view.</p>

A new kind of lipid/polymer composite particle, consisting of a biodegradable polymer matrix with well-defined lipid domains, has been created. The lipid used is the water-swelling lipid monoolein (MO), which forms a reversed bicontinuous cubic diamond structure in aqueous solutions. The polymer is poly(d,l-lactide-co-glycolide) (PLG), which degrades into water-soluble monomers through hydrolysis. This new particle might be a good alternative for encapsulation of active substances intended to be released over a longer period of time, i.e. sustained/retained/controlled release. To prepare such particles can be difficult. Suitable phase behaviour and a solvent with the right properties are needed. For this reason, the phase behaviours of several different lipid/polymer/solvent/water systems have been explored. From the phase behaviour of a suitable system (i.e. MO/PLG/ethyl acetate/water), a route for formation of lipid/polymer composite particles has been deduced. Particles have been formed and distinct, water-swelling, lipid domains have been confirmed by characterization by means of confocal laser scanning probe microscopy (CLSM). The sample preparation process has been automated and a method based on using a robotic liquid handler has been developed. Phase diagrams have been determined by examination of macroscopic behaviours and the microstructures of the phases have been studied by small- and wide-angle X-ray scattering (L3, V2, Lα, L), nuclear magnetic resonance self-diffusion (L, L3), viscosimetry (L) and rheology (L). Several different theoretical models have been applied for interpretation of the results. For example, the swelling of the reversed bicontinuous cubic phases and the sponge phase have been modelled by applying the theory of infinite periodical minimal surfaces, the sponge phase has been shown to be bicontinuous according to the theory of interconnected rods and the phase behaviour of the polymer has been described by the Flory-Huggins theory. The main focus of this work (4/5) concerns phase studies in multicomponent systems from a physical-chemical point of view.

La 1-β-D-arabinofuranosylcytosine (ara-C) demeure l’agent anticancéreux principalement utilisé dans le traitement de la leucémie myéloblastique aiguë (LMA), malgré sa dégradation et son élimination rapide après une administration parentérale. Son encapsulation dans des vecteurs pharmaceutiques, majoritairement des liposomes, a permis de surmonter ces inconvénients. L’objectif général de ce projet de doctorat était de développer deux systèmes à libération prolongée, à base de phospholipides, de cholestérol et de poly(éthylène glycol) (PEG) afin d’encapsuler l’ara-C et ultimement, d’améliorer son efficacité dans le traitement de la LMA. Des Sphérulites® (vésicules multilamellaires d’un type particulier) ont d’abord été étudiées pour leur forte capacité d’encapsulation, due à leur mode de préparation. Par la suite, une formulation liposomale capable, d’une part de cibler spécifiquement les cellules leucémiques et, d’autre part, de promouvoir la libération intracellulaire de l’ara-C grâce à sa sensibilité au pH, a été mise au point. Les deux formulations se devaient d’avoir un faible diamètre, une stabilité en présence de fluides biologiques et des temps de circulation prolongés chez l’animal. Une préparation de Sphérulites®, composée de Phospholipon 90G, de Solutol HS15 et de cholestérol, a permis d’obtenir des vésicules de 300 nm de diamètre. Un dérivé lipidique de PEG a pu être fixé à leur surface, sans modifier la disposition concentrique des lamelles, ni changer leur stabilité. Les Sphérulites® PEGylées ont été chargées d’ara-C et injectées chez le rat par la voie intraveineuse. Elles ont démontré des temps de circulation significativement prolongés comparativement aux Sphérulites® sans PEG. Cependant, l’ara-C s’est retrouvée éliminée de la circulation sanguine très rapidement, révélant une libération précoce du principe actif à partir de ces vésicules. Les liposomes sensibles au pH (~150 nm) ont été obtenus suite à l’insertion d’un copolymère à base de dioctadécyle, de N-isopropylacrylamide (NIPAM) et d’acide méthacrylique. L’anticorps anti-CD33, soit complet soit son fragment Fab’, a été fixé à la surface des liposomes afin de cibler les cellules leucémiques. Les essais in vitro ont démontré la spécificité de la formulation pour différentes cellules leucémiques (CD33+), sa stabilité en présence de protéines plasmatiques et la libération intracellulaire d’un marqueur fluorescent et de l’ara-C. Enfin, des études menées chez la souris saine et immunodéprimée inoculée de cellules HL60 ont montré que la formulation exposant le fragment Fab’ possédait un profil pharmacocinétique et une biodistribution semblables à ceux des liposomes contrôles non-ciblés. L’encapsulation de l’ara-C a permis d’améliorer grandement ses temps de circulation après une administration intraveineuse. Cependant, bien que les immunoliposomes ont permis de prolonger la survie des souris leucémiques comparativement à l’ara-C libre, l’addition du polymère sensible au pH n’a pas permis d’apporter de réel avantage à la formulation lorsque administrée in vivo. Les résultats obtenus dans ce travail de thèse ont, dans un premier temps, mis en évidence que les Sphérulites® pourraient s’avérer utiles dans la vectorisation d’agents anticancéreux si leur capacité à retenir le principe actif in vivo était améliorée. Dans un second temps, les données présentées avec les immunoliposomes suggèrent qu’ils pourraient apporter un bénéfice notable dans le traitement de la LMA. / Despite its rapid degradation and fast elimination in vivo, 1-β-D-arabinofuranosylcytosine (ara-C) is the main anticancer agent used in the treatment of acute myeloid leukemia (AML). The encapsulation of this drug into nanocarriers such as liposomes has been shown to improve its stability, pharmacokinetic profile and, consequently, the treatment efficacy. The purpose of this doctoral work was to develop two nanocarriers employing phospholipids, cholesterol and poly(ethylene glycol) (PEG) to encapsulate ara-C, with the ultimate goal of developing more efficient treatments for AML. The first formulation relied on Spherulites®, which are multilamellar vesicles possessing high entrapment yields due to their fabrication method. In a second part, pH-sensitive immunoliposomes were optimized to target specifically the leukemia cells and promote the release of the loaded ara-C at the desired intracellular site. Both formulations required a small diameter, stability in the presence of biological fluids and long circulation time properties when injected intravenously. An optimized formulation of Spherulites® was developed. It was composed of Phospholipon 90G, Solutol HS15 and cholesterol. The vesicles (300 nm) were able to accommodate PEG-lipid derivatives at their surface without altering their concentric lamellar shape and their in vitro stability. The PEGylated Spherulites® were loaded with ara-C and injected intravenously into rats. The surface-modified vesicles exhibited longer circulation times compared to uncoated Spherulites®. However, most of the loaded-drug was cleared from the systemic circulation very rapidly, reflecting rapid leakage of ara-C from the vesicles. The pH-sensitive immunoliposomes (~150 nm) were obtained by including a terminally-alkylated copolymer made of dioctadecyl, N-isopropylacrylamide (NIPAM) and methacrylic acid in the liposome bilayer. The whole monoclonal antibody anti-CD33 or its Fab’ fragment were grafted on liposomes to target leukemic cells. In vitro assays revealed that this formulation was really specific for the various CD33+ leukemic cell lines, stable in presence of blood proteins, and able to promote the intracellular release of an encapsulated fluorescent probe as well as ara-C. In vivo studies in naïve Balb/c and immunodeprimed (SCID) mice inoculated with HL60 cells confirmed that the anti-CD33 Fab’ targeted formulation possessed pharmacokinetic and biodistribution profiles similar to those of the non-targeted liposomes. The encapsulation of ara-C in this formulation improved substantially its circulation time after intravenous injection. However, although ara-C-loaded immunoliposomes were able to prolong the survival of leukemic mice compared to the free drug, the addition of pH-sensitive polymer did not add any benefit to the formulation. Although these formulations require some optimization, the first part of this work pointed out that Spherulites® could be used to deliver anticancer agents provided that leakage is reduced in vivo. On the other hand, the data obtained with the targeted immunoliposomes suggest that these carriers could be beneficial in the treatment of AML.

Les liposomes sont des structures sphériques formés par l'auto-assemblage de molécules amphiphiles sous forme d'une bicouche. Cette bicouche sépare le volume intérieur du liposome du milieu extérieur, de la même manière que les membranes cellulaires. Les liposomes sont donc des modèles de membranes cellulaires et sont formulés pour étudier les processus biologiques qui font intervenir la membrane (transport de molécules à travers la membrane, effets des charges en surface, interactions entre la matrice lipidique et d'autres molécules, etc.). Parce qu'ils peuvent encapsuler une solution aqueuse en leur volume intérieur, ils sont aussi utilisés aujourd'hui comme nanovecteurs de principes actifs. Nous avons formulé des liposomes non-phospholipidiques riches en stérol que nous avons appelés stérosomes. Ces stérosomes sont composés d'environ 30 % d'amphiphiles monoalkylés et d'environ 70 % de stérols (cholestérol, Chol, et/ou sulfate de cholestérol, Schol). Quand certaines conditions sont respectées, ces mélanges sont capables de former une phase liquide ordonnée (Lo) pour donner, par extrusion, des vésicules unilamellaires. Certaines de ces nouvelles formulations ont été fonctionnalisées de manière à libérer leur contenu en réponse à un stimulus externe. En incorporant des acides gras dérivés de l’acide palmitique possédant différents pKa, nous avons pu contrôler le pH auquel la libération débute. Un modèle mathématique a été proposé afin de cerner les paramètres régissant leur comportement de libération. En incorporant un amphiphile sensible à la lumière (un dérivé de l’azobenzène), les liposomes formés semblent répondre à une radiation lumineuse. Pour ce système, il serait probablement nécessaire de tracer le diagramme de phase du mélange afin de contrôler la photo-libération de l’agent encapsulé. Nous avons aussi formulé des liposomes contenant un amphiphile cationique (le chlorure de cétylpyridinium). En tant que nanovecteurs, ces stérosomes montrent un potentiel intéressant pour la libération passive ou contrôlée de principes actifs. Pour ces systèmes, nous avons développé un modèle pour déterminer l’orientation des différentes molécules dans la bicouche. La formation de ces nouveaux systèmes a aussi apporté de nouvelles connaissances dans le domaine des interactions détergents-lipides. Aux nombreux effets du cholestérol (Chol) sur les systèmes biologiques, il faut ajouter maintenant que les stérols sont aussi capables de forcer les amphiphiles monoalkylés à former des bicouches. Cette nouvelle propriété peut avoir des répercussions sur notre compréhension du fonctionnement des systèmes biologiques. Enfin, les amphiphiles monoalkylés peuvent interagir avec la membrane et avoir des répercussions importantes sur son fonctionnement. Par exemple, l'effet antibactérien de détergents est supposé être dû à leur insertion dans la membrane. Cette insertion est régie par l'affinité existant entre le détergent et cette dernière. Dans ce cadre, nous avons voulu développer une nouvelle méthode permettant d'étudier ces affinités. Nous avons choisi la spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS) pour sa sensibilité. Les hypothèses permettant de déterminer cette constante d’affinité se basent sur l’incapacité du détergent à exalter le signal SERS lorsque le détergent est inséré dans la membrane. Les résultats ont été comparés à ceux obtenus par titration calorimétrique isotherme (ITC). Les résultats ont montré des différences. Ces différences ont été discutées. / Liposomes are spherical structures formed by the self-assembly of amphiphilic molecules to form bilayers. The bilayer separates the interior volume of the liposome from the external milieu, as do cellular membranes. Liposomes are cellular membrane models and are used to study biological processes that occur in relation with the membrane (molecular transport across the membrane, surface charge effects, interactions between the lipid matrix and other molecules, etc.). Because they can encapsulate an aqueous solution in their interior volume, they are also used as nanovectors of active agents. We have formulated non-phospholipid liposomes enriched in sterol that we have named sterosomes. These sterosomes are composed of approximately 30 % of monoalkylated amphiphiles and around 70 % of sterols (cholesterol, Chol, and/or cholesterol sulfate, Schol). Under certain conditions, these mixtures are able to form a liquid ordered phase (Lo) and unilamellar vesicles by extrusion. Some of these new formulations were functionalized in order to release their content in response to an external stimulus. By incorporating fatty acids (palmitic acid derivatives) with different pKas, we were able to control the pH at which the release starts. A mathematical model has been proposed in order to get insights on the parameters that control their release behavior. By incorporating a light-sensitive amphiphile (an azobezene derivative), liposomes seem to respond to an irradiation. For this system, it is probably necessary to plot the phase diagram of the mixture in order to control the photo-release of the encapsulated agent. We also have formulated liposomes containing a cationic amphiphile (cetylpyridinium chloride). As nanovectors, these sterosomes show an interesting potential for passive or active agent controlled release. For these systems, a model has been developed in order to study the orientation of the different molecules in the bilayer. The formation of these new formulations has also contributed to new knowledge in the detergent-lipid interaction field. Added to the numerous known effects of cholesterol (Chol) on biological systems, we must now add that sterols are also able to force monoalkylated amphiphiles to form bilayers. This new property can have an impact on our comprehension of biological system functioning. Finally, monoalkykated amphiphiles can interact with the membrane and have a negative impact on its functioning. For example, the antibactericidal effect of detergents is supposed to be due to their insertion in the membrane. This insertion is related to the affinity between the detergent and the membrane. Within this field, we wanted to develop a new method to investigate detergent-membrane affinities. We chose surface enhanced Raman Spectroscopy (SERS) due to its sensitivity. Hypotheses allowing the determination of affinity constants are based on the incapability of the detergent to enhance the SERS signal when the detergent is inserted in the membrane. Results were compared to those obtanined bi isothermal titration calorimetry (ITC). Differences were found and are discussed.

Tesis por compendio / [ES] La presente tesis doctoral se centra en el diseño, síntesis y caracterización de varios nanodispositivos híbridos orgánico-inorgánicos, utilizando como soporte nanopartículas de sílice mesoporosa equipadas con enzimas y puertas moleculares, los cuales muestran capacidades comunicativas además de la evaluación de diferentes estrategias de comunicación. El primer capítulo incluye un resumen de diferentes conceptos sobre los que se fundamentan los estudios realizados tales como nanotecnología, materiales de sílice mesoporosa, materiales con puertas moleculares que reaccionan a estímulos específicos, partículas Janus y biocomputación. Finalmente, se incluyen conceptos básicos acerca de la comunicación química, materiales y estrategias empleados hasta ahora y ejemplos representativos. A continuación, en el segundo capítulo, se presentan los objetivos generales de esta tesis doctoral que son abordados en los siguientes capítulos experimentales. El tercer capítulo muestra un sistema de biocomputación para liberación basado en nanopartículas Janus de oro-sílice mesoporosa capaces de comunicarse con el entorno procesando la información e imitando la función lógica booleana propia de un demultiplexer y que resulta en la liberación controlada de la carga. Se muestra que dicho nanodispositivo puede llevar a cabo sus funciones en medios complejos como en células cancerígenas. En el cuarto capítulo, se presenta un modelo circular de comunicación dentro de una red de tres nanopartículas diferentes basado en el intercambio jerárquicamente programado de mensajes químicos. La parte mesoporosa del nanodispositivo 1 (S1βgal) es cargada con la especie fluorescente [Ru(bpy)3]Cl2 y tapada con cadenas de oligo(etilenglicol) que contienen puentes disulfuro y que funcionan como puertas moleculares, mientras que la enzima β-galactosidasa es unida a la parte del oro. En la nanopartícula 2 (S2galox), la enzima galactosa oxidasa es inmovilizada en la cara del oro mientras que la sílice mesoporosa es cargada con 4-(bromometil)benzoato de metilo y los poros tapados con un derivado de arilboronato autoinmolante sensible a H2O2 que forma un complejo huéspedanfitrión con β-ciclodextrina. Finalmente, el nanodispositivo 3 (S3est) es funcionalizado con la enzima esterasa en la parte del oro, cargada con la especie reductora hidroclururo de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) en la parte mesoporosa y tapada con una nanoválvula supramolecular que responde a pH (βciclodextrina:benzimidazol). En el quinto capítulo, se muestra un modelo interactivo de comunicación química entre una nanopartícula Janus abiótica y un organismo vivo (Saccharomyces cerevisiae). En particular, el nanodispositivo está basado en nanopartículas funcionalizadas con glucosa oxidasa en la parte del oro, cargadas con el genotóxico fleomicina y tapadas con la puerta molecular sensible a pH (βciclodextrina:benzimidazol). El microorganismo usado en el estudio es una levadura modificada que expresa GFP bajo el control del promotor del gen RNR3; la transcripción de dicho gen es inducida con la exposición a agentes que dañan el ADN. La ruta de comunicación interactiva empieza con la adición de sacarosa (estímulo de entrada) la cual es hidrolizada en glucosa por la invertasa localizada en el espacio periplásmico de las levaduras y que difunde al nanodispositivo donde es trasformada en el correspondiente ácido por la glucosa oxidasa de la parte del oro. La bajada local de pH da lugar a la apertura de la nanoválvula sensible a pH del nanovehículo y con ello a la liberación de fleomicina (mensaje de vuelta) que induce la expresión de GFP (señal de salida) en las levaduras. En el sexto capítulo, proponemos una estrategia para establecer una comunicación lineal entre dos microorganismos diferentes que no interactúan entre ellos mediada por un nanodispositivo que actúa como traductor químico. Finalmente, las conclusiones generales de la presente tesis doctoral son expuestas en el capítulo siete. El estudio de las capacidades comunicativas de los nanodispositivos mesoporosos funcionalizados con enzimas permite la construcción de estrategias de cooperación entre diferentes entidades que permiten funcionalidades que van más allá que aquellas llevadas a cabo por agentes individuales. / [CA] La present tesi doctoral es centra en el disseny, síntesi i caracterització de diversos nanodispositius híbrids orgànic-inorgànics, utilitzant com a suport nanopartícules de sílice mesoporosa equipades amb enzims i portes moleculars, i que mostren capacitats comunicatives a més de l’avaluació de diferents estratègies de comunicació. El primer capítol inclou un resum de diferents conceptes sobre els quals es fonamenten els estudis realitzats com ara nanotecnologia, materials de sílice mesoporosa, materials amb portes moleculars que reaccionen a estímuls específics, partícules Janus i biocomputació. Finalment, s’inclouen conceptes bàsics sobre la comunicació química, materials i estratègies utilitzades fins ara i exemples representatius. A continuació, en el segon capítol, es presenten els objectius generals d’aquesta tesi doctoral que són abordats en els següents capítols experimentals. El tercer capítol mostra un sistema de biocomputació per alliberament basat en nanopartícules Janus d’or-sílice mesoporosa capaços de comunicar-se amb l’entorn processant la informació i imitant la funció lògica booleana pròpia d’un demultiplexer i que resulta en l’alliberament controlat de la càrrega. Es mostra que aquest nanodispositiu pot dur a terme les seves funcions en mitjans complexos com en cèl·lules canceroses. En el quart capítol, es presenta un model circular de comunicació dins d’una xarxa de tres nanopartícules diferents basat en l’intercanvi jeràrquicament programat de missatges químics. La part mesoporosa del nanodispositiu 1 (S1βgal) es carrega amb l’espècie fluorescent [Ru(bpy)3]Cl2 i es tapa amb cadenes d’oligo(etilenglicol) que contenen ponts disulfur i que funcionen com portes moleculars, mentre que l’enzim β-galactosidasa s’immobilitza a la part de l’or. A la nanopartícula 2 (S2galox), l’enzim galactosa oxidasa s’immobilitza a la cara de l’or mentre que la sílice mesoporosa es carrega amb 4-(bromometil)benzoat de metil i els porus són tapats amb un derivat d’arilboronat autoimmolant sensible a H2O2 que forma un complex hoste-amfitrió amb β-ciclodextrina. Finalment, el nanodispositu 3 (S3est) es funcionalitza amb l’enzim esterasa en la part de l’or, es carrega amb l’espècie reductora hidroclurur de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) a la part mesoporosa i es tapa amb una nanoválvula supramolecular que respon a pH (β-ciclodextrina:benzimidazol). En el cinqué capítol, es mostra un model interactiu de comunicació química entre una nanopartícula Janus abiòtica i un organisme viu (Saccharomyces cerevisiae). En particular, el nanodispositiu està basat en nanopartícules funcionalitzades amb glucosa oxidasa en la part de l’or, carregades amb el genotòxic fleomicina i tapades amb la porta molecular sensible a pH (βciclodextrina:benzimidazol). El microorganisme utilitzat en l’estudi és un rent modificat que expressa GFP sota el control del promotor del gen RNR3; la transcripció d’aquest gen és induïda amb l’exposició a agents que danyen l’ADN. La ruta de comunicació interactiva comença amb l’addició de sacarosa (estímul d’entrada) la qual és hidrolitzada en glucosa per la invertasa localitzada en l’espai periplasmàtic dels rents i que difon al nanodispositiu on és transformada en el corresponent àcid per la glucosa oxidasa de la part de l’or. La baixada local de pH dona lloc a l’obertura de la nanoválvula sensible a pH del nanovehicle i amb això l’alliberament de fleomicina (missatge de tornada) que indueix l’expressió de GFP (senyal de sortida) en el rent. En el sisé capítol, proposem una estratègia per establir una comunicació lineal entre dos microorganismes diferents que no interactuen entre ells facilitada per un nanodispositiu que actua com a traductor químic. Finalment, les conclusions generals de la present tesi doctoral són exposades en el capítol set. L’estudi de les capacitats comunicatives dels nanodispositius mesoporosos funcionalitzats amb enzims permet la construcció d’estratègies de cooperació entre diferents entitats que permeten funcionalitats que van més enllà que aquelles dutes a terme per agents individuals. Esperem que els resultats obtinguts inspiren aplicacions futures en diferents àrees com ara biomedicina, nanorobots, materials que imiten la naturalesa i tecnologies de la informació. / [EN] This PhD Thesis is focused on the design, synthesis and characterization of several hybrid organic-inorganic nanodevices using mesoporous silica nanoparticles equipped with enzymes and molecular gates which display communication capabilities as well as the design and evaluation of different communication strategies. The first chapter includes an overview of the different concepts which lay the foundations of the presented studies such as nanotechnology, mesoporous silica materials, stimuli-responsive gated materials, Janus particles and biocomputing. Basic concepts of chemical communication, materials and enabling technologies employed so far and representative examples in this field are also included. Next, in the second chapter, the general objectives of this PhD Thesis that are addressed in the following experimental chapters are presented. The third chapter shows a biocomputing delivery system based on Janus gold-mesoporous silica nanoparticles capable of chemically communicating with the environment and processing the information mimicking a demultiplexer Boolean logic function which results in a programmed cargo release. Finally, it is shown that such nanodevice is operative in complex media such as cancer cells. In the fourth chapter, it is presented a circular model of communication within a network of three different nanoparticles based on the hierarchically programmed exchange of chemical messages. The mesoporous face of nanodevice 1 (S1βgal) is loaded with the fluorescent dye [Ru(bpy)3]Cl2 and capped with disulfidecontaining oligo(ethylene glycol) chains acting as gatekeepers, whereas the enzyme β-galactosidase is attached to the gold face. In nanoparticle 2 (S2galox), the enzyme galactose oxidase is immobilized on the Au face, while the mesoporous silica is loaded with methyl 4-(bromomethyl)benzoate and the mesopores capped with a H2O2-sensitive self-immolative arylboronate derivative which forms a host-guest complex with β-cyclodextrin. Finally, the nanodevice 3 (S3est) is functionalized with the enzyme esterase on the Au face, loaded with the reductive species tris(2- carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) in the mesoporous face and capped with a pH-responsive supramolecular nanovalve (β-cyclodextrin:benzimidazole). In the fifth chapter, it is showed an interactive model of chemical communication between an abiotic Janus nanoparticle and a living organism (Saccharomyces cerevisiae). In particular, the nanodevice is based on Janus goldmesoporous silica nanoparticles functionalized with glucose oxidase on the Au face, loaded with the genotoxin phleomycin and capped with a pH-responsive (βcyclodextrin:benzimidazole) gatekeeper. The microorganism used in the studies is an engineered budding yeast that expresses GFP under the control of the RNR3 promoter; RNR3 gene transcription is induced upon exposure to DNA-damaging agents. The interactive communication pathway starts with the addition of sucrose (input) which is hydrolyzed into glucose by invertase located in periplasmic space of yeasts and diffuses to the nanodevice where it is transformed into the corresponding acid by glucose oxidase on the Au face. The local drop in pH leads to uncapping of the pH-sensitive nanovalve in the nanocarrier and the release of phleomycin (feedback messenger) that induces GFP expression (output) in yeasts. In the sixth chapter, we propose a strategy to establish linear communication between two different non-interacting microorganisms mediated by a nanodevice which acts as a chemical “nanotranslator”. Finally, the general conclusions from this PhD Thesis are presented in chapter seven. The study of communication capabilities of enzyme-functionalized mesoporous nanodevices enables the construction of strategies of cooperation between different entities allowing sophisticated functionalities that go beyond those carried out by individual agents. We hope that the obtained results inspire future applications in different areas such as biomedicine, nanorobots, life-like materials and information technologies. / The authors wish to thank the Spanish Government (projects RTI2018-100910-B-C41 and RTI2018-101599-B-C22 (MCUI/AEI/FEDER, UE), CTQ2017-87954-P), the Generalitat Valenciana (PROMETEO 2018/024), the Comunidad de Madrid (IND2017/BMD7642) and CIBER-BBN (NANOCOMMUNITY project) for support. / De Luis Fernández, B. (2021). Development of enzyme-functionalized hybrid mesoporous nanodevices for advanced chemical communication [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/171506 / TESIS / Compendio

Lung cancer is the deadliest cancer in the world, with a global 5-year survival rate of about 15%. Despite a notable impact of the latest improvements in prevention, screening, detection and staging, the efficacy of conventional treatments is not sufficient and has reached a therapeutic plateau. These conventional treatments involve a combination of surgery, radiotherapy (RT) and chemotherapy (CT). CT is used in almost all stages: in operable and inoperable stages to limit tumour cell invasion and in latest stages as a palliative treatment. Cisplatin is one of the most frequently used and most potent drugs available. It is administered by parenteral route at doses limited by its high and cumulative nephrotoxicity but also by other systemic toxicities (e.g. ototoxicity). Its administration therefore requires many precautions (long hydration procedure, surveillance of the renal function), which mobilize medical personnel. A major limitation of parental CT is the low concentration of drug that successfully reaches the tumour or the metastases. A potential additional modality could be aerosolized CT to localize lung cancer treatment. It has shown a relative local tolerance for cisplatin through preclinical and clinical studies in humans by means of nebulized solutions or liposomal formulations. As a local treatment, aerosolized CT has a clear pharmacokinetic (PK) advantage, as it can increase local exposure while decreasing systemic exposure. However, because CT drugs, such as cisplatin, are active at rather high doses (in the mg range), the duration of administration from nebulizers is very long as it depends on the drug solubility or on drug encapsulation into liposomes. They also pose a high risk of environmental contamination and require HEPA-filtrated hoods during the nebulization procedure. Of all the inhalation devices available to deliver high drug doses, dry powder inhalers (DPIs) were chosen in this work. These were chosen to circumvent the above issues by providing higher deposited doses, in very short timeframes, using a patient-driven device that could help limit environmental exposure to only very low levels of drug. DPI in general also have the advantage of being applicable to both poorly-water-soluble and to water-soluble anticancer drugs. However, because direct deposition of high quantities of anticancer drugs to the lung parenchyma could pose a high risk of local irritation and pulmonary adverse effects, controlled release (CR) of cisplatin from deposited particles in the lung parenchyma was needed. However, in the lungs, foreign undissolved particles are rapidly eliminated by means of naturally occurring clearance mechanisms, in particular macrophage uptake in the alveoli. Therefore, formulation strategies able to limit the particles clearance are needed to assure high lung residence of these CR particles. The formulation strategy of this work was to develop DPI formulation based on solid-lipid microparticles (SLM) able to (i) be deposited into the lung, (ii) control the release of cisplatin and (iii) escape macrophage uptake in order to remain in the lung long enough and at a concentration able to optimize the therapeutic index (i.e. increase the potential therapeutic effect and decrease the potential side effects).The primary objectives of the SLM-based DPI formulations were to (i) exhibit aerodynamic properties compatible with lung cancer patients abilities and cisplatin requirements (e.g. a high deposited fraction, high deagglomeration abilities under low airflow within a low-resistance DPI, deposition in the mg range), (ii) provide a CR matrix for cisplatin in vitro, (iii) be able to be retained into the lung long enough in vivo, (iv) using scalable production techniques and (v) using only potentially well-tolerated excipients.Cisplatin was initially reduced to microcrystals under high-pressure homogenization (HPH) cycles up to 20 000 psi. This procedure permitted uncoated particles with mean diameters below 1.0 μm to be obtained. To assess the cisplatin release abilities of the DPI formulations on the deposited fraction only, a new dissolution test was adapted. This test used a classical paddle apparatus from the pharmacopoeia and a Fast Screening Impactor (FSI). An excipient-free formulation, obtained from the spray dried suspension of cisplatin microcrystals (100% cisplatin) was initially produced. It was compared to a 95:5 cisplatin/tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) formulation, which exhibited a higher deposition ability (fine particle fraction (FPF) of 24.2 vs. 51.5% of the nominal dose, respectively). Both exhibited immediate release (IR), with 90% dissolved under 10 minutes.Solid lipid microparticle (SLM)-based formulations were then produced using the cisplatin microcrystalline suspension and various lipid excipients. Those had previously been screened for their ability to be spray dried following their solubilisation in heated isopropanol. The addition of a triglyceride, tristearin (TS), as the main lipid component and if necessary a polyethylene glycol (PEG) excipient-comprising fraction with TPGS or distearoyl phosphoethanolamine polyethylene glycol 2000 (DSPE-mPEG-2000) as a surface modifier, provided spray dried particles with interesting characteristics. These formulations, comprised of at least 50% cisplatin, exhibited high CR abilities in simulated lung fluid at 37°C for more than 24 h (as low as 56% released after 24 h) and a low burst-effect (as low as 24% and 16% after 10 minutes with and without PEGylated excipients, respectively). They also showed high aerodynamic properties, with a high FPF ranging from 37.3 to 50.3% w/w of the nominal dose and a low median mass aerodynamic diameter (MMAD) between 2.0 and 2.4 μm. The process also offered high production yields (> 60%).The best IR DPI formulation (evaluated on the FPF, i.e. cisplatin/TPGS 95:5) and the most promising CR formulations without (i.e. cisplatin/TS 50:50) and with PEGylated excipients (evaluated on CR abilities, i.e. cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5) were then administered to CD 1 mice, concurrently to endotracheal nebulization (EN) of a cisplatin solution. This was done using specific endotracheal devices, the Penn-Century Inc. DP-4M© Dry Powder Insufflatorn and for the cisplatin solution, the Microsprayer™ IA-1C©. They were compared to intravenous (IV) injection during a PK study over 48 hours. The administration of DPI formulations required the development of a spray dried diluent (Mannitol:Leucine 10:1) and specific dilution method (3D mixing for 4 hours and double-sieving) to be able to deliver precise and repeatable quantities of powder into the lungs of mice at 1.25 mg/kg dose. A PK study was carried out of the lungs, blood, kidneys, liver, mediastinum and spleen of the mice. The study used a developed and validated electrothermal atomic absorption spectrometry (ETAAS) method. Results showed that endotracheal administration of DPI formulations permitted the exposure of the lungs to cisplatin, expressed as the area under the curve (AUC) to be greatly increased while decreasing the systemic exposure. More precisely, the only formulation that exhibited prolonged lung retention was the one comprising PEGylated excipient (cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5), which was observed for ~7 hours. This lung retention was associated with smoother concentration vs. time profiles in blood (higher tmax and lower Cmax), which also confirmed its CR abilities in vivo as dissolved cisplatin is a highly permeable drug. The overall exposure, established by the AUC, helped calculate the target efficiency (Te: the ratio of AUC in the lungs to the sum of AUC in non-target organs) and the target advantage (Ta: ratio of AUC in the lungs by the tested route to the AUC in the lungs by the IV route). For instance, the Ta of the aforementioned formulation (cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5) was of 10.9, as compared to 1 for IV, 3.3 for EN, 2.6 for the IR DPI formulation (cisplatin/TPGS 95:5) and 3.7 for the non-PEGylated CR DPI formulation (cisplatin/TS 50:50). In the meantime, the Te for the same formulations were 1.6, 0.09, 1.1, 0.4 and 0.9, respectively, showing again the great efficiency of the inhaled route vs. the IV route in targeting the lungs. More importantly, it showed the added efficiency of the CR DPI formulation with lung retention abilities, provided by the addition of PEGylated excipients. In the last part of the work, maximum tolerated doses (MTD) of formulations were established. These showed that the best candidate, selected based on the PK results (CR DPI with lung retention abilities composed of cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5) had better overall tolerance than IR approaches (DPI formulation at cisplatin/TPGS 95:5 and EN of a cisplatin solution). More precisely, it was possible to double the administered dosage for the CR formulation (1.0 mg/kg) vs. the IR DPI and EN (both at 0.5 mg/kg) under a repeated administration scheme (3 times a week for 2 weeks).Moreover, an assessment of the lung tolerance of this best candidate was realized and compared to the IR DPI, EN and the IV route. It was done through analysis of the broncho-alveolar lavage fluid (BALF) 24 hours following a single administration at the pre-determined MTD. IL-1β, IL-6 and TNF-α cytokines were not increased following the administrations. No evidence of tissue damage or cytotoxicity could be observed through quantification of the protein content and of lactate dehydrogenase (LDH) activity. The only observations were a decrease in total cells and an increase in polynuclear neutrophils (PN) cells in the BALF, which was not observed by IV or following the administration of the vehicle of the CR formulation alone (i.e. PEGylated SLM and dry diluent). This increase was not directly linked to the formulation but rather to cisplatin, as it was observed in each cisplatin inhalation experiments, and not with the vehicle of the CR formulation, which was comparable to the non-treated mice.In parallel, we realized a survival study following the administration of the best DPI formulation candidate (cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5) vs. the IR DPI candidate (cisplatin/TPGS 95:5), both at their respective MTD under the aforementioned repeated dosing scheme. Cisplatin was administered to mice bearing a grafted orthotopic M109-HiFR lung tumour model, previously developed in the laboratory. The DPI formulations were evaluated against IV administration at each dose (0.5 and 1.0 mg/kg, respectively). This study first confirmed the lower toxicity of the CR approach, as the IR DPI formulation caused a much higher number of deaths during treatment of the grafted mice. The CR formulation administered at 1.0 mg/kg showed a higher survival than the negative control but a tumour response comparable to IV administered at half this dose (0.5 mg/kg). This unexpected outcome with regard to the PK results is explained by the fact that the tumour model is highly metastatic. Mice treated with inhaled formulations died due to distant tumour involvement, while those treated systemically died due to pulmonary tumour involvement. This led us to believe that this kind of treatment may have greater potential in combination, adjuvant to the parenteral route.This work helped establish the proof-of-concept of a cisplatin CR DPI formulation with an up-scalable process. The SLM approach confirmed that encapsulation of drugs exhibiting low solubility, such as cisplatin, was possible using highly hydrophobic excipients and that surface modification was mandatory to provide notable lung retention in vivo. The SLM approach showed good signs of tolerance during the exploratory study but still needs to be confirmed under a chronic scheme using other determinants such as histopathological analyses of the lung tissue. Moreover, comparison of the nephrotoxicity of formulations against that of the IV route should be conducted with appropriate and sensitive methods. Finally, the survival study of the CR DPI formulation showed mitigated results, partly because of the orthotopic model characteristics. This could be proof that inhaled CT has a role to play combined with classical systemic CT. This needs to be assessed in a further study.Le cancer du poumon est le cancer ayant le taux de mortalité le plus élevé au monde, avec un taux de survie global à 5 ans d'environ 15%. Malgré un impact notable des dernières améliorations en matière de prévention, de dépistage, et de classification du cancer du poumon, l'efficacité des traitements classiques n'est toujours pas suffisante et semble avoir atteint un plateau thérapeutique. Ces traitements classiques comprennent de la chirurgie, de la radiothérapie et de la chimiothérapie, le plus souvent en combinaison. La chimiothérapie est utilisée à presque tous les stades: dans les stades opérables et inopérables afin de limiter l'invasion par les cellules tumorales jusqu’aux derniers stades en tant que traitement palliatif. Le cisplatine est l'un des médicaments anticancéreux les plus fréquemment utilisés et les plus puissants actuellement disponibles. Il est administré par voie parentérale à des doses qui sont limitées par sa néphrotoxicité élevée et cumulative mais également par d'autres toxicités systémiques (par exemple, de l'ototoxicité). Son administration nécessite donc de nombreuses précautions (longue procédure d'hydratation, surveillance de la fonction rénale), ce qui mobilise fortement le personnel médical. Une limitation importante de la chimiothérapie parentérale est la faible concentration d’actif qui atteint avec succès la tumeur ou les métastases. Une autre voie d’accès potentielle pourrait être la chimiothérapie inhalée pour traiter le cancer du poumon. Cette approche a montré une relativement bonne tolérance locale pour le cisplatine à travers différentes études précliniques et cliniques chez l'homme au moyen de solutions ou de formulations liposomales nébulisées. En tant que traitement via la voie pulmonaire, la chimiothérapie inhalée présente un avantage pharmacocinétique évident, car elle permet d’augmenter l'exposition locale tout en diminuant l'exposition systémique. Cependant, du fait que les médicaments chimiothérapeutiques, tels que le cisplatine, soient actifs à des doses relativement élevées (dans la gamme du mg), la durée d'administration à partir des nébuliseurs s’avère en pratique très longue car elle dépend principalement de la solubilité de l’actif ou de son encapsulation dans les liposomes. Les nébuliseurs présentent également un risque élevé de contamination de l'environnement et nécessitent de lourds appareillages (hottes filtrantes en particulier) pendant la procédure d’administration.Parmi tous les dispositifs d'inhalation existants, capables de délivrer des doses élevées de médicaments, les inhalateurs de poudre sèche (DPI) semblent être de bons candidats. Ceux-ci ont été choisis dans ce travail afin de contourner les problèmes énumérés ci-dessus, en fournissant des doses pulmonaires plus élevées, dans des délais très courts. De plus, ces dispositifs sont activés par le flux inspiratoire du patient, ce qui pourrait aider à limiter l'exposition environnementale à des niveaux très faibles. Les inhalateurs à poudre sèche présentent également l'avantage d'être utilisables à la fois avec des médicaments solubles et des médicaments peu solubles dans l’eau. Malgré tout, étant donné que la déposition directe de quantités élevées de médicaments chimiothérapeutiques dans le parenchyme pulmonaire pourrait présenter un risque élevé d'irritation et d'effets indésirables locaux, une libération contrôlée du cisplatine à partir de particules déposées dans le parenchyme pulmonaire s’avère nécessaire. Cependant, dans les poumons, ces particules non dissoutes d’origine étrangère sont rapidement éliminées par les mécanismes d’élimination, en particulier par la clairance par les macrophages au niveau des alvéoles. Par conséquent, des stratégies de formulation capables de limiter la clairance des particules sont nécessaires pour assurer une résidence pulmonaire élevée de ces particules à libération contrôlée.La stratégie de formulation de ce travail a donc consisté à développer une formulation pour inhalateur à poudre sèche à base de microparticules lipidiques solides capable de (i) être déposées dans le poumon, (ii) de contrôler la libération du cisplatine et (iii) de rester dans le poumon suffisamment longtemps dans le but d’optimiser l'indice thérapeutique (c'est-à-dire augmenter le potentiel thérapeutique du cisplatine et diminuer ses potentiels effets secondaires).Les objectifs principaux des formulations basées sur les microparticules lipidiques solides étaient (i) de présenter des hautes charges en cisplatine au sein des microparticules lipidiques tout en présentant des propriétés aérodynamiques compatibles avec la capacité pulmonaire des patients atteints de cancer du poumon (par exemple, une fraction déposée élevée et une capacité élevée à la désagglomération sous faible débit d'air dans un inhalateur de faible résistance), (ii) de fournir une matrice capable de libérer le cisplatine de manière contrôlée in vitro, (iii) d’être capable de rester dans le poumon suffisamment longtemps in vivo, tout cela (iv) en utilisant des techniques de production ayant une bonne capacité d’augmentation d’échelle et (v) de n’utiliser que des excipients potentiellement bien tolérés au niveau du poumon.Le cisplatine a été initialement réduit sous forme microcristalline à l’aide de cycles d'homogénéisation à haute pression jusqu'à 20 000 psi. Cette procédure a permis d'obtenir des particules non enrobées ayant un diamètre moyen inférieur à 1.0 μm. Afin d’évaluer les capacités de libération du cisplatine des formulations à partir de la fraction capable théoriquement de se déposer dans les poumons, un nouveau test de dissolution a été adapté à partir d’un appareil à palettes classique de la pharmacopée et d’un impacteur à cascade « Fast Screening Impactor ». Une formulation sans excipient, obtenue à partir de la suspension de cisplatine, soumise à la technique de séchage par l’atomisation (100% de cisplatine) a été produite comme point de départ. Celle-ci a ensuite été comparée à une formulation de cisplatine/tocophéryl polyéthylène glycol succinate (TPGS) (95:5), qui présentait une capacité de déposition pulmonaire in vitro (fraction de particules fines (FPF) de 24.2% pour la première et de 51.5% pour la deuxième, exprimée par rapport à la dose nominale). Toutes deux ont démontré des capacités de libération immédiate, avec 90% du cisplatin dissous en moins de 10 minutes.D’autres formulations, cette fois élaborées sous la forme de microparticules lipidiques solides ont ensuite été produites à partir de la suspension microcristalline de cisplatine et de divers excipients lipidiques. Ces microparticules avaient préalablement été testées pour leur aptitude à être séchées par atomisation après solubilisation des excipients dans de l'isopropanol chaud. L’ajout d’un triglycéride, la tristéarine (TS), comme excipient lipidique principal et également d’une fraction comprenant un excipient contenant du polyéthylène glycol (PEG), à l’aide de TPGS ou de distéaroyl phosphoéthanolamine polyéthylène glycol 2000 (DSPE-mPEG-2000) a montré des résultats intéressants. Ces formulations, ayant une teneur en cisplatine d’au moins 50%, ont présenté des aptitudes élevées pour la libération contrôlée dans le fluide pulmonaire simulé in vitro à 37 °C, et ce, pendant plus de 24 h (jusqu'à 56% libérées après 24 h) ainsi qu’un faible « burst-effect » (de seulement 24% et 16% après 10 minutes avec et sans excipients PEGylés, respectivement). Elles ont également montré des propriétés aérodynamiques élevées, avec une FPF élevée allant de 37.3 à 50.3% m/m par rapport à la dose nominale et un diamètre aérodynamique compris entre 2.0 et 2.4 μm. Le meilleur candidat à libération immédiate (évaluée sur base de la FPF, soit la formulation cisplatine/TPGS 95:5 m/m) et les formulations à libération contrôlée les plus prometteuses n’incluant pas d’excipients PEGylés (cisplatine/TS 50:50 m/m) et incluant des excipients PEGylés (évalués sur les capacités de libération contrôlée, c'est-à-dire la formulation cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5 m/m/m) ont ensuite été administrées à des souris CD-1, en comparaison d’une nébulisation endotrachéale d'une solution de cisplatine. Ceci a été fait à l’aide de dispositifs endotrachéaux dédiés aux poudres pour le DP-4M© « Dry Powder Insufflator » et aux solutions pour le Microsprayer™ IA-1C© de Penn-Century. Ces formulations ont été comparées à l'injection intraveineuse (IV) au cours d’une étude pharmacocinétique étendue sur 48 heures.L'administration de formulations de poudres sèches pour inhalation a nécessité le développement préalable d'un diluant par atomisation (Mannitol:Leucine 10:1 m/m) ainsi que d’une méthode de dilution des poudres (mélange tridimensionnel pendant 4 heures et suivi d’un double-tamisage) afin de pouvoir délivrer des quantités précises et répétables de poudre dans les poumons de souris à la dose d’1.25 mg/kg. Le suivi des paramètres pharmacocinétiques a ainsi pu être réalisé au niveau des poumons, du sang, des reins, du foie, du médiastin et de la rate des souris. Ceci a été fait à l’aide d’une méthode de spectrométrie d'absorption atomique électrothermique, qui a été préalablement développée et validée. Les résultats obtenus ont montré que l'administration endotrachéale de formulations de poudres sèches permettait d’augmenter fortement l'exposition des poumons par le cisplatine, exprimée en aire sous la courbe (AUC) tout en diminuant l'exposition systémique. Plus précisément, la seule formulation présentant une rétention pulmonaire prolongée était celle qui comprenait un excipient PEGylé (cisplatine/TS/TPGS 50:49.5:0.5 m/m/m), ce qui a été observé pendant environ 7 heures. Cette rétention pulmonaire a été associée à des profils de concentration en fonction du temps plus réguliers dans le sang (tmax supérieur et Cmax inférieur), ce qui a également confirmé ses capacités de libération contrôlée in vivo car la perméabilité de l’épithélium pulmonaire pour le cisplatine dissous s’est avérée très élevée. L'exposition globale établie à partir de l’AUC a permis de calculer l’efficacité de ciblage (Te: rapport de l'AUC mesurée dans les poumons et de la somme des AUC mesurées dans les organes non cibles) et l’avantage du ciblage (Ta: rapport de l’AUC mesuré dans les poumons suite à l’administration pulmonaire et de l'AUC mesurée dans les poumons suite à l’administration par la voie IV). Par exemple, le Ta de la formulation décrite ci-dessus (cisplatine/TS/TPGS 50:49.5:0.5 m/m/m) était de 10.9, comparativement à 1 pour l’IV, 3.3 pour la nébulisation endotrachéale, 2.6 pour la formulation de poudre sèche à libération immédiate (cisplatine/TPGS 95:5 w/w) et 3.7 pour la formulation de poudre sèche à libération contrôlée ne comprenant pas d’excipient PEGylé (cisplatine/TS 50:50). Dans le même temps, le Te mesuré pour les mêmes formulations était de 1.6, 0.09, 1.1, 0.4 et 0.9, respectivement, démontrant également le rendement élevé de la voie inhalée par rapport à la voie IV dans sa capacité à cibler les poumons. Plus important encore, ceci a démontré le grand avantage des capacités de rétention pulmonaire de la formulation à libération contrôlée comprenant un excipient PEGylé.Dans la dernière partie de ce travail, les doses maximales tolérées (DMT) des formulations ont été déterminées. Le meilleur candidat, choisi en fonction des résultats de pharmacocinétique (formulation à libération contrôlée ayant des capacités de rétention pulmonaire composé de cisplatine/TS/TPGS 50:49.5:0.5 m/m/m), avait une meilleure tolérance globale que les deux approches à libération immédiate testées (formulation de poudre sèche cisplatine/TPGS 95:5 et la nébulisation endotrachéale d'une solution de cisplatine). Plus précisément, il s’est avéré possible de doubler le dosage administré pour la formulation à libération contrôlée (1.0 mg/kg) par rapport à la poudre sèche à libération immédiate et à la nébulisation endotrachéale (toutes les deux à 0.5 mg/kg) suivant un schéma d'administration chronique (3 fois par semaine pendant 2 semaines). De plus, une évaluation de la tolérance pulmonaire de cette formulation à libération prolongée a été réalisée et comparée à la poudre sèche à libération immédiate, à la nébulisation endotrachéale et à la voie IV. Elle a été réalisée par analyse du liquide provenant du lavage broncho-alvéolaire, 24 heures après une administration unique à la dose maximale tolérée préalablement déterminée pour chaque formulation. Aucune augmentation des cytokines IL-1β, IL-6 et TNF-α n’a pu être détectée à la suite des administrations. Aucunes preuves de lésion tissulaire ou de cytotoxicité n'ont pu être observées au travers du dosage de la teneur en protéines totale et de l'activité de la lactate déshydrogénase. Les seules observations qui ont pu être faites ont été une diminution des cellules totales et une augmentation des polynucléaires neutrophiles dans le lavage broncho-alvéolaire, ce qui n'a pas été observé suite à l’administration IV ou après l'administration du véhicule de la formulation à libération contrôlée seul (c'est-à-dire les microparticules lipidiques solides PEGylées et le diluant). Cette augmentation ne semble pas liée aux microparticules lipidiques solides ou au diluent mais probablement à l’exposition pulmonaire au cisplatine, car cette augmentation a été observée pour chaque groupe inhalé contenant du cisplatine. Le cisplatine a ensuite été administré à des souris qui ont été greffées de manière orthotopique par une lignée murine de carcinome pulmonaire M109-HiFR, modèle préclinique préalablement développé au sein de notre laboratoire. Les formulations de poudres sèches ont été évaluées par rapport à l'administration IV à chaque dose testée (0.5 et 1.0 mg/kg, respectivement). Cette étude a d'abord confirmé la toxicité plus faible de l'approche à libération contrôlée, car la formulation à libération immédiate a causé un nombre beaucoup plus élevé de décès pendant le traitement des souris greffées. La formulation à libération contrôlée administrée à 1.0 mg/kg, a montré une survie plus élevée que le contrôle négatif, mais une réponse comparable à la dose IV administrée à la moitié de la dose (0.5 mg/kg). Ce résultat inattendu par rapport aux résultats de l’étude pharmacocinétique s'explique probablement par le fait que le modèle de tumeur utilisé est hautement métastatique. Les souris traitées avec des formulations inhalées sont mortes en raison de tumeurs secondaires distantes par rapport à la tumeur primaire implantée au niveau du poumon, alors que celles traitées par la voie systémique sont mortes en raison d’un envahissement tumoral pulmonaire. Cela nous amène à penser que ce type de traitement inhalé pourrait avoir un plus grand potentiel en combinaison à la voie parentérale. Ce travail a ainsi permis d’établir la preuve du concept de formulation à base de poudre sèche de cisplatine à libération contrôlée, en utilisant un processus de fabrication capable de subir une mise à l’échelle industrielle. L’utilisation de microparticules lipidiques solides a confirmé que l'encapsulation d’actifs présentant une certaine hydrophilie, comme le cisplatine, était possible en utilisant des excipients hautement hydrophobes et qu'une modification de leur surface était cependant obligatoire pour obtenir une rétention pulmonaire intéressante in vivo. Les microparticules lipidiques solides ont montré de bons signes de tolérance au cours de l'étude exploratoire, mais celle-ci doit encore être confirmée avec une administration chronique des poudres. Ceci doit être fait en suivant des paramètres supplémentaires, tels que des analyses histologiques du tissu pulmonaire. De plus, la comparaison de la néphrotoxicité des formulations avec celle mesurée par la voie IV doit être effectuée avec des méthodes appropriées et sensibles. Enfin, l'étude de survie de la formulation à libération prolongée a montré des résultats mitigés, en partie à cause des caractéristiques du modèle orthotopique de tumeur pulmonaire. Cependant, il semblerait que la chimiothérapie inhalée à un rôle important à jouer en combinaison avec la chimiothérapie systémique classique. Ceci doit être évalué dans une étude future. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

[ES] La presente tesis doctoral, titulada "Microportadores inteligentes para la liberación controlada de sustancias de interés nutracéutico", se centra en el diseño y evaluación de sistemas híbridos orgánico-inorgánicos para proteger y liberar controladamente compuestos bioactivos. Dichos sistemas están basados en (i) materiales de sílice, principalmente partículas mesoporosas, como soporte inorgánico para almacenar y proteger la carga bioactiva; y (ii) una capa externa de biomoléculas como puerta molecular, que regula la liberación de la carga ante ciertos estímulos. En el primer capítulo de la tesis se describe el ácido oleico como puerta molecular. Este capítulo se subdivide en tres artículos diferentes, con distintos objetivos. En el primer artículo se emplea por primera vez el ácido oleico como puerta molecular de un soporte mesoporoso, cargado con la molécula modelo rodamina B. El material preparado es capaz de proteger la carga en las condiciones presentes en la boca y en el estómago, e inducir su liberación en el intestino con la acción surfactante de las sales biliares. El sistema se ha empleado para la liberación de vitamina B2, demostrando así la utilidad del diseño para la protección y liberación controlada de nutracéuticos. El segundo artículo evalúa la efectividad de esta puerta molecular en diferentes tipos de partículas mesoporosas de sílice, con diversos tamaños y estructuras de poro (MCM-41, MCM-48, SBA-15 y UVM-7). En todos los sistemas estudiados, la puerta molecular es capaz de mantener protegidas las moléculas cargadas, y liberarlas ante la presencia de sales biliares. El sólido basado en la estructura de UVM-7 se validó in vivo, observándose un retraso en la absorción intestinal de la rodamina gracias a su encapsulación. Por último, el tercer artículo incluido en este capítulo ha estudiado la posibilidad de incorporar puertas moleculares en filosilicatos. Se ha conseguido la protección y liberación controlada de biomoléculas de gran tamaño implicadas en el metabolismo humano (vitamina B12 y hematina) empleando filosilicatos funcionalizados con ácido oleico como puerta molecular. El segundo capítulo describe por primera vez el uso de la proteína zeína (prolamina de maíz) como puerta molecular. La presencia de la prolamina de maíz inhibe la salida de los compuestos antimicrobianos encapsulados (timol, carvacrol y cinamaldehído) liberándolos en presencia de las enzimas proteolíticas excretadas durante el crecimiento bacteriano. De todos los materiales desarrollados, el sistema cargado con cinamaldehído ha demostrado una inhibición del crecimiento de E. coli superior a la del compuesto libre. Finalmente, el tercer capítulo estudia la efectividad de la lactosa como puerta molecular para proteger aceites esenciales y liberarlos solo en las condiciones presentes en el intestino. Se han preparado tres materiales diferentes basados en MCM-41, cargados con timol, eugenol y cinamaldehído, y funcionalizados con lactosa para inhibir la salida de los compuestos. La acción enzimática de la lactasa secretada en el intestino es capaz de hidrolizar la puerta molecular en los correspondientes monosacáridos, liberando la carga a lo largo del lumen intestinal. Los microdispositivos diseñados han sido validados in vitro con células Caco-2, donde se ha observado el aumento de la capacidad citotóxica del cinamaldehído y la disminución de la permeabilidad a través del modelo de membrana intestinal gracias a su encapsulación. Finalmente, el microdispositivo cargado con cinamaldehído se ha validado in vivo ratificándose la disminución de la permeabilidad del compuesto y su mayor permanencia en el lumen intestinal. Así, la presente tesis doctoral ha demostrado la posibilidad de emplear biomoléculas sencillas de grado alimentario como puertas moleculares sobre diversos materiales de sílice. Estos nuevos sistemas han permitido proteger y liberar control / [CA] La present tesi doctoral, titulada "Microportadors intel·ligents per a l'alliberament controlat de substàncies d'interès nutracèutic", se centra en el disseny i avaluació de sistemes híbrids orgànic-inorgànics per a la protecció i alliberament controlat de compostos bioactius. Aquests sistemes estan basats en (i) materials de sílice, principalment partícules mesoporoses, com a suport inorgànic per emmagatzemar i protegir la càrrega bioactiva; i (ii) una capa externa de biomolècules com a porta molecular, que regula l'alliberament d'aquesta càrrega davant de determinats estímuls. En el primer capítol de la tesi es descriu l'àcid oleic com a porta molecular. Aquest capítol se subdivideix en tres articles diferents, amb objectius diferents. En el primer article s'empra per primera vegada l'àcid oleic com a porta molecular d'un suport mesoporós, carregat amb la molècula model rodamina B. El material preparat és capaç de protegir la càrrega en les condicions presents a la boca i a l'estómac, i induir el seu alliberament a l'intestí amb l'acció surfactant de les sals biliars. El sistema s'ha emprat per a l'alliberament de vitamina B2, demostrant així la utilitat del disseny per a la protecció i alliberament controlat de nutracèutics. El segon article avalua l'efectivitat d'aquesta porta molecular en diferents tipus de partícules mesoporoses de sílice, amb diverses mides i estructures de porus (MCM-41, MCM-48, SBA-15 i UVM-7). En tots els sistemes estudiats, la porta molecular és capaç de mantindre protegides les molècules carregades, i alliberar-les davant la presència de sals biliars. El sòlid basat en l'estructura de UVM-7 es validà in vivo, observant-se un retard en l'absorció intestinal de la rodamina gràcies a la seua encapsulació. Finalment, en el tercer article inclòs en aquest capítol s'ha estudiat la possibilitat d'incorporar portes moleculars en fil·losilicats. S'ha aconseguit la protecció i alliberament controlat de biomolècules de grans dimensions implicades en el metabolisme humà (vitamina B12 i hematina) emprant fil·losilicats funcionalitzats amb àcid oleic com a porta molecular. El segon capítol descriu per primera vegada l'ús de la proteïna zeïna (prolamina de dacsa) com a porta molecular. La presència de la prolamina de dacsa inhibeix la sortida dels compostos antimicrobians encapsulats (timol, carvacrol i cinamaldèhid) alliberant-los en presència dels enzims proteolítics excretades durant el creixement bacterià. De tots els materials desenvolupats, el sistema carregat amb cinamaldèhid ha demostrat una inhibició de l'creixement d'E. coli superior a la del compost lliure. Finalment, el tercer capítol estudia l'efectivitat de la lactosa com a porta molecular per protegir olis essencials i alliberar-los només en les condicions presents a l'intestí. S'han preparat tres materials diferents basats en MCM-41, carregats amb timol, eugenol i cinamaldèhid, i funcionalitzats amb lactosa per inhibir l'eixida dels compostos. L'acció enzimàtica de la lactasa secretada a l'intestí és capaç d'hidrolitzar la porta molecular en els corresponents monosacàrids, alliberant la càrrega al llarg del lumen intestinal. Els microdispositius dissenyats s'han validat in vitro amb cèl·lules Caco-2, on s'observà l'augment de la capacitat citotòxica del cinamaldèhid i la disminució de la permeabilitat a través del model de membrana intestinal gràcies a la seua encapsulació. Finalment, el microdispositiu carregat amb cinamaldèhid s'ha validat in vivo ratificant la disminució de la permeabilitat del compost i la seua major permanència al lumen intestinal. Així, la present tesi doctoral ha demostrat la possibilitat d'emprar biomolècules senzilles de grau alimentari com portes moleculars sobre diversos materials de sílice. Aquests nous sistemes han permès protegir i alliberar controladament diferents nutracèutics, millorant així la seua biodisponibilitat. / [EN] This PhD thesis, entitled "Smart microdevices for nutraceutical-delivery", is focused on the design and evaluation of organic-inorganic hybrid systems for the protection and controlled release of bioactive molecules. These systems are based on (i) silica materials, mainly mesoporous particles, as inorganic support to store and protect the bioactive cargo; and (ii) an outer layer of biomolecules that regulate the payload release triggered by certain stimuli. In the first chapter of the thesis oleic acid is described as a molecular gate. This chapter is subdivided into three different articles, with different objectives. In the first article, oleic acid is used for the first time as molecular gate of a mesoporous support, loaded with the rhodamine B model molecule. The designed material is capable of protecting the cargo under the conditions present in the mouth and stomach, and inducing its release in the small intestine with the surfactant action of bile salts. The system has been used for the release of vitamin B2, thus demonstrating the validity of the design for the protection and controlled release of nutraceuticals. The second article evaluates the effectiveness of this molecular gate in different types of mesoporous silica particles, with different sizes and pore structures (MCM-41, MCM-48, SBA-15 and UVM-7). In all the systems studied, the molecular gate is capable of keeping cargo molecules protected and releasing them in the presence of bile salts. The solid based on the structure of UVM-7 was validated in vivo, observing a delay in the intestinal absorption of rhodamine thanks to its encapsulation. Lastly, the third article included in this chapter has studied the possibility of incorporating molecular gates onto phyllosilicates. The protection and controlled release of large biomolecules involved in human metabolism (vitamin B12 and hematin) have been achieved using phyllosilicates functionalized with oleic acid as molecular gate. The second chapter describes for the first time the use of the protein zein (corn prolamine) as a molecular gate. The presence of corn prolamine inhibits the release of encapsulated antimicrobial compounds (thymol, carvacrol and cinnamaldehyde) releasing them in the presence of the proteolytic enzymes excreted during bacterial growth. Among all the materials developed, the cinnamaldehyde-loaded system has shown greater inhibition of E. coli growth than the free compound. Finally, the third chapter studies the effectiveness of lactose as a molecular gate to protect essential oils and release them only under the conditions present in the intestine. Three different materials based on MCM-41 loaded with thymol, eugenol, and cinnamaldehyde, and functionalized with lactose to inhibit the release of the compounds have been prepared. The enzymatic action of the lactase secreted in the intestine is capable of hydrolyzing the molecular gate into the corresponding monosaccharides, thus releasing the cargo along the intestinal lumen. The designed microdevices have been validated in vitro with Caco-2 cells, where an increase in the cytotoxic capacity of cinnamaldehyde and a decrease in permeability through the intestinal membrane model have been observed thanks to its encapsulation. Finally, the cinnamaldehyde-loaded microdevice has been validated in vivo, confirming the decrease in the permeability of the compound and its greater permanence in the intestinal lumen. Thus, the present PhD thesis has demonstrated the possibility of using simple food-grade biomolecules as gatekeepers on various silica materials. These new systems have allowed the protection and controlled release of different nutraceuticals, thus improving their bioavailability. / The authors also thank the Electron Microscopy Service at the UPV for support. The authors also thank Prof. Pedro Amorós for his explanations and guidance on the knowledge of phyllosilicates. / Poyatos Racionero, E. (2020). Smart microdevices for nutraceutical-controlled delivery [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/159247 / TESIS