La nutrition au cours de la période postnatale précoce programme l’activité de l’axe somatotrope à l’âge adulte (GH/IGF-1). Une altération de la nutrition chez les souriceaux au cours de la lactation altère la croissance staturo-pondérale de façon permanente et augmente leurs susceptibilités à développer des pathologies cardio-métaboliques à l’âge adulte. La restriction au cours de la lactation induit une diminution des taux plasmatiques en IGF-1 et en leptine. Ceci est associé à une diminution transitoire de l’innervation de l’éminence médiane par les neurones GHRH, ce qui induit une hypoplasie hypophysaire permanente en cellules somatotropes. Durant ma thèse, j’ai étudié l’impact de la nutrition périnatale sur la mise en place de l’axe somatotrope, notamment les mécanismes impliqués dans la régulation du développement des neurones GHRH. Les cultures d’explants de noyaux arqués issus de souriceaux normalement nourris indiquent que l’IGF-1 stimule de façon préférentielle la croissance axonale des neurones GHRH par l'intermédiaire des voies PI3K/AKT et MAPK. La leptine présenterait quant à elle un effet plus global sur les neurones du noyau arqué, stimulant la croissance axonale des neurones GHRH et des neurones orexigène à NPY/AgRP. Les neurones GHRH issus de souris restreintes sont quant à eux résistants à la stimulation de la croissance axonale par l’IGF-1 ou la leptine. Concernant l’IGF-I, cette résistance est associée à une altération des capacités de phosphorylation de la voie PI3K/AKT, tandis que celles de l’IGF-1R et de la voie MAPK ne sont pas altérées. / Nutrition during lactation programs the activity of the somatotropic axis (GH/IGF-1). Alteration of nutrition during the early postnatal period in mice induces increased susceptibility to develop cardiovascular and metabolic pathologies later in life. Nutritional restriction during lactation permanently alters growth of mice. Ten days old restricted pups present decreased plasmatic level of IGF-1 and Leptin. They also present a transient alteration of median eminence innervation by GHRH neurons, which induce a permanent somatotroph cells (GH) hypoplasia in pituitary. The aim of my thesis was to study the impact of nutrition during the perinatal period on the programming of the somatotropic axis, notably the cellular and molecular mechanisms involved in the regulation of GHRH neuronal development. In vitro cultures of arcuate nucleus explants of hypothalamus from normally fed pups indicate that IGF-1 preferentially stimulates axonal growth of GHRH neurons by its signaling pathways PI3K/AKT and MAPK. Leptin present a more global effect and is able to stimulate axonal growth of arcuate nucleus neurons, including GHRH and AgRP neurons. GHRH neurons from restricted pups are resistant to the stimulation of axonal growth by IGF-1 or leptin. Regarding IGF-1, this resistance is associated with an alteration of phosphorylation capacities of the PI3K/AKT pathway, whereas those from IGF-1R and MAPK are not altered.

Le développement cérébral est une succession d'étapes aboutissant à l'établissement d'un réseau neuronal. Il fait intervenir de nombreuses molécules comme des protéines d'adhésion permettant l'interaction des neurones avec leur environnement. L'implication de nombreux gènes codant des protéines d'adhésion dans la physiopathologie de maladies neuropsychiatriques comme l'autisme souligne l'intérêt à en identifier de nouveaux. Pendant ma thèse, j'ai pu caractériser deux nouveaux gènes, Susd2 et Susd4, codant des protéines contenant des domaines CCP (Complement Control Protein), classiquement connus pour leur présence dans les protéines participant à la régulation du système du Complément. Récemment, des protéines à domaines CCP ont été décrites chez la souris comme ayant une fonction dans le développement neuronal. L'existence de nombreuses protéines prédites à domaines CCP sans fonction connue m'ont conduit à tenter de caractériser Susd2 et Susd4 qui en font partie.Susd2 est exprimé dans les neurones au sein de cultures de cellules d'hippocampe de rat. Son expression atteint un pic à un stade post natal précoce, suggérant une fonction développementale. La protéine Susd2 recombinante a une localisation neuronale diffuse, mais est particulièrement enrichie dans les synapses excitatrices. La diminution de l'expression de Susd2 a pour conséquences un défaut de croissance axonale, une augmentation de la croissance dendritique, et une inhibition spécifique de la synaptogénèse excitatrice. Susd4 est également exprimé dans les neurones, avec un pic d'expression au stade embryonnaire, et semble jouer un rôle de régulation du développement dendritique. / During brain development, several steps precisely coordinated lead to establishment of a functional neuronal network. Many molecules participate to this process, including adhesion proteins mediating interactions between neurons and their environment. Involvement of numerous genes coding for adhesion proteins in neuropsychiatric diseases such as autism argue for usefulness of identifying new ones. During my PhD, I characterized two new genes, Sud2 and Susd4, coding for proteins containing CCP domains (Complement Control Protein), classically described in proteins involved in Complement regulation system. Recently, in mammals, CCP containing proteins were shown to be involved in neuronal development. Identification of several predicted CCP containing proteins without a known function prompted me to characterize Susd2 and Susd4 which are part of them.Susd2 is expressed in neurons from hippocampal cell cultures. Its peak of expression takes place in early post natal period, suggesting a developmental function. Susd2 recombinant protein has a diffuse neuronal localization, but is particularly enriched in excitatory synapses. Decreased expression of Susd2 leads to decreased axonal growth, increased dendritic growth, and specific inhibition of excitatory synaptogenesis. Susd4 is also expressed in neurons, with a peak of expression during embryonic development, and seems to act as a regulator of dendritic growth.

L'émergence de la notion selon laquelle la réponse inflammatoire exercerait des effets bénéfiques dans la pathologie ischémique cérébrale, en particulier au cours de la phase de récupération fonctionnelle nous a conduit à étudier l'implication des cellules microgliales dans le déclenchement des mécanismes de neuroplasticité post-ischémique. Notre étude a été réalisée chez le Rat soumis à une ischémie focale permanente induite par photothrombose. L'activation microgliale a été modulée par un traitement au 3-aminobenzamide (3-AB), un inhibiteur spécifique de la poly(ADP-ribose)polymérase-1, jouant un rôle prépondérant dans l'activation de ces cellules. Nos données montrent que le 3-AB entraîne une diminution importante de l'activation microgliale aux temps courts associée à plus long terme à une réduction de l'expression de la synaptophysine et de GAP-43, respectivement marqueurs des processus de synaptogenèse et croissance axonale. L'ensemble de ces données indique donc que les cellules microgliales constituent effectivement des acteurs cellulaires essentiels de la neuroplasticité post-ischémique. Le Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) se révélant un candidat potentiellement capable de promouvoir de tels changements, nous avons pu mettre en évidence que ces cellules représentaient de façon précoce une source importante de BDNF. Ces résultats ont été confirmés par la nette diminution des taux de BDNF mesurés dans les zones corticales lésionnelles et péri-lésionnelles des animaux traités par le 3-AB. Dans un deuxième temps, le métabolisme complexe de cette neurotrophine à travers l'existence de deux formes, pro- et mature, aux effets biologiques opposés, nous a conduit à réaliser une étude spatio-temporelle des expressions post-ischémiques du BDNF total (ELISA), pro- et mature (Western blotting). Aux temps courts (4-24 h), les expressions du BDNF total, pro- et mature sont augmentées dans les territoires corticaux lésés, péri-lésionnels et homotopiques tandis qu'aux temps longs (8-30 j), le BDNF total reste accru dans les régions distantes de la zone infarcie (hippocampes et cortex contralatéral). Concernant les expressions des formes pro- et mature, nos résultats indiquent une augmentation entre 8 et 30 j uniquement dans les territoires hippocampiques. D'un point de vue cellulaire, le BDNF est exprimé du côté ipsilatéral dans les neurones et les cellules non neuronales tandis que du côté contralatéral, l'expression est limitée aux neurones. Nos résultats tout en faisant apparaître des divergences importantes dans les variations d'expressions du BDNF total (ELISA) et des différentes formes (Western blotting) indiquent que la mesure du BDNF total doit être couplée à une étude permettant de discriminer les deux formes. De plus, tout en confirmant l'implication de cette neurotrophine dans les mécanismes adaptatifs induits en réponse à une ischémie cérébrale, ces données suggèrent que les territoires distants de la zone lésée jouent un rôle majeur dans ces processus.

Les lésions du Système Nerveux Central, qu'elles soient accidentelles ou liées à une maladie, sont à l'origine de dégâts irréversibles. En effet, suite à la section des axones, il s'en suit un processus de cicatrisation. Cette « cicatrice gliale » constitue une barrière physique et chimique sollicitant de nombreux acteurs cellulaires et moléculaires. Les principales cellules la constituant sont les astrocytes, les oligodendrocytes, les microgliocytes et les fibroblastes. Ces cellules surexpriment les protéines de myéline et la sémaphorine 3A (Sema3A), des agents très inhibiteurs de la régénération nerveuse et de la croissance axonale. Par ailleurs, l'hyperactivité des microgliocytes est à l'origine de l'augmentation considérable de la quantité de radicaux libres oxygénés néfastes pour les neurones.<br />Une approche thérapeutique novatrice serait l'utilisation de composés hybrides portant deux activités distinctes. Une activité neurotrophique permettant la neuro-régénération et une activité antioxydante assurant la neuro-protection en piégeant les radicaux libres.<br />Dans cet objectif, cinq séries de molécules hybrides combinant une chaîne grasse Ω-hydroxylée et des noyaux quinol ont été synthétisés. Les alcools gras quinoliques (QFA) C-alkylés, comportant des noyaux quinol polyméthoxylés, ont été obtenu par couplage de Sonogashira entre des arylbromures et des alcynes vrais. Les homologues N- ou O-alkylés ont été obtenus par des réactions de type SN2.<br />Les molécules synthétisés possèdent de très bonnes activités antioxydantes sous leurs formes déméthylés dépassant d'un facteur 100 l'activité antioxydante du Trolox®. Par ailleurs, le QFA15 portant une chaîne latérale à 15 atomes de carbones, est capable de promouvoir une croissance axonale très importante, aussi bien sur substrat permissif que sur substrat inhibiteur tel les protéines de myéline ou la Sema3A. Des études préliminaires du mécanisme d'action ont permis de conclure que le QFA15 sollicite les nucléotides cycliques.

L’émergence de la notion selon laquelle la réponse inflammatoire exercerait des effets bénéfiques dans la pathologie ischémique cérébrale, en particulier au cours de la phase de récupération fonctionnelle nous a conduit à étudier l’implication des cellules microgliales dans le déclenchement des mécanismes de neuroplasticité post-ischémique. Notre étude a été réalisée chez le Rat soumis à une ischémie focale permanente induite par photothrombose. L’activation microgliale a été modulée par un traitement au 3-aminobenzamide (3-AB), un inhibiteur spécifique de la poly(ADP-ribose)polymérase-1, jouant un rôle prépondérant dans l’activation de ces cellules. Nos données montrent que le 3-AB entraîne une diminution importante de l’activation microgliale aux temps courts associée à plus long terme à une réduction de l’expression de la synaptophysine et de GAP-43, respectivement marqueurs des processus de synaptogenèse et croissance axonale. L’ensemble de ces données indique donc que les cellules microgliales constituent effectivement des acteurs cellulaires essentiels de la neuroplasticité post-ischémique. Le Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) se révélant un candidat potentiellement capable de promouvoir de tels changements, nous avons pu mettre en évidence que ces cellules représentaient de façon précoce une source importante de BDNF. Ces résultats ont été confirmés par la nette diminution des taux de BDNF mesurés dans les zones corticales lésionnelles et péri-lésionnelles des animaux traités par le 3-AB. Dans un deuxième temps, le métabolisme complexe de cette neurotrophine à travers l’existence de deux formes, pro- et mature, aux effets biologiques opposés, nous a conduit à réaliser une étude spatio-temporelle des expressions post-ischémiques du BDNF total (ELISA), pro- et mature (Western blotting). Aux temps courts (4-24 h), les expressions du BDNF total, pro- et mature sont augmentées dans les territoires corticaux lésés, péri-lésionnels et homotopiques tandis qu’aux temps longs (8-30 j), le BDNF total reste accru dans les régions distantes de la zone infarcie (hippocampes et cortex contralatéral). Concernant les expressions des formes pro- et mature, nos résultats indiquent une augmentation entre 8 et 30 j uniquement dans les territoires hippocampiques. D’un point de vue cellulaire, le BDNF est exprimé du côté ipsilatéral dans les neurones et les cellules non neuronales tandis que du côté contralatéral, l’expression est limitée aux neurones. Nos résultats tout en faisant apparaître des divergences importantes dans les variations d’expressions du BDNF total (ELISA) et des différentes formes (Western blotting) indiquent que la mesure du BDNF total doit être couplée à une étude permettant de discriminer les deux formes. De plus, tout en confirmant l’implication de cette neurotrophine dans les mécanismes adaptatifs induits en réponse à une ischémie cérébrale, ces données suggèrent que les territoires distants de la zone lésée jouent un rôle majeur dans ces processus. / Evidences showing that under certain circumstances, inflammatory response could be neuroprotective and could also promote adult neurogenesis are growing. In this context, the objective of this work was to investigate the impact of microglial cells in the neuroplastic events. Rats were subjected to photothrombotic ischemia and microglial cells activation was blocked by the mean of poly(ADP-ribose)polymérase-1 (PARP-1) inhibition using 3- aminobenzamide (3-AB) since this protein has been shown to play a major role in this activation. Our results show that PARP-1 activity reduction was associated with a strong repression of the acute microglial activation. Beside, 3-AB treated animals exhibited a decrease in synaptophysin (synaptogenesis) and GAP-43 (axonal growth) expressions. Taken together, our data argue for a supportive role of microglial in adaptive brain plasticity events. According to the preponderant contribution of BDNF in these events, assessment of its cellular localization was performed, and confirmed that these cells represent a significant source. Beside, BDNF immunoreactivity (IR) in microglial cells and BDNF levels in the lesioned and surrounding lesioned areas were found decreased in 3-AB treated animals. However, since this neurotrophin can exert ambivalent biological actions through pro- versus mature forms, we investigate the proper effect of cerebral ischemia on total (Elisa), pro- and mature (Western blotting) expressions. Our results show that total, pro- and mature BDNF expressions are augmented in the early times (4-24h) of ischemia within the lesioned, the surrounding non lesioned and the contralateral cortical areas. At longer time points, total BDNF was still increased at 8d in regions distant from the lesion (hippocampi and contralateral cortex) while pro- and mature forms rise between 8d to 30d in hippocampic territories only. In term of cellular distribution, BDNF-IR was found in neurons but also in non neuronal cells ipsilaterally whereas in the opposite side BDNF staining was restricted to neurons. Our data while raising the question of the pertinence of total BDNF expression in a context of studying its supportive potential action indicate that such assessment has to be coupled with the discrimination of both forms. In addition, our data confirm the important role of BDNF in post-stroke adaptive mechanisms and argue in favour of an important contribution of the hippocampal territory and of the contralateral hemisphere in BDNF related post-stroke neuronal circuit remodelling suggesting that strategies targeting this hemisphere are likely to mediate functional compensation.

La construction du cerveau et de ses connexions pendant le développement reste une question ouverte dans la communauté scientifique. Des efforts fructueux ont été faits pour élucider les mécanismes de la croissance axonale, tels que la guidance axonale et les molécules de guidage. Cependant, des preuves récentes suggèrent que d'autres acteurs seraient impliqués dans la croissance des neurones in vivo. Notamment, les axones se développent dans des environnements mécaniquement contraints. Ainsi, pour bien comprendre ce processus dynamique, il faut prendre en compte les mécanismes collectifs et les interactions mécaniques au sein des populations axonales. Néanmoins, les techniques pour mesurer directement cela à partir de cerveaux vivants sont aujourd'hui insuffisantes ou lourdes à mettre en œuvre. Cette thèse résulte d'une collaboration multidisciplinaire, pour faire la lumière sur le développement axonal in vivo et les morphologies complexes des axones adultes. Notre travail a été inspiré et validé à partir d'images d'axones y individuels chez la drosophile, de type sauvage et modifiés génétiquement, que nous avons segmentés et normalisés. Nous avons d'abord proposé un cadre mathématique pour l'étude morphologique et la classification des groupes axonaux. A partir de cette analyse, nous avons émis l'hypothèse que la croissance axonale dérive d'un processus stochastique et que la variabilité et la complexité des arbres axonaux résultent de sa nature intrinsèque, ainsi que des stratégies d'élongation développées pour surmonter les contraintes mécaniques du cerveau en développement. Nous avons conçu un modèle mathématique de la croissance d'un axone isolé fondé sur des chaînes de Markov gaussiennes avec deux paramètres, représentant la rigidité axonale et l'attraction du champ cible. Nous avons estimé les paramètres de ce modèle à partir de données réelles et simulé la croissance des axones à l'échelle de populations et avec des contraintes spatiales pour tester notre hypothèse. Nous avons abordé des thèmes de mathématiques appliquées ainsi que de la biologie, et dévoilé des effets inexplorés de la croissance collective sur le développement axonal in vivo. / How the brain wires up during development remains an open question in the scientific community across disciplines. Fruitful efforts have been made to elucidate the mechanisms of axonal growth, such as pathfinding and guiding molecules. However, recent evidence suggests other actors to be involved in neuron growth in vivo. Notably, axons develop in populations and embedded in mechanically constrained environments. Thus, to fully understand this dynamic process, one must take into account collective mechanisms and mechanical interactions within the axonal populations. However, techniques to directly measure this from living brains are today lacking or heavy to implement. This thesis emerges from a multidisciplinary collaboration, to shed light on axonal development in vivo and how adult complex axonal morphologies are attained. Our work is inspired and validated from images of single wild type and mutated Drosophila y axons, which we have segmented and normalized. We first proposed a mathematical framework for the morphological study and classification of axonal groups. From this analysis we hypothesized that axon growth derives from a stochastic process, and that the variability and complexity of axonal trees result from its intrinsic nature, as well as from elongation strategies developed to overcome the mechanical constraints of the developing brain. We designed a mathematical model of single axon growth based on Gaussian Markov Chains with two parameters, accounting for axon rigidity and attraction to the target field. We estimated the model parameters from data, and simulated the growing axons embedded in spatially constraint populations to test our hypothesis. We dealt with themes from applied mathematics as well as from biology, and unveiled unexplored effects of collective growth on axonal development in vivo.

Pendant le développement du système nerveux embryonnaire, des niveaux élevés d'énergie sont nécessaires à la croissance axonale des neurones et des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) vers leurs cibles cérébrales. Cette demande énergétique entraîne une augmentation des concentrations de lactate, ligand du récepteur GPR81/HCAR1. Cependant, le rôle du lactate et de son récepteur au cours du développement du système nerveux central (CNS) a été négligé. Ce mémoire de maitrise rapporte la présence du récepteur GPR81 sur des neurones (CGR) pendant le développement embryonnaire et à l’âge adulte chez la souris. L’effet d’activation du GPR81 par manipulation pharmacologique permet de réguler la morphologie des cônes de croissance et augmente la croissance axonale des CGR sur les explants de rétine in vitro. L’utilisation de souris transgénique gpr81-/- rendant le récepteur GPR81 déficient nous a permis de confirmer ces résultats. De plus, l’injection in vivo de CTb-Alexa Fluor 555 dans l’œil gauche et de CTb-Alexa Fluor 647 dans l’œil droit a permis de visualiser les projections des CGR dans le cerveau des souris gpr81+/+ et gpr81-/-. Les souris gpr81- /- présentent une diminution dans les projections ipsilatérales des CGR dans le corps géniculé latéral dorsal (CGLd). Toutefois, l’acuité visuelle testée à l’aide du réflexe oculomoteur ainsi que la sensibilité de la rétine suivant des flashs lumineux de différentes intensités mesurée par électrorétinogrammes (ERG) n’ont pas été modifiés chez les souris gpr81-/-. Ces résultats suggèrent un rôle important du récepteur GPR81 au niveau anatomique pendant le développement du système nerveux visuel. / During the development of the embryonic nervous system, high energy levels are required for the axonal growth of neurons and retinal ganglion cell axons (RGCs) to their brain targets. This energy demand leads to an increase in the concentrations of lactate, a ligand for the GPR81 / HCAR1 receptor. However, the role of lactate and its receptor in the development of the central nervous system (CNS) has been overlooked. This manuscript reports, the presence of the GPR81 receptor on neurons (RGCs) during embryonic development and into adulthood in mice. The activating effect of GPR81 by pharmacological manipulation helps to regulate the morphology of growth cones and increases axonal growth of RGCs on retinal explants in vitro. The use of gpr81-/- transgenic mice rendering the GPR81 receptor deficient enabled us to confirm these results. In addition, in vivo injection of CTb-Alexa Fluor 555 in the left eye and CTb-Alexa Fluor 647 in the right eye made it possible to visualize the projections of RGCs in the brains of gpr81+/+ and gpr81-/- mice. The gpr81-/- mice show a decrease in ipsilateral projections of RGCs in the dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN). However, the visual acuity tested by the oculomotor reflex as well as the retinal sensitivity following light flashes of different intensities measured by electroretinograms (ERGs) were not modified in gpr81-/- mice compared to the wildtypes. These results suggest an important role of the GPR81 receptor at the anatomical level during the development of the visual nervous system.

Résumé confidentiel / Confidential abstract

Les paramètres de surface contrôlent les fonctions des cellules, en coopération avec leurs codes génétiques. Des études récentes soulignent l'impact combiné des signaux chimiques, topographiques et mécaniques des substrats d'adhésion sur les processus de différenciation. Cette étude se focalise sur le paramètre énergétique, et plus spécialement, sur l'influence exercée par la distribution spatiale des énergies de surface sur la différenciation des cellules neuronales. Le modèle étudié est constitué par les cellules de la lignée PC12, capables de se différencier en neurones suite au traitement par le facteur de croissance nerveux (NGF). Les cellules sont cultivées sur des surfaces de verre modifiées par auto-assemblage de monocouches d'alkylsiloxanes ou de biopolymères. La modification de la nature chimique et du degré d'organisation des monocouches module la distribution des composantes dispersives et polaires de l'énergie de surface, à une échelle inférieure au micron. Sur des substrats très homogènes (dotés de terminaisons CH3, NH2, ou OH), l'adhésion des cellules PC12 est modulée par le degré d'affinité chimique, et peu de cellules initient des neurites. Inversement, sur des substrats localement très hétérogènes, les cellules adhèrent quel que soit le couple chimique produisant les hétérogénéités (NH2/OH ou CH3/OH), et elles génèrent un nombre important de neurites en moins de 48 h, sans traitement au NGF. Ce travail démontre que les hétérogénéités chimiques de surface exercent une influence critique sur les processus de régénérescence des cellules nerveuses, en induisant des gradients dans les énergies d'adhésion aux échelles nanométriques.