Die Arbeit hatte zum Ziel, ein In-vitro-Infektionsmodell für den protozoären Durchfallerreger Cryptosporidium parvum zu optimieren und dahingehend zu testen, ob es für eine quantitative Beurteilung der Infektiosität von Kryptosporidienoozysten eingesetzt werden kann. Die verwendeten Oozysten wurden zuvor im Zuge einer Passagierung im Kalb vermehrt, aus dem Kot isoliert, aufgereinigt und zur Infektion einer humanen ileocaecalen Adenokarzinomzelllinie (HCT-8) verwendet Die Kultivierung erfolgte über 48 Stunden in Mikrotiterplatten mit jeweils 24 Kavitäten. Die DNA infizierter Zellen und nichtinfizierter Kontrollen wurde anschließend isoliert und die parasitenspezifische DNA in der real-time PCR quantifiziert. Die gewählten Primer-Sonden-Kombinationen erlaubten eine spezifische Amplifikation der Erreger-DNA. In der Optimierung wurden das Brilliant®QPCR Core Reagent Kit, der ABsoluteTMQPCR sowie zwei verschiedene Oligonukleotidkombinationen untersucht. Durch die Klonierung einer Sequenz im Target-Gen und die Herstellung einer Titrationsreihe aus dieser klonierten DNA gelang es, den für die Vergleichbarkeit unerlässlichen homogenen Standard zu gewinnen. Der In-vitro-Vitalitätsassay wurde außerdem auf seine praktische Anwendbarkeit hin geprüft. Es wurde einerseits eine Desinfektionsmittelprüfung mit Chlorokresol (Neopredisan®135-E), andererseits ein Versuch zur thermischen Inaktivierung, beide unter Nutzung dreier verschiedener C. parvum-Chargen (LE-06-Cp-05/0, LE-07-Cp-05/2 vom Isolat A, LE-06-Cp-05/2 vom Isolat B), vollzogen. Die Überbewertung der Infektiosität der Oozysten durch die Betrachtung der Exzystierung konnte anhand der parallel zur DNA-Quantifizierung ermittelten Exzystierungsraten gezeigt werden. Die Exzystierungshemmung lag in jedem Versuch deutlich unter den in der real-time PCR berechneten Inaktivierungsraten. Je nach verwendeter Oozystencharge lieferte die Desinfektion mit 4 % Neopredisan®135-E Inaktivierungsraten, die zwischen 90 und 100 % bei einstündiger Einwirkzeit lagen. Mit steigender Dauer der Inkubation stieg erwartungsgemäß auch der Grad der Inaktivierung. Die Anwendung der 1 %igen Verdünnung resultierte in einer deutlich gesteigerten Exzystierungsrate gegenüber der unbehandelten Kontrolle sowie in stark variierenden Inaktivierungsraten (24 - 91,5 %). Es konnte gezeigt werden, dass mit Neopredisan®135-E unter den gewählten Inkubationsbedingungen zwar eine gute, aber keine vollständige Inaktivierung der C. parvum-Oozysten erfolgt. Eine suboptimale Wirkung zeigte sich in einer hohen Varianz der Einzelmesswerte. Die Vitalitätsraten betrugen nach einstündiger Inkubation der Oozysten bei 38°C noch 100 %, nach 24 Stunden waren diese bereits auf 5 - 23 % abgesunken. Es scheint, als würden mesophile Verhältnisse die Exzystierung der Sporozoiten anregen und bei längerer Konditionierung eine Erschöpfung des Stoffwechsels der Entwicklungsstadien herbeiführen. Die Inaktivierungsrate bei 55°C lag zwischen 96 und 100 %. Bei thermophiler Konditionierung wurde in drei von sieben Fällen, nach der Inkubation in Neopredisan®135-E nur in einer der sieben Untersuchungen ein vollständiger Vitalitätsverlust beobachtet. Die vorgestellte Methode erwies sich als gut reproduzierbar, sensitiv und schnell. Die In-vitro-Kultivierung des Erregers C. parvum ließ sich mit der real-time PCR, welche eine absolute Quantifizierung erlaubte, gut in Einklang bringen. Die Verwendung der In-vitro-Kultur als lebendes System ließ eine gewisse Variabilität der Ergebnisse zwischen einzelnen Untersuchungen erwarten, die sich aber in einem akzeptablen Bereich bewegten. Eine weitere Optimierung im Sinne einer Sensitivitätssteigerung bei akzeptabler Störanfälligkeit und Variabilität ist anzustreben.

Cryptosporidium parvum is an obligatory intracellular parasitic protist that belongs to the phylum Apicomplexa. Cryptosporidiosis is an infection for which no satisfactory efficient curative treatment is known, especially in immunocompromised individuals. Furthermore, the parasite oocysts show considerable tenacity in the environment. Therefore, new potent drugs along with a simple and reliable experimental model for evaluation of anticryptosporidial measures are urgently needed. The present studies were undertaken to establish a combined cell culture and quantitative PCR assay (cc-qPCR) to assess efficacy of pharmacological compounds against C. parvum. Human ileocecal adenocarcinoma cells (HCT-8) were selected for culture of C. parvum. Oocysts were excysted directly on confluent monolayers for infection. After 3 h of incubation the non invasive parasite remains were removed by washing. At the end of the incubation period the cells were harvested and subjected to DNA extraction. Real time PCR was performed to quantify the target parasite DNA (fragments of 70 kDa heat shock protein gene) copy numbers. Each reaction was run in triplicate. A standard curve calculated on the basis of serial dilutions of plasmid DNA or infected control culture DNA was run in each experiment. A series of oocyst suspensions were applied to cell cultures to determine the sensitivity of the cc-qPCR assay and also to generate a calibration curve to calculate the infectivity of oocysts. A dilution series of heat inactivated oocysts (70°C for 1 h) were used to determine the size of the oocyst inoculum at which complete elimination of extracellular parasite material by washing is reliably achieved. The results obtained by the assays were reproducible and the method sensitive with a detection limit of infection with 10 oocysts 48 h post infection (p.i.) and with 100 oocysts 24 h p.i. Percent effects of drugs and disinfectants were enumerated by comparing DNA copies between treated and non treated samples. The suitability of cc-qPCR for screening of pharmacological compounds was validated by confirming the in vitro efficacy of monensin (98.15% ± 1.09 at 0.144 µM) and halofuginone (98.05% ± 0.59 at 25 µM) over the entire incubation period with a dose dependent reduction of parasite multiplication demonstrated 27 h p.i. The inhibition of parasite proliferation by 0.144 µM monensin in the period from 3 h p.i (time defined to represent the initial level of parasite development before drug application) to 27 h p.i. or 45 h p.i. was 97 and 99% respectively, and by 25 µM halofuginone 99% (27 h p.i.). Hexadecylphosphocholine (miltefosine), a new anti-leishmanial compound, was tested against cryptosporidia and provided a maximum of 98% reduction of parasite multiplication at 45 h p.i. The potential activity of curcumin (extract from the herb Curcuma longa) against C. parvum was also evaluated by cc-qPCR. Curcumin appeared to be sensitive to degradation after prolonged incubation and the observed inhibition of multiplication of C. parvum was significantly increased when medium was replaced by fresh medicated medium after 12 h of exposure. The effects on parasite multiplication (>95% inhibition with IC50 value of 13 µM) and on sporozoite invasion (assessed 3 h p.i.; 65% inhibition at 200 µM) suggest that further exploration of anticryptosporidial efficacy of curcumin may be rewarding. The cc-qPCR was further optimized to analyse inactivation measures directed against oocysts of C. parvum. The suitability of the assay for assessment of inactivation measures was confirmed by the reproducible demonstration of effectiveness of cresolic disinfectants at the recommended concentration of 4% and incubation period of 2 h (Neopredisan® 135-1, Menno Chemie, Norderstedt, Germany: 99.91% ± 0.08; Aldecoc® TGE, EWABO Chemikalien GmbH & Co. KG, Wietmarschen, Germany: 99.91± 0.05) and by using thermally inactivated oocysts (complete inactivation by 56°C and 70°C for 20 min). Based on the in vitro results and previously obtained data from the chicken infection model 99.5% inactivation is proposed as a suitable threshold value that needs to be consistently exceeded by a product to be considered efficient. Application of Neopredisan® 135- 1 and Aldecoc® TGE (4% for 2h) consistently inactivated more than 99.5% of oocysts while other disinfectants that are not certified as anticoccidial products like Aldecoc® XD (EWABO Chemikalien GmbH & Co. KG, Wietmarschen, Germany) and IGAVET® FF spezial (COS OHLSEN Chemie & Gerätevertrieb GmbH, Geltorf-Esprehm, Germany) and bleach (sodium hypochlorite) did not. It can be concluded that the cc-qPCR method is suited to easily and reliably assess anticryptosporidials in vitro. The method demonstrated that miltefosine and curcumin display anticryptosporidial efficacy under the applied conditions. The cc-qPCR is a highly standardized method supposedly appropriate to replace the chicken infection model for Eimeria tenella as currently practised for certification of anticoccidial disinfectants according to the guidelines of DVG (German Veterinary Society).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1998. / Vita. Includes bibliographical references (leaves [114]-124).

Thesis (Ph. D.)--University of California, Riverside, 2009. / Includes abstract. Includes bibliographical references. Issued in print and online. Available via ProQuest Digital Dissertations.

Cryptosporidium are protozoan parasites that infect the gastrointestinal epithelium of various vertebrate hosts. The genus has two major phylogenetic groups: a gastric group that infect the epithelium of the stomach and an intestinal group that infect the epithelium of the small and large intestine. Cryptosporidium are transmitted by the faecal-oral route and infect epithelial cells following excystation of the environmental oocyst stage. It has been proposed that excystation of intestinal species is triggered by exposure to the acidic stomach contents, although this has not been verified experimentally. This study aimed to determine whether exposure to stomach contents is necessary for in vivo infection by the intestinal species C. parvum and whether passage through the intestine is necessary for the gastric species C. proliferans to cause infection. It was shown that purified and non-purified oocysts of C. parvum were infectious for SCID mice following surgical inoculation directly into different parts of the small intestine, demonstrating that passage through the stomach is not necessary for infection by this intestinal species. Inoculation of the jejunum resulted in a course of infection similar to oral inoculation. Cryptosporidium proliferans was infectious for na?ve SCID mice following surgical extraction from the stomach of infected SCID mice, demonstrating that passage through the small intestine is not necessary for infection by this gastric species. However, surgical inoculation of C. proliferans oocysts directly into the intestinum tenue did not cause infection.

Surface waters used for irrigation purposes in South Africa have been found to be of poor microbiological quality and to be contaminated with human pathogens. These pathogens can be transferred from contaminated water onto fresh produce and potentially cause human infections. Cryptosporidium and Giardia are waterborne parasitic protozoa that have been found in surface waters worldwide. They can cause morbidity in infected individuals and be lethal when infecting people with compromised immunity. This study was divided into two phases. The first phase was a field survey aimed at determining the incidence of human pathogens Cryptosporidium, Giardia and Salmonella spp. in rivers used for irrigation purposes in South Africa as well as on vegetables irrigated with these rivers. The rivers selected were from three different provinces of South Africa. The relationship between faecal indicators and the presence of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts was also investigated. Out of the 30 water samples analysed, 43% were positive for Cryptosporidium oocysts, 23% tested positive for Giardia cysts and 27% were positive for Salmonella spp. However, no Cryptosporidium oocysts or Giardia cysts were found on the vegetables analysed. No significant differences in the prevalence of Cryptosporidium and Giardia and indicator parameters were observed between the three rivers. Using a logistic regression model, no significant correlations were observed between the incidence of faecal indicators and the presence of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts. In the second phase of the study, the individual and combined effects of chlorine, blanching, blast freezing and microwave heating on Cryptosporidium parvum oocysts inoculated on green peppers were investigated. The viability of the oocysts after treatments was determined using the vital dye propidium iodide. Stained oocysts were counted with a flow cytometer. Chlorine treatments did not significantly affect the viability of the oocysts. Blast freezing affected the viability of 20% of the oocysts. Both microwave heating and blanching affected 93% of oocysts. Combined treatments with chlorine and blast freezing did not affect the viability of the oocysts significantly compared to the control. Combined treatment with chlorine and microwave heating was significantly more effective than microwave heating alone and affected 98.1 % of the oocysts. The data indicate that C. parvum oocysts are sensitive to heat and, to some extent, to freezing temperature but are resistant to chlorine. The results of the survey show the presence of Cryptosporidium and Giardia in irrigation waters and thus a possible health risk associated with the consumption of raw vegetables as those can become contaminated via the irrigation water. The results of the challenge tests indicate that C. parvum oocysts on vegetables are inactivated by blanching and microwave heating but survive blast freezing and exposure to chlorine. Boiling and microwave heating of vegetables should be sufficient to kill C. parvum. On the other hand, ready-to-eat vegetables could be at risk of carrying live C. parvum oocysts as the use of chlorine in washing bath is not expected to inactivate C. parvum oocysts present on vegetables. Copyright / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2012. / Food Science / unrestricted

Introduction: Cryptosporidium parvum is a protozoan parasite that causes diarrhoea in many host species worldwide. CpCDPK1 appears to be essential for invasion and a promising drug target. Aim of the study: The aims of this study were to expand the knowledge of CpCDPK1. To achieve that, attempts were made to inhibit this gene by BKI-1294 in vitro and generate CpCDPK1 KO C. parvum. To maintain the genetically modified parasites, I studied the suitability of infection and propagation in a new animal model RAGgc × IFN-gamma mouse and in vitro model COLO - 680 N cell line. Animals, materials and methods: 4×106 freshly excysted C. parvum sporozoites were seeded into transfected GFP-MDBK cultures at the confluency of 70 – 80 % and simultaneously exposed to 500 nM of BKI-1294. IFA was applied to observe the invasion and host cell actin accumulation. Guide RNA (gRNA) for CRISPR-mediated transfection was designed and the Nluc-neoR repair cassette was flanked with 50 bp long 5’- and 3’UTR of CpCDPK1 by PCR. Transfection was performed by octaarginine transportation and compared to electroporation. COLO - 680 N cells with the confluency of 70 – 80% were infected with 4×106 non-transfected and transfected sporozoites of C. parvum. To establish a laboratory animal model for propagation of C. parvum and drug screening RAGgc × IFN-gamma mice were infected with 500 (G2), 1000 (G3) and 5000 (G4) of oocysts. BALB/c WT mice were inoculated with 5000 (G1) oocysts as control. Faeces were sampled for C. parvum DNA extraction. Real time PCR was applied to calculate the oocyst yield. Results: In the presence of 500 nM BKI-1294, parasite-induced host cell actin accumulation was not observed at 24 and 48 h after inoculation in vitro pointing at altered infectivity of CDPK inhibited sporozoites. Extracellular noninvasive sporozoites were found at 24 h p.i., only one meront was observed in a host cell at 72 h p.i. CRISPR-mediated gene editing was applied to C. parvum to knock out CDPK1. Transfected C. parvum were found in COLO-680 N cells through 6 passages. However, no newly generated oocysts were harvested. RAGgc × IFN-gamma mice were tested suitable as an animal model for C. parvum infection studies and oocyst propagation. These crossbred mice are very sensitive to infection at doses as low as 500 oocysts. They displayed emaciation, rough fur and trembling. The survival percentage was 71.4 % (G2), 85.7 % (G3), 57.1 % (G4) and 100 % (G1) at the end of study. Oocyst yield of 108 OPG was calculated in the crossbred mice whereas only 104 OPG were counted in Balb/C mice. Yields did not differ significantly (P > 0.05) in crossbred mice infected with different oocysts doses. Conclusions: 1.The function of CpCDPK1 is obviously important to the invasion process including attachment and utilization of host cell actin to form PV. This assumption was confirmed by CDPK inhibition and genetic KO. However, methods that increase the transfection efficiency are needed to enhance the generation of KO C. parvum. 2. The transfection method mediated by octargninine is superior to electroporation in consideration of DNA consumption and requirement of device. 3. Due to the low required infection dose and clinical manifestation RAGgc × IFN-gamma mice appear very well suited to serve as an in vivo laboratory model of C. parvum infection and for propagation of particularly transgenic C. parvum strains. 4. COLO – 680 N cells appear suited to be an in vitro model for C. parvum infection and transfection study, however, not qualified for propagation.:Contents 1. Introduction 1 2. Literature Review 2 2.1 Biology 2 2.1.1 Systematics 2 2.1.2 Life cycle 2 2.1.3 Tenacity of oocysts 4 2.1.4 Excystation of oocysts and invasion of host cells 4 2.1.5 Formation of the PV 6 2.1.6 Nutrient supply by the host 7 2.2 Epidemiology 8 2.2.1 Human Cryptosporidiosis 8 2.2.2 Animal Cryptosporidiosis 9 2.3 Detection and Diagnosis 11 2.4 Treatment options 12 2.5 Hygiene 14 2.6 Vaccine 16 2.7 In vitro and vivo Models 16 2.8 Structure and function of Calcium-dependent protein kinases 18 3. Animals, materials and methods 21 3.1 Animals and materials 21 3.1.3 Mice 21 3.1.4 Cells 21 3.1.5 C. parvum oocysts 21 3.1.6 Reagents 21 3.1.7 Plasmids and oligonucleotides 23 3.1.7.1 Plasmids 23 3.1.7.2 Primers and probes 24 3.1.8 Kits 25 3.1.9 Instruments and software 25 3.2 Methods 26 3.2.1 Preparation of reagents 26 3.2.2 C. parvum oocysts maintaince 27 3.2.3 PCR 27 3.2.3.1 Amplification of NdeI and AatII flanked 5’CDPK1 27 3.2.3.2 Annealing of gRNA 27 3.2.3.3 Amplification of repair cassette via Touchdown PCR (TD-PCR) 28 3.2.3.4 Colony PCR 29 3.2.3.5 Real-time PCR for C. parvum hsp70 30 3.2.4 Restriction enzyme digestion 31 3.2.4.1 Restriction enzyme digestion of pA - pD 31 3.2.4.2 Enzyme digestion and dephosphorylation of p185 31 3.2.5 Agarose gel electrophoresis 32 3.2.6 Gel purification 32 3.2.7 Ligation 33 3.2.7.1 Ligation of CDPK1 KO plasmids 33 3.2.7.2 Ligation of gRNA and p185 33 3.2.8 Transformation 34 3.2.9 Plasmid extraction 34 3.2.10 C. parvum oocysts excystation 35 3.2.11 C. parvum infection 35 3.2.11.1 In vitro infection 35 3.2.11.2 C. parvum infection in mice 36 3.2.12 Transfection 36 3.2.12.1 Electroporation for MDBK transfection 36 3.2.12.2 Electroporation for C. parvum transfection 37 3.2.12.3 CpCDPK1 knock out through Cell penetrating peptide (CPP) - octaarginine mediated transfection 38 3.2.13 Geneticin screening for GFP-MDBK cells 39 3.2.14 Indirect immunofluorescent assay (IFA) 39 3.2.15 Animal feeding and body conditioning score (BCS) monitoring 40 3.2.16 Faecal sample collection 43 3.2.17 DNA extraction and oocysts per gram (OPG) determination of fecal samples 43 3.2.18 Statistical analysis 44 4. Results 45 4.1 CDPK1 knockout by REMI 45 4.1.1 Construction of Knockout plasmid 45 4.1.2 Electroporation protocol and in vitro analysis 49 4.2 CDPK1 knockout by CRISPR/Cas 9-mediated gene editing 50 4.2.1 Constructing CRISPR/Cas9_CpCDPK1_7 plasmid 51 4.2.2 Amplification of CDPK1 flanked repair cassette 52 4.2.3 Knockout CDPK1 via CRISPR/cas 9 53 4.2.3.1 Electroporation and in vitro analysis 53 4.2.3.2 CPP transfection and in vitro analysis 55 4.2.3.3 Genetic assay of transfection 57 4.3 In vitro and in vivo model for infection and propagation 58 4.3.1 In vitro model - C. parvum cultivation in COLO - 680 N cells 58 4.3.2 In vivo model Infection pattern of C. parvum in RAGgc x IFN-g KO mice 60 4.3.2.1 Clinical symptoms 60 4.3.2.2 Oocysts excretion 63 4.4 In vitro inhibition of CDPK1 66 4.4.1 Generating bAct-GFP-MDBK cells 67 4.4.2 Influence of CDPK1 inhibition on infection 70 5. Discussion 73 5.1 Sub-cloning 73 5.2 Inhibition of CpCDPK1 delays the host cell actin accumulation in vitro 73 5.3 RAGgc x IFN-gamma KO mice for C. parvum propagation 76 5.4 CpCDPK1 knockout by CRISPR/cas 9 79 5.5 COLO-680 N cells are not suited to propagate C. parvum in vitro 82 6. Summary 85 7. Zusammenfassung 87 8. References 89

Die Kryptosporidiose der Kälber wird zumeist durch die Spezies C. parvum verursacht, einem ubiquitär verbreiteten Parasiten mit zoonotischem Potential. Die Infektion geht insbesondere in den ersten Lebenswochen mit wässrigem Durchfall einher, was in der Nutztierhaltung durch eine erhöhte Sterblichkeit enorme wirtschaftliche Verluste bedeuten kann. Neben einer Vielzahl anderer Einflussfaktoren trägt der Erreger mit unterschiedlicher Virulenz zur Ausprägung der Klinik bei. Aufgrund limitierter kausaler Therapeutika ist das Desinfektionsmanagement auf einem Kälber haltenden Betrieb bei der Bekämpfung entscheidend. Epidemiologische Studien sind essentiell, um die eher unterschätze Parasitose im Sinne eines One-Health-Ansatzes mehr in den Fokus der Aufmerksamkeit zu rücken. Mit der Testung verschiedener chemischer Substanzen und UV-Bestrahlung auf die Wirksamkeit gegen C. parvum-Oozysten sollten mögliche Alternativen zu den antiprotozoären Desinfektionsmitteln für das Labor aufgezeigt werden. Anhand von Sequenzanalysen des Gp60-Genlokus wurden C. parvum-Feldisolate von Kälbern aus sächsischen Milchviehbetrieben molekulargenetisch charakterisiert, um einen Überblick über die im Untersuchungsgebiet verbreiteten Subtypen generieren zu können. Diese Feldisolate wurden außerdem in vitro unter standardisierten Laborbedingungen in humanen Adenokarzinomzellen (HCT-8) auf Zytopathogenität getestet, um möglicherweise auf die Erregervirulenz in vivo rückschließen zu können. C. parvum-Oozysten eines Laborstammes wurden in denaturiertem Ethanol, Ethanol (70 %, 100 %), Wasserstoffperoxid (H2O2, 3 %, 10 %) oder Natriumhypochlorit (NaOCl, 1,5 %, 3 %, 6 %) über 30 min, 2 h, 4 h, 12 h oder 24 h in Suspension inkubiert oder auf einem Keimträger über 10 min, 20 min und 30 min einer UV-C-Strahlung ausgesetzt. Anschließend wurden mit diesen Oozysten HCT-8-Zellen infiziert und die Infektiosität mittels Real-Time-PCR quantifiziert. In einer epidemiologischen Studie wurden bis zu 13 Kälber aus 61 Milchviehbetreiben klinisch untersucht. Entnommene Kotproben wurden nach ihrer Konsistenz gescort und semiquantitativ mittels Heine-Färbung auf Cryptosporidium spp. untersucht. Gewonnene Feldisolate wurden in vitro zur Infektion von HCT-8-Zellmonolayern verwendet, um deren Zytopathogenität mit Hilfe eines Zellviabilitätsassay (MTT-Assay) zu ermitteln. Nicht infizierte Zellmonolayer dienten als Negativkontrolle. Zur genetischen Subtypisierung der Feldisolate erfolgten Sequenzanalysen des Gp60-Genlokus mittels Amplifizierung in zwei unterschiedlichen PCR-Verfahren. Alle Zellkulturexperimente wurden in Triplikaten durchgeführt und der Mittelwert (Inaktivierungsstudien) bzw. der Median (Zellviabilität) errechnet. Die ermittelten Daten wurden auf Normalverteilung getestet (Shapiro-Wilk-Test). Gruppenvergleiche erfolgten mit dem Mann-Whitney-U-Test (keine Normalverteilung) bzw. dem t-Test (Normalverteilung). Korrelationsanalysen wurden mit dem Pearson-Korrelationskoeffizienten durchgeführt. Die Anwendung von 10 %igem H2O2 mit einer Einwirkzeit von mindestens 12 h sowie die Inkubation in NaOCl (3 % und 6 %) über 12 h führte zu einer fast vollständigen Inaktivierung (> 99 %) der C. parvum-Oozysten. Diese Effektivität wurde auch mit der UV-Bestrahlung über 30 min (100 mJ/cm2) erreicht. 89 % (455/512) der beprobten Kälber wurden positiv auf Cryptosporidium spp. getestet und in jedem Betrieb wurde mindestens ein Ausscheider detektiert. Infizierte Tiere zeigten signifikant häufiger Durchfall als negativ Getestete. Die Subtypisierung war für 47 Feldisolate erfolgreich. IIaA15G2R1 wurde in 66 % der Betriebe gefunden, IIaA16G3R1 in 13 %. Acht weitere Gp60-Subtypen der Gruppe IIa wurden weniger häufig (< 8,5 %) nachgewiesen, der Subtyp IIaA17G4R1 dabei erstmals in Deutschland. 26 Feldisolate konnten in vitro auf ihre Zytopathogenität getestet werden. Es wurden Werte zwischen 17,7 % (± 5,1 %) und 99,5 % (± 7,1 %) lebender Zellen nach Infektion ermittelt. Die Feldisolate wurden in drei Zytopathogenitätskategorien gruppiert. Es wurde eine signifikante Korrelation zwischen In vitro- und In-vivo-Daten ermittelt. Außerdem hatte die Lagerungsdauer der Oozysten signifikanten Einfluss auf die Zytopathogenität. UV-C-Strahlen (100 mJ/cm2) und 10 %iger H2O2 sind bei Einhaltung entsprechender Einwirkzeiten geeignet C. parvum-Oozysten effizient zu inaktivieren. Die Studienergebnisse bestätigen in einem regional eingeschränkten Rahmen, dass C. parvum als Primärpathogen entscheidend am Durchfallgeschehen junger Kälber beteiligt ist. Alle in Sachsen detektierten Subtypen weisen ein zoonotisches Potential auf. Durch die Anwendung des MTT-Assay ist eine Aussage über die Qualität von C. parvum-Oozysten nach Lagerung bei 4 °C möglich. Zur Eignung als diagnostisches Tool bedarf es weiterer Untersuchungen.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2. 1 Taxonomie des Erregers 2. 2 Morphologie und Entwicklungszyklus intestinaler Kryptosporidien 2. 3 In-vitro-Kultivierung des Erregers 2. 4 Invasionsmechanismen und Modulation der Apoptose 2. 5 Klinik, Pathogenese und Bekämpfung von C. parvum beim Kalb 2. 6 Humane Kryptosporidiose 2. 7 Diagnostik und molekulargenetische Charakterisierung von Feldisolaten 2. 8 Viabilitäts- und Infektiositätsnachweis von C. parvum-Oozysten 2. 8. 1 Bewertung der Viabilität 2. 8. 2 Bewertung der Infektiosität 2. 9 Inaktivierung des Parasiten 2. 9. 1 Physikalische Inaktivierung 2. 9. 1. 1 Temperatur 2. 9. 1. 2 UV-Bestrahlung 2. 9. 1. 3 Gammastrahlung 2. 9. 1. 4 Ultraschall 2. 9. 1. 5 Sonstige Methoden der physikalischen Inaktivierung 2. 9. 2 Chemische Inaktivierung 2. 9. 2. 1 Chlorverbindungen 2. 9. 2. 2 Ozon 2. 9. 2. 3 Alkohole und Aldehyde 2. 9. 2. 4 Ammoniumverbindungen 2. 9. 2. 5 Wasserstoffperoxid 2. 9. 3 Kommerziell erhältliche Desinfektionsmittel 3 Publikation 1: Inactivation of Cryptosporidium parvum under laboratory conditions 4 Publikation 2: Distribution of Cryptosporidium parvum gp60 subtypes in calf herds of Saxony, Germany 5 Publikation 3: Bovine Cryptosporidium parvum field isolates differ in cytopathogenicity in HCT-8 monolayers 6 Diskussion 6. 1 Chemische Desinfektion von C. parvum unter Laborbedingungen 6. 2 Physikalische Inaktivierung von C. parvum mittels UV-Bestrahlung 6. 3 Nachweisraten von Cryptosporidium spp. in Sachsen 6. 4 Zytopathogenität der C. parvum-Feldisolate 6. 5 Verbreitung von Gp60-Subtypen in Sachsen 7 Zusammenfassung 8 Summary 9 Literaturverzeichnis

Das Ziel der Arbeit war, ein In-vitro-Infektionsmodell für den protozoären Parasiten C. parvum zu etablieren, um eine Aussage über die Infektiosität der Oozysten treffen zu können. Es wurde ein robustes Zellkultursystem zur In-vitro-Kultivierung dieses Einzellers erarbeitet. Die Oozysten von C. parvum wurden im neonatalen Kälbern passagiert und aus dem Kot isoliert und aufgereinigt, so dass ein direkt in die Zellkultur einsetzbares Inokulum gewonnen werden konnte. Als Zelllinie wurden adhärent wachsende HCT-8-Zellen verwendet. Die konfluenten Zellmonolayer wurden in Mikrotiterplatten direkt mit der Oozystensuspension inokuliert. Dabei wurde dem Medium zur Erleichterung der Exzystierung der Sporozoiten 0,4 % Natriumtaurocholat beigemischt, ohne dass dabei ein zytotoxischer Effekt festzustellen war. Die erfolgreiche Exzystierung und Invasion der Zellen durch die Parasiten mit anschließender Vermehrung konnte bei hohen Anzahlen inokulierter Oozysten mit einer geeigneten Kontrasttechnik mikroskopisch beobachtet werden. Zum sicheren semiquantitativen Nachweis der Infektion wurde ein PCR-basierter Assay verwendet. Die Robustheit und Sensitivität des Zellkultur-PCR-Systems wurde mit vitalen Oozysten getestet und anschließend auf die Testung des Einflusses einer physikalischen (hohe Temperatur) und chemischen (Neopredisan®) Inaktivierungsmethode auf die Vitalität der Oozysten angewandt. Es wurden insgesamt 271 Zellkulturen mit unterschiedlichen Mengen vitaler Oozysten inokuliert. Mindestens 1000 Oozysten waren notwendig, um eine sicher nachweisbare Infektion zu erzeugen. Bei Einsatz von 100 Oozysten konnten etwa drei von vier Kulturen als infiziert diagnostiziert werden, bei Verwendung von 10 Oozysten betrug dieser Anteil etwas unter einem Drittel. Bei der thermischen Inaktivierung wurden zwei Temperaturen benutzt: 38 °C und 55 °C, die für unterschiedlich lange Zeitspannen (zwischen 1 und 24 h) auf die Oozysten eingewirkt hatten. In den 68 so untersuchten Kulturen zeigte sich, dass 55 °C unabhängig von der Einwirkdauer ausreichend waren, um die Oozysten soweit zu inaktivieren, dass kein PCR-Nachweis in der Kultur mehr möglich war. Eine Erwärmung auf lediglich 38 °C hatte dagegen keinen nennenswerten Einfluss auf die Infektiosität der Oozysten in der Zellkultur. Diese Oozysten verhielten sich ähnlich wie die unbehandelten Chargen. Es wurde ferner der Einfluss einer einstündigen Exposition mit Neopredisan® in den Konzentrationen von 0,25, 1 und 4 % auf die Infektiosität getestet (80 untersuchte Kulturen), sowie einer zweistündigen Inkubation mit 4 % (60 PCR-Ansätze). Die beiden niedrigen Konzentrationen übten keinen hemmenden Effekt auf die Vermehrungspotenz der so behandelten Oozysten aus, teilweise wurde hier sogar eine erhöhte Nachweisbarkeit vor allem in den niedrigen Inokula festgestellt. Dagegen konnte die höchste Konzentration die Oozysten in ihrer Vermehrung signifikant hemmen. Die längere Desinfektion erwies sich hierbei als wirksamer. Dieser Effekt war jedoch deutlich geringer als der einer Erwärmung auf 55 °C, und es konnten nicht alle Oozysten inaktiviert werden. Die Genotypisierung (Sequenzierung von zwei Genloci) der verwendeten Isolate ergab, dass es sich bei den verwendeten Parasiten um den bovinen Genotyp von C. parvum handelte und dass durch die verwendete PCR der richtige DNA-Abschnitt amplifiziert wurde. Insgesamt gesehen ist die Methode geeignet, reproduzierbare intrazelluläre Infektionen einer permanenten Zelllinie in vitro zu erzeugen, die sich auch gut mit der vorgestellten PCR nachweisen lassen. Allerdings ist auf diese Weise nur eine semiquantitative Abschätzung der Intensität der Entwicklung (über eine Titrationsreihe) möglich. Es wäre anstrebenswert, hier eine quantitative Methode (z.B. quantitative PCR) einsetzen zu können.

Cryptosporidium parvum is an important diarrhoea-associated protozoan, which is difficult to propagate in vitro. In 2017, a report described a continuous culture of C. parvum Moredun strain, in the oesophageal squamous cell carcinoma cell line COLO-680N, as an easy-to-use system for C. parvum propagation and continuous production of oocysts. Here, we report that—using the Köllitsch strain of C. parvum—even though COLO-680N cells, indeed, allowed parasite invasion and early asexual parasite replication, C. parvum proliferation decreased after the second day post infection. Considering recurring studies, reporting on successful production of newly generated Cryptosporidium oocysts in the past, and the subsequent replication failure by other research groups, the current data stand as a reminder of the importance of reproducibility of in vitro systems in cryptosporidiosis research. This is of special importance since it will only be possible to develop promising strategies to fight cryptosporidiosis and its ominous consequences for both human and animal health by a continuous and reliable methodological progress.