Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-12Bitstream added on 2014-06-13T20:29:49Z : No. of bitstreams: 1 curtis_kmc_me_araiq.pdf: 767278 bytes, checksum: b9eefeb12752b6e4c943bbfc29b1a46c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A síndrome do cromossomo X frágil (SXF) é a forma mais comum de deficiência mental herdada. A doença ocorre pela expansão das repetições de trinucleotídeos na região 5’ não traduzida do gene FMR1 no cromossomo X. Dependendo do número de repetições CGG originam-se 4 tipos de alelos: normal (NL), pré-mutado (PM), gray zone (GZ) e mutação completa (FM). A instabilidade e expansão das repetições, aliado à metilação do DNA, causam a diminuição ou ausência na produção da proteína FMRP, a qual é essencial para a função cerebral. O diagnóstico da SXF tem sido realizado principalmente por análise molecular Southern blot. Porém, este método é trabalhoso, demorado e de custo elevado. Recentemente foi desenvolvido um novo método molecular para triagem da SXF por PCR, que segundo os autores, é rápido, de baixo custo, e eficiente na detecção das repetições CGG em homens e mulheres. No entanto, notou-se a ausência de informações importantes para reprodução do método. Os objetivos deste estudo foram: (i) padronizar a técnica de PCR proposta por Tassone et al., (2008), adaptando-a, devido a carência de informações metodológicas; (ii) comprovar a exatidão (acurácia), sensibilidade e especificidade do método, comparando-a ao Southern blot; (iii) avaliar a aplicação da técnica utilizando DNA extraído de diferentes materiais biológicos/métodos de extração; (iv) estimar o custo e o tempo de execução do método no mercado nacional. Os materiais biológicos utilizados foram: sangue coletado por sistema à vácuo e células da mucosa oral, que foram extraídos por solventes orgânicos e sangue coletado em cartões FTA, purificado pelo kit Whatman. Obtevese sucesso na reprodução do método da PCR em 75 indivíduos utilizando a enzima Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostics). A exatidão (acurácia), sensibilidade e especificidade foram... / Fragile X Syndrome (FXS) is the most common form of inherited mental retardation. The disease occurs by the expansion of triplet nucleotide repeats in the 5' untranslated of the FMR1 gene on chromosome X. Depending on the number of CGG repeats four types of alleles originate from it: normal (NL), pre-mutated (PM), gray zone (GZ) and full mutation (FM). The instability and expansion of these repetitions, together with the methylation of DNA, cause a decrease or absence in the production of the protein FMRP, which is essential for the brain function. The diagnosis of FXS has been done mainly by molecular analysis Southern blot. However, this method is laborious, time consuming and expensive. Recently we have developed a new molecular method for FXS screening by PCR, which according to the authors, is rapid, inexpensive, and efficient in the detection of CGG repeats in male and female. However, we noted the absence of important information for breeding method. The objectives of this study were: (i) to standardize the PCR technique proposed by Tassone et al. (2008), adapting it, due to the lack of methodological information, (ii) verify the accuracy, sensitivity and specificity of the method, comparing it to the Southern blot, and (iii) to evaluate the technique using DNA extracted from different biological materials / extraction methods, and (iv) estimate the cost and time of the method execution in the domestic market. The biological materials used were: blood collected by vacuum system and oral mucosal cells, which were extracted by organic solvents and blood collected on FTA cards, purified by Whatman kit. Success was achieved in the reproduction of the PCR method in 75 individuals using the enzyme Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostics). The accuracy, sensitivity and specificity were 100% when analyzing the total sample, indicating that the technique can detect the presence... (Complete abstract click electronic access below)

Adrenoleucodistrofia ligada ao cromossomo X (X-ALD) é um Erro Inato do Metabolismo dos peroxissomos, que se caracteriza pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA) em fluidos e tecidos corporais. É causada por mutações no gene ABCD1, o qual codifica uma proteína responsável por transportar VLCFA do citosol para dentro do peroxissomo, para serem oxidados. Apesar dos mecanismos relacionados ao dano tecidual ainda não estarem bem elucidados, estudos vêm mostrando que o acúmulo de metabólitos tóxicos e o estresse oxidativo podem estar relacionados com a fisiopatologia da doença. Considerando que ainda não foi reportado dano ao DNA em pacientes X-ALD, e que muitos estudos vêm investigando as propriedades antioxidantes de N-acetil-L-cisteína (NAC), rosuvastatina (RSV) e trolox (TRO), os objetivos deste trabalho foram avaliar o dano ao DNA em HTZ e pacientes sintomáticos portadores de X-ALD, verificar o efeito in vitro de NAC, TRO e RSV sobre o dano ao DNA nestes pacientes, estudar associações entre o dano ao DNA e a peroxidação lipídica e, por fim, investigar a capacidade da NAC em aumentar, in vitro, os níveis de glutationa (GSH) e sulfidrila nos pacientes X-ALD. Não foi verificada diferença significativa no dano ao DNA em mulheres HTZ, quando comparado a controles. Em contraste, pacientes sintomáticos apresentaram um maior índice de dano ao DNA comparado às HTZ e ao grupo controle. No ensaio in vitro, foi observado que os antioxidantes NAC (1 e 2,5 mM), TRO (25 e 75 μM) e RSV (0,5; 2 e 5 μM) foram capazes de reduzir o dano ao DNA em pacientes sintomáticos a níveis de controle. Além disso, observamos uma correlação positiva entre o dano ao DNA e o nível de isoprostanos urinários (biomarcador de dano a lipídios), o que nos permite inferir que o dano ao DNA poderia estar sendo causado por processos oxidativos em pacientes sintomáticos. Verificou-se também que os conteúdos de glutationa eritrocitária e sulfidrila plasmática estavam diminuídos em pacientes X-ALD (independentemente do fenótipo) e que 5 mM de NAC, in vitro, foi capaz de aumentar estes parâmetros a níveis de controle saudáveis. O presente trabalho fornece evidências experimentais de que há dano ao DNA em pacientes X-ALD, os quais possuem níveis diminuídos de GSH e sulfidrila, e que a administração dos antioxidantes NAC, TRO e RSV poderia ser considerada uma terapia adjuvante no tratamento da X-ALD. / X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is an inborn error of peroxisome metabolism which is characterized by the accumulation of very long chain fatty acids (VLCFA) in tissue and body fluids. It is caused by mutations in the ABCD1 gene, which encodes a protein responsible for transporting VLCFA from cytosol to peroxisomes to be oxidized. Although the mechanisms underlying tissue damage are still poor understood, studies have been shown that the accumulation of toxic metabolites and oxidative stress may be related to the pathophysiology of X-ALD. Considering that DNA damage was not reported in X-ALD patients yet, and that former studies have been investigated the antioxidant properties of N-acetyl-L-cistein (NAC), rosuvastatin (RSV) and trolox (TRO), the aims of this study were to evaluate DNA damage in HTZ and symptomatic X-ALD patients, to study the in vitro effect of NAC, TRO and RSV on DNA damage in these patients, to look for associations between DNA damage and lipid peroxidation and to verify the ability of NAC in increasing, in vitro, glutathione (GSH) and sulfhydryl levels on X-ALD patients. It was verified no significant difference on DNA damage in HTZ women when compared to controls. In contrast, symptomatic patients presented higher DNA damage levels, compared to HTZ and control group. In the vitro assay, it was observed that the antioxidants NAC (1 e 2,5 mM), TRO (25 e 75 μM) and RSV (0,5; 2 e 5 μM) were able to reduce DNA damage in symptomatic patients until control levels. Likewise, our results showed positive correlation between DNA damage and urinary isoprostanes (biomarker of lipid damage), allowing us to hypothesize that DNA damage might be caused by oxidative processes in symptomatic patients. It was also verified that the plasmatic sulfhydryl content and erythrocyte glutathione levels were decreased in X-ALD patients (regardless of the phenotype) and that 5mM of NAC in vitro was able to increase these parameters until control levels. The present work yields experimental evidence that DNA damage occurs in X-ALD patients, which have GSH and sulfhydryl levels reduced and that the administration of the NAC, TRO and RSV antioxidants might be considered as an adjuvant therapy for X-ALD.

A epigenética aborda o controle da expressão gênica através de diversos fatores que agem sob a cromatina, os melhor estudados são a metilação do DNA e a acetilação em histonas, relacionadas à repressão e ativação gênica, respectivamente. Em mamíferos, existem dois fenômenos epigenéticos interessantes: a inativação do cromossomo X (ICX) em fêmeas, que garante o equilíbrio transcricional gênico entre os sexos, e o imprinting genômico, caracterizado pela expressão monoalélica dependente da origem parental. No presente estudo, propusemos verificar a manutenção do controle epigenético em células humanas normais e transformadas em condições semelhantes de hipometilação do DNA e hiperacetilação em histonas (após uso das drogas 5-aza-2-\'deoxicitidina (5-aza-dC) e ácido valproico, respectivamente), através do monitoramento da expressão alelo-específica pelo uso de polimorfismos de única base presentes em regiões codificadoras. Em células normais houve manutenção da ICX e do imprinting genômico, enquanto que em células transformadas hipometiladas foram observadas indução de XIST, e perda de imprinting dos genes IGF2, H19 e PEG10. Observamos que ambas as drogas podem diminuir a expressão de DNMT1, e 5-aza-dC altera o equilíbrio entre acetilação e desacetilação da histona H4. Ainda, a ordem de adição dos reagentes ocasionou diferenças no nível de acetilação da histona H4 e na expressão gênica de XIST e PEG10. Nossos dados sugerem que: células humanas normais apresentam maior estabilidade do controle epigenético comparadas às células humanas transformadas, genes submetidos à ICX e \"imprintados\" não apresentam diferenças na rigidez do controle de expressão, e a cascata de reação seguida após perturbação de marcas epigenéticas pode ser alterada dependendo da modificação inicial. / Epigenetics refers to mechanisms related to gene activity through conformational modifications in DNA without changes in the nucleotide sequence. Key players in the epigenetic control are DNA methylation and histone acetylation, which are related to gene activation and repression, respectively. Two striking epigenetic phenomena in mammalians are X chromosome inactivation (XCI) and genomic imprinting. XCI triggers the transcriptional silencing of all but one X chromosome in each female cell, while genomic imprinting is a process that leads to mono-allelic gene expression based on parental origin. In the present study, we intended to verify the maintenance of epigenetic control in normal and transformed human cells under the same conditions of epigenetic disturbance. For this purpose, 5-aza-2\'-deoxycytidine (5-aza-dC) and valproic acid (VPA) were used to cause DNA hypomethylation and histone hyperacetylation, respectively. By monitoring allelic-specific expression using single nucleotide polymorphisms present in coding regions, we were able to check the effects of the modifications in the expression pattern of imprinted or subjected to XCI genes. While in female normal cells XCI and genomic imprinting were not affected by VPA or 5-aza-dC treatments, transformed male cells showed XIST activation and loss of imprinting of PEG10, IGF2 and H19 genes in the hypomethylation scenario. In addition, both drugs can decrease the expression of DNMT1, and 5-aza-dC alters the balance between acetylation and deacethylation of histone H4. Furthermore, we could see different degrees of histone H4 acetylation levels and of XIST and PEG10 expression, depending on which of the drugs was added first. Our data suggest that the epigenetic control in normal human cells is more stable when compared to transformed human cells. In addition, both XCI and genomic imprinting are epigenetic features equally hard to disturb. Finally, depending on the initial epigenetic modification (global demethylation or acethylation), it will induce different epigenetic control networks, with consequence to the final status of gene expression.

Objetivo: Analisar os aspectos clínicos, bioquímicos e moleculares uma família com vários membros afetados por duas doenças ligadas ao X: mucopolisacaridose II e miopia de alto grau. Métodos: Na avaliação familiar de um paciente com Mucopolissacaridose II se descobrem vários meninos afetados pela mesma doença e outros por miopia de alto grau. Os pacientes com MPS II foram estudados com testes clínicos, bioquímicos e moleculares. Os pacientes com miopia foram submetidos a um exame oftalmológico completo, incluindo retinografia, teste de Isihara e eletroretinografia. Resultados e Discussão: O primeiro resultado encontrado na análise de DNA do caso índice foi uma mutação comum no exon 8 (G374G), presente em todos os meninos afetados e ausente nos irmãos normais. Surpreendentemente, a alteração encontrada nos hemizigotos não foi detectada nas heterozigotas obrigatórias, por razões não esclarecidas. Adicionalmente, quando da análise completa do gene da IDS foi encontrado nos afetados e portadoras um rearranjo complexo, com inversão entre o gene e o pseudogene, o que é provavelmente a causa da doença. A miopía encontrada em cinco meninos da mesma irmandade foi de - 9 a - 18 D. Três deles apresentavam nistagmo, e dois estrabismo. A retinografía mostrou mudanças fundoscópicas típicas. O eletroretinograma e o teste a cor de Ishihara foram normais. Conclusões: A mucopolissacaridose II é causada pela deficiência da enzima iduronato- 2-sulfatase, codificada por um gene localizado na região Xq28, com elevada heterogeneidade observada em diferentes populações relatadas na literatura. Em relação à miopia, os resultados encontrados na pesquisa bibliográfica revelaram 12 formas autossômicas e 2 ligadas ao X. A miopia de alto grau ligada ao X, com teste de cor normal, permite descartar a MYP1, enquanto a presença de nistagmo e de estrabismo descarta a MYP13. A presença de duas doenças ligadas ao X em uma mesma família parece ser muito rara, não tendo sido descrita previamente na literatura. / Purpose: To study the clinical, biochemical and molecular aspets of a family with several members affected by two X-linked diseases: mucopolysaccharidosis II and high-grade myopia. Methods: On the family study of a patient with Mucopolysaccharidosis II it was discovered several boys affected by the same disease and others by high-grade myopia. The patients with MPS II were studied with clinical, biochemical and molecular tests. The patients with myopia were submitted to a complete ophthalmologic evaluation, including retinography, Ishihara test and electroretinography. Results and Discussion: The first result found on the DNA analysis of the index case was a common mutation on exon 8 (G374G), also found in all affected boys but not on their normal brothers. The abnormality found on the affected patients was not found on the obligatory carriers, due to reasons so far not understood. In addition, on the full analysis of the IDS gene it was found a complex rearrangement, with inversion involving gene and pseudogene, which is probably the cause of the disease. The myopia found in five boys of the same sibship was of -9 to -18 D. Three of them presented nistagmus, and two strabismus. The retinography showed typical fundoscopic findings. The electroretinogram and the Ishihara color test were normal. Conclusions: The mucopolysaccharidosis II is caused by the deficiency of the enzyme iduronate-2-sulfatase, codified by a gene mapped to Xq28, with high heterogeneity observed in different populations, reported on the literature. Concerning the myopia, the results found on the bibliography search indicated 12 autosomic and 2 X-linked forms. The X-linked high-grade myopia, with normal color test, allow us to discard MYP1. The presence of nystagmus and strabismus discards MYP13. The occurrence of two X-linked diseases in the same family seems to be very rare, and was not described previously in the literature.

Dois sistemas para amplificação simultânea de short tandem repeats (STRs) do cromossomo X foram desenvolvidos neste trabalho. O Multiplex 1 foi composto por HPRTB, DXS101, DXS7424, DXS6807, DXS6800 e GATA172D05 e o Multiplex 2 foi composto por DXS8378, DXS7133, DXS9898, DXS7423, DXS6809, DXS6789, DXS8377 e DXS6801. Além do desenvolvimento de dois sistemas multiplex, nós apresentamos, neste estudo, a freqüência alélica para esses locos na população do Rio Grande do Sul, Brasil. A amostra foi composta por um total de 266 indivíduos, sendo 125 mulheres e 141 homens. O equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) foi testado na amostra feminina e não foram encontrados desvios significativos após a correção de Bonferroni. Os testes de desequilíbrio de ligação (LD) foram realizados para todos os pares de locos e três resultados significativos, após a correção de Bonferroni, de 91 comparações, foram obtidos entre DXS101 e DXS8377 (P<0,001), DXS7133 e DXS6809 (P<0,001) e DXS7423 e DXS6809 (P<0,001). O poder de discriminação em mulheres (PDF) variou entre 0,832 para DXS6801 e 0,987 para DXS8377. DXS6801 foi o marcador menos informativo (PIC=0,605), enquanto o DXS8377 foi o loco mais polimórfico (PIC=0,911), seguido pelo DXS101 (PIC=0,872). / We developed two multiplex systems for the coamplification of X-chromosomal short tandem repeats (STRs). X-Multiplex 1 consisted of HPRTB, DXS101, DXS7424, DXS6807, DXS6800 and GATA172D05 and X-Multiplex 2 consisted of DXS8378, DXS7133, DXS9898, DXS7423, DXS6809, DXS6789, DXS8377 and DXS6801. In addition, we present allele frequencies for this loci in a south Brazilian population comprising 125 females and 141 males. Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) was tested in the female sample and no significant deviations were found, after applying Bonferroni’s correction. Linkage disequilibrium (LD) tests were performed for all pairs of loci and three significant results, even after applying Bonferroni’s correction, out of 91 pairwise comparisons, were obtained between DXS101 and DXS8377 (P<0.001), DXS7133 and DXS6809 (P<0.001) and DXS7423 and DXS6809 (P<0.001). The power of discrimination in females (PDF) varied between 0,832 for DXS6801 and 0,987 for DXS8377. DXS6801 was the least informative marker (PIC=0,605), while DXS8377 was the most polymorphic (PIC=0,911), followed by DXS101 (PIC=0,872).

Adrenoleucodistrofia ligada ao cromossomo X (X-ALD) é um Erro Inato do Metabolismo dos peroxissomos, que se caracteriza pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA) em fluidos e tecidos corporais. É causada por mutações no gene ABCD1, o qual codifica uma proteína responsável por transportar VLCFA do citosol para dentro do peroxissomo, para serem oxidados. Apesar dos mecanismos relacionados ao dano tecidual ainda não estarem bem elucidados, estudos vêm mostrando que o acúmulo de metabólitos tóxicos e o estresse oxidativo podem estar relacionados com a fisiopatologia da doença. Considerando que ainda não foi reportado dano ao DNA em pacientes X-ALD, e que muitos estudos vêm investigando as propriedades antioxidantes de N-acetil-L-cisteína (NAC), rosuvastatina (RSV) e trolox (TRO), os objetivos deste trabalho foram avaliar o dano ao DNA em HTZ e pacientes sintomáticos portadores de X-ALD, verificar o efeito in vitro de NAC, TRO e RSV sobre o dano ao DNA nestes pacientes, estudar associações entre o dano ao DNA e a peroxidação lipídica e, por fim, investigar a capacidade da NAC em aumentar, in vitro, os níveis de glutationa (GSH) e sulfidrila nos pacientes X-ALD. Não foi verificada diferença significativa no dano ao DNA em mulheres HTZ, quando comparado a controles. Em contraste, pacientes sintomáticos apresentaram um maior índice de dano ao DNA comparado às HTZ e ao grupo controle. No ensaio in vitro, foi observado que os antioxidantes NAC (1 e 2,5 mM), TRO (25 e 75 μM) e RSV (0,5; 2 e 5 μM) foram capazes de reduzir o dano ao DNA em pacientes sintomáticos a níveis de controle. Além disso, observamos uma correlação positiva entre o dano ao DNA e o nível de isoprostanos urinários (biomarcador de dano a lipídios), o que nos permite inferir que o dano ao DNA poderia estar sendo causado por processos oxidativos em pacientes sintomáticos. Verificou-se também que os conteúdos de glutationa eritrocitária e sulfidrila plasmática estavam diminuídos em pacientes X-ALD (independentemente do fenótipo) e que 5 mM de NAC, in vitro, foi capaz de aumentar estes parâmetros a níveis de controle saudáveis. O presente trabalho fornece evidências experimentais de que há dano ao DNA em pacientes X-ALD, os quais possuem níveis diminuídos de GSH e sulfidrila, e que a administração dos antioxidantes NAC, TRO e RSV poderia ser considerada uma terapia adjuvante no tratamento da X-ALD. / X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is an inborn error of peroxisome metabolism which is characterized by the accumulation of very long chain fatty acids (VLCFA) in tissue and body fluids. It is caused by mutations in the ABCD1 gene, which encodes a protein responsible for transporting VLCFA from cytosol to peroxisomes to be oxidized. Although the mechanisms underlying tissue damage are still poor understood, studies have been shown that the accumulation of toxic metabolites and oxidative stress may be related to the pathophysiology of X-ALD. Considering that DNA damage was not reported in X-ALD patients yet, and that former studies have been investigated the antioxidant properties of N-acetyl-L-cistein (NAC), rosuvastatin (RSV) and trolox (TRO), the aims of this study were to evaluate DNA damage in HTZ and symptomatic X-ALD patients, to study the in vitro effect of NAC, TRO and RSV on DNA damage in these patients, to look for associations between DNA damage and lipid peroxidation and to verify the ability of NAC in increasing, in vitro, glutathione (GSH) and sulfhydryl levels on X-ALD patients. It was verified no significant difference on DNA damage in HTZ women when compared to controls. In contrast, symptomatic patients presented higher DNA damage levels, compared to HTZ and control group. In the vitro assay, it was observed that the antioxidants NAC (1 e 2,5 mM), TRO (25 e 75 μM) and RSV (0,5; 2 e 5 μM) were able to reduce DNA damage in symptomatic patients until control levels. Likewise, our results showed positive correlation between DNA damage and urinary isoprostanes (biomarker of lipid damage), allowing us to hypothesize that DNA damage might be caused by oxidative processes in symptomatic patients. It was also verified that the plasmatic sulfhydryl content and erythrocyte glutathione levels were decreased in X-ALD patients (regardless of the phenotype) and that 5mM of NAC in vitro was able to increase these parameters until control levels. The present work yields experimental evidence that DNA damage occurs in X-ALD patients, which have GSH and sulfhydryl levels reduced and that the administration of the NAC, TRO and RSV antioxidants might be considered as an adjuvant therapy for X-ALD.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-12T14:48:04Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Danyllo Felipe de Oliveira.pdf: 2356321 bytes, checksum: 65e8ae7586ecebdf70bf8d998cba93d3 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T14:48:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Danyllo Felipe de Oliveira.pdf: 2356321 bytes, checksum: 65e8ae7586ecebdf70bf8d998cba93d3 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014 / CAPES / Entende-se por Deficiência Intelectual (DI), conforme a mais recente versão do Código Internacional de Doenças (CID-10), como sendo uma “parada do desenvolvimento ou desenvolvimento incompleto do funcionamento intelectual”. Essa alteração se dá essencialmente durante o desenvolvimento do indivíduo e afeta, principalmente, “funções cognitivas, de linguagem, motricidade e do comportamento social”. Ainda segundo as definições teóricas do CID-10, a DI pode ser subdividida de acordo com o grau de severidade de comprometimento intelectual, sendo este medido pelo nível do quociente de inteligência (QI) obtido dos pacientes em testes de neuropsicologia A deficiência intelectual é uma característica bastante recorrente, e tem sido extensivamente estudada do ponto de vista genético desde a identificação da trissomia do cromossomo 21 como um fator etiológico para a Síndrome de Down. Posteriores investigações usando técnicas citogenéticas de bandeamento cromossômico e hibridização in situ, contribuíram para melhor compreender a base molecular da DI, através da descrição de perdas e ganhos de grandes fragmentos cromossômicos além de microdeleções e microduplicações. Estas alterações têm sido crescentemente descritas para a Síndrome de Cri Du Chat, Smith-Magenis, Wolf- Hischhron, entre outras. Dentre as condições genéticas onde DI é encontrada, as cujo padrão de herança está ligado ao cromossomo X representam de 10 a 15 % dos casos. Em face disso, a deficiência mental de herança ligada ao cromossomo X (DMLX) apresenta-se como um complexo grupo de mais de mais de 200 entidades nosológicas, com uma considerável heterogeneidade genética, uma vez que mais de 100 genes têm sido identificados até o momento. Entretanto, a despeito da grande quantidade de genes envolvidos, mais de 50 % das famílias identificadas com deficiência mental ligada ao X possuem uma etiologia genética desconhecida. Duas famílias com um provável padrão de herança ligado ao cromossmo X, originárias do Estado de Pernambuco foram avaliadas do ponto de vista clínico e molecular. A família 1 apresentou quatro afetados, sendo três homens e uma mulher, que eram portadores de deficiência mental grave. O indivíduo probando, cuja idade é 29 anos, apresenta além da DI, um perímetro cefálico abaixo do segundo percentil. Nenhuma outra alteração dismórfica foi evidenciada nos outros indivíduos, embora entre os afetados haja o registro de crises convulsivas. A segunda família, com três afetados, sendo dois deles gêmeos univitelinos, apresenta indivíduos com deficiência intelectual grave, com nenhum outro sinal dismórfico aparente. A análise por Southern blotting de ambas famílias para a verificação das expansões do gene FMR1, associado à síndrome do cromossomo X frágil, revelou que o probando da família 1 apresentava a pré-mutação (fragmentos de 3 kb), assim como a sua genitora e a irmã desta. O outro afetado, filho desta última portadora da pré-mutação, apresentou a mutação completa (fragmentos de 6 , 6,3 e 8kb). O último indivíduo afetado e sua respectiva genitora apresentaram fragmentos correspondentes ao de indivíduos normais (2,8 e 5,2 kb). Tais dados levam ao diagnóstico da Síndrome do cromossomo X frágil para a primeira família. A segunda família foi semelhantemente testada, mas os indivíduos e sua genitora são normais para o teste do gene FMR1. O estudo do teste de desvio de inativação do cromossomo X na mãe dos afetados da família 2 revelou que este indivíduo apresenta um desvio total de inativação (100:0), um indicativo do padrão de herança ligado ao cromossomo X. A hibridização genômica comparativa (array CGH) não identificou nenhuma alteração cromossômica microestrutural que pudesse explicar o fenótipo.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-03-30T13:52:07Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese_Adriana_Bispo_final_ficha catalografica.pdf: 4400523 bytes, checksum: b3e9eb79c58483144a4659be5ab2d45c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-30T13:52:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese_Adriana_Bispo_final_ficha catalografica.pdf: 4400523 bytes, checksum: b3e9eb79c58483144a4659be5ab2d45c (MD5) Previous issue date: 2015-09-15 / A síndrome de Turner (ST) é caracterizada primariamente pelo cariótipo 45,X, mas podem ocorrer linhagens celulares incluindo o cromossomo Y. A precisa identificação do cromossomo Y nessas pacientes é de grande importância clínica devido a um aumento no risco de tumores gonadais. A alta frequência de mosaicismo na ST faz dessa síndrome um importante modelo para investigação do efeito dos polimorfismos dos genes da rota do folato como fatores de risco à não disjunção cromossômica somática. Alterações no metabolismo do folato podem promover aneuploidias por um efeito indireto sobre os padrões de metilação do DNA. Neste trabalho reportamos a frequência de mosaicismo críptico do cromossomo Y e sua associação clínica, como também a descrição de uma alteração cromossômica rara. Adicionalmente, foi investigada uma possível associação entre os polimorfismos de genes da rota do folato e o risco de não disjunção cromossômica somática na ST. A presença de mosaicismo oculto do cromossomo Y foi detectada em 2,7% dos casos, os quais mostraram genitália feminina normal sem sinais de virilização ou desenvolvimento tumoral. Assim, a busca de sequências do Y deve ser realizada na ST independente do cariótipo e/ou sinais clínicos. Não foi possível estabelecer uma associação entre os polimorfismos dos genes MTHFR, MTR, RFC1 e TYMS, independentes ou combinados, modulando o risco de não disjunção somática na ST, demostrando que polimorfismos nesses genes, envolvidos na rota do folato, podem não representar uma importante contribuição para os mecanismos de geração das aneuploidias. / Turner syndrome (TS) is primarily characterized by the 45,X karyotype, but can occur cell lines including the Y-chromosome. The precise identification of Y-chromosome in TS patients is of great clinical importance due to an increased risk of gonadal tumors. The high frequency of mosaicism in TS makes this syndrome an important model to investigate the effect of genetic polymorphisms in folate pathway as risk factors to somatic non-disjunction. Changes in folate metabolism can promote aneuploidies by an indirect effect on the DNA methylation patterns. In this work was reported the frequency of Y-chromosome hidden mosaicism and its clinical association, and also described a rare chromosomal alteration. Additionally, a possible association between gene polymorphisms in folate pathway and the risk of somatic chromosome non-disjunction in TS was investigated. The presence of hidden Y chromosome mosaicism was detected in 2.7% of cases, which showed normal female genitalia without signs virilization or tumor development. Thus, the search for Y sequences should be held at TS regardless of the karyotypes and/or clinical signs. We could not establish an association between polymorphisms of MTHFR, MTR, RFC1 and TYMS genes, independent or combined, modulating the risk of somatic non-disjunction in TS, showing that polymorphisms in these genes, involved in folate metabolism, may not represent an important contribution to the generation mechanisms of aneuploidies.

Em fêmeas de mamíferos, um dos cromossomos X é inativado proporcionando compensação de dose entre os produtos gênicos de machos e fêmeas. A inativação do cromossomo X (ICX) ocorre no embrião em desenvolvimento, e se caracteriza pela aquisição de marcas heterocromáticas no cromossomo X inativado (Xi), que são mantidas nas células somáticas ao longo das divisões celulares. O melhor modelo para estudo do início da ICX são as células-tronco embrionárias femininas. Provenientes da massa celular interna de blastocistos, elas representam um embrião em desenvolvimento e possuem os dois X ativos; a diferenciação das células promove a ICX in vitro, o que permite a identificação dos fatores e mecanismos moleculares envolvidos. A derivação de linhagens de célulastronco embrionárias humanas (human embryonic stem cells - hESCs) em 1998 permitiu novas possibilidades de estudo da ICX, pois a maioria dos trabalhos procurou esclarecer o mecanismo da ICX no modelo murino. Tradicionalmente, a manutenção da ICX em humanos tem sido investigada em células somáticas híbridas ou transformadas; porém, sabe-se que estas não representam um contexto celular natural. Assim, o presente trabalho teve como objetivos principais explorar a potencialidade de hESCs no estudo do início da ICX, e ainda investigar a função de três fatores na manutenção da ICX em células humanas imortalizadas: DNMT1 (enzima responsável pela manutenção da metilação do DNA), SMCHD1 (proteína da família de coesinas/condensinas), e XIST (um RNA não-codificador que inicia o processo de heterocromatinização do futuro Xi) foram selecionados para este estudo, uma vez que todos participam da manutenção da ICX em camundongos. Até o momento foram derivadas em nosso laboratório quatro linhagens de hESCs, as primeiras da América Latina. A caracterização das linhagens mostrou que, apesar de se manterem indiferenciadas, as hESCs femininas encontram-se em estágio pós-ICX, pois mesmo indiferenciadas já apresentam um dos X inativado. Nossos dados indicam que, submetidas às atuais condições de cultivo, as hESCs não são bons modelos para o estudo do início da ICX, e é possível que a inativação de um cromossomo X durante o cultivo confira alguma vantagem seletiva às células. A estratégia utilizada no estudo da manutenção da ICX foi o silenciamento dos três genes por interferência de RNA (RNAi). Não foi possível diminuir significativamente a expressão dos genes XIST e SMCHD1. Porém, o silenciamento de DNMT1 foi expressivo, e em resposta foi observada reativação do gene MAOA, localizado no cromossomo X e submetido à inativação. Apesar de nossas análises mostrarem que os efeitos da diminuição de DNMT1 foram restritos ao gene MAOA, estes resultados sugerem a existência de diferentes hierarquias de controle epigenético dos genes submetidos à ICX em células humanas / In female mammals, one of the X chromosomes is inactivated to achieve dosage compensation between males and females. The X chromosome inactivation (XCI) occurs early during embryogenesis and is characterized by the acquisition of heterochromatic features on the inactive X (Xi), which are maintained during all the subsequent cell divisions. Embryonic stem cells are the most suitable cells to study the establishment of XCI. They are obtained from the inner cell mass (ICM) of blastocysts, and can represent a developing female embryo, possessing two active X-chromosomes; when differentiated, these cells recapitulate XCI in vitro, and thus one can identify XCI regulators and factors involved. The derivation of human embryonic stem cells (hESCs) in 1998 offered new possibilities to study XCI, since most of the mechanistic studies of XCI have so far been investigated in the mouse model system. Traditionally, maintenance of XCI in humans has been addressed in somatic cell hybrids or transformed cells; however, they do not represent a natural cellular context. The main goals of the present work were to verify the potential of hESCs as models of XCI, and also to study the function of three important factors in XCI maintenance in immortalized human cells. DNMT1 (DNA-methyltransferase 1), SMCHD1 (a cohesin/condensin protein family member) and the XIST gene (a non-coding RNA which triggers XCI and promotes X heterochromatin formation on the future Xi) were selected, as they are key factors in XCI maintenance in the mouse. Until now four hESCs lines were derived in our lab. Their characterization showed that, in spite of been undifferentiated, the female hESCs have already undergone XCI. Our data suggest that, under the actual culture conditions, hESCs are not good models to study XCI, and it is also possible that X inactivation confers selective advantage to hESCs. Knockdown by RNA interference was used to study the roles of three genes in XCI maintenance. We could not efficiently knockdown XIST or SMCHD1. However, the DNMT1 silencing was substantial, and led to the reactivation of MAOA, an X-linked gene subjected to XCI. Although the effect of DNMT1 silencing was restricted to MAOA, our data suggest that there are different epigenetic hierarchies to control the expression of the genes subjected to XCI in human cells.

A identificação forense através da análise de ácidos nucléicos é realizada, freqüentemente, pelo estudo de regiões polimórficas do DNA, tais como os STRs, regiões que apresentam repetições consecutivas curtas. Para a utilização destes marcadores na identificação humana é necessário conhecer a distribuição de seus alelos na população a qual o indivíduo pertence, visto que essa varia entre diferentes populações. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo determinar a freqüência alélica de cinco STRs do cromossomo X (DXS6854, DXS7424, DXS101, DXS6808 e DXS7132), a fim de avaliar a contribuição destes marcadores, através de cálculos estatísticos, na prática forense e em testes de paternidade. Foram coletadas amostras de esfregaço bucal, através de swab bucal, sendo depositado em cartão de coleta, e/ou sangue, através de punção digital depositada em cartão de coleta, em 243 sujeitos da pesquisa, sendo estes indivíduos não aparentados, residentes no Estado de São Paulo. A extração do DNA foi realizada a partir do Kit DNA IQ® (Promega), de acordo com as normas do fabricante e, na reação de PCR, utilizou-se um multiplex desenvolvido pela empresa BIOCOD (Belo Horizonte, MG), sendo a tipagem dos loci obtida através de corrida eletroforética, em gel de poliacrilamida desnaturante, no seqüenciador automático AlfExpress® (Amersham Biosciences). Os resultados foram analisados através dos programas PowerStats ver. 12 (Promega®) e Arlequin ver. 3.1. Como resultados principais foram observados: a grande variabilidade de alelos presentes na população estudada para os STRs selecionados; que o Poder de Discriminação em mulheres variou de 0,658 (DXS6808) a 0,975 (DXS101), assim como em homens entre 0,451 (DXS6808) e 0,881 (DXS101); as chances de exclusão foram calculadas em duas situações, par pai/filha (MECD) e trio pai/mãe/filha (MECT), sendo os melhores resultados apresentados pelo DXS101; além de verificar que a diversidade haplotípica (nas amostras masculinas) foi de 0,9993, indicando uma Probabilidade de Coincidência menor que 0,0007. Sendo assim, é possível concluir que, com exceção do DXS6808, os demais loci STR permitem uma boa aplicação na prática forense, permitindo sua utilização para cálculo estatístico em análises de identificação humana e testes de parentesco. / The forensic identification through DNA analysis is, frequently, done by the study of DNA?s polymorphic regions, such as STR, short tandem repeats. In order to use these markers in human identification, it?s necessary to know the allelic distribution in the population in wich the person belongs. This research aimed to settle the allelic frequencies of five X-chromosome?s STR (DXS6854, DXS7424, DXS101, DXS6808 e DXS7132) and analysis the contribution of these markers, through statistical parameters, in forensic activities and paternity tests. For this, samples of oral rub were collected by oral swab, being deposited on collect card, and/or blood by digital punction, deposited on collect card, with 243 research subject, being not related, living at Sao Paulo State, Brazil. The DNA extraction was performed using Kit DNA IQ® (Promega), according to manufacturer rules and, at PCR, was used a multiplex developed by BIOCOD (Belo Horizonte, Minas Gerais State), being the loci typifying obtained by eletrophoretical procedure, on polyacrilamid gel, using AlfExpress® (Amersham Biosciences). The results were statistically analyzed by PowerStats ver. 12 (Promega®) and Arlequin ver. 3.1 programs. The principal results showed: the great allele variability in this population sample to the selected STRs; that Power of Discrimination in women varied from 0.658 (DXS6808) to 0.975 (DXS101), as well as in men between 0.451 (DXS6808) and 0.881 (DXS101); the mean exclusion chance were calculated at two conditions, pair father/daughter (MECD) and trios involving daughters (MECT), being the best results performed by DXS101; and verify that haplotipical diversity (in men samples) was 0.9993, showing a Chance of Coincidence under 0.0007. In this way, it?s possible to conclude that, with exception of DXS6808, the other STRs loci studied can be used at forensic practice, using for statistical math in human identification and kinship testing.