Submitted by Adriana Martinez (amartinez@unoeste.br) on 2018-05-10T22:40:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Isabella Saneshigue.pdf: 688383 bytes, checksum: dcc746f15532dd8ee811a23185cc4201 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-10T22:40:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Isabella Saneshigue.pdf: 688383 bytes, checksum: dcc746f15532dd8ee811a23185cc4201 (MD5) Previous issue date: 2017-11-24 / Accidents caused by venom of Crotalus snakes, popularly known in Brazil as rattlesnake, cause the highest number of deaths in humans and animals, mainly due to the great neurotoxic, myotoxic, coagulant, nephrotoxic and hepatotoxic potential of their venom. The present study had the objective of analyzing by histology and fractal dimension liver samples of Wistar rats experimentally poisoned with venom of the snake Crotalus durissus terrificus. The hypothesis is that the venom of Crotalus durissus terrificus is capable of inducing hepatic damage at the dose recommended in this study, that its alterations can be quantified by the fractal dimension and that the antiofidic serum be able to minimize the hepatic lesions induced by the venom. Ninety rats were divided into different groups and treated with: control group (GC, n = 30) 0.9% sodium chloride solution; venom group (GV, n = 30) crotalic venom; (GVS, n = 30) Crotalic venom and antiofidic serum 6 hours after the application of the venom. Liver samples were collected at 2h (M1), 8h (M2) and 24h (M3) after venom administration and submitted to histological analysis and fractal dimension (DF) using the ImageJ® software and box-counting method. Procedures for collecting, processing and analyzing samples were standardized. No significant lesions were observed in GC and GV. Necrosis, cytoplasmic and nuclear vacuolization and absence of inflammatory infiltrate were observed in M2 and M3, whereas in GVS, mononuclear inflammatory infiltrate was evident at all times, in addition to the lesions found in GV. The lesions of necrosis, cytoplasmic and nuclear vacuolization, considered of greater severity were visualized in M3 in both GV and GVS. There was an increase in DF for the same changes in GV and GVS over time, but with no difference between them, but with a significant difference compared to CG. The lesions evidenced in the liver were not minimized by the application of the antiofidic serum. This study agrees with other authors about the hepatotoxicity of crotalic venom in relation to histological findings and the results indicate an increase in FD for the findings of vacuolization and necrosis, proving to be an efficient method for the quantitative evaluation of morphological changes induced by venom without observer interference. In addition, non-protection of the liver by antiofidic serum was evident. It is concluded that Crotalus durissus terrificus venom has hepatotoxic effects; FD is effective in the quantitative morphological evaluation of the liver for vacuolization and necrosis, and antiofidic serum did not protect the liver from venom-induced lesions. / Os acidentes causados pelo veneno das serpentes do gênero Crotalus, conhecidas popularmente no Brasil como cascavel, causam o maior índice de óbitos em seres humanos e animais, principalmente pelo grande potencial neurotóxico, miotóxico, coagulante, nefrotóxico e hepatotóxico do seu veneno. O presente estudo teve por objetivo analisar pela a dimensão fractal e achados histológicos em amostras de fígado de ratos Wistar intoxicados experimentalmente com veneno da serpente Crotalus durissus terrificus. A hipótese é que o veneno da Crotalus durissus terrificus seja capaz de induzir lesão hepática na dose preconizada neste estudo, que suas alterações possam ser quantificadas pela dimensão fractal e que o soro antiofídico seja capaz de minimizar as lesões hepáticas induzidas pelo veneno. Noventa ratos, foram distribuídos em diferentes grupos e tratados com: grupo controle (GC, n=30) solução de cloreto de sódio 0,9%; grupo veneno (GV, n=30) veneno crotálico; grupo veneno/soro antiofídico (GVS, n=30) veneno crotálico e soro antiofídico 6 horas após aplicação do veneno. As amostras do fígado foram realizadas nos momentos 2h (M1), 8h (M2) e 24h (M3) após administração do veneno e submetidas a análise histológica e dimensão fractal (DF) utilizou o software ImageJ® e método de box-counting. Os procedimentos para coletar, processar e analisar as amostras foram padronizados. Não foram observadas lesões significativas no GC e no GV foram evidenciadas necrose, vacuolização citoplasmática e nuclear e ausência de infiltrado inflamatório nos M2 e M3, enquanto que no GVS evidenciou-se infiltrado inflamatório mononuclear em todos os momentos, além das lesões constatadas no GV. As lesões de necrose, vacuolização citoplasmática e nuclear, consideradas de maior severidade foram visualizadas no M3 tanto no GV quanto no GVS. Observou-se uma elevação da DF para as mesmas alterações nos GV e GVS ao longo do tempo, porém sem diferença entre eles, mas com diferença significativa comparado ao GC. As lesões evidenciadas em fígado não foram minimizadas pela aplicação do soro antiofídico. Este estudo concorda com outros autores quanto a hepatotoxicidade do veneno crotálico frente aos achados histológicos e os resultados apontam aumento da DF para os achados de vacuolização e necrose, mostrando ser um método eficaz na avaliação quantitativa de alterações morfológicas induzidas pelo veneno, sem a interferência do observador. Além disso, a não proteção do fígado pelo soro antiofídico foi evidente. Conclui-se que o veneno de Crotalus durissus terrificus apresenta efeitos hepatotóxicos; a DF é eficaz na avaliação morfológica quantitativa do fígado para vacuolização e necrose, e o soro antiofídico não protegeu o fígado de lesões induzidas pelo veneno.

Estudos anteriores demonstraram que o veneno de Crotalus durissus terrificus (VCdt) apresenta ação antiinflamatória prolongada, bem como inibe o espraiamento e a atividade fagocítica de macrófagos peritoneais, sendo a crotoxina (CTX), o principal componente do VCdt, a responsável por esses efeitos. Em relação aos neutrófilos, demonstrou-se que o VCdt inibe, in vitro e in vivo, a fagocitose por essas células, porém o componente do VCdt responsável por esse efeito não foi identificado. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi identificar o componente responsável pelo efeito inibitório do VCdt sobre a fagocitose por neutrófilos, bem como investigar os possíveis mecanismos envolvidos nessa ação. Além disso, foi também objetivo desse estudo investigar o efeito do VCdt e da CTX sobre a atividade microbicida e a produção de espécies reativas do oxigênio por essas células. Inicialmente, foi avaliado o efeito in vitro dos três picos do VCdt, obtidos durante a purificação da CTX (pico I; pico II, que corresponde a CTX, e pico III), sobre a atividade fagocítica de neutrófilos. A incubação dos neutrófilos com a CTX ou com os picos I ou III, em diferentes concentrações (0,02; 0,04; 0,08; 0,16 ou 0,32 ug/mL), mostrou que somente o pico II inibiu essa atividade, demonstrando que a CTX é o componente do VCdt responsável pelo seu efeito inibitório sobre a fagocitose por neutrófilos. Uma vez realizada essa identificação, foi investigado o efeito in vivo da CTX sobre essa função. O tratamento dos animais com a CTX (0,1 mg/kg), 2 horas, 1, 4 ou 14 dias antes ou 1 hora após a administração de carragenina inibiu a fagocitose por neutrófilos, o que demonstra que esta toxina, além do efeito direto, apresenta efeito sistêmico sobre a atividade fagocítica dessas células. Esses resultados mostraram também que a CTX apresenta efeito inibitório prolongado sobre a atividade fagocítica de neutrófilos. Ainda, com o objetivo de elucidar os possíveis mecanismos envolvidos nesse efeito inibitório foram realizados ensaios imunocitoquímicos para avaliar a reorganização do citoesqueleto. A incubação dos neutrófilos com o VCdt (0,5 ug/mL) ou com a CTX (0,08 ug/mL), bem como o tratamento dos animais com o VCdt (0,18 mg/kg) ou a CTX (0,1 mg/kg), 2 horas antes da administração de carragenina, inibiram a fosforilação de resíduos de tirosina e a polimerização da actina. Em relação ao efeito do VCdt e da CTX sobre outra função dos neutrófilos, foi investigado, em ensaios in vitro e in vivo, a atividade microbicida e a produção de espécies reativas do oxigênio por essas células. A incubação dos neutrófilos com o VCdt (0,125; 0,25; 0,5; 1,0 ou 2,0 ug/mL) ou a CTX (0,02; 0,04; 0,08; 0,16 ou 0,32 ug/mL), bem como o tratamento dos animais com o VCdt (0,18 mg/kg) ou a CTX (0,1 mg/kg), 2 horas antes da administração de carragenina, não alteraram a atividade microbicida e a produção de ânion superóxido, peróxido de hidrogênio e ácido hipocloroso. Em conclusão, a CTX é o componente do VCdt responsável por inibir a fagocitose por neutrófilos e um dos mecanismos envolvidos neste efeito é a inibição da fosforilação de proteínas sinalizadoras e a conseqüente polimerização de actina, importante evento para o início da formação do fagossoma e a completa internalização da partícula. Por outro lado, o VCdt e a CTX não alteram a atividade microbicida e a produção de espécies reativas do oxigênio por neutrófilos. Dessa forma, considerando-se o papel fundamental dessas células na inflamação, este estudo amplia os conhecimentos das ações moduladoras da CTX sobre a resposta inflamatória e, ainda, contribui para a elucidação dos mecanismos envolvidos nestas ações, particularmente, a inibição do processo de fagocitose por neutrófilos. / Previous studies showed that Crotalus durissus terrificus snake venom (CdtV) has long-lasting anti-inflammatory properties and inhibits the spreading and the phagocytic activity of peritoneal macrophages. Crotoxin (CTX), the main component of CdtV, is responsible for these effects. In addition, CdtV inhibits, in vitro and in vivo, the phagocytic activity of neutrophils, but the component of the venom responsible for this effect was not identified. In this way, the aim of this study was to investigate the CdtV component responsible for the inhibitory effect on phagocytosis by neutrophils, as well as to investigate possible mechanisms involved on this effect. Besides, the aim of this study was also to investigate the effect of CdtV and CTX on the microbicidal activity and the production of reactive oxygen species by neutrophils. Initialy, it was avaliated the in vitro effect of the three peaks of CdtV, obtained during CTX purification (peak I, peak II that corresponds to CTX and peak III), on phagocytosis by neutrophils. The incubation of the cells with CTX, peak I or peak III, at different concentrations (0.02, 0.04, 0.08, 0.16 or 0.32 ug/mL), showed that just peak II inhibited this activity, so CTX is the CdtV component responsible for the inhibitory effect on phagocytosis by neutrophils. Once realized this identification, it was investigated the in vivo effect of CTX on the same neutrophil function. Treating animals with CTX (0.1 mg/kg), 2 hours, 1, 4 or 14 days before or 1 hour after the administration of carrageenan inhibited the phagocytic activity of neutrophils, which demonstrates that this toxin, in addition to the direct effect, has systemic effect on phagocytosis by neutrophils. These results also show that CTX has a long-lasting inhibitory effect on the phagocytic activity of these cells. Further, to elucidate possible mechanisms involved on this inhibitoty effect, immunocytochemical assays was realized to evaluate the reorganization of the cytoskeleton. The incubation of the neutrophils with CdtV (0.5 ug/mL) or CTX (0.08 ug/mL), as well as the treatment of the animals with CdtV (0.18 mg/kg) or CTX (0.1 mg/kg), 2 hours before the carrageenan injection, inhibited the phosphorilation of tyrosine residues and actin polymerization. Regarding the effect of CdtV and CTX in other neutrophil function, it was investigated, in vitro and in vivo, the microbicidal activity and the production of reactive oxygen species by neutrophils. The incubation of the cells with CdtV (0.125, 0.25, 0.5, 1.0 or 2.0 ug/mL) or CTX (0.02, 0.04, 0.08, 0.16 or 0.32 ug/mL), as well as the treatment of the animals with CdtV (0.18 mg/kg) or CTX (0.1 mg/kg), 2 hours before the carragennan injection, did not alter the microbicidal activity or the production of superoxide, hydrogen peroxide and hypochlorous acid. In conclusion, CTX is the CdtV component responsible for the inhibitory effect on phagocytosis by neutrophils and a mechanism involved on this effect is the inhibition of phosphorilation of signaling proteins and the consequent actin polymerization, an important event for the phagosome formation and the complete internalization of the particle. On the other hand, CdtV and CTX did not alter the microbicidal activity or the production of reactive oxygen species. Thus, considering the essential role of these cells in inflammation, this study extends the knowledge of the actions of CTX on modulating the inflammatory response and also contributes to the elucidation of the mechanisms involved in these actions, particularly the inhibition of phagocytosis by neutrophils.

Os venenos de serpentes são alvos de pesquisas constantes, pois possuem 90 a 95% do seu peso seco em proteínas que exercem diversas atividades fisiológicas em suas presas. As espécies do gênero Crotalus estudadas no presente trabalho possuem venenos capazes de induzir alterações neurotóxicas, miotóxicas e causam distúrbios de coagulação no caso do veneno de Crotalus vegrandis. A crotamina é um peptídeo catiônico proveniente do veneno de Crotalus durissus terrificus, com atividade miotóxica e antimicrobiana já descritas. O trabalho avaliou a atividade antimicrobiana de crotamina e crotamina-símile provenientes do veneno de serpentes do gênero Crotalus. O veneno bruto foi fracionado por três diferentes métodos cromatográficos, e, para avaliar a técnica, utilizou-se SDS-PAGE. Na etapa de identificação e caracterização de crotamina, foi feito ELISA, utilizando como anticorpo primário uma IgG policlonal anti-crotamina. A fim de analisar a atividade antimicrobiana foram realizados os ensaios de difusão em gota e CIM (Concentração inibitória mínima). A citoxicidade em células murinas, foi avaliada por MTS. A purificação por duas etapas cromatográficas foi suficiente para observarmos a presença da crotamina e crotamina-símile puras (SDS-PAGE). Foram identificados dois peptídeos promissores com relação à atividade antimicrobiana no veneno de C. vegrandis. Todas as amostras testadas foram imunorreativas. Os peptídeos apresentam atividade antimicrobiana com diferentes especificidades e potências. Não houve alta toxicidade frente à linhagem celular murina, apresentando-se como um futuro protofármaco. / Snake venoms are common targets of research due to their high protein content (up to 90 to 95% of dry weight) which affect several biological functions. The species of the genus Crotalus that were studied in the present document have venoms able to induce neurotoxic, myotoxic and coagulation disorders (Crotalus vegrandis). Crotamine is a cationic polypeptide from the venom of rattlesnake Crotalus durissus terrificus, described as myotoxic and displaying antimicrobial activity. The present study aimed to evaluate the antimicrobial activity of crotamine and crotamine-like toxins from the genus Crotalus. Crude venom was fractionated by three different chromatographic methods, and to confirm the efficiency of purification SDS-PAGE was used. In the purification and characterization stage of crotamine, we performed ELISA, using as primary antibody a polyclonal anti-crotamine IgG. To analyze the antimicrobial activity, antibiograms (droplet diffusion) and MIC (minimal inhibitory concentration) assays were performed. Citotoxicity in murine cells was evaluated by MTS. The results of two chromatographic steps were enough to obtain isolated crotamine and crotamine-like (SDS-PAGE). Two promising peptides from C vegrandis were identified for antimicrobial activity. Crude venom and crotamine-like fraction from C. d. ruruima were immunoreactive in ELISA assays. Peptides showed antimicrobial activity with different specificities and potencies. The toxicity towards murine cells was low, indicating the potential of these peptides as a model to future drug.

As peçonhas de serpentes são consideradas ricas fontes de componentes com importantes ações farmacológicas. Estudar seus componentes permite esclarecer a patogenia do envenenamento e identificar moléculas com potenciais aplicações biotecnológicas. As serpentes da espécie Crotalus durissus habitam diversas regiões do Brasil e suas peçonhas são compostas de grande quantidade de proteínas (cerca de 95%), carboidratos, cátions metálicos, aminas biogênicas, nucleosídeos, componentes não enzimáticos, aminoácidos livres e uma pequena fração lipídica. Muitos componentes ainda não foram isolados, embora alguns já tenham sido identificados em análises ômicas (transcriptoma e proteoma), como é o caso do VEGF (Fator de Crescimento Endotelial Vascular) identificado por estas técnicas na peçonha de Crotalus durissus collilineatus (C.d.c). Os VEGFs são homodímeros não enzimáticos com massas moleculares de 20 a 30 kDa, para o dímero, e de 13 a 16 kDa, para o monômero. Eles desempenham o papel principal na angiogênese (crescimento de novos vasos). No entanto, seu papel no envenenamento ainda não está elucidado. Diante disso, o presente estudo teve como objetivo isolar e elucidar os aspectos estruturais e funcionais parciais, de um VEGF da peçonha da serpente C.d.c. A peçonha foi inicialmente submetida a uma análise por LC-MS para um conhecimento geral dos seus componentes. Em seguida, foi fracionada por cromatografia líquida de fase reversa em sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) e, posteriormente, todas as 43 frações obtidas foram submetidas ao ELISA para identificação do VEGF. As frações 23, 24 e 25 foram positivas para VEGF e, por isso, escolhidas para serem estudadas. Estas frações foram recromatografadas por meio de três protocolos (troca catiônica, fase reversa e troca aniônica). Após os fracionamentos, todas as subfrações foram submetidas ao ELISA para identificação do VEGF e à eletroforese em gel de poliacrilamida para a análise da composição das mesmas. Em seguida, essas amostras foram reduzidas, alquiladas e digeridas com tripsina e submetidas a ensaios de espectrometria de massas (ESI-Q-TOF e PMF), para identificar peptídeos trípticos de VEGF e, as que mostraram maior pureza na eletroforese, foram analisadas por sequenciamento amino-terminal, a fim de elucidar sua estrutura primária. Nestes estudos foram identificados um Fator de crescimento de fibroblasto (FGF) e duas isoformas de VEGF. A cromatografia em coluna de troca iônica (HiTrap QXL) foi a mais efetiva na purificação dos compostos das frações 23, 24 e 25. As 6 subfrações obtidas, após confirmação da presença de VEGF pelo ELISA, eletroforese e espectrometria de massas, foram submetidas a uma análise de reconhecimento do VEGF pelo soro anticrotálico comercial por meio do ELISA e o VEGF foi reconhecido com alta afinidade pelo soro. Em seguida, essas amostras foram analisadas por ELISA com anticorpo anti-FGF a fim de confirmar a presença do FGF, porém, este não foi reconhecido nas amostras pelo anticorpo, nas concentrações utilizadas. As frações contendo VEGF, denominado de CdcVEGF, foram submetidas aos ensaios funcionais. No ensaio de angiogênese in vitro, no qual se analisa a indução da formação de tubos em Matrigel® pelas células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVECs), todas as 6 subfrações induziram a angiogênese, confirmando que mantiveram sua atividade após os fracionamentos e dentre estas, a subfração denominada de 24-QXL3 foi a mais potente, mostrando uma indução da formação dos tubos ainda mais potente que o controle positivo (bFGF). No ensaio in vitro de migração de células mononucleares de sangue periférico humano (quimiotaxia em câmara de boyden), os CdcVEGFs não alteraram significativamente a migração das células, nas concentrações testadas. Os dados obtidos neste trabalho ampliam o conhecimento sobre a composição da peçonha de C.d.c, além de desenvolver um novo protocolo para isolamento de VEGF e possibilitar sua caracterização. Adicionalmente, foi possível a identificação de um novo FGF, o qual ainda não havia sido identificado na peçonha de C.d.c. / Snake venoms are considered rich sources of a variety of components that displays important pharmacological activities. The study of these diverse components allows the elucidation of envenoming pathology and the identification of molecules with potential biotechnological applications. The snakes of Crotalus durissus species inhabit various regions of Brazil and their venoms are a complex mixture of proteins (around 95%), carbohydrates, metal cations, biogenic amines, nucleosides, non-enzymatic components, free amino acids and a small lipid fraction. Many components have not yet been isolated, although some of them have already been identified in omics analysis (transcriptome and proteome), like the VEGF (Vascular Endothleial Growth Factor) identified by these techniques in the Crotalus durissus collilineatus (C.d.c) venom. VEGFs are non-enzymatic homodimers with molecular weights varying from 20 to 30 kDa for the dimer and 13 to 16 kDa for the monomer. They have a central role in angiogenesis (growth of new vessels) but their role in the envenoming pathophisiology is not elucidated. This study aimed to isolate and perform the elucidation of the structural and functional aspects of a VEGF from C.d.c snake venom. Initially, the venom was submitted to a LC-MS analysis for the global knowledge of its components. Then, it was fractionated by reversed phase chromatography on FPLC system (Fast Protein Liquid Chromatography) and later all the fractions collected were submitted to an ELISA for identification of VEGF. The fractions 23, 24 and 25 proved being positive for VEGF and therefore, were chosen to be studied. These fractions were rechromatographed by three different protocols (cation exchange, reversed phase and anionic exchange). All the subfractions obtained by these chromatographies were analyzed by ELISA for the confirmation and identification of VEGF and by an SDS-PAGE for the analysis of their composition. These subfractions were then reduced, alquilated and digested with tripsin and submitted to spectrometry analysis (ESI-QTOF and PMF) in order to identify tryptic peptides of VEGF and the ones that presented a higher level of purity in the electrophoresis, were analyzed by amino-terminal sequencing to elucidate its primary structure. In these studies were identified an FGF and two isoforms of VEGFs. The chromatography on ion-exchange column (HiTrap QXL column) was the most effective in purifying the compounds of fractions 23, 24 and 25. The six subfractions obtained, after confirmation of the presence of VEGF by the ELISA, electrophoresis and mass spectrometry, were analyzed by another ELISA with anticrotalic serum and the VEGF was recognized with high affinity by the serum, indicating that the molecule is immunogenic. Subsequently, another ELISA was performed with a FGF-antibody to confirm the presence of FGF in the samples. However, the antibody was not able to recognize it in the concentrations used of the fractions. The VEGF found in all six subfractions was denominated as CdcVEGF and submitted to functional analysis. In the in vitro angiogenesis assay, which analyzes the induction of tube formation in Matrigel® by human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) cells, all 6 subfractions induced angiogenesis, confirming that they maintained their activities after the fractionations. Among those, the subfraction 24-QXL3 showed a more potent response, demonstrating a tube formation even more significant than the positive control (bFGF). In the in vitro assay for the migration of human peripheral blood mononuclear cells (chemotaxis technique in boyden chamber), the CdcVEGFs did not significantly alter cell migration at the concentrations tested. The data obtained in this study amplify the knowledge about the composition of C.d.c venom and the development of a new isolation protocol for VEGF, possibiliting its characterization. Additionally, it was possible to identify a new FGF, which had not yet been identified in C.d.c venom.

Células dendríticas (DCs) participam tanto da geração da resposta imune adaptativa como na manutenção da tolerância. O veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus, sua principal toxina, crotoxina (CTX) e sua subunidade CB (fosfolipase A2), apresentam efeito supressor sobre o sistema imunológico. Neste trabalho foi avaliado o efeito da CTX e CB sobre a ativação/função das DCs e consequente indução de resposta adaptativa específica anti-Ovalbumina (OVA). Primeiramente, foi verificada a eficiência do processo de maturação das DCs incubadas com OVA associada ao LPS. Os resultados obtidos nesse modelo in vitro mostraram que a CTX e CB inibiram a maturação das DCs estimuladas com OVA + LPS, caracterizada por menor expressão de moléculas coestimuladoras, MHC-II e secreção de citocinas pró-inflamatórias. Em contraste, a CTX e CB induziram maior expressão de ICOS-L, PDL1/2 nas DCs incubadas com OVA + LPS assim como a expressão de RNAm para IL-10 e TGF-β. Além disso, ambas as toxinas foram capazes de aumentar a expressão de PDL1, mas não de ICOS-L ou PDL-2 em DCs. Com relação ao mecanismo envolvido no efeito da CTX e CB sobre as DCs, os resultados mostraram o envolvimento dos receptores peptídeo-formil (FPRs) e a via da 5-Lipoxigenase nesse processo. Sobre a imunidade adaptativa, os resultados mostraram menor proliferação de células TCD3+ ou TCD4+ obtidas de animais imunizados com OVA quando co-cultivadas com DCs incubadas com ConA ou OVA + LPS na presença de CTX ou CB. A diferenciação de células Th1 e Th2 foi inibida pela adição de CTX ou CB nas co-culturas com DCs estimuladas com LPS. No entanto, verificou-se aumento da população Treg nas co-culturas de células CD4+ e DCs incubadas com LPS + CTX ou CB em comparação com DCs estimuladas somente com LPS. A CTX e CB inibiram a diferenciação de células CD4+ Tbet+ e CD4+Gata3+ nas co-culturas de TCD4+ purificados de animais DO 11.10 com DCs estimuladas com OVA + LPS. No entanto, apenas a CTX foi capaz de induzir aumento da porcentagem de células CD4+CD25+FoxP3+. Em experimentos in vivo, foi observada menor proliferação e secreção de IL-2 e IFN nas culturas de células de camundongos imunizados com OVA que receberam CTX ou CB quando estimuladas com OVA em comparação com o observado nas culturas de células de camundongos imunizados com OVA. CTX e CB administradas in vivo em camundongos imunizados com OVA também inibiram a porcentagem de células CD4+IFN+, CD4+IL-4+ e promoveram aumento da população CD4+IL-10+ em comparação com o obtido em camundongos imunizados somente com a OVA. Em relação à imunidade humoral, a produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-OVA também foi inibida em camundongos imunizados com OVA que receberam a CTX ou CB. Além disso, a reação de hipersensibilidade do tipo tardio foi suprimida somente em camundongos imunizados com OVA e que receberam a CTX. Estes dados demonstram que a CTX e CB exercem efeito regulador sobre o sistema imune inato e adaptativo e os FPRs bem como a via da 5-lipoxigenase estão envolvidos nessa ação imunomoduladora. / Dendritic cells (DCs) are involved in both the generation of the adaptive immune response and maintenance of the tolerance. The Crotalus durissus terrificus rattlesnake venom, its main toxin, crotoxin (CTX) and CB (phospholipase A2) subunit have suppressive effect on the immune system. In this work it was analyzed the effect of CTX and its CB subunit on the activation/function of DCs and consequent induction of anti-ovalbumin immune response. Firstly, the efficiency of the DCs maturation incubated with OVA associated with LPS was verified. Following, the results obtained in this in vitro model showed that CTX and CB inhibited the maturation of DCs stimulated with OVA + LPS, characterized by lower expression of costimulatory, MHC-II molecules on DCs as well as secretion of proinflammatory cytokines. In contrast, CTX and CB induced an enhancement of ICOS-L, PDL1/2 expression on DCs incubated with OVA, +LPS as well as the expression of IL-10 and TGF-ß RNAm. In addition, both toxins were able to increase the expression of PDL1, but not ICOS-L or PDL-2, on DCs. Regarding the mechanism involved in the effect of CTX and CB on DCs, the results showed the involvement of the formyl-peptide receptors (FPRs) and the 5-Lipoxygenase pathway in this process. On adaptive immunity, the results showed lower proliferation of TCD3+ or TCD4+ cells obtained from mice immunized with OVA when co-cultured with DCs incubated with ConA or OVA + LPS in the presence of CTX or CB. The differentiation of Th1 and Th2 cells were inhibited by the addition of CTX or CB in co-cultures with DCs stimulated with LPS. However, it was verified increased Treg population in co-culture of CD4+cells and DCs incubated with LPS plus CTX or CB compared with DCs LPS-stimulated. CTX and CB inhibited the differentiation of of CD4+Tbet+ and CD4+Gata 3+ cells in co-cultures of TCD4+ purified from DO11.10 mice with DCs stimulated with OVA + LPS. However, only CTX was able to increase the percentage of CD4+CD25+FoxP3+ cells. In in vivo experiments, it was observed lower proliferation and IL-2 and IFN secretions in cell cultures of mice immunized with OVA that received CTX or CB incubated with OVA compared with those observed in cell culture of OVA-immunized mice. The administration of CTX and CB in vivo in mice immunized with OVA also inhibited the percentage of CD4+IFN+, CD4+IL-4+ cells and increased the CD4+IL-10+ population compared with those observed in mice immunized with OVA. In relation to the humoral immunity, the production of anti-OVA IgG1 and IgG2a antibodies was also inhibited in mice immunized with OVA that received CTX or CB. In addition, the delayed hypersensitivity reaction (DTH) was also diminished in mice immunized with OVA that received the CTX. These data demonstrate that CTX and CB exert regulatory effect on innate and adaptive immune system and that FPRs as well as the 5-lipoxygenase pathway are involved in this immunomodulatory activity.

Malformações ou anomalias congênitas são deformidades que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário e que, no caso dos répteis podem ter diversas causas, como genética, temperatura, radiação ou contaminantes entre outros fatores. Este estudo verificou as malformações em filhotes recém-nascidos de jararaca (Bothrops jararaca) e cascavel (Crotalus durissus) de fêmeas prenhes recém-capturadas na natureza (323 e 41 ninhadas respectivamente) do sudeste brasileiro. Após o nascimento, os filhotes foram medidos, pesados e o sexo foi verificado. Realizamos análise macroscópica em busca de malformações perceptíveis e conduzimos exames radiográficos a fim de descrever e documentar as anomalias. As jararacas apresentaram 129 indivíduos malformados entre 5427 recém-nascidos (2,4%); e as cascavéis ttiveram 50 serpentes malformadas em 391 nascidos (12,7%). Anomalias na coluna vertebral foram as mais comuns para as duas espécies, seguidas de fusão nas placas ventrais e malformações oculares. Os filhotes de jararaca apresentaram uma maior variedade de malformações como esquistossomia, cauda retorcida, bicefalia e hidrocefalia, não encontradas em cascavéis. O Ensaio do Cometa não apresentou diferença estatística significativa no índice de dano do DNA (ID) das células das mães que pariram filhotes normais e das que pariram filhotes malformados. Os dois grupos apresentaram células com diferentes graus de dano no DNA. Quando comparamos o tamanho das mães e a frequência de malformações encontramos uma regressão positiva (r2= 0,67). Devido à relação positiva entre idade e tamanho nos répteis concluímos que serpentes com idade mais avançada tendem a apresentar mais filhotes com malformações. O padrão de uso do solo (urbanização, agricultura, pecuária e vegetação nativa), foi correlacionado com a presença de filhotes com malformações, utilizando o Coeficiente de Spearman. Houve uma correlação positiva entre a presença de malformações e as áreas agrícolas (rs= 0,67; p=0,01), mas negativa quando comparados às áreas de vegetação nativa (rs= -0,57; p=0,03). Não houve correlação entre a pecuária ou urbanização e malformações em jararaca. Malformações em cascavel não apresentaram quaisquer correlações com o padrão de uso do solo, sendo que tal condição pode ser resultado da baixa amostragem desta espécie no presente estudo. Serpentes são animais de topo de cadeia e se mostram como bons indicadores biológicos. A presença e diversidade de malformações apresentadas, aliadas ao fato de haver correlação com os padrões do uso do solo, demonstram a necessidade de se realizar um estudo mais aprofundado e interdisciplinar das causas destes fenômenos e um monitoramento destas espécies para se ter um panorama temporal do problema / Malformations or congenital anomalies are deformities that occur during embryonic development and in the case of reptiles may have several causes, such as genetics, temperature, radiation, contaminants and other factors. This study assessed malformations in newborn of pit viper (Bothrops jararaca) and South American rattlesnake (Crotalus durissus,) from wild captured pregnant females (323 and 41 litters respectively) in southeastern Brazil. Newborn snakes were measured, weighed, sexed and studied grossly and by radiography for the presence of malformations. We performed macroscopic analysis in search of noticeable defects and radiographic examinations conducted in order to describe and document the deficiencies. A hundred twenty -nine malformed pit vipers were identified from 5,427 births (2.4%), while 50 malformed rattlesnakes were found from 391 births (12.7%). Spinal abnormalities were the most common in both species, followed by fusion of ventral scales. Pit vipers showed a greater range of malformations including schistosomia, kinked tail, bicephaly and hydrocephaly. There was no statistically significant difference in the index of DNA damage (ID) determined by the Comet Assay in the erythrocytes of mothers that delivered normal litters compared to the erythrocytes of the ones that delivered malformed neonates, both groups containing cells with different degrees of DNA damage. When comparing the length of the pit viper mothers with the frequency of malformations, a positive regression (r2 = 0.67) was found. Due to the positive relationship between age and size in snakes we conclude that older animals tend to have more malformed offspring. The patterns of land use (urbanization, agriculture, livestock and native vegetation) have been correlated with the presence of neonates with malformations. There was a positive correlation between the presence of malformations in pit viper neonates and agricultural areas (rs = 0.67, p = 0.01) but a negative one when compared to areas of native vegetation (rs = -0.57, p = 0.03). There was no correlation between urbanization or livestock and malformations in pit vipers. Malformations in rattlesnake did not show any correlation with the pattern of land use, and such condition could be the result of the poor sampling of this species in the present study. As snakes are in the top of the animal food-chain they are good biological indicators. The presence and diversity of malformations presented, coupled with the correlation with the patterns of land use, demonstrate the need to undertake further interdisciplinary study of the causes of these phenomena and the behavior of these species to have a temporal overview of the problem

As peçonhas ofídicas apresentam uma grande diversidade de componentes proteicos e estes podem variar dependendo de diversos fatores, como espécie, hábitos alimentares e comportamentais, ontogenia e até mudanças sazonais. Este alto grau de variabilidade pode levar a mudanças na fisiopatologia do envenenamento ofídico. No Brasil, as serpentes da espécie Crotalus durissus são capazes de habitar várias regiões do país e sua peçonha está sujeita a variabilidade, levando a uma grande dificuldade no tratamento do envenenamento, que é realizado por infusão do soro antiofídico. O estudo proteômico permite conhecer os componentes expressos pela glândula de peçonha. Sendo assim, este trabalho teve como objetivos realizar uma análise comparativa das diferenças intraespecíficas na composição proteica das peçonhas de 22 espécimes de Crotalus durissus collilineatus através de técnicas ômicas, avaliar a capacidade neutralizante do soro antiofídico produzido pelo Instituto Butantan contra essas peçonhas, avaliar a atividade hialuronidásica de cada peçonha e comparar as alterações bioquímicas e imunológicas de camundongos após o envenenamento crotálico experimental. Para isto, as peçonhas de 22 serpentes da espécie C. d. collilineatus, da região de Catalão - GO, foram fracionadas em uma coluna de fase reversa C-18 acoplada a um sistema de cromatografia líquida rápida de proteínas e analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida e métodos de espectrometria de massas. Inicialmente, foi observado que as peçonhas destas 22 serpentes variaram entre as cores branca e amarela. Os perfis cromatográficos foram semelhantes, entretanto, apresentaram diferenças qualitativas e quantitativas significativas de alguns componentes, por exemplo, apenas duas das peçonhas apresentaram a proteína crotamina. Outros componentes previamente relatados em outros estudos também foram identificados, como, o complexo da crotoxina, serinoproteases, metaloproteases e convulxina. Pela primeira vez foi possível evidenciar por técnicas proteômicas alguns componentes para a subespécie C. d. collilineatus, como: fator de crescimento neural, enzima conversora de angiotensina, fosfodiesterase, 5\'-nucleotidase, carboxipeptidase, glutaminil ciclase, glutationa peroxidase, NADH desidrogenase e fosfolipase B. Através do método de ELISA, constatou-se que o soro anticrotálico produzido pelo Instituto Butantan foi capaz de reconhecer todas as peçonhas utilizadas, embora algumas frações isoladas não tenham sido reconhecidas com tanta eficácia. A atividade hialuronidásica também foi avaliada, evidenciando que as peçonhas de algumas serpentes não apresentaram atividade detectável desta enzima. Por fim, o envenenamento crotálico experimental em camundongos Balb/c revelou que peçonhas diferentes são capazes de produzir alterações bioquímicas e imunológicas distintas. Assim, as vítimas do envenenamento podem necessitar de tratamentos diferenciados. Este trabalho mostrou que existem variações intraespecíficas importantes nas peçonhas de C. d. collilineatus, sendo que algumas podem ser mais miotóxicas que outras, evidenciadas por induzirem grandes aumentos dos níveis de creatina quinase. Além disso, este estudo proteômico revelou a presença de novos componentes proteicos na peçonha de C. d. collilineatus, contribuindo significativamente para o conhecimento de sua composição. Adicionalmente, estes dados indicam que quanto mais diversificado for o pool de peçonhas utilizado para a imunização de cavalos, melhor será o soro anticrotálico produzido, de forma que o único tratamento para este acidente seja ainda mais eficaz. / Snake venoms present a wide variety of protein components and these can vary depending on several factors such as species, eating and behavioral habits, ontogeny and even seasonal changes. This high degree of variability can lead to changes in the pathophysiology of snake bite envenoming. In Brazil, snakes of the species Crotalus durissus are capable of inhabiting various regions of the country and its venom is subject to variability, leading to a high difficulty in treating envenoming, which is performed by the infusion of an antivenom. Proteomic studies allow the knowledge of the components expressed by the venom gland. Thus, this study aimed to perform a comparative analysis of intraspecific differences in the protein composition of the venoms of 22 specimens of Crotalus durissus collilineatus through omics techniques, to evaluate the neutralizing capacity of antivenom produced by Instituto Butantan against these venoms, to evaluate the hyaluronidase activity of each venom and to compare the biochemical and immunological changes of mice after experimental crotalic envenoming. In this way, the snake venoms of the 22 species of C. d. collilineatus, from Catalão - GO region, were fractionated on a reverse phase column C-18 coupled to a fast protein liquid chromatography system and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry methods. Initially, it was observed that the venoms of these 22 snakes varied between white and yellow colors. The chromatographic profiles were similar, however, presenting significant qualitative and quantitative differences of some components, for example, only two venoms showed the protein crotamine. Other components previously reported in other studies were also identified, such as crotoxin, serine proteases, metalloproteases and convulxin. For the first time, it was possible to demonstrate, by proteomic techniques, some components not found thus far in the subspecies C. d. collilineatus, such as nerve growth factor, angiotensin converting enzyme, phosphodiesterase, 5\'-nucleotidase, carboxypeptidase, glutaminyl cyclase, glutathione peroxidase, NADH dehydrogenase, and phospholipase B. By ELISA method, it was found that the crotalic serum produced by the Instituto Butantan was able to recognize all the venoms used, although some isolated fractions have not been recognized effectively. The hyaluronidase activity was also evaluated, showing that the venom of some snakes do not presented detectable activity of this enzyme. The experimental crotalic envenoming in Balb/c mice revealed that different venoms are able to produce different biochemical and immunological changes. Thus, the victims of envenoming may need different treatments. This study demonstrated that there are significant intraspecific variations in the venom of C. d. collilineatus, and some of them may be more myotoxic than others, evidenced by an increasing of creatine kinase levels. Furthermore, the proteomic study revealed the presence of new protein components in the venom of C. d. collilineatus, significantly contributing to the knowledge of its composition. In addition, these data indicate that the more diverse the pool of the venoms used for the immunization of horses, better will be the anticrotalic serum produced, so that the only treatment for this accident will be even more effective

As serinoproteases de peçonha de serpentes (SVSPs) agem sobre pontos específicos do sistema circulatório, sendo consideradas promissoras para o tratamento de uma diversidade de desordens hemostáticas. No presente estudo, é descrita a expressão de uma serinoprotease de Crotalus durissus collilineatus (Collineina-1) em Pichia pastoris, bem como a purificação dessa toxina a partir da peçonha de C. d. collilineatus e a caracterização estrutural e enzimática da Collineina-1 nas formas nativa e recombinante. O cDNA que codifica a serinoprotease foi amplificado a partir da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha de C. d. collilineatus e ligado ao vetor pPICZ A. A linhagem KM71H de P. pastoris foi transformada com o plasmídeo recombinante e as colônias foram selecionadas por resistência à zeocina. A expressão heteróloga foi realizada em meio mínimo suplementado com metanol, resultando em um rendimento de 56 mg de proteína por litro de cultura. A proteína recombinante foi purificada por um protocolo baseado em técnicas cromatográficas de troca iônica e fase reversa. A purificação da serinoprotease a partir da peçonha de C. d. collilineatus foi realizada pela combinação de técnicas de cromatografia de exclusão molecular, troca iônica e fase reversa, e resultou no isolamento de duas isoformas, denominadas Collineina-1 e 2. Quando analisada por espectrometria de massas, a Collineina-1 recombinante apresentou massa molar de 28.868 Da, enquanto as enzimas Collineina-1 e 2 apresentaram massas de 29.475 Da e 29.388 Da, respectivamente. A partir do alinhamento das sequências parciais das serinoproteases, foi possível determinar 100% de identidade dos aminoácidos para a Collineina-1 nativa e recombinante. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida de aminoácidos da Collineina-1 indica uma semelhança estrutural dessa proteína com outras serinoproteases de peçonha de serpente. As enzimas nativa e recombinante mostraram efeitos similares sobre fibrinogênio bovino por clivarem preferencialmente a cadeia A do fibrinogênio, liberando o fibrinopeptídeo A. Ambas as enzimas induziram a coagulação do plasma bovino de forma dose-dependente, sendo que a Collineina-1 recombinante apresentou maior potencial coagulante, com uma dose mínima coagulante (DMC) de 0,08 mg/uL contra 0,225 mgu/L para a proteína nativa. As serinoproteases foram capazes de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222, S-2238 e S2302, embora ambas as enzimas tenham demonstrado maior atividade sobre o substrato S-2302. A atividade esterásica sobre o TAME foi avaliada em diferentes condições de temperatura e na presença de íons divalentes. As duas enzimas demonstraram alta termoestabilidade e tiveram a atividade inibida na presença dos íons Zn2+ e Cu2+. A cinética enzimática de ambas as serinoproteases seguiram o modelo de Michaelis-Menten. A Collineina-1 nativa apresentou um valor de Km de 1,43 mM, contra 1,682 mM para a proteína recombinante, indicando que a proteína nativa apresenta maior afinidade pelo substrato TAME. No entanto, as enzimas apresentaram valores similares de Kcat/Km (250,69 mM.min-1 para a Collineina-1 e 248,03 mM.min-1 para a rCollineina-1), sugerindo que as serinoproteases não diferem significativamente na eficiência em hidrolisar o substrato. Estes resultados demonstraram a adequação do sistema de escolha na produção heteróloga da Collineina-1, já que a proteína recombinante foi expressa com integridade funcional sobre os parâmetros avaliados. / Snake venom serine proteases (SVSPs) act on specific points of the circulatory system and are promising for the treatment of a variety of hemostatic disorders. In the present study, we describe the expression of a serine protease from Crotalus durissus collilineatus (Collineina- 1) in Pichia pastoris, the purification of the native toxin from C. d. collilineatus venom and the structural and enzymatic characterization of Collineina-1 in native and recombinant forms. The cDNA encoding the serine protease was amplified from cDNA library of C. d. collilineatus venom gland and cloned into pPICZ A vector. KM71H P. pastoris strain was transformed with the recombinant plasmid and colonies were selected by zeocin resistance. Heterologous expression was carried out in minimal medium supplemented with methanol, resulting in a yield of 56 mg of protein per liter of culture. The recombinant protein was purified by ion exchange and reverse phase chromatography. Purification of the native serine protease was accomplished by combining techniques of molecular exclusion, ion exchange and reversed phase, and resulted in the isolation of two isoforms, named Collineina-1 and 2. When analyzed by mass spectrometry, the recombinant Collineina-1 showed a molar mass of 28,868 Da, while Collineina-1 and 2 presented masses of 29,475 and 29,388 Da, respectively. The alignment of partial sequences of the enzymes resulted in 100% of amino acid identity between native and recombinant Collineina-1. The multiple alignment of deduced amino acid sequence of Collineina-1 indicates structural similarity with other snake venom serine proteases. The native and recombinant forms of the enzyme showed similar effects on bovine fibrinogen by cleaving preferentially A chain, releasing fibrinopeptide A. Both enzymes induced coagulation of bovine plasma in a dose-dependent way, though recombinant Collineina-1 presented a higher coagulant potential, with a minimum coagulant dose (MCD) of 0.08 mg/uL against 0.225 mg/uL for the native form. The serine proteases hydrolyzed S- 2222, S-2238 and S2302 chromogenic substrates, although both enzymes demonstrated increased activity upon S-2302. The esterase activity on TAME was evaluated at different temperatures and in the presence of divalent ions. Both enzymes showed high thermostability and their activity were inhibited in the presence of Zn2+ and Cu2+. The enzyme kinetics of both serine proteases followed Michaelis-Menten model. The native Collineina-1 showed a Km value of 1.43 mM, against 1.682 mM for the recombinant form, indicating that the native protein has a higher affinity for TAME substrate. However, enzymes had similar values for Kcat/Km (250.69 mM.min-1 for Collineina-1 and 248.03 mM.min-1 for rCollineina-1), suggesting that the serine proteases did not differ significantly in the efficiency to hydrolyze the substrate. These results demonstrated the adequacy of the system of choice in producing the snake venom serine protease, since the recombinant protein was expressed with functional integrity on the evaluated parameters.

Malformações ou anomalias congênitas são deformidades que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário e que, no caso dos répteis podem ter diversas causas, como genética, temperatura, radiação ou contaminantes entre outros fatores. Este estudo verificou as malformações em filhotes recém-nascidos de jararaca (Bothrops jararaca) e cascavel (Crotalus durissus) de fêmeas prenhes recém-capturadas na natureza (323 e 41 ninhadas respectivamente) do sudeste brasileiro. Após o nascimento, os filhotes foram medidos, pesados e o sexo foi verificado. Realizamos análise macroscópica em busca de malformações perceptíveis e conduzimos exames radiográficos a fim de descrever e documentar as anomalias. As jararacas apresentaram 129 indivíduos malformados entre 5427 recém-nascidos (2,4%); e as cascavéis ttiveram 50 serpentes malformadas em 391 nascidos (12,7%). Anomalias na coluna vertebral foram as mais comuns para as duas espécies, seguidas de fusão nas placas ventrais e malformações oculares. Os filhotes de jararaca apresentaram uma maior variedade de malformações como esquistossomia, cauda retorcida, bicefalia e hidrocefalia, não encontradas em cascavéis. O Ensaio do Cometa não apresentou diferença estatística significativa no índice de dano do DNA (ID) das células das mães que pariram filhotes normais e das que pariram filhotes malformados. Os dois grupos apresentaram células com diferentes graus de dano no DNA. Quando comparamos o tamanho das mães e a frequência de malformações encontramos uma regressão positiva (r2= 0,67). Devido à relação positiva entre idade e tamanho nos répteis concluímos que serpentes com idade mais avançada tendem a apresentar mais filhotes com malformações. O padrão de uso do solo (urbanização, agricultura, pecuária e vegetação nativa), foi correlacionado com a presença de filhotes com malformações, utilizando o Coeficiente de Spearman. Houve uma correlação positiva entre a presença de malformações e as áreas agrícolas (rs= 0,67; p=0,01), mas negativa quando comparados às áreas de vegetação nativa (rs= -0,57; p=0,03). Não houve correlação entre a pecuária ou urbanização e malformações em jararaca. Malformações em cascavel não apresentaram quaisquer correlações com o padrão de uso do solo, sendo que tal condição pode ser resultado da baixa amostragem desta espécie no presente estudo. Serpentes são animais de topo de cadeia e se mostram como bons indicadores biológicos. A presença e diversidade de malformações apresentadas, aliadas ao fato de haver correlação com os padrões do uso do solo, demonstram a necessidade de se realizar um estudo mais aprofundado e interdisciplinar das causas destes fenômenos e um monitoramento destas espécies para se ter um panorama temporal do problema / Malformations or congenital anomalies are deformities that occur during embryonic development and in the case of reptiles may have several causes, such as genetics, temperature, radiation, contaminants and other factors. This study assessed malformations in newborn of pit viper (Bothrops jararaca) and South American rattlesnake (Crotalus durissus,) from wild captured pregnant females (323 and 41 litters respectively) in southeastern Brazil. Newborn snakes were measured, weighed, sexed and studied grossly and by radiography for the presence of malformations. We performed macroscopic analysis in search of noticeable defects and radiographic examinations conducted in order to describe and document the deficiencies. A hundred twenty -nine malformed pit vipers were identified from 5,427 births (2.4%), while 50 malformed rattlesnakes were found from 391 births (12.7%). Spinal abnormalities were the most common in both species, followed by fusion of ventral scales. Pit vipers showed a greater range of malformations including schistosomia, kinked tail, bicephaly and hydrocephaly. There was no statistically significant difference in the index of DNA damage (ID) determined by the Comet Assay in the erythrocytes of mothers that delivered normal litters compared to the erythrocytes of the ones that delivered malformed neonates, both groups containing cells with different degrees of DNA damage. When comparing the length of the pit viper mothers with the frequency of malformations, a positive regression (r2 = 0.67) was found. Due to the positive relationship between age and size in snakes we conclude that older animals tend to have more malformed offspring. The patterns of land use (urbanization, agriculture, livestock and native vegetation) have been correlated with the presence of neonates with malformations. There was a positive correlation between the presence of malformations in pit viper neonates and agricultural areas (rs = 0.67, p = 0.01) but a negative one when compared to areas of native vegetation (rs = -0.57, p = 0.03). There was no correlation between urbanization or livestock and malformations in pit vipers. Malformations in rattlesnake did not show any correlation with the pattern of land use, and such condition could be the result of the poor sampling of this species in the present study. As snakes are in the top of the animal food-chain they are good biological indicators. The presence and diversity of malformations presented, coupled with the correlation with the patterns of land use, demonstrate the need to undertake further interdisciplinary study of the causes of these phenomena and the behavior of these species to have a temporal overview of the problem

Os venenos de serpentes são alvos de pesquisas constantes, pois possuem 90 a 95% do seu peso seco em proteínas que exercem diversas atividades fisiológicas em suas presas. As espécies do gênero Crotalus estudadas no presente trabalho possuem venenos capazes de induzir alterações neurotóxicas, miotóxicas e causam distúrbios de coagulação no caso do veneno de Crotalus vegrandis. A crotamina é um peptídeo catiônico proveniente do veneno de Crotalus durissus terrificus, com atividade miotóxica e antimicrobiana já descritas. O trabalho avaliou a atividade antimicrobiana de crotamina e crotamina-símile provenientes do veneno de serpentes do gênero Crotalus. O veneno bruto foi fracionado por três diferentes métodos cromatográficos, e, para avaliar a técnica, utilizou-se SDS-PAGE. Na etapa de identificação e caracterização de crotamina, foi feito ELISA, utilizando como anticorpo primário uma IgG policlonal anti-crotamina. A fim de analisar a atividade antimicrobiana foram realizados os ensaios de difusão em gota e CIM (Concentração inibitória mínima). A citoxicidade em células murinas, foi avaliada por MTS. A purificação por duas etapas cromatográficas foi suficiente para observarmos a presença da crotamina e crotamina-símile puras (SDS-PAGE). Foram identificados dois peptídeos promissores com relação à atividade antimicrobiana no veneno de C. vegrandis. Todas as amostras testadas foram imunorreativas. Os peptídeos apresentam atividade antimicrobiana com diferentes especificidades e potências. Não houve alta toxicidade frente à linhagem celular murina, apresentando-se como um futuro protofármaco. / Snake venoms are common targets of research due to their high protein content (up to 90 to 95% of dry weight) which affect several biological functions. The species of the genus Crotalus that were studied in the present document have venoms able to induce neurotoxic, myotoxic and coagulation disorders (Crotalus vegrandis). Crotamine is a cationic polypeptide from the venom of rattlesnake Crotalus durissus terrificus, described as myotoxic and displaying antimicrobial activity. The present study aimed to evaluate the antimicrobial activity of crotamine and crotamine-like toxins from the genus Crotalus. Crude venom was fractionated by three different chromatographic methods, and to confirm the efficiency of purification SDS-PAGE was used. In the purification and characterization stage of crotamine, we performed ELISA, using as primary antibody a polyclonal anti-crotamine IgG. To analyze the antimicrobial activity, antibiograms (droplet diffusion) and MIC (minimal inhibitory concentration) assays were performed. Citotoxicity in murine cells was evaluated by MTS. The results of two chromatographic steps were enough to obtain isolated crotamine and crotamine-like (SDS-PAGE). Two promising peptides from C vegrandis were identified for antimicrobial activity. Crude venom and crotamine-like fraction from C. d. ruruima were immunoreactive in ELISA assays. Peptides showed antimicrobial activity with different specificities and potencies. The toxicity towards murine cells was low, indicating the potential of these peptides as a model to future drug.