Made available in DSpace on 2016-04-01T17:55:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-08-31. Added 1 bitstream(s) on 2016-04-01T18:00:53Z : No. of bitstreams: 1 000859876_20160630.pdf: 471050 bytes, checksum: b283e5cdd6fee1565d98e89bf93e40b0 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-07-01T13:02:23Z: 000859876_20160630.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-01T13:03:18Z : No. of bitstreams: 1 000859876.pdf: 729708 bytes, checksum: 0c3f9644fb91e37bed700362170aae04 (MD5) / As plantas da família Orchidaceae são muito apreciadas pelo potencial ornamental, ecológico e econômico. O domínio de técnicas para a domesticação e propagação em massa das espécies é extremamente importante, visto que, possibilita diminuir a coleta predatória, além de reduzir o custo de produção das plantas. O cultivo in vitro é uma técnica que permite produzir grande número de plantas; entretanto, ocorrem muitas perdas durante o período de aclimatização (ex vitro). O aprimoramento dos métodos de conservação de recursos genéticos por meio de criopreservação de sementes em desenvolvimento é uma importante estratégia para a conservação de germoplasma e programas de melhoramento genético de plantas desta família. Este trabalho teve como objetivos avaliar o desenvolvimento in vitro de plântulas em meio de cultura alternativo e diferentes ambientes das orquídeas Amblostoma amblostomoides e Cattleya percivaliana, bem como, diferentes protocolos para a criopreservação de sementes da orquídea Ionopsis utricularioides. Nos experimentos sobre desenvolvimento in vitro de plântulas em meio de cultura alternativo e diferentes ambientes, para cada espécie, o delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado. Inicialmente foram seis tratamentos (T1 - meio MS (Murashige e Skoog) + sala de crescimento - Controle; T2 - MCA (meio de cultura alternativo) + sala de crescimento; T3 - MCA + tela preta com 70% de sombreamento; T4 - MCA + tela azul com 50% de sombreamento; T5 - MCA + tela preta com 50% de sombreamento e T6 - MCA + tela vermelha com 50% de sombreamento) e quatro repetições com 10 plântulas por parcela avaliando-se porcentagem de sobrevivência; para avaliação dos dados biométricos, em razão do alto índice de mortalidade, foram avaliados quatro tratamentos para A. amblostomoides e três tratamentos para C. percivaliana, com 12 repetições para ambas as espécies, sendo uma plântula... / Orchids are well appreciated by ornamental, ecological and economic potential. The improvement of genetic resources conservation methods through seeds and protocorms cryopreservation is an important strategy for the conservation of germplasm and plant breeding programs of this family. The domain of techniques for domestication and mass propagation of species is very important because, enables decreasing predation and reduce the cost of production of plants. The in vitro culture is a technique that allows the production of a large numbers of plants; however, there are many losses during the acclimatization period (ex vitro). This work aimed to evaluate different protocols for cryopreservation of Ionopsis utricularioides seeds, as well as the in vitro development of seedlings in alternative culture media and different environments of the orchids, Amblostoma amblostomoides and Cattleya percivaliana. In experiments on cryopreservation of seeds for each species, the experimental design was completely randomized with eight treatments and four replications each. The treatments were: T1) seeds without cryopreservation (control 1); T2) seeds cryopreserved without cryoprotectants (Control 2); T3) glycerol + PVS2; T4) glycerol + PVS2 + phloroglucinol; T5) sucrose + PVS2; T6) sucrose + PVS2 + phloroglucinol; T7) glycerol + sucrose + PVS2; and T8) + sucrose + glycerol + PVS2 + phloroglucinol and 10 repetitions. The variables analyzed were germination percentage, number of seedlings and protocorms and development of the seedlings formed. In the experiments on in vitro development of seedlings in an alternative culture media and in different environments, the experimental design was completely randomized for each species. There were six treatments [T1: MS medium (Murashige e Skoog) - under laboratory conditions; T2: ACM (Alternative Culture Medium) - under laboratory conditions; T3: MCA - black net with 50% shading; T4: MCA - black net with ...

Made available in DSpace on 2016-04-01T17:55:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-08-10. Added 1 bitstream(s) on 2016-04-01T18:00:57Z : No. of bitstreams: 1 000860413_20170910.pdf: 230352 bytes, checksum: 018e667c9aa92dfab87506346c37b2be (MD5) Bitstreams deleted on 2017-09-11T13:56:01Z: 000860413_20170910.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-09-11T13:56:50Z : No. of bitstreams: 1 000860413.pdf: 1309321 bytes, checksum: 5ddda6b6b143e0c96151c41cdd3f86a3 (MD5) / Embriões produzidos in vitro (PIV) apresentam baixa sobrevivência aos métodos convencionais de criopreservação. Na tentativa de melhorar a produção e taxa de sobrevivência embrionária após a vitrificação foram utilizados reguladores metabólicos L-carnitina (CA), Forskolina (FO) e Ácido linoleico conjugado trans-10; cis-12 (CLA), separadamente ou em associação em diferentes doses, à partir do quarto (D4) ou sexto (D6) dia do cultivo de desenvolvimento embrionário. No experimento 1 o uso de 2,5 mM de CA influenciou positivamente na produção (62,0±12,5%, P=0,02), expansão (60,7%, P=0,009) e eclosão (41,1%, P=0,04). No experimento 2, a produção de embriões não foi influenciada pela suplementação com FO (P=0,2), entretanto, a dose de 15,0μM afetou positivamente a expansão (53,2%, P=0,001) e eclosão (46,8%, P0,001). No experimento 3, a produção de embriões não foi influenciada pela suplementação do meio de cultivo com CLA (P=0,4), no entanto a dose de 150,0 μM afetou positivamente a expansão (85,5%, P=0,001) e eclosão (70,9%, P=0,001) dos embriões reaquecidos e cultivados por 48 horas. No experimento 4, a associação dos reguladores de metabolismo lipídico utilizados não influenciou a produção de embriões (P=0,16), entretanto o melhor resultado de produção observado foi no tratamento com 15,0 μM de FO individualmente. As taxas de expansão e eclosão foram influenciadas pela suplementação com reguladores de metabolismo adicionados individualmente ou em associação (P=0,001). A melhor taxa de expansão foi observada na suplementação associando CA+FO+CLA, com 90,05%, que não diferiu (P>0,05) da suplementação com CLA (86,4) e da associação CA+CLA (87,9%). Entretanto, a melhor taxa de eclosão foi obtida com CLA (71,8%, P=0,01), superior aos demais tratamentos. Foi concluído que o uso dos... / Embryos produced in vitro (IVP) have low survival to conventional cryopreservation methods. In attempt to improve the production and the rate of embryo survival to the cryopreservation process, was used the metabolic regulators, L-carnitine (CA), forskolina (FO) and the conjugated linoleic acid isomers trans-10, cis-12 (CLA), separately or in combination in different doses, starting the fourth (D4) or sixth (D6) days of the embryo culture development in vitro. In experiment 1, the best results of production (62,0 ± 12,5%, P = 0,02), expansion (60,7%, P = 0,009), and hatching (41,1 % P = 0,04) was obtained using 2,5 mM of CA. In experiment 2, the production of embryos was not influenced by supplementation with FO (P=0,2), however, the dose of 15,0μM was the best result of expansion (53,2%) and hatching (46,8%) (P=0,001). In experiment 3, the production of embryos was not influenced by supplementation with CLA (P=0,4), however, the dose of 150,0 μM resulted in higher rates of expansion (85,5%, P=0,001) and hatching (70,9%, P=0,001). In the experiment 4, the embryo production was not influenced by the supplementations (P=0,16), however the best result of the production was using 15,0μM of FO individually. The expansion and hatching rates was influenced by supplementation with the metabolism regulators added individually or in a combination (P=0,001). The best expansion rate was observed with the association CA+FO+CLA (90,05%), that was not different (P>0,05) of the CLA (86,4%) or CA+CLA (87,9%) groups. However, the best hatching rate was obtained with CLA (71,8%), which was higher to the other treatments (P=0.01). In conclusion, the use of the metabolic regulators CA, FO and CLA from the fourth day of the embryo culture in vitro increase ...

Submitted by ENDRIGO ADONIS BRAGA DE ARAUJO null (adonis.tecvet@yahoo.com.br) on 2016-04-27T02:07:05Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_BHT_Araujo, EAB.pdf: 638286 bytes, checksum: 01feb4c9fddef023795b0f62318b20f2 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-04-28T16:16:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 araujo_eab_me_bot.pdf: 638286 bytes, checksum: 01feb4c9fddef023795b0f62318b20f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T16:16:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 araujo_eab_me_bot.pdf: 638286 bytes, checksum: 01feb4c9fddef023795b0f62318b20f2 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O processo de criopreservação acarreta estresse oxidativo à célula espermática e a adição de antioxidantes aos meios de refrigeração e congelação de sêmen pode auxiliar na proteção dos espermatozoides contra o dano induzido pelas espécies reativas de oxigênio (ERO), incluindo perda da motilidade de forma irreversível, peroxidação lipídica e fragmentação do DNA, interferindo na capacidade de fertilização do espermatozoide. Dentre os diferentes antioxidantes, o Butil-hidroxitolueno (BHT) é um análogo sintético da vitamina E, cujo efeito protetor é atribuído a dois mecanismos: o aumento da fluidez da membrana plasmática após a incorporação do antioxidante, e o segundo por conter a cascata de peroxidação lipídica pela conversão de peroxil em hidroperóxido lipídico. O BHT foi testado em diversas espécies demonstrando melhora na motilidade, integridade de membrana plasmática e viabilidade espermática; porém, na espécie equina, a inclusão de BHT em diluentes para criopreservação de sêmen necessita ser melhor avaliada. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do BHT nas células espermáticas de equinos submetidas à criopreservação e sua capacidade de conter a peroxidação lipídica e produção de espécies reativas de oxigênio quando os espermatozoides foram submetidos a estresse. / The process of cryopreservation brings out oxidative stress to spermatic cell and the addition antioxidant of into cooling and freezing semen extenders could assist in protection of spermatozoa against the damage induced by reactive oxygen species (ROS), including irreversible loss in motility, lipid peroxidation and DNA fragmentation, interfering with the fertilizing capacity of sperm. Among different antioxidants, the butylated hydroxytoluene (BHT) is a synthetic analogue of vitamin E, whose protective effect is attributed to two mechanisms: the increase in sperm membrane fluidity after the addition of antioxidant, and the lipid peroxidation cascade for converting peroxy radicals into lipid hydroperoxides. BHT was tested in different species and the results include improvement in motility, spermatic membrane integrity and sperm viability. However, the addition of BHT in horse semen extenders for cryopreservation purposes demands further research. Thereby, the aims of this study were (1) to evaluate the influence of BHT on equine spermatic cells submitted to cryopreservation and (2) the capacity of BHT to contain the lipid peroxidation and the production of reactive species of oxygen when sperm cells were submitted to stress. / FAPESP: 2014/00175-8

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-26Bitstream added on 2014-06-13T20:46:11Z : No. of bitstreams: 1 crespilho_am_dr_botffmvz.pdf: 1224891 bytes, checksum: 5f6cd3bb0ea028b0690772b9a9bf8493 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo do estudo foi comparar a efetividade de três diluidores empregados para criopreservação e refrigeração do sêmen bovino em relação aos padrões de motilidade, integridade de membrana plasmática e acrossomal, índice de peroxidação lipídica e fertilidade nos programas de inseminação artificial em tempo-fixo (IATF). No Trabalho científico número 1 foi comparado a viabilidade e fertilidade pós-descongelação proporcionada pelos diluidores Tris-frutose (TRIS, Controle) e Botu-Bov® (BB), ambos contendo 20% de gema de ovo como fonte de lipoproteínas, frente à diluição em Botu- Bov®-Lecitina de Soja (meio BB-L) apresentando 1% de lecitina em substituição ao produto de origem animal. No Trabalho 2 foram avaliados os mesmos diluentes quando utilizados para a refrigeração do sêmen bovino por 48 horas a 5°C. Já no Trabalho número 3 foi avaliada a taxa de concepção na inseminação artificial (C/IA) proporcionada pelo sêmen bovino refrigerado por 24 horas em meio Botu-Bov® em comparação ao sêmen convencionalmente criopreservado no mesmo diluidor. Os meios TRIS e BB a base de gema de ovo foram mais efetivos na manutenção da viabilidade espermática pósdescongelação, conferindo melhores resultados de C/IA (P<0,05) em relação ao meio BBL. No entanto, quando utilizado o sêmen na forma líquida e refrigerado (Trabalho número 2) foi observada uma maior proteção contra o estresse oxidativo proporcionado pelo diluidor a base de lecitina de soja, resultando em maior probabilidade de prenhez quando comparado às amostras refrigeradas em TRIS ou BB, alcançando índice de concepção similar ao obtido com o sêmen congelado. A utilização do sêmen bovino refrigerado por 24 horas levou ao aumento da C/IA de vacas submetidas a IATF quando comparado ao sêmen congelado em meio Botu-Bov®. Conclui-se que embora a lecitina de soja represente... / The aim of this study was to compare three different extenders used for cryopreservation of bovine semen, based on the results obtained during the cooling storage and post-thaw evaluation for motility patterns, integrity of plasmatic and acrossomal membranes, lipid peroxidation rate, as well as conception rate after fixed-time artificial insemination (FTAI). In Paper.1, the efficiency of Tris-Fructose extender (TRIS, control group), Botu-Bov® extender (BB), both containing 20% of egg yolk, and Botu-Bov®-Lecithin extender (BBL), which has 1% of soy lecithin instead of egg yolk, were compared in cryopreservation of bovine semen. In Paper.2, ejaculates from different bulls were cooled to 5°C for 48 hours using the same extenders of Paper.1. In Paper.3 the fertility trial was conducted either with frozen-thawed semen or cooled semen for 24 hours in the BB extender. The egg yolk extenders, TRIS and BB, demonstrated significant differences on the viability and the fertility of frozen-thawed bovine semen when compared to BB-L (P<0.05). However, the use of lecithin instead of egg yolk on semen extender resulted in a greater protection against oxidative stress; moreover, this extender improved the conception rates, reaching the results obtained in FTAI programs with frozen-thawed semen. The use of cooled bovine semen at 5°C for 24 hours improves the conception rate of Nelore cows submitted to FTAI. Although soy lecithin is an interesting alternative source of phospholipids in the elaboration of chemically defined extenders and decrease the risk of microbiological contamination, the egg yolk semen extenders are more effective in preserving the viability and fertility of frozen-thawed bovine semen. However, there was a higher production of free radicals in cooled semen with the use of egg yolk based extenders, resulting in lower conception rates when compared to frozen-thawed... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-29Bitstream added on 2014-06-13T19:24:35Z : No. of bitstreams: 1 prado_fra_dr_jabo.pdf: 264327 bytes, checksum: dd7379d7711c643e9ed9087d9e75a42d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / objetivo deste estudo foi contribuir para o conhecimento da técnica de criopreservação de embriões in vitro. Oócitos (n=965) foram maturados durante 24h em TCM-199 suplementado com 0,2mM de piruvato, 25 mM de bicarbonato de sódio e 75 mg/ml de gentamicina. Os zigotos foram cultivados em meio SOFm suplementado com 0,5% BSA e FCS 2,5%. Culturas foram realizadas a 38,5°C em 5% de CO2 no ar umidificado, em 100 μl de meio de gotículas recuperado com óleo mineral. No sétimo dia da cultura, os embriões (n = 387) foram marcados e apenas blastocistos excelente a boa qualidade foram criopreservados (10 embriões / palheta 0,25 ml). Os seguintes grupos experimentais foram concebidos, nomeado de acordo com a solução de crioprotetor utilizado: glicerol 1,0 M de etileno glicol em PBS (G); glicerol 1,0 M + 0,3 M de sacarose em PBS (GS); etilenoglicol 1.5 M em PBS (E) e 1,5 M + 0,3 M de sacarose em PBS (ES). Após o descongelamento, os embriões foram re-cultivadas em 100 ml de meio de gotas SOFm a 38,5 º C e 5% de CO2 no ar por 72 h. Os dados demonstraram que a qualidade do embrião, avaliada pelo escore de embriões e número de células embrionárias, parece ser melhor no grupo E e ES. No processo de vitrificação, 300 embriões de excelente qualidade morfológica, Bi e Bl foram vitrificados, e foram sincronizadas 500 receptoras de embriões, divididas em 3 grupos de 150 animais cada grupo. O diagnóstico de gestação nas receptoras após a inovulação dos embriões foram realizados após 42 dias. A taxa de concepção variou entre os grupos, sendo que no grupo I obteve 6 gestações (18,75%) de receptoras que receberam embriões da raça Nelore, 9 gestações (26,47%) de receptoras que receberam embriões da raça Brangus e 12 gestações (35,3%) de receptoras que receberam embriões da raça Brahman... / The aim of this study was to contribute to the knowledge of the technique of cryopreservation of embryos in vitro. Oocytes (n = 965) were matured for 24h in TCM- 199 supplemented with 0.2 mM pyruvate, 25 mM sodium bicarbonate and 75 mg / ml of gentamicin. Zygotes were cultured in medium supplemented with 0.5% SOFm BSA and 2.5% FCS. Cultures were performed at 38.5 ° C in 5% CO2 in humidified air in 100 l of medium droplets recovered with mineral oil. On the seventh day of culture, the embryos (n = 387) were scored and only good quality excellent blastocysts were cryopreserved (10 embryos / straw 0.25 ml). The following experimental groups were designed, named according to the cryoprotectant solution used: glycerol 1.0 M ethylene glycol in PBS (G) 1.0 M glycerol + 0.3 M sucrose in PBS (GS), ethylene glycol 1.5 M PBS (E) and 1.5 M + 0.3 M sucrose in PBS (ES). After thawing, the embryos were re-grown in 100 ml of medium SOFm drops to 38.5 º C and 5% CO2 in air for 72 h. The data demonstrated that embryo quality was evaluated by scoring the number of embryos and embryonic cells, seems to be better in group E and ES. In the process of vitrification, 300 embryos of excellent morphology, Bi and Bl, were vitrified, and 500 were synchronized embryo recipients were divided into 3 groups of 150 animals each group. Pregnancies after embryo transfer in recipient embryos were performed after 42 days. The conception rate varied between the groups, whereas in group I had six pregnancies (18.75%) of recipients that received embryos Nellore, 9 pregnancies (26.47%) of recipients that received embryos of Brangus and 12 pregnancies (35.3%) of recipients that received embryos from Brahman ... (Complete abstract click electronic access below)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2015. / Submitted by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-06-15T14:23:55Z No. of bitstreams: 1 2015_AndrielleThainarMendesCunha.pdf: 1263718 bytes, checksum: d3e361eee393e655519a6623e0bb6ce0 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-06-15T14:24:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_AndrielleThainarMendesCunha.pdf: 1263718 bytes, checksum: d3e361eee393e655519a6623e0bb6ce0 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-15T14:24:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_AndrielleThainarMendesCunha.pdf: 1263718 bytes, checksum: d3e361eee393e655519a6623e0bb6ce0 (MD5) / A utilização de espermatozoides do epidídimo (EP) em técnicas de reprodução assistida tem um papel importante na multiplicação e armazenamento de material genético. Entretanto, melhor conhecimento sobre o comportamento fisiológico destes espermatozoides é necessário para otimizar a sua utilização. Objetivou-se avaliar a viabilidade, resistência e longevidade de EP de sete touros da raça Gir, durante e após a criopreservação, usando os espermatozoides do ejaculado (EJ) como controle. O ejaculado foi coletado através de eletroestimulação, posteriormente os animais foram castrados e os espermatozoides da cauda do epidídimo foram coletados pelo método de extravasamento. Primeiramente, verificou-se a resistência dos EJ e EP diante à criopreservação, as células foram avaliadas logo após a recuperação, após quatro horas de refrigeração e após o descongelamento. Em uma segundo etapa, foi avaliada a longevidade após a criopreservação. Foram utilizados três grupos de espermatozoides do EJ, do EP e um grupo em que EP foram incubados com plasma seminal (EPP). Após o descongelamento amostras dos três grupos foram incubadas por zero, três, seis e 24 horas. Em cada momento foi avaliada a motilidade total e progressiva, integridade de membrana plasmática, integridade acrossomal, morfologia espermática capacitação. Finalmente foi avaliada a capacidade dos espermatozoides do epidídimo de se ligarem às células da tuba uterina (CTU). Para isso foram utilizados os grupos EJ, EP e EPP, foram co-incubados, com CTU por zero, três, seis e 24 horas. Devido ao resultado obtido, um segundo teste foi realizado utilizando testículos de quatro touros, coletados em abatedouro. Um testículo de cada animal foi utilizado para o grupo de EP criopreservado (EP-C) e o outro para o grupo de EP fresco (EP-F). Os dados foram analisados usando procedimento GLIMMIX do programa SAS (P≤0,05). Os EP apresentaram características de qualidade semelhantes aos do EJ frescos e após a criopreservação (P>0,05). Entretanto, foram mais resistentes à refrigeração do que os do EJ, apresentado maior MT (79,8±4,5 e 56,8±5,6), maior MP (46,1±3,5 e 29,2±3,2) e maior porcentagem de acrossoma íntegro (68,7±5,8 e 48,5±6,1). Após o descongelamento, e 6h de incubação os grupos EP e EPP comparados com o EJ apresentaram maior porcentagem de membrana plasmática íntegra (29±4,3, 28,2±4,2 e 16,4±3,4), maior porcentagem de espermatozoides com acrossoma intacto (31,6±3,8, 31,6±3,8 e 19,9±3,2) e maior porcentagem de espermatozoides não capacitados (81±3,5, 80,9±3,5 e 70,3±3,7). O número de espermatozoides ligados após a co-incubação das CTU com EJ, EP ou EPP não diferiu (P>0,05) em nenhum grupo, a análise dentro de cada grupo mostrou que ambos apresentaram queda gradativa no número de espermatozoides ligados às CTU, sendo que o menor número foi observado às 24 h para todos os grupos. No segundo teste de ligação, o grupo EP-F apresentou maior numero de células ligadas aos 30 min (130,9±21,2) e às 24 horas (131,7±21,2) de incubação do que o grupo EP-C aos 30 min (88±21,2) e 24 h (20,4±21,2). Pode-se concluir que EP são mais resistentes à refrigeração dos que os do EJ, apresentam maior longevidade e características de capacitação tardia, quando comparados ao EJ. Além disso, os EP se ligam às CTU da mesma forma que os EJ, no entanto a criopreservação pode afetar esta ligação. / The use of epididymal sperm (ES) in assisted reproductive technologies is an important tool form multiplication and conservation of genetic material. However, a better understanding of several aspects of those sperm physiology is needed to optimize its use. The aim of this study was to evaluate the strength, the post thawed viability, longevity and sperm characteristics behavior of ES from 7 Gir bulls, during and after cryopreservation, using ejaculated sperm (EJ) as a control. After ejaculated sperm was collected the testis were removed and sperm from the cauda epididymis were recovered First we evaluate the resistance of ES and EJ to cryopreservation, sperm were evaluated just after recovering, after 4 h of cooling and after freezing. Then, we evaluate the post thawing longevity by examining the sperm after different periods of incubation. Three groups were used ES, EJ, and a third group, in which ES was incubated with seminal plasm for 10 min after thawed (ESS). After thawing, samples from the 3 groups were incubated for 0, 3, 6 e 24 h. In each moment they were evaluated for total motility and progressive motility, plasm membrane integrity. acrosome integrity, morphology and capacitation. Finally, we evaluated the ability of ES, EJ and ESS to bind to oviduct epithelium cells (OEC), Samples from EJ, EP e EPP groups were co-incubated with OEC for 0, 3, 6 e 24 h. Due to the results obtained, another test had to be done to evaluated if the cryopreservation process was affecting ES binding. To do that we used testis form 4 bulls collected at slaughter house. From each animal one testis was used for the fresh sperm (ES-F) and the other for the frozen sperm (EP-C). Data analysis was performed using GLIMMIX from SAS (P≤0.05). Fresh and cryopreserved ES presented all quality parameters similar (P>0.05) to the EJ However, after cooling at 4°C, ES showed to be more resistance to cold than the EJ presenting greater TM (79.8±4.5 and 56.8±5.6), greater PM (46.1±3.5 and 29.2±3.2) and higher percentage of cells with intact acrosome (68.7±5.8 and 48.5±6.1) than EJ. After thawed at 6 h of incubation ES and ESS compared to EJ had a higher percentage of intact membranes (29±4.3, 28.2±4.2 and 16.4±3.4), higher percentage of cells with intact acrosome (31.6±3.8 31.6±3.8 and 19.9±3.2) and higher percentage of non-capacitated sperm (81±3.5, 80.9±3.5 and 70.3±3.7). The number of bounded sperm after co-incubation with OEC was similar (P>0.05) for EJ, ES and ESS groups. The analysis within the group showed that all had a decreased on the number of bounded sperm, with the lowest number of bounded sperm found at 24 h of incubation. In the second biding test the group EF had a higher number of bounded sperm at 30 min (130.9±21.2) and at 24 h (131.7±21.2) of incubation than the EC (30 min=88±21.2 and 24 h=20.4±21.2). It can be concluded that ES are more resistant to cooling than the EJ, presenting a greater longevity and a delay on capacitation process than the EJ. In addition, ES binds to OEC similarly to EJ; however cryopreservation can affect that binding.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Tecnologia, Departamento de Engenharia Florestal, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-06-19T21:03:15Z No. of bitstreams: 1 2017_DanielaVasconcelosdeOliveira.pdf: 3772125 bytes, checksum: 7ce470b996f01205102b9c87984b13a3 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-08-18T18:47:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_DanielaVasconcelosdeOliveira.pdf: 3772125 bytes, checksum: 7ce470b996f01205102b9c87984b13a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-18T18:47:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_DanielaVasconcelosdeOliveira.pdf: 3772125 bytes, checksum: 7ce470b996f01205102b9c87984b13a3 (MD5) Previous issue date: 2017-08-18 / O objetivo geral desse trabalho foi desenvolver um protocolo de criopreservação para ápices caulinares de Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen, ginseng-brasileiro, visando assegurar a conservação em longo prazo do seu germoplasma. Inicialmente foram estabelecidas as condições para a introdução e multiplicação clonal in vitro de Pfaffia glomerata, a partir de gemas laterais de segmentos nodais de plantas em crescimento em campo, para obter o lote de plantas doadoras de ápices caulinares para os experimentos de criopreservação. Após 30 dias de cultivo in vitro 92% das gemas laterais retomaram o crescimento dando origem a plântulas inteiras, com sistema radicular e parte aérea bem desenvolvidos. Para a definição do protocolo de criopreservação foram testadas duas técnicas, a vitrificação e a gota-vitrificação. A técnica de vitrificação consistiu dos seguintes procedimentos: isolamento dos ápices caulinares (±2,0 mm) de plântulas em crescimento in vitro, pré-cultivo em meio de cultura MS básico, solidificado com ágar e suplementado com 0,3M de sacarose por aproximadamente 18 hrs, tratamento com meio de saturação (MS básico líquido suplementado com 2,0M de glicerol e 0,4M de sacarose, vitrificação com três soluções crioprotetoras (PVS2, PVS3 e PVS4), três tempos de exposição (20 min, 40 min e 60 min), e duas temperaturas para cada solução (25°C e 0°C), congelamento em nitrogênio líquido (-196°C), descongelamento, diluição (MS suplementado com 1,2 M de sacarose) e cultivo in vitro. Para a metodologia de vitrificação o melhor percentual de regeneração foi 64%, obtido para ápices caulinares tratados com a solução PVS4, por 60 minutos, a 25°C . Para o método de gota-vitrificação, as etapas utilizadas foram semelhantes, consistindo de isolamento dos explantes, pré-cultivo (MS sólido suplementado com 0,3M de sacarose), saturação (MS líquido suplementado com 2,0 M de glicerol e 0,4M de sacarose), vitrificação com três soluções (PVS2, PVS3 e PVS4), três tempos de exposição (20 min, 40 min e 60 min), e duas temperaturas (25°C e 0°C), congelamento dos ápices caulinares dispostos em tiras de alumínio e submersos diretamente em nitrogênio líquido, descongelamento, diluição (MS suplementado com 1,2M de sacarose) e cultivo in vitro. As melhores condições para o congelamento pelo método de gota-vitrificação foi o tratamento com a solução PVS3, por 40 minutos, a 0°C, o que resultou em 82% de regeneração. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a criopreservação em nitrogênio líquido pode ser usada para a conservação do germoplasma de ginseng brasileiro. O método mais eficiente, com maior percentual de regeneração dos ápices caulinares (82%) foi o método de gota-vitrificação, adotando-se o tempo de 40 minutos de exposição dos explantes à solução crioprotetora PVS3, na temperatura de 0°C. / The main objective of this work was to develop a cryopreservation protocol for Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen shoot tips, in order to ensure the long-term conservation of its germplasm. The conditions for introduction in vitro and clonal multiplication of Pfaffia glomerata from lateral buds of nodal segments of plants growing in the field were established to obtain the batch of stock donor plants for the cryopreservation experiments. After 30 days of culture in vitro 92% of the lateral buds resumed growth giving rise to whole plantlets, with well developed root system and shoots. For the definition of the cryopreservation protocol, two techniques were tested, vitrification and dropvitrification,. The vitrification technique consisted of the following procedures: isolation of shoot apices (± 2.0 mm) from in vitro growing plantlets, pre-culture ( MS culture medium, solidified with agar and supplemented with 0.3M sucrose), loading with MS medium supplemented with 2.0M glycerol and 0.4M sucrose), vitrification with three cryoprotectant solutions (PVS2, PVS3 and PVS4), three exposure times (20 min, 40 min and 60 min), two temperatures for each solution (25°C and 0°C), freezing in liquid nitrogen (-196°C), thawing, dilution (MS medium supplemented with 1.2 M sucrose) and culture in vitro. For the drop-vitrification method, the steps used were similar, consisting of excision of the shoot tips, pre-culture of explants (solid MS supplemented with 0.3M sucrose), loading (liquid MS supplemented with 2.0M glycerol and 0.4M sucrose), vitrification (PVS2, PVS3 and PVS4), three exposure times (20 min, 40 min and 60 min), and two temperatures (25°C and 0°C), freezing of the shoot apices arranged in aluminum strips and submerged directly into liquid nitrogen, thawing, dilution (MS supplemented with 1.2M sucrose) and in vitro culture. The best conditions for cryopreservation using the droplet-vitrification method were treatment with PVS3 solution for 40 minutes at 0°C, which resulted in 82% regeneration. The results obtained with this work indicate that cryopreservation in liquid nitrogen can be used for conservation of germplasm of brazilian ginseng. The most efficient method, with the highest percentage of shoot tip regeneration (82%), was the droplet-vitrification method, with 40 minutes of exposure of the explants to the cryoprotectant solution PVS3 at 0°C.

O objetivo deste trabalho foi determinar o protocolo mais eficiente de criopreservação de tecido ovariano utilizando o sistema automático de congelação, que requer rampas de resfriamento gradativo, modelo Freeze Control®, para comparar a integridade do tecido ovariano congelado através de duas diferentes curvas de congelação combinadas com dois diferentes crioprotetores: dimetilsulfóxido (DMSO) e etileno glicol (EG). Para a realização do trabalho foram utilizadas 20 ratas Wistar que foram submetidas à oofarectomia bilateral. Os ovários foram divididos em duas partes, uma parte foi criopreservada em DMSO 1,5M e a outra em EG 1,5M. Ainda, foram analisadas duas curvas de congelamento (curva lenta com duração de 1h e 50min, e uma curva rápida com duração de 35 min). As amostras de tecido, após congelação, foram descongeladas, fixadas e processadas para a coloração com hematoxilina e eosina para a análise da integridade dos oócitos. Finalmente fez-se a análise e quantificação dos folículos íntegros versus os não íntegros, como também o dano tecidual. Para a análise folicular foi utilizado o microscópio óptico em aumento de 400x e realizou-se a classificação dos folículos pré-antrais de acordo com o estágio de desenvolvimento em primordiais e primários. Os resultados foram submetidos à ANOVA e as comparações entre as médias feitas pelo teste de Tukey com (P<0,05). Nos resultados foi observado que no tecido criopreservado os folículos que persistiram íntegros em cada ovário foram os primordiais em 79% e primários em 29%. Já no tecido não congelado (controle) foram encontrados todos os tipos foliculares, primordiais, primários, secundários, pré-antrais e antrais. Entre as alterações reversíveis identificaram-se vacuolizacão citoplasmática e contorno irregular. Quanto às alterações irreversíveis foi encontrado picnose. Concluindo, no tecido ovariano criopreservado, foram encontrados apenas folículos primordiais e primários apresentando alterações histológicas reversíveis e irreversíveis. Além disso, o crioprotetor EG promoveu uma melhor preservação destes folículos, comparado com o DMSO. Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa, na preservação dos folículos, quando se comparou as duas curvas de congelação. / The aim of this study was to determine the most efficient protocol of cryopreservation of ovarian tissue using authomatic freezing system. This system requires Freeze Control® ramps of gradative cooling to compare the integrity of frozen ovarian tissue through two different freezing curves together with two different cryoprotectants: dimethilsulphoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG). In this work 20 Wistar female rats were submitted to bilateral oophorectomy. The ovaries were divided in two parts, one part was cryopreserved in DMSO 1,5M and the other in EG 1,5M. Two frozen curves (a slow curve lasting 1h and 50min and a rapid curve lasting 35min) were analyzed. The tissue samples were frozen and after defrosted, fixed, and processed to hematoxylin and eosin staining to analyse oocyte. The analysis and quantification of integrated follicles, non-integrated, and tissue damage was performed. In the follicular analysis it was used 400x optical microscope and performed the classification of pre-antral follicles in primordial and primary according to their stage of development. The results were submitted to ANOVA and the comparasions between the averages were done using the Tukey test (P<0,05). It was observed that in the cryopreserved tissue the follicles remaining integrated in each ovary were 79% primordial and 29% primary. In the non-frozen tissue (control) were found all kinds follicular primordial, primary, secondary, preantral and antral follicles. Cytoplasmic vacuolization and irregular cell outline were identified among reversible alterations. Picnosis was found as an irreversible alteration. To conclude only primordial and primary follicles were enconutered in the ovarian tissue cryopreserved and there are revisable and irreversible histological alterations. Furthermore, the crioprotectant EG was more efficient then DMSO in other to preserve a higher number of primordial and primary viable folicules. No statistical significant difference was detected when we compare the two curves of cryopreservation system.

Objetivo: Investigar a influência do tamanho dos fragmentos ovarianos na preservação dos folículos primordiais e primários pós-congelamento. Desenho: Experimento laboratorial controlado. Foram realizadas análises histológicas comparativas em grupos controle e pós-congelamento de fragmentos de ovários bovinos. No grupo dos fragmentos menores, a menor das medidas era de 2mm e no grupo dos fragmentos maiores, todos as medidas eram maiores de 2mm. Local de Realização: Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Faculdade de Veterinária da UFRGS e Centro de Reprodução Humana Nilo Frantz, Porto Alegre, RS, Brasil. Animais: Foi utilizado um ovário de vaca raça Hereford. Resultados Principais: Nos fragmentos congelados com medida de 2mm, e com medidas maiores de 2mm, a percentagem de folículos normais foi de 56% e 34%, respectivamente. O risco relativo para a manutenção dos folículos normais póscongelamento nos fragmentos com de 2mm e maiores de 2mm foi de 0,63 e de 0,47, respectivamente. A comparação desse dois riscos relativos mostrou, de forma significativa (qui-quadrado de heterogeneidade p=0,022), que o impacto do congelamento na redução das taxas de sucesso foi maior nos fragmentos com espessuras maiores de 2mm. Conclusões principais: Este estudo mostrou que há um comprometimento maior na preservação folicular em fragmentos ovarianos criopreservados com espessuras maiores de 2mm. / Aims of the study: To assess the effect of different tissue sizes on the morphology of primordial and primary follicles after cryopreservation. Desing: Laboratorial controlled experiment. Comparative histological evaluations were performed of fresh control and cryopreserved tissue strips. Two groups were analyzed. In the group of the smaller fragments, the major face measure 2mm and in the group of the larger fragments, all the faces measure more than 2mm. Setting: Veterinary School of the Federal University of Rio Grande do Sul and Nilo Frantz Assisted Reproduction Clinic, Porto Alegre, RS, Brazil. Animal (s): One ovary from a Hereford cow. Main results: The percentages of normal follicles in large ovarian fragments cut into 2mm and >2mm slices were 56% and 34%, respectively. The relative risks to obtain normal follicles in the 2mm and >2mm strips after cryopreservation were 0.63 and 0.47, respectively. The comparison of the two relative risks shows significantly (heterogeneity qui-square p=0.022) that the effect of freezing on reducing success rate was higher in large tissue fragments that are cut >2mm. Conclusion(s): The present study shows that there is an increased risk of damage to primary and primordial follicles when the cryopreserved fragment has all its measures larger than 2mm.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade em Agronomia e Veterinária, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2016-09-14T19:07:12Z No. of bitstreams: 1 2016_LuziaRenatadeOliveiraDias.pdf: 585188 bytes, checksum: c1d67f8ad9c30dc53f569fab1b6a16a0 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-10-24T11:06:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_LuziaRenatadeOliveiraDias.pdf: 585188 bytes, checksum: c1d67f8ad9c30dc53f569fab1b6a16a0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-24T11:06:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_LuziaRenatadeOliveiraDias.pdf: 585188 bytes, checksum: c1d67f8ad9c30dc53f569fab1b6a16a0 (MD5) / A criopreservação de embriões produzidos in vitro (PIV) é afetada pelas altas concentrações de gotículas lipídicas que se acumulam no interior dos blastômeros. A remoção parcial de lipídios intracitoplasmáticos, por estímulo da lipólise química no citoplasma celular ou pela diminuição da captação e síntese de ácidos graxos pelas células, pode ser uma alternativa para melhorar a criopreservação desses embriões. Neste sentido, objetivou-se estimar o efeito de alguns agentes delipidantes, L-carnitina e o isômero trans-10 cis-12 do ácido linoleico conjugado (CLA), durante o cultivo na quantidade, qualidade e conteúdo lipídico de embriões bovinos produzidos in vitro. Foram utilizados 2.448 ovócitos de grau 1 e 2 obtidos de ovários de abatedouro, que foram maturados in vitro por 24h a 38,5ºC, 5% de CO2. Após a co-incubação dos complexos cumulus ovócitos (COC) com os espermatozoides (16-18 horas), os possíveis zigotos foram distribuídos em quatro tratamentos: T1) Controle (n=616): meio fluido de oviduto sintético (SOF), suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB); T2) L-carnitina (n=648): meio SOF suplementado com 5% de SFB, acrescido de 0,6 mg mL-1de L-carnitina; T3) CLA (n=627): meio SOF suplementado com 5% de SFB, acrescido de 100 μM de trans-10 cis-12 CLA; e T4) L-carnitina+CLA (n=597): meio SOF suplementado com 5% de SFB, acrescido de 0,6 mg mL-1de L-carnitina e 100 μM de trans-10 cis-12 CLA. As taxas de clivagem e blastocisto foram avaliadas no dia 2 e dia 7 de cultivo e, os blastocistos expandidos (Bx) foram armazenados para quantificação de lipídios utilizando o corante Sudan Black B. Os dados de produção de embriões foram analisados pelo teste Chi-quadrado (P<0,05) e os de quantificação de lipídios por análise de variância (ANOVA) (P<0,05). A taxa de clivagem foi semelhante (P>0,05) entre todos os tratamentos (T1=95±4,3; T2=95±3,5; T3=95±3,7 e T4=95±3,1). A taxa de blastocisto foi superior (P<0,05) no grupo controle do que nos demais tratamentos que não diferiram (P>0,05) entre si tanto no D6 (T1=19±2,7; T2=13±2,4; T3=14±2,6 e T4=13±2,6), quanto no D7 (T1=49±3,5; T2=39±3,0; T3=42±3,9 e T4=39±3,9). Não foi observada diferença entre os tratamentos (P>0,05) quanto à velocidade de desenvolvimento, sendo que em todos os grupos a maioria dos embriões de D7 encontravam-se no estágio de blastocisto expandido. Os embriões do T2 apresentaram menor quantidade de lipídios no citoplasma do que os de T1 (P=0,0138) e de T3 (P=0,0261), sendo que os do T4 foram semelhantes (P>0,05) aos demais tratamentos. Os resultados obtidos indicaram que a suplementação com agentes delipidantes não afeta a qualidade, mas afeta negativamente a produção de embriões. Entretanto, a presença de L-carnitina durante o cultivo in vitro (CIV) diminuiu a quantidade de lipídios sugerindo que sua utilização pode resultar em embriões com maior resistência a criopreservação. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cryopreservation of in vitro produced (IVP) embryosis affected by the high concentrations of lipid droplets that accumulate inside the blastomeres. Therefore, the partial removal of intracytoplasmic lipids by chemical lipolysis stimulation or by decreasing uptake or synthesis of fatty acids by cells can be an alternative to improve cryopreservation of IVP embryos. For that, this study aimed to evaluate the effect of some delipidant agents, L-carnitine and the trans-10 cis-12 isomer conjugated linoleic acid (CLA), during culture on the quantity, quality and lipid content of bovine embryos produced in vitro. A total of 2,448 oocytes graded 1 and 2, obtained from slaughterhouse ovaries were matured in vitro for 24 hours at 38.5 ° C, 5% CO2. After co-incubation (16-18 hours) of sperm and cumulus oocyte complex (COC), the presumptive zygotes were distributed into four treatments: T1) Control (n=616): sinthect oviduct fluid (SOF) medium supplemented with 5% bovine calf serum (FCS); T2) L-carnitine (n=648): SOF medium supplemented with 5% FCS plus 0.6 mg ml-1 of L-carnitine; T3) CLA (n=627): SOF medium supplemented with 5% FCS plus 100 uM trans-10 cis 12 CLA; and T4) L-carnitine + CLA (n=597): SOF medium supplemented with 5% FCS plus 0.6 mg ml-1 of L-carnitine and 100 uM of trans-10 cis-12 CLA. The cleavage and blastocyst rates were evaluated on day 2 and day 7 of culture, and expanded blastocysts (Bx) were stored for lipid quantification by Sudan Black B stain. Embryo production data were analyzed by Chi-square test (P<0.05) and lipids quantification by analysis of variance (ANOVA) (P<0.05). Cleavage rate was similar (P>0.05) among all treatments (T1=95±4.3; T2=95±3.5; T3=95±3.7 e T4=95±3.1). Blastocyst rate was higher (P<0.05) on the control group than the other treatments, wich were similar (P>0.05) among on D6 (T1=19 ± 2.7; T2=13±2.4; T3=14±2.6 and T4=13±2.6) and on D7 (T1=49±3.5; T2=39±3.0; T3=42±3.9 and T4=39±3.9). There was no difference between treatments (P>0.05) on the development speed, and for all treatments the majority of D7 embryos were already on expanded blastocyst stage. Embryos from T2 showed lower cytoplasmic lipids than those from T1 (P=0.0138) and T3 (P=0.0261), being T4 similar to all treatments. The results suggested that supplementation with delipidant agents had not affected quality but had negatively affected embryo production. However, the presence of L-carnitine during in vitro culture (CIV) decreased the amount of lipids, suggesting that its use can result in bovine IVP embryos more resistant to cryopreservation.