A epigenética é considerada como a interface entre os componentes genéticos, o ambiente externo e o estilo de vida. Estudos recentes sugerem uma relação entre o processo de envelhecimento cerebral e o desequilíbrio de mecanismos epigenéticos, contudo, estes dados ainda não são conclusivos. Ainda, tem sido demonstrado que o exercício físico parece alterar marcadores epigenéticos em hipocampo de ratos adultos jovens. Sabe-se que o grau de neuroplasticidade varia com a idade e que as estruturas encefálicas podem responder diferentemente à exposição ao exercício. Assim, este trabalho teve como objetivo central investigar o impacto do exercício físico sobre parâmetros epigenéticos em hipocampo e estriado de ratos Wistar em diferentes fases do desenvolvimento. Na primeira etapa, avaliou-se os efeitos do processo de envelhecimento e do exercício físico sobre parâmetros de metilação, conteúdo das enzimas DNA metiltransferase 1 (DNMT1) e DNA metiltransferase 3b (DNMT3b) e níveis de metilação da histona H3-K9 em hipocampos de ratos Wistar adultos jovens (3 meses) e envelhecidos (20 meses). Os animais foram submetidos a diferentes protocolos de exercício físico: sessão única, que constituiu em corrida em esteira durante 20 minutos, ou treinamento crônico, caracterizado pela corrida em esteira por 20 minutos durante duas semanas. Ainda, no intuito de verificar os efeitos agudos e tardios do exercício, os animais foram decapitados 1 ou 18 horas após a sessão única ou o último treino do protocolo crônico. Observou-se um perfil de hipometilação global nos animais envelhecidos, uma vez que este grupo apresentou uma redução no conteúdo hipocampal da enzima DNMT1 e nos níveis de metilação da histona H3-K9. A sessão única de exercício reduziu agudamente o conteúdo hipocampal das enzimas DNMT1 e DNMT3b no grupo adulto jovem, um indicativo de aumento da atividade transcricional e expressão gênica. No entanto, não afetou estes marcadores no grupo envelhecido. Além disto, a sessão única de exercício induziu uma redução nos níveis de metilação da histona H3-K9 no grupo adulto jovem, enquanto que, no grupo envelhecido induziu um aumento neste parâmetro em ambos os tempos testados. Ainda, o protocolo crônico reduziu de forma persistente este parâmetro no grupo adulto jovem, mas não alterou em ratos envelhecidos. Na segunda etapa, analisou-se o efeito destes mesmos protocolos de exercício sobre a atividade global da enzima Histona Desacetilase (HDAC) em estriado de ratos Wistar em diferentes fases do desenvolvimento, adolescentes (25 dias), adultos jovens (3 meses) e envelhecidos (20 meses). A sessão única de exercício induziu efeitos persistentes na atividade da HDAC nos adolescentes, visto que o grupo exercitado apresentou uma diminuição neste parâmetro em ambos os tempos testados, sugerindo um aumento nos níveis de acetilação de histonas e ativação da maquinaria transcricional. No entanto, o exercício não alterou a atividade desta enzima nos demais grupos, ratos adultos jovens e envelhecidos. Estes resultados sugerem que o exercício físico moderado de corrida em esteira é capaz de induzir mudanças epigenéticas em encéfalo de ratos, o que pode alterar a atividade transcricional, e assim, modular a expressão de genes específicos envolvidos com a função cerebral. Além disso, demonstramos que a modulação epigenética em resposta ao exercício ocorre de forma protocolo e idade-dependentes. / Epigenetics is considered as the interface between the genetic components, the external environment and lifestyle. Recent studies suggest a relationship between the brain aging process and the imbalance of epigenetic mechanisms, however, these data are not conclusive. Moreover, it has been shown that exercise seems to alter epigenetic markers in the hippocampus of adult rats. It is known that the neuroplasticity degree varies with age and that the brain structures may respond differently to exercise exposure. Therefore, this work was mainly aimed to investigate the impact of physical exercise on epigenetic parameters in the hippocampus and striatum of rats at different stages of development. In the first moment, we evaluated the effects of the aging and exercise on methylation parameters, DNA methyltransferase 1 (DNMT1) and DNA methyltransferase 3b (DNMT3b) content and histone H3-K9 methylation levels in hippocampi from young adult (3 months) and aged (20 months) Wistar rats. The animals were subjected to different exercise protocols: a single session, which consisted in running on a treadmill for 20 minutes, or chronic training, characterized by running on a treadmill for 20 minutes during two weeks. Moreover, in order to examine the acute and delayed effects of exercise, the animals were decapitated 1 or 18 hours after the single session or the last training session of chronic protocol. It was observed a global hipomethylation profile in the aged animals, since this group showed a reduction on hippocampal DNMT1 enzyme content and on histone H3-K9 methylation levels. The single exercise session acutely reduced hippocampal content of DNMT1 and DNMT3b enzymes in the young adult group, an indicative of increased transcriptional activity and gene expression. However, did not affect these markers in the aged group. Furthermore, the single exercise session induced a reduction on histone H3-K9 methylation levels in the young adult group, while in the aged group, increased this parameter in both tested times. Moreover, the chronic protocol also reduced persistently this parameter in the young adult group, but did not alter in the aged rats. In the second moment, it was analyzed the effect of these same exercise protocols on the global enzyme Histone Deacetylase (HDAC) activity in the striatum of Wistar rats at different stages of development, adolescents (25 days), young adult (3 months) and aged (20 months). The single exercise session induced persistent effects on HDAC activity in the adolescents, given that the exercised group showed a decrease in this parameter in both time points evaluated, suggesting increased levels of histone acetylation and transcriptional machinery activation. However, the exercise did not alter this enzyme activity in the other groups, young adult and aged rats. These results suggest that moderate exercise treadmill running it is able to induce epigenetic changes in rat brain, which might alter the transcriptional activity, and thus might modulate the expression of specific genes involved with the brain function. Furthermore, we demonstrated that epigenetic modulation in response to exercise occurs in a protocol and age-dependent manner.

Os mecanismos fisiopatológicos exatos, responsáveis pelas manifestações clínicas das doenças em que altas concentrações de ácido etilmalônico (EMA) têm sido observadas como a deficiência da atividade das acil-CoA de cadeia curta (SCADD) e a encefalopatia etilmalônica (EE), permanecem ainda desconhecidos. Dessa forma, no presente trabalho, investigamos os efeitos ex vivo da administração intraestriatal de EMA sobre importantes parâmetros do metabolismo energético em estriado de ratos jovens, incluindo a produção de 14CO2 a partir de glicose, as atividades dos complexos I-IV da cadeia respiratória (fosforilação oxidativa), da enzima creatina quinase (CK) (transferência intracelular de ATP) e a atividade da Na+K+-ATPase (NaK) sináptica (neurotransmissão). Avaliamos também o efeito da injeção intraestriatal de EMA sobre os níveis de glutationa reduzida (GSH), uma importante defesa antioxidante cerebral. O EMA reduziu significativamente a produção de 14CO2 a partir de glicose 2 e 24 horas após a injeção intraestriatal, sugerindo que esse metabólito compromete a atividade da via glicolítica e/ou ciclo do ácido cítrico. Além disso, o EMA diminuiu as atividades dos complexos II e II-III da cadeia respiratória apenas 24 horas após sua administração, bem como, a atividade da NaK de membrana sináptica em ambos os tempos. O EMA também diminuiu os níveis de GSH. O pré tratamento de ratos com Nacetilcisteína por 3 dias preveniu a redução nos níveis de GSH, causado pelo EMA, sem modificar a inibição da atividade da NaK. Considerando a importância da via glicolítica, do ciclo do ácido cítrico e do transporte de elétrons através da cadeia respiratória para a transformação de energia e da NaK para a manutenção do potencial de membrana da célula, os dados apresentados indicam que o EMA altera a homeostase energética cerebral e a neurotransmissão. Presume-se que esses mecanismos possam estar envolvidos no dano neuronal encontrado nos pacientes afetados pela SCADD e pela EE. / The pathophysiological mechanism responsible for the clinical manifestations of the diseases in which high concentrations of ethylmalonic acid (EMA) have been observed as short acyl-CoA dehydrogenase deficiency activity (SCADD) and ethylmalonic encephalopathy (EE) are unknown. Therefore, in the present work we investigated the in vivo effects of administration of EMA (2 and 24 hours), on important parameters of energy metabolism in rat cerebral striatum, including 14CO2 production from glucose, enzyme activities of the respiratory chain complexes I-IV (oxidative phosphorylation), creatine kinase (CK) (intracellular ATP transfer), and synaptic Na+K+-ATPase (NaK) (neurotransmission). We also tested the effect of EMA on reduced glutathione (GSH) levels, an important non-enzymatic antioxidant defense. EMA significantly reduced 14CO2 production from glucose 2 and 24 hours after its administration, implying that this compound compromises the citric acid cycle activity. Furthermore, EMA diminished the activities of complex II and II-III of the respiratory chain only 24 hours after administration and synaptic membrane NaK activity in both times. EMA also decreased the levels of GSH. Pretreatment of rats with N-acetylcysteine for 3 days prevented the reduction of GSH levels caused by EMA, without modifying the inhibition of NaK activity. Considering the importance of the citric acid cycle and the glycolytic pathway, the electron flow through the respiratory chain for brain energy transformation and the NaK for the maintenance of the cell membrane potential, the present data indicate that EMA potentially impairs mitochondrial brain energy homeostasis and neurotransmission. We presumed that these pathomecanisms are involved in the neurological damage found in patients affected by SCADD and EE.

As acidúrias D-2-hidroxiglutárica (D-2-HGA) e L-2-hidroxiglutárica (L-2-HGA) são doenças neurometabólicas hereditárias causadas pelas deficiências das atividades da D-2-hidroxiglutarato desidrogenase (D-2-HGA do tipo I) ou isocitrato desidrogenase 2 (D-2-HGA do tipo II) e L-2-hidroxiglutarato desidrogenase (L-2-HGA). Os pacientes afetados por essas doenças desenvolvem principalmente sintomas e sinais neurológicos como convulsões, coma e atrofia cerebral. As lesões cerebrais ocorrem majoritariamente nos gânglios da base (D-2-HGA e L-2-HGA) e no cerebelo (L-2-HGA). Bioquimicamente, a D-2-HGA e a L-2-HGA são caracterizadas pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária dos ácidos D-2-hidroxiglutárico (D-2-HG) e L-2-hidróxiglutárico (D-2-HG), respectivamente. Tendo em vista que a fisiopatologia da disfunção cerebral encontrada nestes pacientes ainda é pouco conhecida, o presente trabalho investigou os efeitos da administração intracerebral in vivo em ratos jovens dos ácidos D-2-HG e L-2-HG sobre parâmetros de estresse oxidativo e sobre a histopatologia das principais estruturas afetadas nos pacientes com D-2-HGA (estriado) ou L-2-HGA (estriado e cerebelo). Inicialmente, avaliamos o efeito dos ácidos D-2-HG e L-2-HG sobre os níveis de malondialdeído (MDA) e sobre a formação de carbonilas em estriado e cerebelo. Verificamos que ambos os ácidos orgânicos aumentaram significativamente os níveis de MDA (dano oxidativo lipídico) no estriado (D-2-HG e L-2-HG) e no cerebelo (L-2-HG). Por outro lado, apenas o D-2-HG foi capaz de aumentar a formação de carbonilas (dano oxidativo proteico) no estriado. Além disso, o D-2-HG diminuiu as concentrações de glutationa reduzida (GSH) e as atividades enzimáticas da glutationa peroxidase (GPx) e da superóxido dismutase (SOD), além de aumentar as concentrações de glutationa oxidada (GSSG) no estriado. Já o L-2-HG foi capaz de diminuir as concentrações de GSH e de gutationa total (tGS), bem como a atividade da GPx e da glutationa redutase (GR). Por fim, o L-2-HG aumentou as concentrações de GSSG no estriado e no cerebelo. Também investigamos o efeito da administração intracerebral in vivo do D-2-HG e do L-2-HG sobre a oxidação de diclorofluorosceína (DCFH), produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) e sobre o conteúdo de nitratos e nitritos, com o objetivo de verificar quais as principais espécies reativas envolvidas nos danos induzidos por estes ácidos orgânicos. O D-2-HG aumentou os níveis de nitratos e nitritos, mas não foi capaz de alterar a oxidação de DCFH e a produção de H2O2, indicando o envolvimento de espécies reativas de nitrogênio (ERN) nesses efeitos. Já o L-2-HG aumentou a oxidação de DCFH e a produção de H2O2, não alterando o conteúdo de nitratos e nitritos. Tais resultados sugerem que o L-2-HG provavelmente induz as alterações observadas através do aumento na geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Também demonstramos que os antioxidantes melatonina, creatina, ácido ascórbico mais α-tocoferol (Vit C + E), N-acetilcisteína (NAC), maleato de dizocilpina (MK-801) e Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) foram capazes de prevenir o dano oxidativo lipídico e a diminuição das defesas antioxidantes induzidos pelo D-2-HG e pelo L-2-HG. Melatonina, creatina e a solução de Vit C + E preveniram vários efeitos induzidos pelo L-2-HG, enquanto o MK-801 e o L-NAME foram capazes de prevenir apenas os efeitos induzidos pelo D-2-HG e o NAC não preveniu os efeitos induzidos pelos dois ácidos orgânicos. Observamos ainda que os ácidos 3-metilglutacônico (3-MGT; estruturalmente similar ao D-2-HG) e L-2-hidróxi-3-metilvalérico (L-HMV; estruturalmente similar ao L-2-HG), não foram capazes de alterar esses parâmetros, sugerindo uma ação seletiva para as atividades pro-oxidantes induzidas pelos D-2-HG e L-2-HG. Finalmente, estudos histológicos mostraram que o D-2-HG e L-2-HG são capazes de alterar a morfologia tecidual no estriado (D-2-HG e L-2-HG) e no cerebelo (L-2-HG). O D-2-HG causou vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico no estriado. Já o L-2-HG, além de causar vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico, também induziu necrose, formação de corpos granulares eosinofílicos e astrogliose (aumento da proteína ácida fibrilar glial). Também observamos em ratos injetados com L-2-HG perda da população neuronal (diminuição da imunodetecção da proteína neuronal nuclear específica) no estriado, enquanto que no cerebelo o L-2-HG induziu vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico. Concluindo, este trabalho foi o primeiro a demonstrar efeitos in vivo do D-2-HG e do L-2-HG (administração intracerebral) sobre parâmetros de estresse oxidativo e alterações histopatológicas em cérebro de ratos jovens. Presumimos que o comprometimento da homeostase redox possa estar associado às alterações histopatológicas observadas, podendo contribuir pelo menos em parte, para a neuropatologia encontrada nos pacientes afetados pela D-2-HGA e pela L-2-HGA. / D-2-hydroxyglutaric aciduria (D-2-HGA) and L-2-Hydroxyglutaric aciduria (L-2-HGA) are inherited neurometabolic disorders caused by enzymatic defects in D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (D-2-HGA type I) or isocitrate dehydrogenase 2 (D-2-HGA type II) and L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (L-2-HGA), respectively. Patients affected by these disorders develop severe neurological damage, which leads to seizures, coma and cerebral atrophy. Brain lesions occur mainly in the basal ganglia (D-2-HGA and L-2-HGA) and in cerebellum (L-2-HGA) Biochemically, D-2-HGA and L-2-HGA are characterized by tissue accumulation and high urinary excretion of D-2-hydroxyglutaric acid (D-2-HG) and L-2-hydroxyglutaric acid (L-2-HG), respectively. Since the pathophysiology of the tissue damage in these diseases is still poorly unknown, the present study investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG in adolescent rats on important parameters of oxidative stress and on the histopathology of the principal cerebral structures damaged in patients with D-2-HGA (striatum) and L-2-HGA (striatum and cerebellum). Initially, we investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on malondialdehyde (MDA) levels and carbonyl formation in striatum and cerebellum. We verified that both organic acids significantly elevated MDA levels (lipid oxidative damage) in striatum (D-2-HG and L-2-HG) and cerebellum (L-2-HG), whereas only D-2-HG was able to elevate carbonyl formation (protein oxidative damage) in striatum. Furthermore, D-2-HG and L-2-HG significantly diminished reduced glutathione (GSH) concentrations, glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD) activities, besides increasing oxidized glutathione (GSSG) concentrations in striatum. Otherwise, L-2-HG reduced GSH, total glutathione (tGS) concentrations and the activities of GPx and reductase glutathione (GR). Finally, L-2-HG augmented GSSG concentrations in striatum and cerebellum. In the next step of this work, we investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on 2’,7’-diclorofluorescein oxidation (DCFH), hydrogen peroxide production (H2O2) and nitrate and nitrite content in order to elucidate the main reactive species involved in the oxidative damage induced by these organic acids. D-2-HG elevated nitrate and nitrite content, whereas it did not change DCFH oxidation and H2O2 production, suggesting the involvement of reactive nitrogen species (RNS) in these effects. On the other hand, L-2-HG injection increased DCFH oxidation and H2O2 production, but did not change nitrate and nitrite content. These results suggest that L-2-HG-induced alterations occur by an elevated generation of reactive oxygen species (ROS). We also demonstrated that antioxidants such as melatonin, creatine, a mixture of ascorbic acid plus α-tocopherol (Vit C + E), N-acethylcysteine (NAC), dizocilpine maleate (MK-801) and Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) were able to prevent D-2-HG- and L-2-HG-induced lipid oxidative damage and the reduction of the antioxidant defenses induced by D-2-HG and L-2HG. Melatonin, creatine and Vit C + E prevented some of the effects induced by L-2-HG, whereas MK-801 and L-NAME were only able to prevent the D-2-HG-elicited effects and NAC did not prevent D-2-HG and L-2-HG-induced alterations. We also observed that 3-methylglutaconic (3-MGT, structurally similar to D-2-HG) and L-2-hydroxy-3-methylvaleric (L-HMV, structurally similar to L-2-HG) acids were not able to change these parameters, suggesting a selective effect on the pro-oxidant activities induced by D-2-HG- and L-2-HG. Finally, histological studies demonstrated that D-2-HG and L-2-HG were able to cause histopathological alterations in the striatum (D-2-HG and L-2-HG) and cerebellum (L-2-HG). D-2-HG provoked vacuolation, lymphocytic and macrophage infiltration in the striatum. Furthermore, L-2-HG induced vacuolation, lymphocytic and macrophage infiltration, necrosis, granular eosinophilic bodies, astrogliosis (glial fibrillary acidic protein (elevated glial fibrillary acidic protein immunostaining) and neuronal loss (decreased neuron-specific nuclear protein (NeuN) immunostaining) in striatum. On the other hand, L-2-HG provoked only vacuolation and lymphocytic and macrophage infiltration in the cerebellum. To the best of our knowledge this is the first report that demonstrates the influence of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on oxidative stress parameters and histopathological alterations in brain of adolescent rats. We presumed that the disturbance of cell redox homeostasis was probably associated with the histopathological abnormalities observed, that possibly contribute at least in part to the neuropathology of the brain injury of patients affected by D-2-HGA and L-2-HGA.

O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é associado ao comprometimento cognitivo, sendo capaz de induzir morte neuronal, de alterar o número e a morfologia das células astrocitárias, de aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BBB) e de promover dano neurovascular. O exercício físico, por outro lado, possui efeitos benéficos sobre o sistema nervoso central (SNC), induzindo plasticidade e melhorando o processo de aprendizagem, de memória e a atividade locomotora. Em nosso primeiro estudo, investigamos os efeitos de cinco semanas de exercício aeróbico sobre a prevenção ou reversão do déficit de memória espacial produzido pelo diabetes, e sobre alterações bioquímicas e imuno-histoquímicas de astrócitos no hipocampo, em ratos machos Wistar com DM1 induzido por estreptozotocina. Foram utilizados quatro grupos: controle não treinado (NTC); controle treinado (TC); diabético não treinado (NTD); e diabético treinado (TD). Neste estudo demonstramos que o exercício reverteu o dano na memória espacial causado pelo DM1, aumentou os níveis de glutationa (GSH) e de glutamina sintetase (GS) nos animais TC, mas não no grupo TD; aumentou a densidade de astrócitos GFAP positivos nos grupos TC e TD, e promoveu ramificação astrocitária no grupo TD. Não observamos nenhuma alteração na captação de glicose e de glutamato entre todos os grupos. No segundo estudo, com os mesmos grupos experimentais, avaliamos os efeitos do exercício sobre a memória de reconhecimento do novo objeto, sobre o comportamento motor no rotarod, e sobre a expressão das proteínas claudina-5 e aquaporina-4 (AQP4), proteínas associadas à integridade da BBB, no hipocampo e no estriado de animais diabéticos. Observamos que o exercício melhorou a memória não espacial e a habilidade motora nos animas TC e TD. O diabetes produziu uma diminuição da expressão da claudina-5 no hipocampo e no estriado, e reduziu os níveis de AQP4 hipocampal. O exercício preservou os níveis de claudina-5 no estriado dos animais TD, mas não no hipocampo, e não alterou os níveis reduzidos de AQP4 hipocampal produzidos pelo diabetes. Nossos resultados indicam que o exercício físico reverte o déficit de memória espacial induzido pelo DM1, melhora a memória de reconhecimento do novo objeto, e a atividade motora, induz importantes alterações morfológicas nas células astrocitárias, e afeta importantes componentes da BBB no estriado. Nossos dados contribuem para a compreensão dos benefícios comportamentais, motores, histofisiológicos e neuroquímicos do exercício físico no DM1. / Type 1 diabetes mellitus (T1DM) affects cognitive domains, induces neuronal death, changes in the number and in morphology of astrocytes, increases blood brain barrier (BBB) permeability and promotes neurovascular impairment. Physical exercise, on the other hand, has beneficial effects on brain functions, inducing brain plasticity and improving learning, memory and locomotor activity. In our first study, we investigated the effects of five weeks of aerobic exercise to prevent or reverse spatial memory deficits produced by diabetes and some biochemical and immunohistochemical changes in hippocampal astrocytes of streptozotocin-induced T1DM in male Wistar rats. The rats were divided in four groups: trained control (TC), non-trained control (NTC), trained diabetic (TD) and non-trained diabetic (NTD). In this study, we demonstrated that exercise reversed spatial memory impairments generated by T1DM, increased glutathione (GSH) and glutamine synthetase (GS) levels in TC animals, but not in TD rats; increased the density of GFAP immunoreactive astrocyte in TC and TD groups, and increased astrocyte ramification in TD group. Glucose and glutamate uptake were not affected. In the second study, using the same experimental groups, we evaluated the effects of exercise on novel object recognition task, on motor behavior in rotarod test, and on the expression of proteins related to BBB integrity, such as claudin-5 and aquaporin-4 (AQP4) in the hippocampus and striatum in diabetic rats. We showed that exercise enhanced the non-spatial memory performance and rotarod ability in the TC and TD animals. Diabetes produced a decrease in claudin-5 expression in the hippocampus and striatum and reduced AQP4 in the hippocampus. Physical exercise preserved the claudin-5 content in the striatum of TD rats, but not in the hippocampus, and the reduction of AQP4 levels produced by diabetes was not reversed by exercise. Our findings indicate that physical exercise reverses the cognitive deficits present in T1DM, improves novel object recognition task retention, enhances motor performance, induces important morphological astrocytic changes, and affects important structural components of the striatal BBB. Our date could enhance the knowledge regarding the behavioral, locomotor, histophysiological and neurochemical benefits of exercise in diabetes.

A hemorragia intracerebral (HIC) é uma das principais causas de mortalidade em todo mundo, desencadeando eventos adversos e déficits neurológicos graves. A partir disso, essa tese teve como objetivo avaliar as respostas celulares e suas interações envolvidas na HIC e investigar os possíveis mecanismos que contribuem para os déficits sensório-motores relacionados, principalmente, à habilidade dos membros anteriores dos animais. Para isso foram realizados dois experimentos. Em ambos os animais de 90 dias foram submetidos à HIC induzida por colagenase no estriado dorsolateral. No primeiro experimento, após 24h, 72h e 7 dias os animais foram avaliados funcionalmente, e histologicamente quanto ao volume da lesão. Ainda, durante 6h, 24h, 72h e 7 dias, o estriado e o córtex foram avaliados quanto ao número de células neuronais, gliais, e em apoptose; a expressão de GFAP e S100B, no estriado e no córtex, a secreção de S100B, no soro e líquido cérebro-espinhal (LCE). A HIC provocou déficits sensório-motores e perda tecidual; induziu morte neuronal e gliose reativa no estriado. O córtex obteve uma resposta astrocitária similar, mas quanto à microglia houve um aumento apenas em 6h. A S100B correlacionou-se positivamente com o número de células gliais; e negativamente com a força e função dos membros anteriores dos animais lesados. No segundo experimento, foram avaliados o estado oxidativo, o nível de TNF-α, a atividade da glutamina sintetase (GS) e a captação de glutamato nos tempos de 6h, 24h, 72h e 7 dias pós-lesão. Após 6h da HIC houve aumento no nível de TNF-α e excitotoxicidade glutamatérgica; entretanto, a função de clearence astrocitário foi restabelecida 7 dias após o dano. A HIC gerou estresse oxidativo e aumento de antioxidantes endógenos, além disso, as espécies reativas de oxigênio (ERO) inibiram a atividade da GS em 24h e 7 dias após a lesão. A partir dos resultados obtidos, podemos concluir que a S100B atua na lesão hemorrágica produzindo respostas distintas, região dependente, contribuindo para o aumento das células gliais no estriado e córtex, correlacionando-se positivamente com os déficits funcionais. Este é o primeiro relato descrevendo a relação da S100B com as alterações celulares e funcionais durante a progressão da HIC experimental. Além disso, os mecanismos envolvidos na HIC demonstraram padrões e respostas envolvendo excitotoxicidade glutamatérgica e inflamação, que colaboraram para o dano oxidativo; em resposta ao estresse houve o aumento de antioxidantes endógenos que podem ter contribuído para o reestabelecimento da função astrocitária. / Intracerebral haemorrhage (ICH) is a major cause of mortality worldwide, triggering adverse events and serious neurological deficits. From this standpoint, this thesis aimed to evaluate the cellular responses and interactions involved in ICH and investigate the possible mechanisms that contribute to sensory-motor deficits, mainly related to the ability of the forelimbs of animals. For this, two experiments were conducted. In both, animals of 90 days of age were subjected to ICH induced by collagenase in dorsolateral striatum. In the first experiment, after 24h, 72h and 7 days, the animals were evaluated functionally, and histologically about the lesion volume. Also, at 6h, 24h, 72h and 7 days, the striatum and the cortex was evaluated as the number of neuronal, glial and apoptotic cells; the expression of GFAP and S100B, the striatum and cortex, S100B secretion in serum and cerebrospinal fluid (CSF). ICH caused sensorimotor deficits and tissue loss; induced neuronal death and reactive gliosis in the striatum. The cortex astrocyte obtained a similar response, but about the microglia there was an increase only at 6h. S100B was positively correlated with the number of glial cells; and negatively correlated with the strength and function of the forelimbs of injured animals. In the second experiment, were evaluated the oxidative state, the level of TNF-α, the activity of glutamine synthetase (GS) and glutamate uptake at 6h, 24h, 72h and 7 days post-injury. After 6h from ICH, there was an increase in TNF-α levels and glutamatergic excitotoxicity; however, the astrocyte clearance function was established 7 days after the damage. HIC generated oxidative stress and increase of endogenous antioxidants, in addition, reactive oxygen species (ROS) inhibited the activity of GS in 24h and 7 days after injury. Based on the results obtained, we can conclude that S100B acts in hemorrhagic lesions producing different responses, region-dependent, contributing to the increase in glial cells in the striatum and cortex, correlating positively with functional deficits. This is the first report describing the relation of S100B with cellular and functional changes during the progression of experimental ICH. Furthermore, the mechanisms involved in ICH displayed patterns and responses involving glutamatergic excitotoxicity and inflammation, that contributed to oxidative damage; in response to stress there was an increase of endogenous antioxidants which may have contributed to the re-establishment of astrocyte function.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Objetivos: Embora compreenda a mais prevalente desordem do movimento, a fisiopatologia do tremor essencial (TE) e ainda controversa. Conforme a hipotese mais aceita, trata-se de um tremor central causado por uma disfuncao do complexo olivar inferior, provavelmente secundario a uma hipofuncao do sistema GABAergico. Vilela Filho et al (2001), por outro lado, relataram o caso de uma paciente com TE da mao direita que foi completamente eliminado apos uma isquemia restrita ao putamen posterior contralateral e sugeriram que o TE poderia representar a manifestacao clinica da hiperatividade do putamen posterior. O presente estudo foi realizado para testar essa hipotese no mais frequentemente usado modelo animal de TE, o tremor induzido pela harmalina em ratos e, empregando-se o mapeamento fisiologico por estimulacao, melhor determinar a organizacao somatotopica do striatum no rato. Metodos: 54 ratos Wistar machos (peso=250-350g) foram aleatoriamente distribuidos em tres grupos: experimental-GE (n=26), controle cirurgico-GCC (n=18) e controle farmacologico-GCF (n=10). Animais do GE foram submetidos a estriatotomia posterior estereotaxica unilateral (coordenadas: 1.8mm posterior/4.6mm lateral/5.85mm inferior; eletrodo: 0.35mm em diametro externo e 1.0mm de ponta exposta; parametros da lesao eletrolitica: 5.0mA/6o/60Hz) apos estimulacao eletrica do alvo (parametros: 0.2, 0.5, 1.0 e 2.0mA/monopolar/6o/60Hz). Nos animais do GCC, o eletrodo foi introduzido no alvo e retirado, sem se proceder a estimulacao ou lesao. Animais do GCF serviram apenas como controles para os efeitos da harmalina, nao tendo sido operados. Todos os animais (7o dia pos-operatorio naqueles operados) receberam harmalina intraperitonial (20mg/kg/ml), tendo sido o tremor induzido filmado 45 e 110 minutos apos sua administracao. A intensidade do tremor apendicular foi avaliada, independentemente, por um observador ocegoo, enquanto a dos tremores axiais, bem como a latencia e duracao de todos os tremores, pelos pesquisadores. Apos o teste da harmalina, os animais do GE e GCC foram sacrificados e seus cerebros enviados para o exame histopatologico. Resultados: Conforme criterios estabelecidos, 13 animais foram excluidos do estudo. O tremor apendicular mostrou-se reduzido ipsolateralmente a cirurgia em 20/21 animais do GE e em 2/9 do GCC e assimetrico em 1/10 do GCF; tais diferencas foram estatisticamente significantes entre GE e GCC e GE e GCF, mas nao entre GCC e GCF. Curiosamente, a latencia e duracao dos tremores axiais foram menores no GCF que no GE e GCC. A percentagem de reducao media do tremor apendicular foi 43.70%±14.22, tendo sido maior nas patas anteriores que posteriores e apos a estriatotomia posterior direita que esquerda. Lesoes estriatais laterais proporcionaram melhores resultados que as mediais. Conclusoes: Esses resultados sao sugestivos de uma provavel participacao do striatum posterior no tremor induzido pela harmalina em ratos e reforcam a hipotese determinante da realizacao do presente estudo. Os resultados derivados do mapeamento fisiologico estriatal por estimulacao e da resposta do tremor a cirurgia, por sua vez, sugerem a seguinte organizacao somatotopica no striatum dorsal do rato: patas dianteiras (muito provavelmente superpostas), posteriores e ventrais; tronco e cauda, anteriores; e patas traseiras, em posicao intermediaria entre as duas anteriores, anterior e dorsalmente as patas dianteiras, situando-se a contralateral posteriormente a ipsolateral / Purposes: Although the most prevalent movement disorder, the pathophysiology of essential tremor (ET) remains controversial. The most accepted hypothesis is that it is a central tremor caused by a dysfunction of the inferior olivary complex, probably secondary to GABAergic system malfunctioning. Evidence for the involvement of the basal ganglia had never been presented. Vilela Filho et al (2001), though, reported a case of a patient with unilateral hand ET which was completely relieved after a stroke restricted to the contralateral posterior putamen and suggested that ET could be the clinical manifestation of posterior putamen hyperactivity. The present study was designed to evaluate this hypothesis in the most used model of ET, harmaline-induced tremor in rats, and, by stimulation mapping, to better determine the somatotopic organization of the rat striatum. Methods: 54 male Wistar rats, 250-350g, were randomly distributed in three groups: experimental-EG (n=26), surgical control-SCG (n=18), and pharmacological control-PCG (n=10) groups. EG animals underwent stereotactic unilateral posterior striatotomy (coordinates: 1.8 posterior/4.6 lateral/5.85mm inferior; electrode: 0.35mm in external diameter and 1.0mm exposed tip; electrolytic lesion parameters: 0.5mA/6”/60Hz) after target stimulation (parameters: 0.2, 0.5, 1.0, and 2.0mA/monopolar/6”/60Hz). SCG rats underwent electrode placement at the target and withdrawn without stimulation or lesioning (sham lesion). PCG served exclusively as controls for harmaline effects. All animals received (7th postoperative day in those of EG and SCG) IP harmaline (20mg/kg/ml) and the induced-tremor was video recorded 45` and 110` after the injection. Limb tremor intensity was independently evaluated by a blind observer, while axial tremors intensity, as well as latency and duration of both limb and axial tremors, were evaluated by the researchers. Animals of EG and SCG were killed after harmaline test and their brains sent to histopathology. Results: Obeying predetermined criteria, 13 animals were excluded from the study. Limb tremor was reduced ipsolaterally to the operation in 20/21 rats of EG and in 2/9 of SCG, and was asymmetric in 1/10 of PCG. Comparisons between EG x SCG and EG x PCG were statistically significant, but not between SCG x PCG. None of the rats presented tremor reduction contralateral to the operation. Curiously, latency and duration of axial tremors, but not of limb tremor, were lesser in PCG than in EG and SCG. The mean percentage of limb tremor reduction in animals of EG was 43.7%±14.22, being greater in anterior than in posterior paws, and after right than left striatotomy. Lateral lesions yielded better results than medial lesions. Conclusions: These results suggest that the posterior striatum is possibly involved with harmaline-induced tremor in rats and give support to our hypothesis, according to which hyperactivity of the posterior putamen may play a role in the genesis of ET. Data provided by stimulation mapping and tremor response to operation suggest the following somatotopic organization in the rat dorsal striatum: forepaws (probably overlapped), caudal and ventral; trunk and tail, rostral; and hind paws, in an intermediary position, dorsal and rostral to the forepaws, being the contralateral one caudal to the ipsolateral. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

As acidúrias D-2-hidroxiglutárica (D-2-HGA) e L-2-hidroxiglutárica (L-2-HGA) são doenças neurometabólicas hereditárias causadas pelas deficiências das atividades da D-2-hidroxiglutarato desidrogenase (D-2-HGA do tipo I) ou isocitrato desidrogenase 2 (D-2-HGA do tipo II) e L-2-hidroxiglutarato desidrogenase (L-2-HGA). Os pacientes afetados por essas doenças desenvolvem principalmente sintomas e sinais neurológicos como convulsões, coma e atrofia cerebral. As lesões cerebrais ocorrem majoritariamente nos gânglios da base (D-2-HGA e L-2-HGA) e no cerebelo (L-2-HGA). Bioquimicamente, a D-2-HGA e a L-2-HGA são caracterizadas pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária dos ácidos D-2-hidroxiglutárico (D-2-HG) e L-2-hidróxiglutárico (D-2-HG), respectivamente. Tendo em vista que a fisiopatologia da disfunção cerebral encontrada nestes pacientes ainda é pouco conhecida, o presente trabalho investigou os efeitos da administração intracerebral in vivo em ratos jovens dos ácidos D-2-HG e L-2-HG sobre parâmetros de estresse oxidativo e sobre a histopatologia das principais estruturas afetadas nos pacientes com D-2-HGA (estriado) ou L-2-HGA (estriado e cerebelo). Inicialmente, avaliamos o efeito dos ácidos D-2-HG e L-2-HG sobre os níveis de malondialdeído (MDA) e sobre a formação de carbonilas em estriado e cerebelo. Verificamos que ambos os ácidos orgânicos aumentaram significativamente os níveis de MDA (dano oxidativo lipídico) no estriado (D-2-HG e L-2-HG) e no cerebelo (L-2-HG). Por outro lado, apenas o D-2-HG foi capaz de aumentar a formação de carbonilas (dano oxidativo proteico) no estriado. Além disso, o D-2-HG diminuiu as concentrações de glutationa reduzida (GSH) e as atividades enzimáticas da glutationa peroxidase (GPx) e da superóxido dismutase (SOD), além de aumentar as concentrações de glutationa oxidada (GSSG) no estriado. Já o L-2-HG foi capaz de diminuir as concentrações de GSH e de gutationa total (tGS), bem como a atividade da GPx e da glutationa redutase (GR). Por fim, o L-2-HG aumentou as concentrações de GSSG no estriado e no cerebelo. Também investigamos o efeito da administração intracerebral in vivo do D-2-HG e do L-2-HG sobre a oxidação de diclorofluorosceína (DCFH), produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) e sobre o conteúdo de nitratos e nitritos, com o objetivo de verificar quais as principais espécies reativas envolvidas nos danos induzidos por estes ácidos orgânicos. O D-2-HG aumentou os níveis de nitratos e nitritos, mas não foi capaz de alterar a oxidação de DCFH e a produção de H2O2, indicando o envolvimento de espécies reativas de nitrogênio (ERN) nesses efeitos. Já o L-2-HG aumentou a oxidação de DCFH e a produção de H2O2, não alterando o conteúdo de nitratos e nitritos. Tais resultados sugerem que o L-2-HG provavelmente induz as alterações observadas através do aumento na geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Também demonstramos que os antioxidantes melatonina, creatina, ácido ascórbico mais α-tocoferol (Vit C + E), N-acetilcisteína (NAC), maleato de dizocilpina (MK-801) e Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) foram capazes de prevenir o dano oxidativo lipídico e a diminuição das defesas antioxidantes induzidos pelo D-2-HG e pelo L-2-HG. Melatonina, creatina e a solução de Vit C + E preveniram vários efeitos induzidos pelo L-2-HG, enquanto o MK-801 e o L-NAME foram capazes de prevenir apenas os efeitos induzidos pelo D-2-HG e o NAC não preveniu os efeitos induzidos pelos dois ácidos orgânicos. Observamos ainda que os ácidos 3-metilglutacônico (3-MGT; estruturalmente similar ao D-2-HG) e L-2-hidróxi-3-metilvalérico (L-HMV; estruturalmente similar ao L-2-HG), não foram capazes de alterar esses parâmetros, sugerindo uma ação seletiva para as atividades pro-oxidantes induzidas pelos D-2-HG e L-2-HG. Finalmente, estudos histológicos mostraram que o D-2-HG e L-2-HG são capazes de alterar a morfologia tecidual no estriado (D-2-HG e L-2-HG) e no cerebelo (L-2-HG). O D-2-HG causou vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico no estriado. Já o L-2-HG, além de causar vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico, também induziu necrose, formação de corpos granulares eosinofílicos e astrogliose (aumento da proteína ácida fibrilar glial). Também observamos em ratos injetados com L-2-HG perda da população neuronal (diminuição da imunodetecção da proteína neuronal nuclear específica) no estriado, enquanto que no cerebelo o L-2-HG induziu vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico. Concluindo, este trabalho foi o primeiro a demonstrar efeitos in vivo do D-2-HG e do L-2-HG (administração intracerebral) sobre parâmetros de estresse oxidativo e alterações histopatológicas em cérebro de ratos jovens. Presumimos que o comprometimento da homeostase redox possa estar associado às alterações histopatológicas observadas, podendo contribuir pelo menos em parte, para a neuropatologia encontrada nos pacientes afetados pela D-2-HGA e pela L-2-HGA. / D-2-hydroxyglutaric aciduria (D-2-HGA) and L-2-Hydroxyglutaric aciduria (L-2-HGA) are inherited neurometabolic disorders caused by enzymatic defects in D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (D-2-HGA type I) or isocitrate dehydrogenase 2 (D-2-HGA type II) and L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (L-2-HGA), respectively. Patients affected by these disorders develop severe neurological damage, which leads to seizures, coma and cerebral atrophy. Brain lesions occur mainly in the basal ganglia (D-2-HGA and L-2-HGA) and in cerebellum (L-2-HGA) Biochemically, D-2-HGA and L-2-HGA are characterized by tissue accumulation and high urinary excretion of D-2-hydroxyglutaric acid (D-2-HG) and L-2-hydroxyglutaric acid (L-2-HG), respectively. Since the pathophysiology of the tissue damage in these diseases is still poorly unknown, the present study investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG in adolescent rats on important parameters of oxidative stress and on the histopathology of the principal cerebral structures damaged in patients with D-2-HGA (striatum) and L-2-HGA (striatum and cerebellum). Initially, we investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on malondialdehyde (MDA) levels and carbonyl formation in striatum and cerebellum. We verified that both organic acids significantly elevated MDA levels (lipid oxidative damage) in striatum (D-2-HG and L-2-HG) and cerebellum (L-2-HG), whereas only D-2-HG was able to elevate carbonyl formation (protein oxidative damage) in striatum. Furthermore, D-2-HG and L-2-HG significantly diminished reduced glutathione (GSH) concentrations, glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD) activities, besides increasing oxidized glutathione (GSSG) concentrations in striatum. Otherwise, L-2-HG reduced GSH, total glutathione (tGS) concentrations and the activities of GPx and reductase glutathione (GR). Finally, L-2-HG augmented GSSG concentrations in striatum and cerebellum. In the next step of this work, we investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on 2’,7’-diclorofluorescein oxidation (DCFH), hydrogen peroxide production (H2O2) and nitrate and nitrite content in order to elucidate the main reactive species involved in the oxidative damage induced by these organic acids. D-2-HG elevated nitrate and nitrite content, whereas it did not change DCFH oxidation and H2O2 production, suggesting the involvement of reactive nitrogen species (RNS) in these effects. On the other hand, L-2-HG injection increased DCFH oxidation and H2O2 production, but did not change nitrate and nitrite content. These results suggest that L-2-HG-induced alterations occur by an elevated generation of reactive oxygen species (ROS). We also demonstrated that antioxidants such as melatonin, creatine, a mixture of ascorbic acid plus α-tocopherol (Vit C + E), N-acethylcysteine (NAC), dizocilpine maleate (MK-801) and Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) were able to prevent D-2-HG- and L-2-HG-induced lipid oxidative damage and the reduction of the antioxidant defenses induced by D-2-HG and L-2HG. Melatonin, creatine and Vit C + E prevented some of the effects induced by L-2-HG, whereas MK-801 and L-NAME were only able to prevent the D-2-HG-elicited effects and NAC did not prevent D-2-HG and L-2-HG-induced alterations. We also observed that 3-methylglutaconic (3-MGT, structurally similar to D-2-HG) and L-2-hydroxy-3-methylvaleric (L-HMV, structurally similar to L-2-HG) acids were not able to change these parameters, suggesting a selective effect on the pro-oxidant activities induced by D-2-HG- and L-2-HG. Finally, histological studies demonstrated that D-2-HG and L-2-HG were able to cause histopathological alterations in the striatum (D-2-HG and L-2-HG) and cerebellum (L-2-HG). D-2-HG provoked vacuolation, lymphocytic and macrophage infiltration in the striatum. Furthermore, L-2-HG induced vacuolation, lymphocytic and macrophage infiltration, necrosis, granular eosinophilic bodies, astrogliosis (glial fibrillary acidic protein (elevated glial fibrillary acidic protein immunostaining) and neuronal loss (decreased neuron-specific nuclear protein (NeuN) immunostaining) in striatum. On the other hand, L-2-HG provoked only vacuolation and lymphocytic and macrophage infiltration in the cerebellum. To the best of our knowledge this is the first report that demonstrates the influence of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on oxidative stress parameters and histopathological alterations in brain of adolescent rats. We presumed that the disturbance of cell redox homeostasis was probably associated with the histopathological abnormalities observed, that possibly contribute at least in part to the neuropathology of the brain injury of patients affected by D-2-HGA and L-2-HGA.

O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é associado ao comprometimento cognitivo, sendo capaz de induzir morte neuronal, de alterar o número e a morfologia das células astrocitárias, de aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BBB) e de promover dano neurovascular. O exercício físico, por outro lado, possui efeitos benéficos sobre o sistema nervoso central (SNC), induzindo plasticidade e melhorando o processo de aprendizagem, de memória e a atividade locomotora. Em nosso primeiro estudo, investigamos os efeitos de cinco semanas de exercício aeróbico sobre a prevenção ou reversão do déficit de memória espacial produzido pelo diabetes, e sobre alterações bioquímicas e imuno-histoquímicas de astrócitos no hipocampo, em ratos machos Wistar com DM1 induzido por estreptozotocina. Foram utilizados quatro grupos: controle não treinado (NTC); controle treinado (TC); diabético não treinado (NTD); e diabético treinado (TD). Neste estudo demonstramos que o exercício reverteu o dano na memória espacial causado pelo DM1, aumentou os níveis de glutationa (GSH) e de glutamina sintetase (GS) nos animais TC, mas não no grupo TD; aumentou a densidade de astrócitos GFAP positivos nos grupos TC e TD, e promoveu ramificação astrocitária no grupo TD. Não observamos nenhuma alteração na captação de glicose e de glutamato entre todos os grupos. No segundo estudo, com os mesmos grupos experimentais, avaliamos os efeitos do exercício sobre a memória de reconhecimento do novo objeto, sobre o comportamento motor no rotarod, e sobre a expressão das proteínas claudina-5 e aquaporina-4 (AQP4), proteínas associadas à integridade da BBB, no hipocampo e no estriado de animais diabéticos. Observamos que o exercício melhorou a memória não espacial e a habilidade motora nos animas TC e TD. O diabetes produziu uma diminuição da expressão da claudina-5 no hipocampo e no estriado, e reduziu os níveis de AQP4 hipocampal. O exercício preservou os níveis de claudina-5 no estriado dos animais TD, mas não no hipocampo, e não alterou os níveis reduzidos de AQP4 hipocampal produzidos pelo diabetes. Nossos resultados indicam que o exercício físico reverte o déficit de memória espacial induzido pelo DM1, melhora a memória de reconhecimento do novo objeto, e a atividade motora, induz importantes alterações morfológicas nas células astrocitárias, e afeta importantes componentes da BBB no estriado. Nossos dados contribuem para a compreensão dos benefícios comportamentais, motores, histofisiológicos e neuroquímicos do exercício físico no DM1. / Type 1 diabetes mellitus (T1DM) affects cognitive domains, induces neuronal death, changes in the number and in morphology of astrocytes, increases blood brain barrier (BBB) permeability and promotes neurovascular impairment. Physical exercise, on the other hand, has beneficial effects on brain functions, inducing brain plasticity and improving learning, memory and locomotor activity. In our first study, we investigated the effects of five weeks of aerobic exercise to prevent or reverse spatial memory deficits produced by diabetes and some biochemical and immunohistochemical changes in hippocampal astrocytes of streptozotocin-induced T1DM in male Wistar rats. The rats were divided in four groups: trained control (TC), non-trained control (NTC), trained diabetic (TD) and non-trained diabetic (NTD). In this study, we demonstrated that exercise reversed spatial memory impairments generated by T1DM, increased glutathione (GSH) and glutamine synthetase (GS) levels in TC animals, but not in TD rats; increased the density of GFAP immunoreactive astrocyte in TC and TD groups, and increased astrocyte ramification in TD group. Glucose and glutamate uptake were not affected. In the second study, using the same experimental groups, we evaluated the effects of exercise on novel object recognition task, on motor behavior in rotarod test, and on the expression of proteins related to BBB integrity, such as claudin-5 and aquaporin-4 (AQP4) in the hippocampus and striatum in diabetic rats. We showed that exercise enhanced the non-spatial memory performance and rotarod ability in the TC and TD animals. Diabetes produced a decrease in claudin-5 expression in the hippocampus and striatum and reduced AQP4 in the hippocampus. Physical exercise preserved the claudin-5 content in the striatum of TD rats, but not in the hippocampus, and the reduction of AQP4 levels produced by diabetes was not reversed by exercise. Our findings indicate that physical exercise reverses the cognitive deficits present in T1DM, improves novel object recognition task retention, enhances motor performance, induces important morphological astrocytic changes, and affects important structural components of the striatal BBB. Our date could enhance the knowledge regarding the behavioral, locomotor, histophysiological and neurochemical benefits of exercise in diabetes.

A hemorragia intracerebral (HIC) é uma das principais causas de mortalidade em todo mundo, desencadeando eventos adversos e déficits neurológicos graves. A partir disso, essa tese teve como objetivo avaliar as respostas celulares e suas interações envolvidas na HIC e investigar os possíveis mecanismos que contribuem para os déficits sensório-motores relacionados, principalmente, à habilidade dos membros anteriores dos animais. Para isso foram realizados dois experimentos. Em ambos os animais de 90 dias foram submetidos à HIC induzida por colagenase no estriado dorsolateral. No primeiro experimento, após 24h, 72h e 7 dias os animais foram avaliados funcionalmente, e histologicamente quanto ao volume da lesão. Ainda, durante 6h, 24h, 72h e 7 dias, o estriado e o córtex foram avaliados quanto ao número de células neuronais, gliais, e em apoptose; a expressão de GFAP e S100B, no estriado e no córtex, a secreção de S100B, no soro e líquido cérebro-espinhal (LCE). A HIC provocou déficits sensório-motores e perda tecidual; induziu morte neuronal e gliose reativa no estriado. O córtex obteve uma resposta astrocitária similar, mas quanto à microglia houve um aumento apenas em 6h. A S100B correlacionou-se positivamente com o número de células gliais; e negativamente com a força e função dos membros anteriores dos animais lesados. No segundo experimento, foram avaliados o estado oxidativo, o nível de TNF-α, a atividade da glutamina sintetase (GS) e a captação de glutamato nos tempos de 6h, 24h, 72h e 7 dias pós-lesão. Após 6h da HIC houve aumento no nível de TNF-α e excitotoxicidade glutamatérgica; entretanto, a função de clearence astrocitário foi restabelecida 7 dias após o dano. A HIC gerou estresse oxidativo e aumento de antioxidantes endógenos, além disso, as espécies reativas de oxigênio (ERO) inibiram a atividade da GS em 24h e 7 dias após a lesão. A partir dos resultados obtidos, podemos concluir que a S100B atua na lesão hemorrágica produzindo respostas distintas, região dependente, contribuindo para o aumento das células gliais no estriado e córtex, correlacionando-se positivamente com os déficits funcionais. Este é o primeiro relato descrevendo a relação da S100B com as alterações celulares e funcionais durante a progressão da HIC experimental. Além disso, os mecanismos envolvidos na HIC demonstraram padrões e respostas envolvendo excitotoxicidade glutamatérgica e inflamação, que colaboraram para o dano oxidativo; em resposta ao estresse houve o aumento de antioxidantes endógenos que podem ter contribuído para o reestabelecimento da função astrocitária. / Intracerebral haemorrhage (ICH) is a major cause of mortality worldwide, triggering adverse events and serious neurological deficits. From this standpoint, this thesis aimed to evaluate the cellular responses and interactions involved in ICH and investigate the possible mechanisms that contribute to sensory-motor deficits, mainly related to the ability of the forelimbs of animals. For this, two experiments were conducted. In both, animals of 90 days of age were subjected to ICH induced by collagenase in dorsolateral striatum. In the first experiment, after 24h, 72h and 7 days, the animals were evaluated functionally, and histologically about the lesion volume. Also, at 6h, 24h, 72h and 7 days, the striatum and the cortex was evaluated as the number of neuronal, glial and apoptotic cells; the expression of GFAP and S100B, the striatum and cortex, S100B secretion in serum and cerebrospinal fluid (CSF). ICH caused sensorimotor deficits and tissue loss; induced neuronal death and reactive gliosis in the striatum. The cortex astrocyte obtained a similar response, but about the microglia there was an increase only at 6h. S100B was positively correlated with the number of glial cells; and negatively correlated with the strength and function of the forelimbs of injured animals. In the second experiment, were evaluated the oxidative state, the level of TNF-α, the activity of glutamine synthetase (GS) and glutamate uptake at 6h, 24h, 72h and 7 days post-injury. After 6h from ICH, there was an increase in TNF-α levels and glutamatergic excitotoxicity; however, the astrocyte clearance function was established 7 days after the damage. HIC generated oxidative stress and increase of endogenous antioxidants, in addition, reactive oxygen species (ROS) inhibited the activity of GS in 24h and 7 days after injury. Based on the results obtained, we can conclude that S100B acts in hemorrhagic lesions producing different responses, region-dependent, contributing to the increase in glial cells in the striatum and cortex, correlating positively with functional deficits. This is the first report describing the relation of S100B with cellular and functional changes during the progression of experimental ICH. Furthermore, the mechanisms involved in ICH displayed patterns and responses involving glutamatergic excitotoxicity and inflammation, that contributed to oxidative damage; in response to stress there was an increase of endogenous antioxidants which may have contributed to the re-establishment of astrocyte function.

As acidúrias D-2-hidroxiglutárica (D-2-HGA) e L-2-hidroxiglutárica (L-2-HGA) são doenças neurometabólicas hereditárias causadas pelas deficiências das atividades da D-2-hidroxiglutarato desidrogenase (D-2-HGA do tipo I) ou isocitrato desidrogenase 2 (D-2-HGA do tipo II) e L-2-hidroxiglutarato desidrogenase (L-2-HGA). Os pacientes afetados por essas doenças desenvolvem principalmente sintomas e sinais neurológicos como convulsões, coma e atrofia cerebral. As lesões cerebrais ocorrem majoritariamente nos gânglios da base (D-2-HGA e L-2-HGA) e no cerebelo (L-2-HGA). Bioquimicamente, a D-2-HGA e a L-2-HGA são caracterizadas pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária dos ácidos D-2-hidroxiglutárico (D-2-HG) e L-2-hidróxiglutárico (D-2-HG), respectivamente. Tendo em vista que a fisiopatologia da disfunção cerebral encontrada nestes pacientes ainda é pouco conhecida, o presente trabalho investigou os efeitos da administração intracerebral in vivo em ratos jovens dos ácidos D-2-HG e L-2-HG sobre parâmetros de estresse oxidativo e sobre a histopatologia das principais estruturas afetadas nos pacientes com D-2-HGA (estriado) ou L-2-HGA (estriado e cerebelo). Inicialmente, avaliamos o efeito dos ácidos D-2-HG e L-2-HG sobre os níveis de malondialdeído (MDA) e sobre a formação de carbonilas em estriado e cerebelo. Verificamos que ambos os ácidos orgânicos aumentaram significativamente os níveis de MDA (dano oxidativo lipídico) no estriado (D-2-HG e L-2-HG) e no cerebelo (L-2-HG). Por outro lado, apenas o D-2-HG foi capaz de aumentar a formação de carbonilas (dano oxidativo proteico) no estriado. Além disso, o D-2-HG diminuiu as concentrações de glutationa reduzida (GSH) e as atividades enzimáticas da glutationa peroxidase (GPx) e da superóxido dismutase (SOD), além de aumentar as concentrações de glutationa oxidada (GSSG) no estriado. Já o L-2-HG foi capaz de diminuir as concentrações de GSH e de gutationa total (tGS), bem como a atividade da GPx e da glutationa redutase (GR). Por fim, o L-2-HG aumentou as concentrações de GSSG no estriado e no cerebelo. Também investigamos o efeito da administração intracerebral in vivo do D-2-HG e do L-2-HG sobre a oxidação de diclorofluorosceína (DCFH), produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) e sobre o conteúdo de nitratos e nitritos, com o objetivo de verificar quais as principais espécies reativas envolvidas nos danos induzidos por estes ácidos orgânicos. O D-2-HG aumentou os níveis de nitratos e nitritos, mas não foi capaz de alterar a oxidação de DCFH e a produção de H2O2, indicando o envolvimento de espécies reativas de nitrogênio (ERN) nesses efeitos. Já o L-2-HG aumentou a oxidação de DCFH e a produção de H2O2, não alterando o conteúdo de nitratos e nitritos. Tais resultados sugerem que o L-2-HG provavelmente induz as alterações observadas através do aumento na geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Também demonstramos que os antioxidantes melatonina, creatina, ácido ascórbico mais α-tocoferol (Vit C + E), N-acetilcisteína (NAC), maleato de dizocilpina (MK-801) e Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) foram capazes de prevenir o dano oxidativo lipídico e a diminuição das defesas antioxidantes induzidos pelo D-2-HG e pelo L-2-HG. Melatonina, creatina e a solução de Vit C + E preveniram vários efeitos induzidos pelo L-2-HG, enquanto o MK-801 e o L-NAME foram capazes de prevenir apenas os efeitos induzidos pelo D-2-HG e o NAC não preveniu os efeitos induzidos pelos dois ácidos orgânicos. Observamos ainda que os ácidos 3-metilglutacônico (3-MGT; estruturalmente similar ao D-2-HG) e L-2-hidróxi-3-metilvalérico (L-HMV; estruturalmente similar ao L-2-HG), não foram capazes de alterar esses parâmetros, sugerindo uma ação seletiva para as atividades pro-oxidantes induzidas pelos D-2-HG e L-2-HG. Finalmente, estudos histológicos mostraram que o D-2-HG e L-2-HG são capazes de alterar a morfologia tecidual no estriado (D-2-HG e L-2-HG) e no cerebelo (L-2-HG). O D-2-HG causou vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico no estriado. Já o L-2-HG, além de causar vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico, também induziu necrose, formação de corpos granulares eosinofílicos e astrogliose (aumento da proteína ácida fibrilar glial). Também observamos em ratos injetados com L-2-HG perda da população neuronal (diminuição da imunodetecção da proteína neuronal nuclear específica) no estriado, enquanto que no cerebelo o L-2-HG induziu vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico. Concluindo, este trabalho foi o primeiro a demonstrar efeitos in vivo do D-2-HG e do L-2-HG (administração intracerebral) sobre parâmetros de estresse oxidativo e alterações histopatológicas em cérebro de ratos jovens. Presumimos que o comprometimento da homeostase redox possa estar associado às alterações histopatológicas observadas, podendo contribuir pelo menos em parte, para a neuropatologia encontrada nos pacientes afetados pela D-2-HGA e pela L-2-HGA. / D-2-hydroxyglutaric aciduria (D-2-HGA) and L-2-Hydroxyglutaric aciduria (L-2-HGA) are inherited neurometabolic disorders caused by enzymatic defects in D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (D-2-HGA type I) or isocitrate dehydrogenase 2 (D-2-HGA type II) and L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (L-2-HGA), respectively. Patients affected by these disorders develop severe neurological damage, which leads to seizures, coma and cerebral atrophy. Brain lesions occur mainly in the basal ganglia (D-2-HGA and L-2-HGA) and in cerebellum (L-2-HGA) Biochemically, D-2-HGA and L-2-HGA are characterized by tissue accumulation and high urinary excretion of D-2-hydroxyglutaric acid (D-2-HG) and L-2-hydroxyglutaric acid (L-2-HG), respectively. Since the pathophysiology of the tissue damage in these diseases is still poorly unknown, the present study investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG in adolescent rats on important parameters of oxidative stress and on the histopathology of the principal cerebral structures damaged in patients with D-2-HGA (striatum) and L-2-HGA (striatum and cerebellum). Initially, we investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on malondialdehyde (MDA) levels and carbonyl formation in striatum and cerebellum. We verified that both organic acids significantly elevated MDA levels (lipid oxidative damage) in striatum (D-2-HG and L-2-HG) and cerebellum (L-2-HG), whereas only D-2-HG was able to elevate carbonyl formation (protein oxidative damage) in striatum. Furthermore, D-2-HG and L-2-HG significantly diminished reduced glutathione (GSH) concentrations, glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD) activities, besides increasing oxidized glutathione (GSSG) concentrations in striatum. Otherwise, L-2-HG reduced GSH, total glutathione (tGS) concentrations and the activities of GPx and reductase glutathione (GR). Finally, L-2-HG augmented GSSG concentrations in striatum and cerebellum. In the next step of this work, we investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on 2’,7’-diclorofluorescein oxidation (DCFH), hydrogen peroxide production (H2O2) and nitrate and nitrite content in order to elucidate the main reactive species involved in the oxidative damage induced by these organic acids. D-2-HG elevated nitrate and nitrite content, whereas it did not change DCFH oxidation and H2O2 production, suggesting the involvement of reactive nitrogen species (RNS) in these effects. On the other hand, L-2-HG injection increased DCFH oxidation and H2O2 production, but did not change nitrate and nitrite content. These results suggest that L-2-HG-induced alterations occur by an elevated generation of reactive oxygen species (ROS). We also demonstrated that antioxidants such as melatonin, creatine, a mixture of ascorbic acid plus α-tocopherol (Vit C + E), N-acethylcysteine (NAC), dizocilpine maleate (MK-801) and Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) were able to prevent D-2-HG- and L-2-HG-induced lipid oxidative damage and the reduction of the antioxidant defenses induced by D-2-HG and L-2HG. Melatonin, creatine and Vit C + E prevented some of the effects induced by L-2-HG, whereas MK-801 and L-NAME were only able to prevent the D-2-HG-elicited effects and NAC did not prevent D-2-HG and L-2-HG-induced alterations. We also observed that 3-methylglutaconic (3-MGT, structurally similar to D-2-HG) and L-2-hydroxy-3-methylvaleric (L-HMV, structurally similar to L-2-HG) acids were not able to change these parameters, suggesting a selective effect on the pro-oxidant activities induced by D-2-HG- and L-2-HG. Finally, histological studies demonstrated that D-2-HG and L-2-HG were able to cause histopathological alterations in the striatum (D-2-HG and L-2-HG) and cerebellum (L-2-HG). D-2-HG provoked vacuolation, lymphocytic and macrophage infiltration in the striatum. Furthermore, L-2-HG induced vacuolation, lymphocytic and macrophage infiltration, necrosis, granular eosinophilic bodies, astrogliosis (glial fibrillary acidic protein (elevated glial fibrillary acidic protein immunostaining) and neuronal loss (decreased neuron-specific nuclear protein (NeuN) immunostaining) in striatum. On the other hand, L-2-HG provoked only vacuolation and lymphocytic and macrophage infiltration in the cerebellum. To the best of our knowledge this is the first report that demonstrates the influence of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on oxidative stress parameters and histopathological alterations in brain of adolescent rats. We presumed that the disturbance of cell redox homeostasis was probably associated with the histopathological abnormalities observed, that possibly contribute at least in part to the neuropathology of the brain injury of patients affected by D-2-HGA and L-2-HGA.