La maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus courante et la première associée à des troubles moteurs. Elle se manifeste principalement par un ralentissement des mouvements volontaires, une raideur des muscles et la présence de tremblements au repos. Sur le plan histopathologique, la maladie de Parkinson est marquée par la diminution progressive des neurones dopaminergiques dans la substance noire et la formation d'agrégats toxiques composés majoritairement de la protéine alpha-synucléine (αSyn). Des recherches ont établi un lien entre le gène *RIT2* et cette maladie. Ce gène code pour la protéine RIT2, une petite GTPase de la famille Ras jouant un rôle dans plusieurs processus neuronaux. L'analyse de l'expression de *RIT2* dans les cerveaux humains post-mortem de patients atteints de la maladie de Parkinson révèle que son expression est diminuée. La surexpression de *RIT2 in vitro* et *in vivo* induit une diminution d'αSyn et renverse les déficits moteurs liés à la synucléinopathie. Ces résultats suggèrent que la modulation de *RIT2* pourrait protéger contre la dégénérescence neuronale. Notre objectif est de produire une lignée cellulaire humaine rapportrice pour l'expression de *RIT2*. Cette lignée sera un outil permettant le criblage de petites molécules capable de passer la barrière hématoencéphalique afin d'identifier des composés existants pouvant augmenter l'expression de *RIT2*. Pour ce faire, la technique CRISPR-cas9 a été utilisée sur des iPSCs humaines afin d'insérer la séquence de la protéine fluorescente tdTomato dans le locus du gène *RIT2*. Les neurones dopaminergiques différenciés à partir de ces cellules exprimeront tdTomato, permettant ainsi le suivi de *RIT2* pour le criblage de petites molécules. La validation éventuelle de ces composés offrira une avancée importante vers l'identification de nouveaux agents thérapeutiques pour la maladie de Parkinson. / Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disease and the first associated with motor disorders. It mainly manifests as a slowing down of voluntary movements, muscle stiffness, and the presence of resting tremors. Histopathologically, Parkinson's disease is marked by the progressive loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra and the formation of toxic aggregates primarily composed of the protein alpha-synuclein (αSyn). Research has linked the *RIT2* gene to this disease. This gene encodes the RIT2 protein, a small GTPase of the Ras family involved in several neuronal processes. Analysis of *RIT2* expression in post-mortem human brains from patients with Parkinson's disease reveals that its expression is decreased. The overexpression of *RIT2 in vitro* and *in vivo* induces a reduction of αSyn and reverses the motor deficits associated with synucleinopathy. These results suggest that modulation of *RIT2* could protect against neuronal degeneration. Our objective is to produce a human reporter cell line for *RIT2* expression. This line will be a tool for screening small molecules capable of crossing the blood-brain barrier to identify existing compounds that can increase *RIT2* expression. To this end, the CRISPR-Cas9 technique was used on human iPSCs to insert the sequence of the fluorescent protein tdTomato into the *RIT2* gene locus. Dopaminergic neurons differentiated from these cells will express tdTomato, allowing the monitoring of *RIT2* for small molecule screening. The eventual validation of these compounds will offer significant progress towards identifying new therapeutic agents for Parkinson's disease.

La leishmaniose est une maladie parasitaire négligée touchant environ 12 millions de personnes dans le monde. Actuellement, les options thérapeutiques sont limitées à quatre médicaments : les dérivés d'antimoine pentavalent (SbV), l'amphotéricine B (AMB), la miltéfosine (MF) et la paromomycine (PMM). Ces traitements présentent de nombreux inconvénients, dont une toxicité importante pour les hôtes, un coût élevé et des protocoles de traitement invasifs. De plus, l'efficacité de ces traitements est de plus en plus compromise par l'émergence de souches de *Leishmania* résistantes aux antimicrobiens. Cette résistance est en grande partie due à la capacité du parasite à adapter rapidement son génome grâce à son aneuploïdie et à sa plasticité génomique. Pour surmonter ces défis, il est crucial de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques et de mieux comprendre les mécanismes de résistance du parasite. Les techniques de criblage, comme le Cos-Seq, ont permis d'identifier des mécanismes de résistance associés à l'amplification génique, tandis que d'autres méthodes comme le Mut-Seq et le Sel-Seq ont révélé des mutations menant à des phénotypes de résistance. Cependant, il manque encore des outils moléculaires optimisés pour des criblages à haut débit de perte de fonction, permettant une analyse complémentaire du génome et du transcriptome de *Leishmania* dans diverses conditions environnementales. Cette thèse propose trois outils moléculaires innovants adaptés aux criblages à l'échelle génomique pour développer l'étude du mode d'action des antimicrobiens et des mécanismes de résistance chez *Leishmania*. Dans le premier chapitre, deux criblages CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome ont été optimisés chez *Leishmania infantum*, une espèce responsable de la forme sévère de la leishmaniose. Un projet pilote ciblant quatre gènes a validé la fonctionnalité du système. Par la suite, une librairie de près de 50 000 ARN guides (ARNg) a été intégrée dans un vecteur d'expression pour le séquençage de nouvelle génération (Illumina), testée pour la couverture du génome et transfectée dans des souches exprimant l'endonucléase Cas9. Deux criblages ont été réalisés avec AMB et MF. Les ARNgs les plus enrichis dans le criblage de la MF ciblaient le gène du transporteur de la miltéfosine, tandis que ceux ciblant des gènes codant pour une protéine au domaine de type RING et une protéine transmembranaire étaient également enrichis. Les ARNgs enrichis dans le criblage avec AMB ciblaient des gènes impliqués dans la méthylation des stérols et un gène hypothétique. Les études fonctionnelles ont prouvé que la perte de fonction de ces gènes était associée à la résistance. Ce criblage à l'échelle du génome a permis d'identifier des cibles thérapeutiques connues et nouvelles, offrant un outil puissant pour découvrir de nouvelles molécules et identifier des cibles potentielles. Dans le deuxième chapitre, l'interférence à l'ARN (ARNi) a été explorée. Bien que cette approche soit bien maîtrisée chez *Trypanosoma brucei*, elle a été peu utilisée pour *Leishmania*. La présence d'un système ARNi actif a été confirmée dans *L. (Viannia) braziliensis*, avec la création d'une construction en boucle ciblant *MT*, entraînant une résistance à la miltéfosine. Une nouvelle construction intégrable avec des promoteurs et des terminateurs en position contraire a été conçue pour cibler *MT* et *AQP1*, démontrant des réductions significatives de l'expression (ou « knockdown ») et une résistance à la miltéfosine et au SbIII. Cette approche ouvre la voie à des études de gènes dont la suppression complète pourrait être délétère, permettant ainsi une régulation plus fine des gènes. Enfin, le troisième chapitre présente le développement du premier outil de criblage à haut débit d'inactivation des ARNs codants ou non codants chez *Leishmania* : le système CRISPR-Cas13b. Une preuve de concept a été réalisée chez *Leishmania infantum* en ciblant le gène de la luciférase, réduisant significativement l'expression de l'ARNm et l'activité de la luciférase. Des tests supplémentaires ont ciblé le gène *MT* avec neuf ARNgs, validant la diminution du niveau d'ARNm et optimisant la conception des ARNgs. Bien que des optimisations soient nécessaires pour une application à grande échelle, ce système de knockdown a le potentiel de faciliter de nombreuses études sur le transcriptome de *Leishmania*. Les trois outils moléculaires développés permettent d'améliorer la compréhension des mécanismes de résistance des parasites et le mode d'action des antimicrobiens, ouvrant la voie à des thérapies plus efficaces et à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques contre cette maladie complexe. / Leishmaniasis is a neglected parasitic disease affecting approximately 12 million people worldwide. Currently, therapeutic options are limited to four drugs: pentavalent antimony derivatives (SbV), amphotericin B (AMB), miltefosine (MF), and paromomycin (PMM). These treatments have many drawbacks, including significant toxicity to hosts, high costs, and invasive treatment protocols. Moreover, the effectiveness of these treatments is increasingly compromised by the emergence of antimicrobial-resistant *Leishmania* strains. This resistance is largely due to the parasite ability to rapidly adapt its genome through aneuploidy and genomic plasticity. To overcome these challenges, it is crucial to discover new therapeutic targets and better understand the parasite's resistance mechanisms. Screening techniques, such as Cos-Seq, have identified resistance mechanisms associated with gene amplification, while other methods like Mut-Seq and Sel-Seq have revealed mutations leading to resistance phenotypes. However, there is still a lack of optimized molecular tools for high-throughput loss-of-function screenings, which would provide complementary analyses of the *Leishmania* genome and transcriptome under various environmental conditions. This thesis describes three innovative molecular tools tailored for genomic-scale screenings to advance the study of antimicrobial mechanisms of action and resistance mechanisms in *Leishmania*. In the first chapter, two genome-wide CRISPR-Cas9 screenings were optimized in *Leishmania infantum*, a species responsible for the severe form of leishmaniasis. A pilot project targeting four genes validated the system's functionality. Subsequently, a library of nearly 50,000 guide RNAs (gRNAs) was incorporated into an expression vector for next-generation sequencing (Illumina), tested for genome coverage, and transfected into Cas9-expressing strains. Two screenings were conducted with AMB and MF. The most enriched gRNAs in the MF screening targeted the miltefosine transporter gene, while those targeting genes coding for a RING-type protein and a transmembrane protein were also enriched. The enriched gRNAs in the AMB screening targeted genes involved in sterol methylation and a hypothetical gene. Functional studies demonstrated that the loss of function of these genes was associated with resistance. This genome-wide screening identified both known and new therapeutic targets, offering a powerful tool for discovering new molecules and identifying potential targets. In the second chapter, RNA interference (RNAi) was explored. Although this approach is well-established in *Trypanosoma brucei*, it has been less used for *Leishmania*. The presence of an active RNAi system was confirmed in *L. (Viannia) braziliensis*, with the creation of a loop construct targeting *MT*, resulting in miltefosine resistance. A new integrable construct with opposing-positioned promoters and terminators was designed to target *MT* and *AQP1*, demonstrating significant knockdowns and resistance to miltefosine and SbIII. This approach paves the way for studies of genes where complete suppression could be deleterious, allowing for more precise gene analysis. Finally, the third chapter presents the development of the first high-throughput tool for the inactivation of coding and non-coding RNAs in *Leishmania*: the CRISPR-Cas13b system. A proof of concept was achieved in *Leishmania infantum* by targeting the luciferase gene, significantly reducing mRNA expression and luciferase activity. Additional tests targeted the *MT* gene with nine gRNAs, validating reduced mRNA levels and optimizing gRNA design. While further optimizations are needed for large-scale application, this knockdown system has the potential to facilitate numerous studies on the *Leishmania* transcriptome. The three developed molecular tools enhance the understanding of parasite resistance mechanisms and antimicrobial modes of action, paving the way for more effective therapies and the discovery of new therapeutic targets against this complex disease.

Contexte. Les phénotypes ABO et Rh(D) des donneurs de sang ainsi que des patients transfusés sont analysés de façon routinière pour assurer une complète compatibilité. Ces analyses sont accomplies par agglutination suite à une réaction anticorps-antigènes. Cependant, pour des questions de coûts et de temps d’analyses faramineux, les dons de sang ne sont pas testés sur une base routinière pour les antigènes mineurs du sang. Cette lacune peut résulter à une allo-immunisation des patients receveurs contre un ou plusieurs antigènes mineurs et ainsi amener des sévères complications pour de futures transfusions. Plan d’étude et Méthodes. Pour ainsi aborder le problème, nous avons produit un panel génétique basé sur la technologie « GenomeLab _SNPstream» de Beckman Coulter, dans l’optique d’analyser simultanément 22 antigènes mineurs du sang. La source d’ADN provient des globules blancs des patients préalablement isolés sur papiers FTA. Résultats. Les résultats démontrent que le taux de discordance des génotypes, mesuré par la corrélation des résultats de génotypage venant des deux directions de l’ADN, ainsi que le taux d’échec de génotypage sont très bas (0,1%). Également, la corrélation entre les résultats de phénotypes prédit par génotypage et les phénotypes réels obtenus par sérologie des globules rouges et plaquettes sanguines, varient entre 97% et 100%. Les erreurs expérimentales ou encore de traitement des bases de données ainsi que de rares polymorphismes influençant la conformation des antigènes, pourraient expliquer les différences de résultats. Cependant, compte tenu du fait que les résultats de phénotypages obtenus par génotypes seront toujours co-vérifiés avant toute transfusion sanguine par les technologies standards approuvés par les instances gouvernementales, les taux de corrélation obtenus sont de loin supérieurs aux critères de succès attendus pour le projet. Conclusion. Le profilage génétique des antigènes mineurs du sang permettra de créer une banque informatique centralisée des phénotypes des donneurs, permettant ainsi aux banques de sang de rapidement retrouver les profiles compatibles entre les donneurs et les receveurs. / Background. ABO and Rh(D) phenotyping of both blood donors and transfused patients is routinely performed by blood banks to ensure compatibility. These analyses are done by antibody-based agglutination assays. However, blood is not routinely tested for minor blood group antigens on a regular basis because of cost and time constraints. This can result in alloimmunization of the patient against one or more minor antigens and may complicate future transfusions. Study design and Methods. To address this problem, we have generated an assay on the GenomeLab SNPstream genotyping system (Beckman Coulter, Fullerton, CA) to simultaneously test polymorphisms linked to 22 different blood antigens using donor’s DNA isolated from minute amounts of white blood cells. Results. The results showed that both the error rate of the assay, as measured by the strand concordance rate, and the no-call rate were very low (0.1%). The concordance rate with the actual red blood cell and platelet serology data varied from 97 to 100%. Experimental or database errors as well as rare polymorphisms contributing to antigen conformation could explain the observed differences. However, these rates are well above requirements since phenotyping and cross-matching will always be performed prior to transfusion. Conclusion. Molecular profiling of blood donors for minor red blood cell and platelet antigens will give blood banks instant access to many different compatible donors through the set-up of a centralized data storage system.

Une approche de métagénomique fonctionnelle a été mise en œuvre afin d’étudier les arsenaux enzymatiques produits par les microbiotes intestinaux de termites phytophages et d’identifier de nouvelles enzymes impliquées dans l’hydrolyse des polysaccharides végétaux, notamment des hétéroxylanes. Le criblage à haut débit des banques métagénomiques constituées à partir de trois espèces de termites sur une gamme de substrats chromogéniques a permis d’identifier plusieurs centaines de clones à activité dépolymérisante (glucanase, xylanase, mannanase, arabinanase), ainsi que des clones exprimant des activités auxiliaires (α-L-arabinofuranosidases, β-D-xylosidases, cellobiose hydrolases). Un total de 42 clones métagénomiques a été séquencé, générant 1,5 Mpb d’ADN assemblé en 58 séquences contigües d’une taille moyenne de 37,8 Kbp. 63 nouvelles Glycoside Hydrolases (GH) ont été identifiées. Ces dernières représentent 19 familles de la classification CAZy, dont les familles GH3, GH8, GH10, GH11, GH43 et GH51. Enfin, huit nouvelles enzymes des familles GH43 et GH51 ont été produites chez E. coli et leurs propriétés biochimiques ont été étudiées. Ces enzymes présentent des activités α-L-arabinofuranosidase, β-D-xylosidase ou L-arabinanase / A functional metagenomics approach was used to reveal the enzymatic diversity present in the guts of biomass-feeding termites and to identify enzymes involved in the degradation of biomass components, notably heteroxylans. High-throughput screening of metagenomic libraries, created using three different termite species, was performed using a variety of chromogenic substrates. This allowed the discovery of hundreds of clones expressing targeted biomass-degrading activities (e.g. depolymerases such as glucanase, xylanase, mannanase arabinanase and auxiliary activities such as α-L-arabinofuranosidases, β-D-xylosidases and cellobiohydrolases). A total of 42 clones were selected for a DNA sequence analysis, thus generating 1.5 Mbp that were assembled into 58 contiguous sequences. 63 new Glycoside Hydrolases (GH) belonging to 19 different families of the CAZy classification were identified, including ones from families GH3, GH8, GH10, GH11, GH43 and GH51. Finally, eight new enzymes, from families GH43 and GH51, were produced in E. coli and their biochemical properties were studied. These enzymes display α-L-arabinofuranosidase, β-D-xylosidase or arabinanase activities

Ce travail traite de l’exploration de la biodiversité des Baeyer-Villiger MonoOxygénases (BVMOs) : des enzymes utilisées en biocatalyse pour la production de lactones optiquement pures à partir de cétones. Pour mettre à bien cet objectif nous avons réalisé, en association avec le Génoscope d’Evry, une sélection de plusieurs centaines d’enzymes couvrant une forte diversité génétique. Après clonage et criblage à haut débit sur plus de vingt substrats différents nous avons obtenus plus de 90 nouvelles BVMOs. Avec ce résultat nous avons triplé le nombre de BVMOs connues dans la littérature. Dans un second temps nous avons étudié l’activité de certaines de ces nouvelles enzymes sur les cétones α,β-insaturées (ou enone), Ces substrats sont peu étudiés en biocatalyse et, lors de la réaction chimique, aboutissent à la formation de nombreux sous-produits. Deux enzymes d’O.batsensis et de P. lavamentivorans se sont révélées être actives aboutissant à la production d’ene-lactone et d’enol-lactone respectivement. La conversion de certaines enones chirales a abouti à des lactones présentant un fort excès énantiomérique.Nous avons ensuite étudié la régio-sélectivité de 35 enzymes issues du criblage sur une série de cétones aliphatiques acycliques. Alors que la formation de l’ester méthylique est très rare, nous avons obtenu des résultats très variés pour la formation de l’ester éthylique allant jusqu’à 80%. Le travail de thèse s’est terminé par le développement d’une cascade enzymatique sur la production d’ester à partir d’alcool secondaire. La cascade implique deux enzymes : une Alcool Déshydrogénase et une BVMO. La cascade est à la fois fonctionnelle et est très efficace. / -

Les halopéroxydases à vanadate (vHPO) seraient des enzymes clés du métabolisme iodé des algues brunes en assurant la captation de l'iode et en participant à la biosynthèse de composés volatils iodés. Pour vérifier ces hypothèses, nous avons mis en place une stratégie de génétique chimique inverse dans le but d'étudier in vivo les effets de l'invalidation des vHPOs. A cette fin, nous avons réalisé un test de criblage à haut-débit sur la bromopéroxydase à vanadate d'Ascophyllum nodosum pour identifier des inhibiteurs de cette enzyme. Les tests secondaires ont montré que les molécules sélectionnées ne sont pas des inhibiteurs mais qu'elles sont très réactives envers les espèces oxydées de l'iode générées par l'enzyme. Un test in vivo a permis de montrer que ces molécules inhibent l'influx des iodures par Laminaria digitata, ce qui corrobore l'implication d'une vHPO dans ce mécanisme. Nous avons étudié la distribution tissulaire et subcellulaire de l'iode chez L. digitata par microsonde nucléaire et par microsonde SIMS. Cette étude a mis en évidence que l'iode est principalement stocké au niveau du tissu périphérique dans le compartiment apoplastique et non au sein de structures intra-cellulaires. Cette découverte remet en cause le modèle de captation des iodures proposé dans la littérature et ouvre de nouvelles perspectives de recherche. Parallèlement à ces études, nous avons poursuivi les travaux concernant les inhibiteurs de la captation des iodures chez des modèles cellulaires exprimant le symporteur Na+/I- en mettant au point leur synthèse, en validant leur activité et en initiant la recherche de leur protéines cibles par photomarquage d'affinité.

Contexte. Les phénotypes ABO et Rh(D) des donneurs de sang ainsi que des patients transfusés sont analysés de façon routinière pour assurer une complète compatibilité. Ces analyses sont accomplies par agglutination suite à une réaction anticorps-antigènes. Cependant, pour des questions de coûts et de temps d’analyses faramineux, les dons de sang ne sont pas testés sur une base routinière pour les antigènes mineurs du sang. Cette lacune peut résulter à une allo-immunisation des patients receveurs contre un ou plusieurs antigènes mineurs et ainsi amener des sévères complications pour de futures transfusions. Plan d’étude et Méthodes. Pour ainsi aborder le problème, nous avons produit un panel génétique basé sur la technologie « GenomeLab _SNPstream» de Beckman Coulter, dans l’optique d’analyser simultanément 22 antigènes mineurs du sang. La source d’ADN provient des globules blancs des patients préalablement isolés sur papiers FTA. Résultats. Les résultats démontrent que le taux de discordance des génotypes, mesuré par la corrélation des résultats de génotypage venant des deux directions de l’ADN, ainsi que le taux d’échec de génotypage sont très bas (0,1%). Également, la corrélation entre les résultats de phénotypes prédit par génotypage et les phénotypes réels obtenus par sérologie des globules rouges et plaquettes sanguines, varient entre 97% et 100%. Les erreurs expérimentales ou encore de traitement des bases de données ainsi que de rares polymorphismes influençant la conformation des antigènes, pourraient expliquer les différences de résultats. Cependant, compte tenu du fait que les résultats de phénotypages obtenus par génotypes seront toujours co-vérifiés avant toute transfusion sanguine par les technologies standards approuvés par les instances gouvernementales, les taux de corrélation obtenus sont de loin supérieurs aux critères de succès attendus pour le projet. Conclusion. Le profilage génétique des antigènes mineurs du sang permettra de créer une banque informatique centralisée des phénotypes des donneurs, permettant ainsi aux banques de sang de rapidement retrouver les profiles compatibles entre les donneurs et les receveurs. / Background. ABO and Rh(D) phenotyping of both blood donors and transfused patients is routinely performed by blood banks to ensure compatibility. These analyses are done by antibody-based agglutination assays. However, blood is not routinely tested for minor blood group antigens on a regular basis because of cost and time constraints. This can result in alloimmunization of the patient against one or more minor antigens and may complicate future transfusions. Study design and Methods. To address this problem, we have generated an assay on the GenomeLab SNPstream genotyping system (Beckman Coulter, Fullerton, CA) to simultaneously test polymorphisms linked to 22 different blood antigens using donor’s DNA isolated from minute amounts of white blood cells. Results. The results showed that both the error rate of the assay, as measured by the strand concordance rate, and the no-call rate were very low (0.1%). The concordance rate with the actual red blood cell and platelet serology data varied from 97 to 100%. Experimental or database errors as well as rare polymorphisms contributing to antigen conformation could explain the observed differences. However, these rates are well above requirements since phenotyping and cross-matching will always be performed prior to transfusion. Conclusion. Molecular profiling of blood donors for minor red blood cell and platelet antigens will give blood banks instant access to many different compatible donors through the set-up of a centralized data storage system.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La recherche de nouvelles réactions est un des enjeux fondamentaux de la chimie organique. En dehors de l’approche classique basée sur la conception d’une réaction en s’appuyant sur les propriétés chimiques des substrats, une nouvelle approche utilisant le criblage systématique de combinaisons aléatoires de fonctions réactives a été récemment adoptée par plusieurs groupes. Cette stratégie nécessite un outil analytique permettant de cribler un très grand nombre de réactions par jour et d’identifier les meilleures combinaisons conduisant à la formation de produits intéressants. Les travaux de thèse présentés dans ce mémoire s’inscrivent dans le contexte de l’utilisation des techniques de dosages immuno-enzymatiques (ELISA) comme outil de criblage pour la recherche de nouvelles réactions de couplage. Dans un premier temps le criblage de 2688 combinaisons de fonctions réactives et de catalyseurs choisies au hasard a été effectué. Ce criblage a permit de mettre en évidence deux nouveaux couplages en présence de sels de cuivre : une réaction entre les thiourées et les phénols conduisant à la formation des isourées et une réaction entre les N-hydroxythiourées et les alcynes conduisant à la formation des thiazole-2-imines. Dans un second temps le criblage de 2816 combinaisons de fonctions sélectionnées, cette fois-ci, de façon rationnelle a été effectué. Ce criblage a visé la découverte de nouvelles cycloadditions [3+2] répondant aux critères de la chimie « click ». Ainsi l’utilisation de dosage immuno-enzymatique a été étendue à l’optimisation des nouvelles réactions découvertes ainsi qu’à l’évaluation de leurs cinétique, chimiosélectivité et biocompatibilité. Près de 3000 tests complémentaires effectuées sur les « hits » issus du criblage primaire ont ainsi permit de mettre en évidence 4 nouvelles réactions de couplage dont une nouvelle réaction « click » : la cycloaddition sydnone-alcyne catalysée au cuivre (CuSAC). Dans la dernière partie de ce manuscrit les études plus détaillées sur la réaction CuSAC ont été effectuées, notamment l’identification de la structure du produit de couplage et l’étendue du champ d’application de cette réaction. Enfin, l’aspect « click » de la réaction CuSAC a été illustré par l’application de cette réaction au marquage d’une protéine. / Discovery of new reactions is one of the fundamental goals in organic chemistry. In addition to the traditional approach to reaction discovery, consisting in designing a reaction on the basis of known chemical properties of reagents, new approaches based on the screening of random combinations of reactive functions and catalysts have been recently developed. The main prerequisite of this strategy is an analytical tool allowing screening of a big number of reactions per day and identifying combinations leading to the formation of unanticipated products. In the work presented herein a high-throughput immunoassay screening has been used for the discovery of new coupling reactions. In the first part of this work a screening of 2688 combinations of randomly chosen reactive functions and catalysts was carried out. This screening led to the discovery of two copper-promoted coupling reactions: a reaction between thioureas and phenols leading to the formation of isoureas through desulfurization; and a reaction between N-hydroxythioureas and alkynes leading to the formation of thiazole-2-imines. In the second part of the work a screening of 2816 combinations of rationally designed chemical functions and catalysts was carried out. This screening was focused on the discovery of catalytic [3+2] cycloadditions that comply with the standards of “click” chemistry. In this study, the use of immunoassay screening was extended to optimize new reactions and to evaluate their kinetics, chemoselectivity and biocompatibility. Therefore, around 3000 complementary tests were carried out on the hits, identified in the primary screening. This allowed the discovery of 3 new coupling reactions and one new “click” reaction: a copper-catalyzed sydnone-alkyne cycloaddition (CuSAC). The last part of the work was focused on detailed studies of the CuSAC reaction. Identification of the structure of the coupling product and substrate scope of this reaction was carried out. Finally, the applicability of the CuSAC reaction for bioconjugation was demonstrated by an example of protein labeling.

Les dégénérescences lobaires frontotemporales (DLFT) représentent la deuxième étiologie neurodégénérative chez l’adulte de moins de 65 ans. Les DLFT sont constituées d’un ensemble hétérogène de phénotypes cliniques et sont fréquemment héréditaires. Leurs particularités neuropathologiques communes reposent sur une atrophie des lobes frontaux et/ou temporaux associée à la présence d’inclusions de protéines agrégées parmi lesquelles la protéine TAR DNA binding protein 43 (TDP43). Actuellement, aucun marqueur protéique n’est validé pour diagnostiquer les DLFT du vivant du patient.Une cohorte de cas certains DLFT-TDP43 a été constituée grâce au développement d’outils spécifiques de diagnostic moléculaire. Une analyse des concentrations pondérales de protéine TDP43 dans le liquide cérébrospinal (LCS) a été réalisée dans cette cohorte, puis comparée à des cohortes bien caractérisées sur le plan clinique et neuropathologique. Finalement, les profils qualitatifs de la protéine TDP43 ont été étudiés dans différents compartiments accessibles du vivant du patient : les profils des formes solubles (LCS et plasma) et des formes intracellulaires (éléments figurés du sang) de la protéine TDP43 ont été comparés aux profils protéiques obtenus sur des tissus cérébraux présentant des inclusions de protéine TDP43. Les profils protéiques des culots plaquettaires présentent des similitudes avec le tissu cérébral et pourraient devenir un marqueur candidat pour le diagnostic probabiliste des DLFT / Frontotemporal lobar degeneration (FTLD) syndrome is the second most common of presenile dementia. FTLD is a clinically heterogeneous syndrome and comprises many hereditary cases. Common neuropathological features rely on a degeneration of the frontal and/or anterior temporal lobes, associated to specific inclusions of aggregated proteins including TAR DNA binding protein 43 (TDP43). Unfortunately, no practical protein marker is currently validated to improve FTLD diagnosis in living patients.A cohort of FTLD patients with definite TDP43 pathology was defined with the development of specific genetic testing. An analysis of TDP43 concentrations in cerebrospinal fluid (CSF) was performed in this cohort and then compared to other cohorts well-characterized on clinical and neuropathological features. Finally, qualitative patterns of TDP43 were studied in compartments accessible from the patient’s living: profiles of soluble TDP43 protein (in CSF or in plasma) and intracellular TDP43 protein (in the formed elements of blood) were compared to protein patterns observed in brain tissues with TDP43 protein inclusions. Platelet samples exhibit similar characteristics to brain tissue and could become a candidate biomarker for FTLD probabilistic diagnosis