O café é um dos principais produtos agrícolas produzidos no Brasil, contribuindo significativamente na economia nacional. Atualmente o Brasil é o maior produtor de café do mundo e segundo maior consumidor, sendo que o maior produtor nacional é o estado de Minas Gerais. Para garantir uma alta produção agrícola os produtores rurais utilizam-se principalmente da aplicação de praguicidas nas lavouras. Dentre esses praguicidas, um dos mais utilizados é o dissulfoton, um inseticida organofosforado, sistêmico e extremamente tóxico. Os praguicidas sofrem naturalmente diversas degradações/transformações quando expostos ao ambiente, podendo gerar desde produtos mais tóxicos que o de origem, até degradados inorgânicos inofensivos. As técnicas mais utilizadas para identificação de praguicidas são as técnicas cromatográficas acopladas à espectrometria de massas (GC-MS e LC-MS). Para estas análises é necessário um prévio preparo de amostras. A preparação pelo método QuEChERS possui muitas vantagens, dentre as quais, pouco gasto de solventes, rapidez na preparação, eficiência e robustez de resultados. Apesar das vantagens, não foram encontrados relatos na literatura da utilização do método para preparação de amostras de café torrado. No presente trabalho foi feito um desenvolvimento e otimização de metodologia de preparo de amostras, baseada no método de QuEChERS e análise por GC-MS para avaliar a contaminação do café com o dissulfoton e derivados (sulfona e sulfóxido), sendo posteriormente introduzidos novos praguicidas nessa análise. Adicionalmente, foram testadas substâncias chamadas “protetores de analitos”, que possuem a capacidade de evitar a degradação dos compostos de interesse no sistema de GC. Foi feita ainda uma validação do método otimizado, seguindo protocolos das agências de controle de resíduos, e, posteriormente, realizou-se a aplicação do método em amostras reais, não sendo detectados resíduos dos praguicidas nestas amostras. Foi estudado ainda a permanência dos contaminantes ao longo da etapa de torra, monitorando o tempo de torra e temperatura final no torrador, sendo verificada a total degradação dos analitos a partir do sexto minuto de torra. Com os resultados obtidos, o método mostrou-se apropriado ao preparo rápido e simples de amostras complexas, precedendo a etapa de GC-MS. / Coffee is one of the most important Brazilian crops, contributing significantly to the national economy. Currently Brazil is the largest coffee producer in the world and second largest consumer, the largest internal producer the state of Minas Gerais. To ensure a high production, farmers apply pesticides on these crops. Among these pesticides, one of the most used is disulfoton, an organophosphate insecticide, systemic and highly toxic. Pesticides undergo natural degradation/ transformation when exposure to the environment; therefore they can generate either products more toxic than the original or can degrade to simple inorganic compound. The most widely used techniques for identification of pesticides are chromatographic techniques coupled to mass spectrometry (GC-MS and LC-MS). Regarding those techniques, sample preparation is required before analysis. The QuEChERS preparation method has many advantages, for instance, it consumes small amount of solvents, provides quick preparation, is efficiency and has robustness of results. Despite these advantages, there are no published reports regarding the sample preparation of roasted coffee. In this report a sample preparation methodology was developed and optimized, based on the QuEChERS method and analysis by GG-MS, in order to evaluate the contamination of coffee with the pesticide disulfoton and its products (sulfoxide and sulfone), subsequently introducing new pesticides in that analysis. Additionally, we tested substances called "analyte protectants”, which have the capacity of preventing degradation of the compounds of interest into the GC system. From the optimized method, it was made a validation, according to protocols from residual control agencies. Real samples were analyzed and no pesticide residues were detected in those samples. The persistence of contaminants was also observed throughout the roasting step, monitoring the roasting time and end temperature, being verified that total degradation of the analytes were achieved after the sixth minute of roasting. With the obtained results the method showed to be adequate to rapid and simple sample preparation of complex samples, before the GC-MS analysis step. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Um método analítico constituído por extração em fase sólida molecularmente impressa (MISPE) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) foi desenvolvido para análise de metabólitos dialquil fosfatos (dietil tiosfato - DETP e dietil ditiosfato - DEDTP) em amostras de urina. Um polímero de impressão molecular (MIP) foi sintetizado utilizando-se 4-vinilpiridina como monômero funcional e etileno glicol dimetacrilato como reagente de ligação cruzada. A etapa de condicionamento foi realizada da seguinte forma: 3 mL de acetonitrila, 3 mL de tampão fosfato dibásico 0,1 mol L-1, pH 11,0 e 2 mL de água foram percolados por um cartucho de polipropileno contendo o MIP. A etapa de extração foi executada utilizando 1,0 mL de amostra de urina com pH previamente ajustado para 3,0. Finalmente, os analitos foram eluídos com 3 mL de acetonitrila e derivatizados com uma solução de  2,3,4,5,6-brometo de  pentafluorobenzil a 3% em acetonitrila, a temperatura ambiente durante 1h. A amostra foi analisada por GC-MS. Curvas de calibração analítica para DETP e DEDTP foram construídas utilizando-se uma mistura de urina de diferentes indivíduos voluntários e em seis níveis de concentração. O método foi linear na faixa de  10-500 µg L-1, com r = 0,99 e limite de detecção de 3,0 µg L-1, para ambos os analitos. A precisão intra-dias e inter-dias foram avaliadas com base na porcentagem de desvio padrão relativo (%RSD) e todos os resultados foram inferiores a 15% para ambos os analitos. O método foi preciso, exato, com boa recuperação e robustez. Posteriormente o método foi utilizado para determinar as concentrações de DETP e DEDTP em amostras de urina de ratos expostos a dissulfoton. Além da concentração de dialquil fosfatos, foram determinadas a atividade de colinesterase sanguínea e a incidência de micronúcleos em eritrócitos policromáticos destes mesmos animais, a fim de se estabelecer uma relação entre a dose de exposição ao dissulfon e os parâmetros avaliados. Observou-se que a atividade de colinesterase plasmática não reflete muito bem a correlação entre a dose de exposição e efeito, ao contrário da colinesterase eritrocitária. A concentração de dialquil fosfatos refletiu uma boa correlação com a dose de exposição. Através da frequência de micronúcleos em eritrócitos policromáticos, foi possível observar que, a semelhança de outros praguicidas organofosforados (OF), o dissulfoton é capaz de causar mutagenicidade. / An analytical method constituted by molecularly imprinted solid phase extraction (MISPE) and gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) was developed for analyses of benzene metabolites (diethyl thiophosphate - DETP and diethyl dithiophosphate - DEDTP) in human urine samples. A molecularly imprinted polymer (MIP) for DETP was synthesized using 4-vinylpiridine as functional monomer and ethylene glycol dimethacrylate as cross linker. The conditioning step of the MISPE was processed flowing though the MIP cartridge 3 mL of acetonitrile, 3 mL of dibasic phosphate buffer 0.1 mol L−1 pH 11 and 2 mL of water. The extraction step was executed using 1.0 mL of urine sample with pH previously adjusted to 3.0. Finally, the analytes were eluted with 3 mL of acetonitrile and derivatized with 2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl bromide 3% at room temperature during 1h. The sample was analyzed by GC-MS. Analytical calibration curves for DETP and DEDTP were constructed using a pool of urine sample and for six levels of concentration. The method was linear from 10 to 500 μg L−1, with r = 0.99 and limit of detection of 3.0 μg L−1, for both analytes. The within-day and between-day precisions were evaluated (as percentage of RSD) and all results were < 15% for both analytes. The method was accurate, with good recovery and robustness. Later this method was used to determine the concentrations of DETP and DEDTP in urine samples of rats exposed to disulfoton. Besides the concentration of dialkyl phosphates, it was determined blood cholinesterase activity and the incidence of micronucleated polychromatic erythrocytes in the same animals, in order to establish a relationship between the dose of exposure and the evaluated parameters. It was observed that the plasma cholinesterase activity did not reflect very well the correlation between exposure dose and effect, unlike the erythrocyte cholinesterases. The concentration of dialkyl phosphates gave a good correlation with exposure dose. By the frequency of micronucleated polychro-matic erythrocytes was possible to observe that, similarly to other organophosphates pesticides (OPs), disulfoton can causes mutagenicity. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

En este trabajo, además de las determinaciones habituales de características físico-químicas del aceite esencial de limón, se introducen las de color mediante el colorímetro digital, y de densidad, mediante densímetro electrónico. El estudio gascromatográfico, para determinar el orden de elución característico, se realiza en columnas capilares de sílice fundida: OV-101 apolar, CPWax-52-CB muy polar y HP-5 ligeramente polar. Comparando los resultados se logra la identificación de setenta y cuatro componentes, ya que son complementarias en cuanto a separación de algunos de ellos. Así mismo, se determinan las condiciones cromatográficas que mejoran la resolución.Se observan las evoluciones de los distintos componentes durante la campaña de elaboración, relacionando constituyentes mayoritarios y minoritarios. Se fijan los valores máximos y mínimos encontrados para los distintos componentes y los porcentajes por grupos funcionales para el aceite esencial de limón español. La aportación para elaborar su norma de calidad presenta gran importancia tecnológica y económica. / In this work, we determine the common parameters of the physic and chemical properties of the essential oil of lemon, as well as it is introduced the colour determination by a digital colorimeter and the density by a electrical densitymeter, in addition to this we studied the characteristic elution order in a different polarity silica fussed capillary columns (Ov-101 nonpolar, CPWax-52-CB polar and HP-5 slightly polar) by gaschromatography. Due to the columns complementarity it was possible identify seventy four components.The chromatographic conditions, which give us the best resolution are indicated. The changes of the different compounds in Lemon oil during one whole year are observed. Relationship between majority and minority components are deduced for Spanish essential lemon oil. The max and min. compound values and functional groups standard percentages are also determinate

Orientador: Marcos José Salvador / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T10:46:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lourenco_CarolineCaramanode_M.pdf: 7003473 bytes, checksum: 01a19e43e829c4233180019cb1a470d8 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Este estudo teve por objetivo a prospecção químico-farmacológica de fotossensibilizadores naturais para aplicação em terapia fotodinâmica (PDT) antimicrobiana e de substâncias bioativas acumuladas no extrato etanólico das folhas de Eugenia chlorophylla (Myrtaceae), bem como a caracterização química e da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais das folhas, caule e flores desta espécie vegetal. Para tanto, procedeu-se o preparo do extrato vegetal bruto (hexânico e etanólico) a partir das folhas de E. chlorophylla e a avaliação da absorção de luz na região espectral do visível de interesse e útil para aplicação em PDT. O extrato bruto etanólico foi submetido a uma extração líquido-líquido com hexano, diclorometano e butanol. Os melhores resultados na avaliação da absorção de luz na região espectral do visível de interesse e útil para aplicação em PDT foram obtidos com o extrato bruto e com a fração diclorometânica da partição, para os quais foram avaliadas suas características fluorescentes em estado estacionário no modo de emissão e excitação (caracterização preliminar de suas propriedades fotoquímicas e fotofísicas). Desenvolveuse a adequação de metodologia para uma avaliação inicial da eficiência fotoquímica dos extratos e frações obtidos (produção de oxigênio singlete, ensaio, 1,3 - diphenylisobenzofuran (DPBF), bem como adequou-se os procedimentos para a realização dos bioensaios na presença e ausência de luz. Procedeu-se a avaliação da atividade antimicrobiana in vitro com o extrato bruto etanólico e suas frações da partição líquidolíquido, na ausência de irradiação laser, determinando-se os valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) para as amostras bioativas e estimando-se os valores de concentração subinibitória que seriam usados na PDT atimicrobiana. Ainda, foram estabelecidos os procedimentos para a padronização do protocolo experimental de PDT antimicrobiana frente a bactérias (Gram positivas e Gram negativas) e leveduras in vitro e avaliou-se o efeito do extrato bruto etanólico e da fração diclorometânica como fotossensibilizadores naturais em PDT antimicrobiana, utilizando-se 11 cepas indicadoras. De acordo com os resultados obtidos o extrato bruto etanólico (ECB) e sua fração diclorometânica (ECD) apresentaram absorção de luz na região de 600 a 800 nm, demonstrou a capacidade de formar oxigênio singlete no ensaio com DPBF quando irradiados pelo laser e apresentou resultado efetivo na inativação de algumas das cepas indicadoras (bactérias e leveduras) em PDT antimicrobiana quando irradiados em sessão única por 5 min com laser diodo InGaAlP, ?=660nm. A partir dos resultados dos ensaios com DPBF e com a utilização de inibidores específicos do mecanismo fotoquímico em modelo biológico sugeriu-se que o mecanismo fotoquímico predominante para ECD é o do tipo II (mediado pela formação de oxigênio singlete). Deu-se inicio ao estudo fitoquímico monitorado pela absorção de luz na região do visível (400 a 830 nm), pela avaliação da eficiência fotoquímica e pelas atividades biológicas. Pelo resultado do estudo de desreplicação por ESI-MS/MS do extrato etanólico bruto e da fração ECD sugeriu-se a presença do ácido quínico nestas amostras. Como as folhas frescas de E. chlorophylla apresentavam odor intenso e neste projeto foi proposto também estudo para a prospecção de substâncias bioativas, realizou-se um estudo para a caracterização química e avaliação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais das folhas, caule e flores desta espécie vegetal. A caracterização química dos constituintes majoritários do óleo essencial foi realizada por cromatografia gasosa (CG-EM). Os óleos essenciais das folhas, caule e flores de E. chlorophylla foram obtidos por hidrodestilação e apresentaram rendimento de 0,01 a 0,1%. Setenta e cinco componentes foram identificados, representando mais de 85% do total do óleo. Os principais componentes detectados nos óleos essenciais foram Ecariofileno (flores), óxido de cariofileno (caule, flores e folhas), globulol (caules e folhas) e T-muurolol, 1-epi-cubenol e ?-cadinol (caule, flores e folhas). Todos os óleos mostraram leve a moderada atividade antimicrobiana (na ausência de radiação laser), sobre principalmente as bactérias Gram positivas e Candida albicans, sendo estes resultados similares ao observado na literatura para esta espécie vegetal, com exceção do óleo do caule, coletado em 2011, que não se mostrou ativo nas condições experimentais utilizadas e é composto, predominantemente (85,4%) por um constituinte alifático para o qual não foi possível identificar a estrutura química por CG-EM. Ainda, observou-se variação nos valores de concentração inibitória mínima frente às cepas bioativas dependendo do ano de coleta e armazenagem dos óleos essenciais obtidos / Abstract: This study aimed at making a chemical-pharmacological search for prospection of natural photosensitizers in photodynamic therapy (PDT) and of bioactive compounds accumulated in the ethanolic extract of leaves from Eugenia chlorophylla (Myrtaceae) and to study the chemical characterization and antimicrobial activity of essential oils from leaves, stems and flowers of this plant species. For this purpose, we carried out the preparation of the crude plant extract (hexane and ethanol) from the leaves of E.chlorophylla followed by the assessment of light absorption in the visible spectral region of interest could be useful for application in PDT. The crude ethanol extract was subjected to a liquid-liquid extraction with hexane, dichloromethane and butanol. The best results for the absorption of light in the visible spectral region of interest to gets with usefulness for application in PDT were obtained for the crude extract and dichloromethane fraction, which were evaluated for their characteristics in steady-state fluorescent emission mode and excitement (preliminary characterization of photochemical properties). Still, it has adequate methodology was developed for an initial assessment of the photochemical efficiency of extracts (production of singlet oxygen, DPBF test 1.3-diphenylisobenzofuran) as well as the adequate conformed for the achievement of bioassays in the presence and absence of light. Evaluation of antimicrobial activity was carried out in vitro with a crude ethanol extract and their fractions from liquid-liquid partition, in the absence of laser irradiation, determining the values of minimum inhibitory concentration (MIC) in antimicrobial testes for bioactive samples and estimating the sub-inhibitory concentration values which would be used in antimicrobial PDT. Standardization of the experimental protocol of in vitro antimicrobial PDT was carried out against Gram positive and Gram-negative bacteria and yeast the effect of the crude ethanol extract and the dichloromethane fraction evaluated as natural photosensitizes in antimicrobial PDT using 11indicator strains. According to results obtained from the crude ethanol extract (ECB) and its dichloromethane fraction (ECD) showed light absorption in the region from 600 to 800 nm, it was demonstrated that singlet oxygen was formed in the assay with DPBF when irradiated by laser ( ?=660nm) showed effective results in the inactivation of antimicrobial PDT in some of the indicator strains (bacteria and yeasts) when irradiated in a single session for 5 min with InGaA1P laser diode. Along with the test result with DPBF, research using specific inhibitors of the photochemical mechanism in a biological model suggests that the dominant photochemical mechanism for ECD is the type II (mediated by the formation of singlet oxygen). We carried out the phytochemical study monitored by light absorption in the visible region (400 to 830nm), in which the evaluation of photochemical efficiency and biological activities and the results of the study of dereplication of the crude ethanolic extract and the ECD fraction by ESI-MS/MS suggest the presence of quinic acid in these samples. Since the fresh leaves of E. chlorophylla have an intense smell and this project also contemplated a search for bioactive substances a study was carried out for the chemical characterization and antimicrobial activity of essential oils from leaves, stems and flowers of the plant species. The chemical characterization of the major constituents of the essential oil was performed by gas chromatography (GC-MS). Essential oils from leaves, stems and flowers of E. chlorophylla were obtained by hydrodistillation and presented a yield of 0.01 to 0.1%. Seventy-five compounds were identified, representing over 85% of the total oil. The main components were E-caryophyllene (flowers), caryophyllene oxide (stem, leaves and flowers), globulol (stems and laves) and T-muurolol, 1-epi-? cubenol, and ?-cadinol (stem, leaves and flowers). All essential oils studied showed mild to moderate antimicrobial activity mainly associated with Gram positive bacteria and Candida albicans with results similar to those observed in the literature for this plant species. An exception was the stem oil collected in 2011 that was not active in the experimental conditions used and is constituted predominantly (85.4%) for an aliphatic constituent not identified by GC-MS. Was verified variation in the minimum inhibitory concentration values of essential oils of E. chlorophylla with the year of collect and with storage time / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestre em Biologia Vegetal