La dystrophie Facio-Scapulo-Humérale (FSHD) fait partie des maladies musculaires génétiques les plus fréquentes. Elle se caractérise par une dégénérescence progressive et asymétrique d’un groupe spécifique de muscles striés squelettiques, dont principalement les muscles faciaux, scapulaires et huméraux. D’un point de vue génétique, la FSHD est une maladie multifactorielle qui résulte d’évènements génétiques situés sur la région sub-télomérique du chromosome 4, ainsi que d’évènements épigénétiques altérant l’organisation chromatinienne du locus 4q35. Ces anomalies provoquent une relaxation chromatinienne et une surexpression de la majorité des gènes du locus 4q35, dont DUX4, gène majeur impliqué dans la FSHD. Les répercussions de l’ensemble de ces altérations se traduisent notamment par une dérégulation de la signature transcriptionnelle des myoblastes primaires issus des patients FSHD, et par des anomalies de leur différenciation myogénique in vitro et leur hypersensibilité au stress oxydant. Plusieurs aspects de la maladie demeurent incompris, et la complexité de cette myopathie rend difficile le choix d’une stratégie thérapeutique optimale. Cependant, la découverte des outils de l’édition du génome et la multiplication de leurs applications à visée thérapeutique dans le cadre de maladies humaines, notamment les myopathies, ouvre de nouvelles perspectives pour la FSHD qui reste, jusque-là, incurable.Le travail de thèse a concerné, dans un premier temps, l’implication des dommages de l’ADN et du stress oxydant dans la pathophysiologie de la FSHD. Nous avons mis en évidence l’omniprésence de ces caractéristiques cellulaires dans les myoblastes FSHD, leur lien à l’expression aberrante de DUX4 et leur participation à la morphologie défectueuse des myotubes FSHD in vitro. Dans un second temps, le travail de thèse a consisté à concevoir et à développer des outils de l’édition génomique et épigénomique, capables de cibler spécifiquement un des évènements génétiques causal de la FSHD, le variant pathogénique 4qA161 touchant un site d’attachement à la matrice nucléaire, FR-MAR. A partir de ces outils développés, deux stratégies de corrections génomique et épigénomique à visée thérapeutique peuvent être alors envisagées in vitro, ayant pour but ultime de rétablir la fonction d’insulation de FR-MAR et la conformation chromatinienne de la région 4q35. / Facioscapulohumeral dystrophy (FSHD) is one of the most common genetic myopathies characterized by a progressive and asymmetric weakening of a specific group of skeletal muscles, typically facial, shoulder girdle and upper arms muscles. FSHD is a multifactorial disease that results from the combination of genetic and epigenetic events mapped at the 4q35 locus. These genetic and epigenetic alterations lead to chromatin relaxation and the subsequent overexpression of the majority of 4q35 genes, notably DUX4, the major actor in FSHD pathology. These genomic alterations lead to molecular and cellular defects observed in vitro. Cultured-FSHD myoblasts show a distinct transcription profile, they exhibit morphological differentiation defects and are sensitive to oxidative stress. Several aspects of the disease remain poorly understood, and the elaboration of an appropriate therapeutic strategy is limited by the complexity of this myopathy. However, the discovery of genome editing tools and their successful therapeutic applications in vitro and in animal models of several human diseases, including myopathies, open doors to potential therapeutic strategies for FSHD.This work highlighted the involvement of DNA damage and oxidative stress in the pathophysiology of FSHD, by revealing their constitutive presence in FSHD myoblasts, their link to DUX4 expression and their participation in morphological defects of FSHD myotubes observed in vitro. The second part of this work was aimed at developing genome- and epigenome-editing tools capable of specifically targeting one of the genetic events causing FSHD, a pathogenic variant 4qA161 that contains an insulator and a nuclear matrix attachment site (FR-MAR). These engineered tools will be then used to develop in vitro therapeutic strategies, with the intention of restoring the insulator activity of FR-MAR and the chromatin organization of 4q35 locus.

La dystrophie Facio-Scapulo-Humérale est caractérisée par une faiblesse musculaire progressive et asymétrique. Elle affecte principalement les muscles faciaux, scapulaires et huméraux. L’association de plusieurs évènements épigénétiques à trois facteurs génétiques de la région subtélomérique du chromosome 4 résulte en un changement dans l’organisation chromatinienne la rendant permissive à l’expression aberrante des gènes de la région 4q35. Les myoblastes DFSH présentent des défauts de différenciation in vitro et des dérégulations dans des voies majeures comme celle de la réponse cellulaire au stress oxydant et de la différenciation myogénique. L’enjeu génétique et épigénétique complexe dans la DFSH et les limitations de la thérapie cellulaire dans son contexte laissent la DFSH jusque-là incurable. Toutefois les avancées dans les thérapies cellulaires et génétiques des myopathies ouvrent des horizons pour de futures applications dans le cadre de la DFSH.Le travail de thèse s’articule autour de trois thématiques. Premièrement, nous démontrons la faisabilité de la correction phénotypique et fonctionnelle des myotubes DFSH in vitro par la fusion de 50% de myoblastes normaux avec des myoblastes DFSH. Ensuite, nous évaluons deux approches d’édition génomique. Dans la première approche, nous ciblons le site de rattachement du chromosome 4 à la matrice nucléaire, FR-MAR avec la protéine CTCF à l’aide du système CRISPR/dCas9 en vue du rétablissement de l’organisation chromatinienne et de la fonction isolatrice de FR-MAR. Dans la deuxième, nous échangeons par translocation les régions homologues 4q35 et 10q26 dans le but de corriger les myoblastes DFSH comme les trois facteurs génétiques du locus 4q35 ne sont pathogéniques que sur un fond génétique lié au chromosome 4. Finalement, nous étudions le rôle du stress oxydant dans la DFSH. / Facio-Scapulo-Humeral dystrophy is characterized by progressive and asymmetrical muscle weakness. It mainly affects the facial, scapular and humeral muscles. The association of several epigenetic events with three genetic factors of the subtelomeric region of chromosome 4 results in a chromatin organization modification making it permissive to the aberrant expression of genes in the 4q35 region. FSHD myoblasts exhibit differentiation defects in vitro and dysregulations in major pathways such as the cellular response to oxidative stress and myogenic differentiation. The limitations of cell therapy and the complex genetic and epigenetic interplay in FSHD leave it, till now, incurable. However advances in cellular and genetic therapies of myopathies open up new horizons for future applications in the FSHD context. The thesis work is structured around three themes. First, we demonstrate the feasibility of phenotypic and functional correction of FSHD myotubes in vitro by fusing 50% of normal myoblasts with FSHD myoblasts. Next, we evaluate two genomic editing approaches. In the first one, we target the site of attachment of chromosome 4 to the nuclear matrix, FR-MAR with the CTCF protein using the CRISPR / dCas9 system for the purpose of restoring the chromatin organization and the insulating function of FR-MAR. In the second one, we exchange the homologous regions 4q35 and 10q26 by translocation in order to correct the FSHD myoblasts as the three genetic factors of the 4q35 locus are pathogenic only on a genetic background linked to chromosome 4. Finally, we study the role of the oxidative stress in the FSHD.

Même si les acteurs majeurs du développement musculaire ont été identifiés et les voies de transductions décrites, d’autres régulateurs restent encore à découvrir. Un crible ARNi pratiqué sur un modèle cellulaire couramment utilisé, la lignée myoblastique C2C12, a identifié 20 nouveaux gènes potentiellement impliqués dans la myogenèse in vitro. Au cours de ma thèse, deux de ces gènes ont été invalidés sur modèle souris en utilisant la technologie CRISPR/Cas9 pour valider in vivo leur implication. Pour l’un d’entre eux, seuls les animaux hétérozygotes ont pu être étudiés puisqu’une létalité précoce a été observée chez les homozygotes mutés. Aucune anomalie du développement musculaire n’a été mise en évidence. Une étude plus fine dans les premières phases du développement embryonnaire nous a permis de montrer le rôle indispensable de cette protéine précocement. L’étude du second gène – dont les analyses se poursuivent – semble confirmer in vivo le rôle de ce gène au cours de la myogenèse. Pour éviter la survenue de létalité embryonnaire et observer rapidement les effets de l’invalidation d’autres gènes, une technique de transgenèse somatique s’appuyant sur l’ARN interférence a été mis en place via l’injection de lentivirus contenant une cassette d’expression de shRNA directement dans le tibialis antérieur des souris. La validation de cette approche a été faite sur le gène de la myostatine, régulateur négatif du développement musculaire, et a montré une diminution de l’expression du gène associée à une augmentation de l’aire des fibres musculaires. La même approche appliquée à trois autres gènes renforce l’hypothèse de l’implication d’un des gènes dans le développement musculaire. Cette approche permet donc un crible rapide « in vivo » de gènes identifiés in vitro. Cependant, certaines améliorations doivent être apportées au protocole au regard des résultats obtenus. / Even if the major actors and transduction pathways of muscle development have been identified, there are still unknown regulatory factors. An in vitro RNAi screening performed on C2C12 myoblastic cells has permitted to identify 20 novel genes potentially implicated in myogenesis. During my thesis, two of these genes were invalidated on mouse model using CRISPR/Cas9 technology in order to confirm their implication in vivo. For the first gene, due to an early lethality occurring in homozygous mutated animals, only heterozygous animals were studied and there was no muscular development anomaly detected. A refined study of earlier stages of embryonic development permitted to show the essential role of the protein in these phases. The study of the second gene, still in progress, seems to confirm in vivo the implication of the gene on the myogenesis. In order to avoid embryonic lethality due to germline invalidation and to observe more rapidly the effects of gene invalidation in muscle, we developed a technique of somatic transgenesis based on RNA interference. Lentivirus containing a shRNA expression cassette was injected directly into the tibialis anterior of mice. We validated this approach on Myostatin gene, a well-known negative regulator of muscle development, showing that the decrease of Myostatin gene expression was associated to an increase of muscle fibers area. The same approach was used with three genes and support the hypothesis of the implication of one of them in muscle development. Thus, this approach allows a rapid “in vivo” screening of in vitro identified genes. Nonetheless, some improvements should be brought on the protocol according to the first results.

Au cours de l'évolution, les cellules eucaryotes ont acquis une enveloppe nucléaire (NE) renfermant et protégeant le génome organisé en chromatine, une structure où l'ADN s’enroule autour de protéines histones. La NE est composé de deux membranes : du côté nucléoplasmique, la membrane nucléaire interne (INM) et du côté cytoplasmique, la membrane nucléaire externe. La NE permet la communication entre les deux compartiments par le biais des complexes de pores nucléaires et relie le cytosquelette au nucléosquelette via le complexe LINC (LInker of Nucleoskeleton to Cytoskeleton). Ainsi, le nucléosquelette associé à l'INM est nécessaire pour transmettre des signaux au noyau et induire des changements dans l'organisation de la chromatine et finalement dans l'expression des gènes.Une nouvelle famille de protéines associées à l'enveloppe nucléaire (NEAP),proposées comme nouveaux composants du nucléosquelette de la plante, a récemment été mise en évidence dans la plante modèle Arabidopsis thaliana. Ces protéines sont codées par une famille de trois gènes et sont ciblées vers le noyau via un NLS où elles sont ancrées à l'INM via leur domaine transmembranaire C-terminal. Les protéines AtNEAPs possèdent également plusieurs longs domaines en spirale (coiled-coil) rappelant la structure des lamines chez les animaux. Cette thèse visait à réaliser une analyse fonctionnelle des AtNEAPs à l'aide de lignées mutantes T-DNA et CRISPR/Cas9. L'interactome AtNEAP a été étudié par des approches moléculaires (Yeast Two Hybrid), indiquant des interactions entre AtNEAPs pouvant former des homo- ou hétéro-dimères; ainsi que la localisation et la co-localisation in vivo couplées à de l’imagerie (apFRET), qui ont confirmé les interactions avec le facteur de transcription (TF) AtbZIP18. Les anticorps spécifiques à AtNEAP générés au cours de cette étude ont été utilisés pour confirmer l'expression in vivo. En outre, les résultats ont indiqué que les AtNEAPs font partie du nucléosquelette et jouent un rôle dans l’ancrage des TF à l’INM afin de maintenir la morphologie nucléaire et l’organisation de la chromatine. / During evolution, eukaryotic cells have acquired a nuclear envelope (NE) enclosingand protecting the genome, which is organized in chromatin, a structure wrapping DNAaround histone proteins. The NE is composed of two membranes: on the nucleoplasmic side,the Inner Nuclear Membrane (INM) and on the cytoplasmic side, the Outer NuclearMembrane. The NE allows communication between both compartments through Nuclear PoreComplexes and bridges the cytoskeleton to the nucleoskeleton through the LInker ofNucleoskeleton to Cytoskeleton complex. Thus, the nucleoskeleton associated with the INMis needed to transmit signals to the nucleus and induce changes in chromatin organisation andultimately gene expression.A novel family of NUCLEAR ENVELOPE ASSOCIATED PROTEINS (NEAPs)proposed to be new components of the plant nucleoskeleton has been recently evidenced inthe model plant Arabidopsis thaliana. AtNEAP proteins are encoded by a small gene familycomposed of three genes and are targeted through a nuclear localisation signal to the nucleuswhere they are anchored at the INM through their C-terminal transmembrane domain.AtNEAPs also possess several long coiled-coil domains reminiscent of the lamin structure inanimals. This thesis aimed at performing a functional analysis of AtNEAPs using T-DNAinsertion and CRISPR/Cas9 mutant lines. The AtNEAP interactome was investigated bymolecular approaches (Yeast Two Hybrid), which indicated AtNEAP interactions with eachother to form homo or hetero-dimers; as well as in vivo localisation and co-localisationcoupled to image analyses (apFRET, acceptor photobleaching Fluorescence ResonanceEnergy Transfer), which confirmed interactions with the transcription factor (TF) AtbZIP18.AtNEAP specific antibodies generated during this study were used to confirm expression invivo. Altogether, results indicated that AtNEAPs are part of the nucleoskeleton, with a role inanchoring TFs at the INM to maintain nuclear morphology and chromatin organisation.

The protozoan parasite Leishmania (Viannia) braziliensis (L. braziliensis) is the main cause of human tegumentary leishmaniasis in the New World, a disease affecting the skin and/or mucosal tissues. Despite its importance, the study of the unique biology of L. braziliensis through reverse genetics analyses has so far lagged behind in comparison with Old World Leishmania spp. In this study, we successfully applied a cloning-free, PCR-based CRISPR–Cas9 technology in L. braziliensis that was previously developed for Old World Leishmania major and New World L. mexicana species. As proof of principle, we demonstrate the targeted replacement of a transgene (eGFP) and two L. braziliensis single-copy genes (HSP23 and HSP100). We obtained homozygous Cas9-free HSP23-and HSP100-null mutants in L. braziliensis that matched the phenotypes reported previously for the respective L. donovani null mutants. The function of HSP23 is indeed conserved throughout the Trypanosomatida as L. major HSP23 null mutants could be complemented phenotypically with transgenes from a range of trypanosomatids. In summary, the feasibility of genetic manipulation of L. braziliensis by CRISPR–Cas9-mediated gene editing sets the stage for testing the role of specific genes in that parasite’s biology, including functional studies of virulence factors in relevant animal models to reveal novel therapeutic targets to combat American tegumentary leishmaniasis. / Alexander von Humboldt-Stiftung / Revisión por pares

Meis transcription factors belong to the group of TALE (three amino acids loop extension) homeodomain proteins. Meis2 proteins have a potential role in regulation of neural crest cells development and in differentiation of their derivates. Zebrafish genome has two paralogues of meis2 gene, meis2a and meis2b. CRISPR/Cas9 technology was used to prepare mutant lines of both paralogues, meis2a and meis2b, for the purpose of study of function of Meis2 transcription factors. Specific morpholinos that reduce the expression of meis2a and meis2b were used as controls. Craniofacial and cardiac development in mutant fish was analyzed in the meis2a line by RNA in situ hybridization, histological cartilage staining, and computed tomography. While we observed impaired craniofacial and cardiac development after injection of specific Morpholinos, we did not detect similar changes in the meis2a KO line. Our genetic approach has not clearly shown that the meis2a paralogue itself plays an important role in craniofacial development and cardiac development. For more detailed analysis, further experiments on fish lines with combined meis2a and meis2b knock-outs are needed. Key words Mutagenesis CRISPR, Danio rerio, neural crest cells, Meis2, transcription factor

La caractérisation des tumeurs malignes et la compréhension des mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux sont essentielles pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. Les criblages génétiques, devenus encore plus puissants avec la technologie d’édition du génome CRISPR-Cas9, le séquençage nouvelle génération et la bioinformatique, sont des outils formidables pour décrypter de nouveaux mécanismes cellulaires, dont la résistance au traitement. La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un syndrome myéloprolifératif qui est caractérisé par l’anomalie génétique t(9;22). Cette aberration chromosomique est à l’origine du gène de fusion BCR-ABL1 qui code l’oncogène du même nom responsable de la prolifération anarchique des cellules. L’imatinib mesylate, un inhibiteur de tyrosine kinase, élimine de manière spécifique les cellules leucémiques en ciblant et en bloquant l’activité kinase de cette protéine. Malheureusement, comme pour tout type de thérapie ciblée, une résistance au traitement survient chez certains patients. Afin de repérer des nouvelles voies de résistance à cet inhibiteur de tyrosine kinase, nous avons effectué un criblage génétique avec la librairie « genome-scale CRISPR knock-out » (GeCKO v2) in vitro dans la lignée cellulaire K562. Nous avons découvert plusieurs gènes qui semblent être essentiels pour la réponse au traitement par imatinib, tels que les facteurs pro-apoptotiques BIM et BAX, ou le répresseur de la voie des MAPK, SPRED2. Le rétablissement spécifique de l’apoptose dans les cellules BIM knock-out (KO) par des BH3-mimétiques, ou l’inhibition ciblée de la voie MAPK dans la lignée SPRED2 KO sensibilise de nouveau les lignées résistantes. Dans ce travail, nous avons découvert des mécanismes de résistance déjà connus (l’apoptose, la voie MAPK…) mais nous avons également démontré l’implication de voies peu connues telles que le complexe Mediator, la maturation de ARNm et l’ubiquitinylation de protéines. Spécifiquement cibler ces lésions génétiques avec des thérapies ciblées combinées peut permettre de surmonter les phénotypes de résistance et ouvre la porte à l’utilisation de l’oncologie de précision. / The characterization of malignant tumour growth and the understanding of resistance mechanisms to treatment in cancer is of utmost importance for the discovery of novel “druggable” targets. Efficient genetic screening, now even more possible with the convergence of CRISPR-Cas9 gene editing technology, next-generation sequencing and bioinformatics, is an important tool for deciphering novel cellular processes, such as resistance to treatment in cancer. Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder characterised by the t(9;22) genetic abnormality, which encodes the driver of CML, the BCR-ABL1 fusion protein. Imatinib mesylate, a tyrosine kinase inhibitor, specifically eliminates CML cells by targeting and blocking the kinase activity of this protein, yet, as for all targeted therapies in cancer, resistance to treatment exists. In order to discover alternative BCR-ABL1 independent mechanisms of imatinib resistance, we utilized the genome-scale CRISPR knock-out library GeCKO v2 to screen for imatinib sensitising genes in vitro on K562 cells. We revealed genes that seem essential for imatinib induced cell death, such as pro-apoptotic genes (BIM, BAX) or MAPK inhibitor SPRED2. Specifically re-establishing apoptotic capabilities in BIM knock-out (KO) cells with BH3-mimetics, or inhibiting MAP-kinase signalling in SPRED2 KO cells with MEK inhibitors restores sensitivity to imatinib, overcoming resistance phenotypes. In this work, we discovered previously identified pathways (apoptosis, MAP-kinase signalling) and novel pathways that modulate response to imatinib in CML cell lines, such as the implication of the Mediator complex, mRNA processing and protein ubiquitinylation. Targeting these specific genetic lesions with combinational therapy can overcome resistance phenotypes and paves the road for the use of precision oncology.

Les translocations chromosomiques sont associées à un grand nombre de cancers. Les translocations chromosomiques sont impliquées dans la tumorigenèse par différents mécanismes : elles conduisent soit à une dérégulation d’un oncogène, soit à la formation d’un nouvel oncogène de fusion. Cependant, le lien direct entre l'apparition d'une translocation chromosomique et la formation d'une tumeur n'est pas totalement établi. Par exemple, plusieurs translocations associées au cancer ont été détectées dans le sang d’individus sains voire dans le sang de cordon des bébés avec une prévalence bien supérieure à celle de la maladie. Ceci suggère que la seule formation de la translocation ne suffit pas toujours à induire l’oncogenèse. La plupart des travaux de recherche antérieurs reposaient sur la surexpression de la protéine de fusion, oncogène supposé. Ces approches présentent de nombreuses limites, la translocation chromosomique est alors absente de même que le contexte chromosomique natif du gène de fusion (promoteur endogène, statut de la chromatine, etc.) ou les éventuels effets d’haplo-insuffisance qui ne sont pas récapitulés. La molécule d’ADN étant organisée de manière non aléatoire dans le noyau, les réarrangements chromosomiques sont également susceptibles d’affecter le statut épigénétique, la réplication et la transcription du chromosome dérivatif entier, en plus des segments d’ADN nouvellement juxtaposés. Or la technologie CRISPR/Cas9, permet de reproduire la translocation chromosomique in situ, après avoir induit deux cassures double-brin simultanées. Ce travail de thèse a porté spécifiquement sur la translocation t(2,5) (p23, q35) qui induit l’expression de la protéine de fusion NPM1-ALK fréquemment rencontrée dans le lymphome anaplasique à grandes cellules (ALCL). Nous avons reproduit la t(2,5) à la fois dans des lignées cellulaires mais aussi dans des cellules T primaires à la fin de ma thèse. Nous avons pu montrer des modifications significatives du timing de réplication des cellules qui portent la translocation en comparaison des cellules isogéniques de départ (par la méthode du Répli-seq) pouvant avoir un impact sur l’homéostasie des cellules tumorales. En parallèle, nous avons mis en évidence la formation d'ARN circulaires de fusion spécifiques, exprimés à partir du gène de fusion, spécifiques des lignées tumorales. Ces ARN circulaires pourraient donner naissance à de nouveaux biomarqueurs diagnostic/pronostic dans le futur. Ces travaux permettront de mieux comprendre les conséquences des translocations chromosomiques oncogéniques dans les cellules humaines et pourraient mener vers de nouvelles orientations thérapeutiques à l’avenir. / Chromosomal translocations are associated with a wide range of cancers. These chromosomal rearrangements are implicated in tumorigenesis by different mechanisms: either they lead to oncogene upregulation or tumor suppressor downregulation. However, the direct link between the appearance of one chromosomal translocation and tumor formation is not always clear. For example, several cancer translocations have been found in PBMCs or in cord blood cells from healthy individuals, suggesting that translocation formation alone is not always sufficient to drive oncogenesis. Most of previous research works on cancer translocation relied on studies using overexpression of the fusion protein. These approaches do not reproduce the chromosome arm translocation nor the chromosomal context of the fusion gene (endogenous promotor, chromatin status etc…) or do not recapitulate a potential haplo-insufficiency of the translocated cells. Because the DNA molecule is organized non-randomly in the nucleus, chromosomal rearrangements are also likely to impact the epigenetic, replication and transcriptional status of the whole rearranged chromosome in addition to the newly juxtaposed gene segments. Using CRISPR/Cas9 technology, we can recapitulate chromosomal translocation in situ, after inducing 2 concurrent double-strand breaks. In this work, we focus on t(2,5)(p23,q35) leading to NPM1-ALK fusion protein frequently found in Anaplasic Large Cell Lymphoma (ALCL). We could recapitulate t(2;5) in cell lines but more importantly in human primary T cells from healthy donors. We showed significant modifications on Replication Timing in model cell lines compare to isogenic non-translocated cells (using Repli-seq analysis). Importantly, these changes might have a direct impact on tumor cell homeostasis. In parallel, we also highlighted the formation of specific fusion circular RNAs expressed from the fusion gene also found in tumor cells. These circular RNAs could give rise to new diagnostic/prognostic biomarkers in the future. This work will lead to a better understanding of the consequences of cancer translocation in human cells and could give new directions for therapeutics in future.

Le neuroblastome est cancer du jeune enfant se développant au sein du système nerveux périphérique sympathique. Cette tumeur est caractérisée par sa grande hétérogénéité clinique : allant de formes régressant spontanément aux tumeurs de haut-risque, réfractaires aux traitements les plus agressifs. La survie à long terme des patients présentant un neuroblastome de haut-risque reste par ailleurs inférieure à 50%, ce qui souligne la nécessité de trouver de nouveaux traitements afin d’améliorer leur prise en charge thérapeutique.Récemment, en définissant le paysage épigénétique des cellules de neuroblastome, nous avons observé la présence de super-enhancers (SE). La caractérisation du paysage des SE dans les lignées de neuroblastome nous a permis de révéler l’hétérogénéité cellulaire du neuroblastome, composée de deux identités distinctes : noradrénergique et mésenchymateuse. Chacune des identités cellulaires est caractérisée par un circuit de régulation transcriptionnelle (CRC) : les facteurs PHOX2B, HAND2 et GATA3 définissent l’identité noradrénergique alors que les facteurs de la famille AP-1 gouvernent l’identité mésenchymateuse. Nous avons par ailleurs montré la différence de sensibilité aux chimiothérapies classiquement utilisées en clinique entre ces deux types cellulaires, avec une résistance accrue des cellules mésenchymateuses.Mon travail de thèse porte sur la caractérisation du rôle des facteurs de transcription PHOX2B et GATA3 dans l’établissement et le maintien de l’identité noradrénergique des cellules de neuroblastome. J’ai réalisé leur knock-out par CRISPR-Cas9 dans la lignée noradrénergique SH-SY5Y. L’inactivation de PHOX2B ne modifie ni le programme transcriptionnel ni le phénotype des cellules, arborant une identité noradrénergique. En revanche, les cellules inactivées pour GATA3 possèdent un phénotype cellulaire mésenchymateux ainsi que des capacités de migration, d’invasion et de résistance aux chimiothérapies. Le knock-out de PHOX2B et GATA3 entraine une diminution de la prolifération cellulaire, traduisant le phénomène d’addiction transcriptionnelle des cellules cancéreuses. La caractérisation du paysage épigénétique des cellules inactivées pour GATA3 démontre leur reprogrammation de l’identité noradrénergique vers l’identité mésenchymateuse avec l’effondrement des SE noradrénergiques ainsi que l’acquisition de SE mésenchymateux. GATA3 est donc indispensable pour le maintien de l’identité noradrénergique in vitro.Les résultats générés lors de ma thèse montrent que les facteurs de transcription impliqués dans un même CRC possèdent des rôles distincts dans l’identité cellulaire. La caractérisation de la dynamique de reprogrammation ainsi que des facteurs impliqués dans ce processus nous permettrons de mieux comprendre les phénomènes de plasticité cellulaire à l’origine de la progression tumorale et de la rechute thérapeutique des patients. / Neuroblastoma is a pediatric tumor of the peripheral sympathetic nervous system characterized by its diversity of clinical presentations from spontaneous regression to highly aggressive tumors. Currently, the overall survival of high-risk neuroblastoma patients remains under 50% which highlight the need to find new therapeutic approaches to improve patient outcome.Recently, we defined the epigenetic landscape of neuroblastoma cell lines and observed the presence of super-enhancers (SE). The characterization of the SE landscape let us to define the heterogeneity of neuroblastoma cell identity with the presence of noradrenergic and mesenchymal cells. Both cell identities are governed by a core regulatory circuitry (CRC), composed by PHOX2B-HAND2-GATA3 in the noradrenergic cells and by AP-1 transcription factors in the mesenchymal cells. We also demonstrate the different behaviors of the cells regarding chemotherapy treatments with a higher resistance of the mesenchymal cells.My thesis aimed at deciphering the role of PHOX2B and GATA3 transcription factors in the establishment and the maintenance of the noradrenergic identity of neuroblastoma cells. To do this, PHOX2B and GATA3 were knock-out by CRISPR-Cas9 in the noradrenergic SH-SY5Y cell line. PHOX2B knock-out has no major impact neither on the transcriptomic profile nor the phenotype of the cells. PHOX2B knock-out cells still maintain their noradrenergic identity. In contrast, GATA3 knock-out cells harbor a mesenchymal phenotype showing higher ability to migrate, invade and being pore resistant to chemotherapy than control SH-SY5Y cells. Both PHOX2B and GATA3 knock-out decrease the SH-SY5Y cell proliferation in vitro and in vivo, which highlight the transcriptional dependency of the noradrenergic cells for their identity-related transcription factors. The characterization of the epigenetic landscape of GATA3 knock-out cells revealed their reprograming from the noradrenergic to the mesenchymal identity with the loss of noradrenergic SE and the acquisition of mesenchymal SE. These results demonstrate that GATA3 is essential for the maintenance of the noradrenergic identity in vitro.Altogether, these results show that transcription factors involved in a CRC can have distinct role in the cell identity. The characterization of the reprogramming dynamics as well as the factors involved in this process will allow us to better understand the cellular plasticity involved in the tumor progression and patient relapse.

The DNA origami method was established by Paul Rothemund in 2009. It allows to produce self-assembling 2D nanostructures with precise geometry and tunable mechanical properties that can be equipped with a broad range of functionalizations. It was extended to 3D by the group of William Shih in 2009 which also presented caDNAno, a software that made the design of nanostructures easier and more accessible. Since then, DNA origami nanostructures were utilized in a broad range of applications, which enabled unprecedented insight into mechanisms and processes of biological systems at the nanoscale. In this thesis multiple nanostructures were designed and manufactured to perform studies at the single-molecule level, which yielded a number of scientifically relevant contributions in the fields of biophysics and nanotechnology. Development of DNA origami nanostructures to mimic the properties and function of membrane proteins As a first application, DNA origami nanostructures with defined geometric and mechanical properties were designed, that mimic the behaviour and function of membrane proteins. To this end, rod-shaped nanostructures were equipped with precisely placed, lipid-integrating cholesterol modifications as well as fluorescent dyes. Subsequently their interaction with lipid membranes was studied. It was found that the prepared nanostructures specifically bound to lipid membranes and could diffuse on their surface, for which the rotational and translational diffusion coefficients were determined. The presence of magnesium thereby promoted the nanostructures to migrate into specific lipid domains in a reversible, switchable manner. Furthermore, their high aspect ratio allowed to investigate crowding effects, which are considered important mechanisms for the self-organisation of membrane proteins. In addition, block-shaped DNA origami nanostructures that organized into micrometre-sized super-structures were designed and produced. They were capable of deforming lipid membranes on the scale of micrometres in a similar fashion to biological counterparts. Establishing ultra-fast twist and torque measurements using DNA origami nanorotors In an additional application, DNA origami nanorotors were developed to perform ultra-fast single-molecule twist and torque measurements, allowing to resolve subtle changes in real-time. This also required the development of a new measurement setup that extended magnetic tweezers with the capability to detect the scattered light of gold nanoparticles. Hence, a complex setup was constructed and calibrated that enabled magnetic tweezers measurements with up to 4 kHz and simultaneously track gold nanoparticles at 4 kHz as well. In an alternative configuration the setup allowed simultaneous magnetic tweezers and single-molecule fluorescence and FRET measurements. DNA origami nanorotors which were embedded within DNA constructs and carried the gold nanoparticles were then obtained and used to perform ultra-fast twist and torque measurements. This constituted improvements in the spatio-temporal resolution over previous methods by one to three orders of magnitude, as demonstrated by direct measurements on the torsional response of DNA to external twists and the unwinding of DNA by an enzyme. Direct measurements of the energy landscape and dynamics of the R-loop formation by the CRISPR-Cas surveillance complex Cascade Using the DNA origami nanorotor enhanced ultra-fast twist measurements, the target recognition process of the CRISPR-Cas surveillance complex Cascade was directly observed. Effector complexes of CRISPR-Cas systems have been widely applied in genome editing recently, since they can be programmed to bind practically any genomic target by their intrinsic RNA (crRNA) component. They have, however, considerable tolerance for mismatches between their RNA and their intended DNA target. For Cascade, after binding with a protein motif to a DNA target, base-pairing between crRNA and the double-stranded DNA target is initiated, resulting in the formation of an R-loop structure which leads to unwinding of the DNA. This was directly measured using the nanorotor, which provided unprecedented insight in the R-loop formation by Cascade, allowing to determine the underlying energy landscape and the dynamics of the process. It was shown that R-loop progression occurs on 6-bp kinetic intermediate steps with an underlying single base pair stepping on fast time scales. Furthermore the effect of mutations in the target DNA on the R-loop formation process was investigated, indicating that the global shape of the energy landscape allows for a highly specific kinetic discrimination of mismatched targets. Investigations into the locking transition, a conformational change that occurs after the full formation of the R-loop and is a prerequisite for subsequent DNA degradation, completed the study. Overall, the findings provide a better understanding of the target recognition process of Cascade, which will contribute to the construction of more precise gene-editing tools in the future. Furthermore, the nanorotor-assisted measurements are applicable to many twist and torque inducing mechanisms and processes that can be investigated in further studies.:1. Introduction 2. Multifunctional magnetic tweezers 3. Applications of DNA origami 4. Ultra-Fast torque measurements on supercoiled DNA 5. R-loop dynamics of the CRISPR-Cas Cascade complex 6. Summary and Discussion Bibliography List of Figures List of Tables List of Publications A. Appendix / Die DNA Origami Methode wurde im Jahr 2006 durch Paul Rothemund begründet. Sie erlaubt es selbst-assemblierende 2D Nanostrukturen mit präzisen Geometrien und kalibrierbaren mechanischen Eigenschaften zu erstellen, die zudem mit einer Vielzahl an Funktionalisierungen ausgestattet werden können. Die Methode wurde 2009 in der Gruppe von William Shih auf 3D Nanostrukturen erweitert, wobei zudem caDNAno präsentiert wurde, eine Software die die Erstellung solcher Nanostrukturen wesentlich einfacher und zugänglicher machte. Seitdem wurden DNA Origami Nanostrukturen in vielfältigen Anwendungen genutzt, die nie dagewesene Einblicke in Mechanismen und Prozesse von biologischen Systemen auf der Nanoskala erlaubten. In dieser Arbeit wird anhand mehrerer Beispiele gezeigt, wie solche Nanostrukturen genutzt werden können, um Studien auf der Einzelmolekül-Ebene durchzuführen. Entwicklung von DNA Origami Nanostrukturen, welche die Eigenschaften und Funktionen von Membranproteinen imitieren In einer ersten Anwendung wurden DNA Origami Nanostrukturen mit definierten geometrischen und mechanischen Eigenschaften entworfen, welche das Verhalten und die Funktion von Membranproteinen nachahmten. Dazu wurden stabförmige Nanostrukturen mit präzise platzierten, lipidintegrierenden Cholesterinmodifikationen und fluoreszierenden Farbstoffen ausgestattet. Anschließend wurde ihre Interaktion mit Lipidmembranen untersucht. Es zeigte sich, dass die Nanostrukturen spezifisch an Lipidmembranen binden und auf deren Oberfläche diffundieren konnten. Hierbei wurden die Diffusionskoeffizienten der Rotations- und Translationsbewegungen bestimmt. Zudem bewirkte die An- oder Abwesenheit freier Magnesiumionen die steuerbare und reversible Anreicherung in verschiedenen Lipiddomänen. Die längliche Form der Nanostrukturen erlaubte es zudem, Verdrängungseffekte zu untersuchen, die als wichtiger Mechanismus für die Selbstorganisation von Membranproteinen gelten. Des weiteren wurden blockartige, multimerisierende DNA Origami Nanostrukturen entwickelt, die mikrometer-große Superstrukturen bilden konnten. Im ähnlichen Maße wie biologische Vorbilder, waren diese Strukturen in der Lage, Lipidmembranen über mehrere Mikrometer hinweg zu verformen. Etablierung ultraschneller Verdrehungs- und Torsionsmessungen mit DNA Origami Nanorotoren In einer weiteren Anwendung wurden DNA Origami Nanorotoren entwickelt, um ultraschnelle Einzelmolekül-Verdrehungs- und Torsionsmessungen durchzuführen, bei denen kleinste Veränderungen in Echtzeit beobachtet werden konnten. Dazu wurde eine neue Messapparatur entwickelt, bei der eine Magnetische Pinzette um die Fähigkeit Goldnanopartikeln zu detektieren erweitert wurde. Dies erlaubte die Konstruktion und Kalibrierung eines komplexen Messaufbaus, mit dem es möglich war Magnetische-Pinzetten-Messungen mit 4 kHz durchzuführen und gleichzeitig Goldnanopartikel mit ebenfalls 4 kHz zu verfolgen. Zudem konnten in einer alternativen Konfiguration Magnetische-Pinzetten-Messungen mit Einzelmolekül-Fluoreszenz- und FRET-Messungen kombiniert werden. Mit Goldnanopartikeln funktionalisierte DNA-Origami-Nanorotoren wurden anschließend in DNA-Konstrukte eingebettet und mit Hilfe des Messaufbaus für ultraschnelle Verdrehungs- und Torsionsmessungen genutzt. Gegenüber vorheriger Methoden wurde dadurch die räumlich-zeitliche Auflösung um eine bis drei Größenordnungen verbessert. Dies wurde anhand der Bestimmung der Torsionsreaktion von DNA auf Verdrehungen sowie deren Entwindung durch ein Enzym demonstriert. Direkte Bestimmung der Energielandschaft und Dynamiken der R-loop Entstehung des CRISPR-Cas Überwachungskomplexes Cascade Die entwickelten DNA Origami Nanorotoren ermöglichten zudem ultraschnelle Verdrehungsmessungen durchzuführen, um den Zielerkennungsprozess des CRISPR-Cas Überwachungskomplexes Cascade direkt zu beobachten. Effektorkomplexe von CRISPR-Cas Systemen werden zunehmend als Geneditierwerkzeuge eingesetzt, da sie aufgrund ihrer intrinsischen RNA-Komponente (crRNA) darauf programmiert werden können an praktisch jede DNA-Sequenz zu binden. Allerdings zeigen Sie eine beträchtliche Toleranz gegenüber Abweichungen zwischen der Sequenz ihrer RNA und der bestimmungsgemäßen DNA-Zielsequenz. Grundsätzlich bindet Cascade zunächst mit einem Protein-Motiv an eine kurze DNA-Sequenz, woraufhin es zur Basenpaarung zwischen der crRNA und der doppelsträngigen DNA-Zielsequenz kommt. Dabei entsteht ein R-loop, was zur Entwindung der DNA führt. Dies wurde direkt mit Hilfe der Nanorotoren gemessen, was nie dagewesene Einblicke in diesen Prozess erlaubte und die Bestimmung der zugrundeliegenden Energielandschaft und Dynamiken ermöglichte. Es wurde gezeigt, dass Längenänderungen des R-loops in kinetischen Zwischenschritten von 6 Basenpaaren erfolgen, denen Einzel-Basenpaar-Schritte auf schnelleren Zeitskalen zugrunde liegen. Des weiteren wurde der Effekt von Mutationen der DNA-Zielsequenz auf die R-loop Entstehung untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die globale Form der Energielandschaft eine hochspezifische kinetische Differenzierung von inkongruenten Zielsequenzen erlaubt. Untersuchungen des 'locking' Mechanismus, ein struktureller Übergang der nach der vollständigen Ausbildung des R-loops erfolgt und eine Voraussetzung für die nachfolgende Zersetzung von DNA darstellt, rundeten die Untersuchungen ab. Insgesamt wurde gezeigt, dass mit Hilfe der ultraschnellen Verdrehungsmessungen, neue, detaillierte Einblicke in den Zielerkennungsprozess von Cascade gewonnen wurden, die zur Erstellung präziserer Genmanipulationswerkzeuge in der Zukunft beitragen können. Darüber hinaus eignen sich die Nanorotoren zur Untersuchung weiterer verdrehungs- und torsionserzeugender Mechanismen und Prozesse, die in weiteren Studien erforscht werden können.:1. Introduction 2. Multifunctional magnetic tweezers 3. Applications of DNA origami 4. Ultra-Fast torque measurements on supercoiled DNA 5. R-loop dynamics of the CRISPR-Cas Cascade complex 6. Summary and Discussion Bibliography List of Figures List of Tables List of Publications A. Appendix