Amylopectin granules in Apicomplexan protozoa are hypothesized to be used as an energy source to aid the parasites in surviving in the environment allow latent stages to excyst and release infective stages, allow them to be mobile, invade host cells, and to continue their life cycle. The objective of this project was to determine if parasite glycolytic enzymes: alpha-amylase, amyloglucosidase, enolase, lactate dehydrogenase, and phosphorylase could be used to decrease amylopectin stores and subsequently infectivity of Cryptosporidium parvum oocysts/sporozoites in both fresh oocysts and stored oocysts. In addition, glycolytic enzymes and substrates: glucose, glucose-1-phosphate, and glycogen synthase were investigated to determine if they can be used to increase amylopectin stores and thus increase infectivity to aid in detection/storage of oocysts. Oocysts of Cryptosporidium parvum were suspended in 1mg/ml glycolytic enzymes or substrates (except glucose - 0.05M and glycogen synthase - 1U/ml) and electroporated. Oocysts were incubated at 37&#176;C for one hour to allow treatments to react with amylopectin followed by incubation on HCT-8 cells for 24 hours for infection. Real-time PCR and immunohistochemistry were performed to determine the effect of the enzymes on infectivity. An amylopectin assay and excystation assay was performed to determine if the enzymes degraded amylopectin and if decreased amylopectin reduced excystation. Alpha amylase and amyloglucosidase had the greatest impact on reducing both amylopectin and infectivity of fresh oocysts with reductions of 99.5% and 99.1% in infective oocysts, respectively (P<0.05). These results suggest that amylopectin may be an important factor in infection, although further research is needed. In stored oocysts, enzymes significantly reduced amylopectin content but not infectivity. In fresh oocysts, amylopectin content was correlated to excystation and infectivity with a decrease in amylopectin correlating to decreased excystation and infectivity. In contrast, there was no direct correlation for stored oocysts. When glucose, glucose-1-phosphate, or glycogen synthase was used to increase infectivity, results show that glycogen synthase had little effect, but glucose and glucose-1-phosphate significantly increased amylopectin content, excystation, and infectivity. In conclusion, amylopectin may be an important polysaccharide store of Cryptosporidium parasites to cause infection by allowing excystation of the oocysts to release infective sporozoites. / Ph. D.

L'évaluation de la contamination des cours d'eau par les agents parasites protozoaires est fondamentale puisqu'on estime qu'une personne sur deux dans le monde est ou a été infectée par une zoonose d'origine parasitaire. Les trois principaux parasites responsables d'épidémies hydriques sont Cryptosporidium parvum, Giardia duodenalis et Toxoplasma gondii. Actuellement, seule la matrice eau est utilisée pour analyser la présence de ces parasites dans l'environnement aquatique. Peu reproductible et chronophage, cette méthode ne permet pas de mettre en place une surveillance de routine. Le projet de thèse propose l'utilisation de la moule zébrée, Dreissena polymorpha, comme un nouvel outil complémentaire pour évaluer la qualité biologique des milieux d'eau douce. Au travers d'expérimentations combinant différentes approches in vivo, ex vivo et in situ, le potentiel de la dreissène à accumuler les parasites protozoaires ainsi que leurs cinétiques d'accumulation dans les tissus ont été déterminés. Utilisée comme espèce sentinelle des contaminations chimiques, l'effet d'un stress biologique dû aux protozoaires a été évalué au laboratoire sur les cellules clefs de l'immunité des bivalves, les hémocytes. Ainsi, le projet permet de placer l'organisme Dreissena polymorpha dans une double stratégie de biosurveillance : une biosurveillance sanitaire liée à l'utilisation de la dreissène en tant que vecteur de parasites considérés comme enjeux de santé publique et une biosurveillance environnementale liée à la compréhension des facteurs de confusion avec les réponses biologiques utilisées comme biomarqueurs. / Assessment of the water biological contamination by protozoa is crucial since one in two person of the world population is or has been infected by a parasitic zoonosis. The main protozoa responsible of waterborne outbreaks are Cryptosporidium parvum, Giardia duodenalis and Toxoplasma gondii. Currently, protozoa detection is only based on water analysis. Irrelevant and time consuming, water analysis do not permit accurate biomonitoring. These project aims to use the freshwater mussel, Dreissena polymorpha, as a new complementary tool for biological quality analysis of freshwater. Through in vivo, ex vivo and in situ experiments, we determine the utility of zebra mussel for protozoa accumulation and their accumulation pattern within mussel tissues. Already use as a sentinel specie for chemical contamination, biological stress caused by protozoa has been determined in laboratory experiments on key cells of bivalve immunity, the hemocytes. Hence, Dreissena polymorpha could be involved in a twofold biomonitoring tactics: sanitary biomonitoring related to the use of zebra mussel as vector to protozoa with public health issue and environmental biomonitoring on understanding of the confounding factors in biological responses used as biomarkers.

Le projet de ma thèse a consisté à étudier chez les nouveau-nés la réponse des cellules épithéliales intestinales (IEC) en microARN (miR) et en peptides antimicrobiens (PAM) dans le contexte de l’infection par Cryptosporidium parvum. Ce protozoaire monoxène se développe uniquement dans les IEC et affecte plus particulièrement les nouveau-nés et les individus immunodéprimés. Nous avons étudié la réponse en miR dans les IEC après infection par C. parvum. La comparaison des réponses obtenues dans les IEC in vitro et in vivo nous a permis de montrer que l’expression du miR-181d-5p est diminuée durant l’infection et que cette diminution d’expression lèverait l’inhibition de l’expression des facteurs anti-apoptotiques OPG et BCL2, favorisant la survie du parasite dans les IEC. Nous avons également caractérisé l’impact de C. parvum sur l’expression des PAM chez le nouveau-né et leur rôle durant l’infection. Nous avons mis en évidence que l’infection entraine une forte modification de l’expression des PAM. Notre attention a été retenue par la diminution, surprenante, de l’expression de la chimiokine antimicrobienne CCL20 et de la cathélicidine CRAMP au cours de l’infection. Pour ces deux peptides, nous avons montré qu’une administration aux souriceaux réduisait significativement la charge parasitaire. Nous avons pu montrer que la protection induite par ces deux molécules antimicrobiennes résultait de leur activité parasiticide sur C. parvum. Ainsi, leur diminution d’expression semble être favorable au développement du parasite et nous avons suggéré qu’elle puisse être induite par le parasite pour échapper à cette activité parasiticide avec notamment la modulation de certains miR. / The aim of my thesis was to study in the mouse model, the intestinal epithelial cell (IEC) response during neonatal Cryptosporidium parvum infection with a focus on microRNAs (miR) and antimicrobial peptides (AMP) response. C. parvum is a protozoan parasite that affects preferentially newborn, young or immunocompromised adult and completes its life cycle only in IECs. In a first part, we studied the expression of miRs in IEC during C. parvum infection. We compared the responses between in vitro infected IEC and IECs purified from infected neonatal mice and observed a decrease of miR-181d-5p expression. This reduced expression of miR-181d-5p was associated with an upregulation of the mRNA coding for two putative targets OPG and BCL2 which are anti-apoptotic agents that may favor parasite survival in IEC. This functional relation between miR-181d-5p and OPG was next demonstrated by using reporter dual-luciferase assay. In a second part of my thesis, we characterized the AMP expression profile and studied their role during C. parvum infection in neonates. We showed that infection up-regulates a broad expression of AMP except for CCL20 and CRAMP cathelicidin for which mRNA expression was decreased. We next choose to focus our work on these two molecules and reported that administration of CCL20 and CRAMP to infected neonatal mice significantly reduced the number of parasites in the intestine through a direct killing activity on free stages of the parasite. As the decreased expression of these two AMPs during infection seems to favor the development of the parasite, this could be an escape mechanism developed by C. parvum that may occur through the modulation of miR.

Die Kryptosporidiose stellt aufgrund ihres zoonotischen Charakters und der Entwicklung chronischer Durchfälle bei Immunsupprimierten ein hohes Gesundheitsrisiko für den Menschen, aber ebenso für Tiere dar. Derzeit verfügbare Therapeutika ermöglichen keine zuverlässige Bekämpfung klinischer Symptome oder eine Erregerelimination, daher ist die Erforschung neuer Therapieansätze dringend notwendig. CDPK stellen in diesem Zusammenhang interessante Zielmoleküle dar, da sie zwar in Pflanzen und Protisten einschließlich Apikomplexa, jedoch nicht in Pilzen und Säugetieren vorkommen. Trotz der Entdeckung vielversprechender neuer Wirkstoffe gegen CpCDPK1 in den letzten Jahren ist zur Lokalisation und Funktion von CDPK in C. parvum wenig bekannt.Diese Arbeit belegt die Transkription von sechs CpCDPK in vitro und beschreibt erstmals die Länge der 3’UTR von CpCDPK. Die Translation wurde durch den Nachweis spezifischen Proteins in Sporozoiten im Immunoblot sowie die Lokalisation von CpCDPK1 mit Hilfe der Immunfluoreszenz belegt. Möglicherweise wird die CpCDPK1 durch N-Myristoylierung an Membranen gebunden, an die Oberfläche von Zoiten gebracht und sezerniert. Eine Rolle des Enzyms im Invasions- und Egressmechanismus des Parasiten wird diskutiert.

Résumé confidentiel. / Confidential summary.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Ciencias Animales / La diarrea neonatal bovina provocada por Cryptosporidium parvum, es una enfermedad parasitaria que produce grandes pérdidas económicas en los rebaños lecheros del mundo. Su principal signo es la presentación de diarrea en bovinos neonatales. menores a 30 días de edad y se caracteriza a una profusa eliminación de ooquistes. El descubrimiento del gen que traduce para la glicoproteína de 60 kDa (gp60) de C. parvum que posee dentro de su genoma un segmento polimórfico hipervariable de codones que traducen para el aminoácido serina, ha servido para el desarrollo de herramientas de epidemiologia molecular por su utilidad para caracterizar distintas subpoblaciones a través de la caracterización de distintos subtipos. En Chile no existen investigaciones basadas en esta glicoproteína y por lo tanto resultó interesante para este trabajo, determinar el o los subtipos presentes en una muestra de heces de bovinos neonatales que presentaron diarrea. Se utilizaron 36 muestras de heces pertenecientes a dos regiones biogeográfica del país: Región Metropolitana (RM) y Región de Los Ríos (RR); previamente diagnósticas como positivas a Cryptosporidium spp mediante tinción de Zielh-Neelsen modificado (ZNm). Las muestras presentaban distinto grado de parasitosis y fueron sometidas a una prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa convencional (PCR) del gen SSU 18S rDNA (18S) para confirmar su positividad. Veinte y nueve (29/36) muestras resultaron positivas a 18S. Las muestras negativas fueron sometidas a una PCR control de amplificación que resultó en la presencia de 5/7 muestras no amplificadas. Las 29 muestras positivas a 18S fueron sometidas a una PCR para amplificar un fragmento del gen gp60, la cual resultó en 15/29 muestras positivas a este gen. Los amplicones producidos en la PCR gp60, fueron secuenciados y analizados mediante programas bioinformáticos. La caracterización molecular dio como resultado la presencia de un reducido número de subtipos de C. parvum: IIaA15G2R1 (13), IIaA17G2R1 (1) y IIaA17G4R1 (1). La presencia del subtipo IIaA15G2R1 concuerda con la literatura internacional en ser el mayormente representado, siendo el único subtipo presente en las muestras de la RR y estar presente en 3/5 de las muestras de la RM. El subtipo IIaA17G2R1 solo ha sido 13 mencionado en dos oportunidades en la literatura internacional en bovinos neonatales, haciendo que esta descripción sea la tercera a nivel mundial. El subtipo IIaA17G4R1 solo ha sido descrito en humanos en la literatura revisada y, por lo tanto, este trabajo haría su primera descripción en bovinos neonatales. Ambos subtipos solo se presentaron en la RM (2/5). Además este estudio confirma la utilidad de la técnica de ZNm al ser más sensible que la PCR 18S en detectar la presencia de Cryptosporidium spp. El presente trabajo fue el primero en determinar el subtipo de C. parvum mediante el secuenciamiento de fragmentos de gp60 en el país y caracterización molecular a través de técnicas bioinformáticas. / Neonatal calf diarrhea caused by Cryptosporidium parvum, it is a parasitic disease that produce mayor economic loses in worldwide dairy herds. The principal sign is diarrhea in preweaned calves accompanied with profuse oocyst shedding. The discovering of the gene that traduce for the 60 kDa glycoprotein of C. parvum which have a polymorphic hypervariable serine codon fragment, has served for the development of molecular epidemiology tools because the utility in the characterization of subpopulations using different subtypes. There are not such investigations in Chile based in this gene and that was interesting for the author of this work to determine different subtype presents in a small sample of feces from neonatal calves. Using 36 samples from two biogeographical districts: Región Metropolitana (RM) and Región de Los Ríos (RR), previously modified Ziehl Neelsen (mZN) positive, distinct parasitic level was present in the samples and a conventional SSU 18S rDNA (18S) Polymerase Chain Reaction (PCR) was made to confirm Cryptosporidium spp. Twenty nine (29/36) samples was 18S positive. Negative samples was submitted to PCR amplification control that turned out in 5/7 not amplified samples. 18S positive samples, was submitted to gp60 PCR that result in 15/29 positive samples. Amplicons produced, were sequenced and analyzed by bioinformatics suites. Molecular characterization of the amplicons shows a reduced number of C. parvum subtypes in the samples: IIaA15G2R1 (13), IIaA17G2R1 (1) y IIaA17G4R1 (1). Presence of the IIaA15G2R1 subtype it is accord with de international scientific communications, the most representative C. parvum subtype. This was confirming in RR, which was the unique subtype describe and in RM was present in 3/5 samples. Subtype IIaA17G2R1 only has mentioned twice in neonatal calf, turning this investigation in the third description of the subtype worldwide. Subtype IIaA17G4R1 only been divulgated once in humans, therefore, this investigation would be the first characterization in bovines worldwide. Both subtype was presents in RM but not in RR. Further, this scientific work confirms the utility of mZN over 18S in terms of sensibility. This actual investigation was the first in it type 15 to characterize C. parvum subtypes in Chile by the sequencing and analyzing of gp60 gene fragments amplicons. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1121035.

Cryptosporidium parvum is widely known for outbreaks within the immunocompetent population, as well its sometimes excruciating effects as an opportunistic agent in AIDS patients. Our understanding of the biology and host-parasite interactions of this parasitic protist is increasing at a rapid rate due to recent molecular and genetic advances. The topic of our research is in the area of C. parvum fatty acid metabolism, which is highly streamlined in this parasite. In addition to a type I fatty acid synthase (CpFAS1), C. parvum also possesses an enormous type I polyketide synthase (CpPKS1). Because of the size of this megasynthase, functional characterization of the complete enzyme is not possible. We have isolated and characterized the loading unit of CpPKS1 which contains an acyl-[acyl carrier protein (ACP)] ligase (AL) and an ACP. This unit is responsible for the overall substrate selection and initiation of polyketide production. Our data show that CpPKS1 prefers long-chain fatty acids with the highest specificity for arachidic acid (C20). Thus, the final polyketide product could contain as many as 34 carbons. Additionally, C. parvum possesses only a single fatty acid elongase. This family of enzymes serves a mechanism similar to FAS, and many have been found to be involved in de novo fatty acid synthesis in other organisms. After expressing this membrane protein in human cells, we have determined that it too prefers long-chain fatty acyl-CoAs which undergo only one round of elongation. This is in contrast to members of this enzyme family in other organisms that can initiate de novo synthesis from two- or four-carbon fatty acids via several rounds of elongation. Our lab has previously characterized the unique acyl-CoA binding protein (CpACBP1) from C. parvum. Molecular and biochemical data suggested that this enzyme may serve as a viable drug target. We have screened a library of known (and somewhat common) compounds against CpACBP1, and have isolated several potential compounds to be further examined for their ability to inhibit the growth of C. parvum.

Cryptosporidium parvum is widely known for outbreaks within the immunocompetent population, as well its sometimes excruciating effects as an opportunistic agent in AIDS patients. Our understanding of the biology and host-parasite interactions of this parasitic protist is increasing at a rapid rate due to recent molecular and genetic advances. The topic of our research is in the area of C. parvum fatty acid metabolism, which is highly streamlined in this parasite. In addition to a type I fatty acid synthase (CpFAS1), C. parvum also possesses an enormous type I polyketide synthase (CpPKS1). Because of the size of this megasynthase, functional characterization of the complete enzyme is not possible. We have isolated and characterized the loading unit of CpPKS1 which contains an acyl-[acyl carrier protein (ACP)] ligase (AL) and an ACP. This unit is responsible for the overall substrate selection and initiation of polyketide production. Our data show that CpPKS1 prefers long-chain fatty acids with the highest specificity for arachidic acid (C20). Thus, the final polyketide product could contain as many as 34 carbons. Additionally, C. parvum possesses only a single fatty acid elongase. This family of enzymes serves a mechanism similar to FAS, and many have been found to be involved in de novo fatty acid synthesis in other organisms. After expressing this membrane protein in human cells, we have determined that it too prefers long-chain fatty acyl-CoAs which undergo only one round of elongation. This is in contrast to members of this enzyme family in other organisms that can initiate de novo synthesis from two- or four-carbon fatty acids via several rounds of elongation. Our lab has previously characterized the unique acyl-CoA binding protein (CpACBP1) from C. parvum. Molecular and biochemical data suggested that this enzyme may serve as a viable drug target. We have screened a library of known (and somewhat common) compounds against CpACBP1, and have isolated several potential compounds to be further examined for their ability to inhibit the growth of C. parvum.

Das Ziel der Arbeit war, ein In-vitro-Infektionsmodell für den protozoären Parasiten C. parvum zu etablieren, um eine Aussage über die Infektiosität der Oozysten treffen zu können. Es wurde ein robustes Zellkultursystem zur In-vitro-Kultivierung dieses Einzellers erarbeitet. Die Oozysten von C. parvum wurden im neonatalen Kälbern passagiert und aus dem Kot isoliert und aufgereinigt, so dass ein direkt in die Zellkultur einsetzbares Inokulum gewonnen werden konnte. Als Zelllinie wurden adhärent wachsende HCT-8-Zellen verwendet. Die konfluenten Zellmonolayer wurden in Mikrotiterplatten direkt mit der Oozystensuspension inokuliert. Dabei wurde dem Medium zur Erleichterung der Exzystierung der Sporozoiten 0,4 % Natriumtaurocholat beigemischt, ohne dass dabei ein zytotoxischer Effekt festzustellen war. Die erfolgreiche Exzystierung und Invasion der Zellen durch die Parasiten mit anschließender Vermehrung konnte bei hohen Anzahlen inokulierter Oozysten mit einer geeigneten Kontrasttechnik mikroskopisch beobachtet werden. Zum sicheren semiquantitativen Nachweis der Infektion wurde ein PCR-basierter Assay verwendet. Die Robustheit und Sensitivität des Zellkultur-PCR-Systems wurde mit vitalen Oozysten getestet und anschließend auf die Testung des Einflusses einer physikalischen (hohe Temperatur) und chemischen (Neopredisan®) Inaktivierungsmethode auf die Vitalität der Oozysten angewandt. Es wurden insgesamt 271 Zellkulturen mit unterschiedlichen Mengen vitaler Oozysten inokuliert. Mindestens 1000 Oozysten waren notwendig, um eine sicher nachweisbare Infektion zu erzeugen. Bei Einsatz von 100 Oozysten konnten etwa drei von vier Kulturen als infiziert diagnostiziert werden, bei Verwendung von 10 Oozysten betrug dieser Anteil etwas unter einem Drittel. Bei der thermischen Inaktivierung wurden zwei Temperaturen benutzt: 38 °C und 55 °C, die für unterschiedlich lange Zeitspannen (zwischen 1 und 24 h) auf die Oozysten eingewirkt hatten. In den 68 so untersuchten Kulturen zeigte sich, dass 55 °C unabhängig von der Einwirkdauer ausreichend waren, um die Oozysten soweit zu inaktivieren, dass kein PCR-Nachweis in der Kultur mehr möglich war. Eine Erwärmung auf lediglich 38 °C hatte dagegen keinen nennenswerten Einfluss auf die Infektiosität der Oozysten in der Zellkultur. Diese Oozysten verhielten sich ähnlich wie die unbehandelten Chargen. Es wurde ferner der Einfluss einer einstündigen Exposition mit Neopredisan® in den Konzentrationen von 0,25, 1 und 4 % auf die Infektiosität getestet (80 untersuchte Kulturen), sowie einer zweistündigen Inkubation mit 4 % (60 PCR-Ansätze). Die beiden niedrigen Konzentrationen übten keinen hemmenden Effekt auf die Vermehrungspotenz der so behandelten Oozysten aus, teilweise wurde hier sogar eine erhöhte Nachweisbarkeit vor allem in den niedrigen Inokula festgestellt. Dagegen konnte die höchste Konzentration die Oozysten in ihrer Vermehrung signifikant hemmen. Die längere Desinfektion erwies sich hierbei als wirksamer. Dieser Effekt war jedoch deutlich geringer als der einer Erwärmung auf 55 °C, und es konnten nicht alle Oozysten inaktiviert werden. Die Genotypisierung (Sequenzierung von zwei Genloci) der verwendeten Isolate ergab, dass es sich bei den verwendeten Parasiten um den bovinen Genotyp von C. parvum handelte und dass durch die verwendete PCR der richtige DNA-Abschnitt amplifiziert wurde. Insgesamt gesehen ist die Methode geeignet, reproduzierbare intrazelluläre Infektionen einer permanenten Zelllinie in vitro zu erzeugen, die sich auch gut mit der vorgestellten PCR nachweisen lassen. Allerdings ist auf diese Weise nur eine semiquantitative Abschätzung der Intensität der Entwicklung (über eine Titrationsreihe) möglich. Es wäre anstrebenswert, hier eine quantitative Methode (z.B. quantitative PCR) einsetzen zu können.

In dieser Arbeit wird eine neue Methode der Vitalitätsbestimmung von Cryptosporidium parvum-Oozysten beschrieben. Die gereinigten Oozysten wurden in einer HCT-8-zelllinie kultiviert und mittels IFAT ausgewertet. Um eine genaue Quantifizierung der fluoreszierenden Flächen vornehmen zu können, wurden die Bilder einer Bildanalysesoftware zugeführt und analysiert. Die Menge eingesäter Oozysten korrelierte signifikant mit den gemessenen Flächen intrazellulärer Entwicklungsstadien. In diesem System wurden verschiedene Feldisolate vergleichend getestet sowie die Vitalität thermisch inaktivierter Oozysten bestimmt.