Use of tubular anaerobic digesters to treat livestock waste in developing countries has energy, agricultural, health, social and environmental benefits. However, careful use of digester effluent as a soil amendment is required due to the potential presence of protozoan parasites Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia. This research investigated the performance of four tubular digesters in the Monteverde region of Costa Rica. High (>75%) volatile solids and BOD5 removal efficiencies were observed, which was attributed to the formation of a biologically active floccular sludge layer. Computational fluid dynamics (CFD) and bioprocess models were developed to evaluate the transport and transformation mechanisms in the digesters. The CFD model estimated a mean liquid hydraulic residence time (HRT) of 23 days and the bioprocess model estimated an average mean cell residence time (MCRT) of 115 days. Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia inactivation studies were performed in the laboratory under conditions similar to the environmental conditions observed in the field tubular digesters. The environmental conditions included: ambient temperatures (21-24°C), neutral pH and total ammonia nitrogen (TAN) concentrations below 250 mg NH4+-N/L. Inactivation rate constants for Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia were 0.056 and 0.726 day-1, respectively. An (oo)cysts solid-liquid phase distribution study indicated that 70% of both (oo)cysts adhered to biosolids. A tubular digester model was used to estimate the concentration of viable (oo)cysts in the digester effluents. (Oo)cysts adhesion to solids, total solids concentration in the digester and HRT were the main factors contributing to the modeled effluent concentration of viable (oo)cysts. Since the model predicted presence of viable (oo)cysts in the tubular digester effluent, a quantitative microbial risk assessment (QMRA) model was developed to estimate the risk of infection from exposure to raw livestock waste and tubular digester effluents in two rural communities in Costa Rica. The risk of infection from Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia was assessed for occupational and public exposure pathways; fomite and soil contamination and crop contamination from runoff. Results from the QMRA indicated that the concentration of (oo)cysts in the raw livestock waste, inactivation rates at the various exposure pathways and the treatment of livestock waste were the main contributing factors to the risk of infection. This research indicated that treatment of livestock waste in tubular digesters significantly decreased the risk of infection to below WHO’s acceptable individual annual risk of infection (10-4). This is the first study to combine mathematical modeling with field studies to determine the physical and biological processes in tubular digesters. This is also the first study to combine mathematical models with field and laboratory studies to determine the concentration of (oo)cysts in tubular digester effluents and to predict the risk of infection from Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia if tubular digester effluent is used as a soil amendment.

In dieser Arbeit wird eine neue Methode der Vitalitätsbestimmung von Cryptosporidium parvum-Oozysten beschrieben. Die gereinigten Oozysten wurden in einer HCT-8-zelllinie kultiviert und mittels IFAT ausgewertet. Um eine genaue Quantifizierung der fluoreszierenden Flächen vornehmen zu können, wurden die Bilder einer Bildanalysesoftware zugeführt und analysiert. Die Menge eingesäter Oozysten korrelierte signifikant mit den gemessenen Flächen intrazellulärer Entwicklungsstadien. In diesem System wurden verschiedene Feldisolate vergleichend getestet sowie die Vitalität thermisch inaktivierter Oozysten bestimmt.

Die Arbeit hatte zum Ziel, ein In-vitro-Infektionsmodell für den protozoären Durchfallerreger Cryptosporidium parvum zu optimieren und dahingehend zu testen, ob es für eine quantitative Beurteilung der Infektiosität von Kryptosporidienoozysten eingesetzt werden kann. Die verwendeten Oozysten wurden zuvor im Zuge einer Passagierung im Kalb vermehrt, aus dem Kot isoliert, aufgereinigt und zur Infektion einer humanen ileocaecalen Adenokarzinomzelllinie (HCT-8) verwendet Die Kultivierung erfolgte über 48 Stunden in Mikrotiterplatten mit jeweils 24 Kavitäten. Die DNA infizierter Zellen und nichtinfizierter Kontrollen wurde anschließend isoliert und die parasitenspezifische DNA in der real-time PCR quantifiziert. Die gewählten Primer-Sonden-Kombinationen erlaubten eine spezifische Amplifikation der Erreger-DNA. In der Optimierung wurden das Brilliant®QPCR Core Reagent Kit, der ABsoluteTMQPCR sowie zwei verschiedene Oligonukleotidkombinationen untersucht. Durch die Klonierung einer Sequenz im Target-Gen und die Herstellung einer Titrationsreihe aus dieser klonierten DNA gelang es, den für die Vergleichbarkeit unerlässlichen homogenen Standard zu gewinnen. Der In-vitro-Vitalitätsassay wurde außerdem auf seine praktische Anwendbarkeit hin geprüft. Es wurde einerseits eine Desinfektionsmittelprüfung mit Chlorokresol (Neopredisan®135-E), andererseits ein Versuch zur thermischen Inaktivierung, beide unter Nutzung dreier verschiedener C. parvum-Chargen (LE-06-Cp-05/0, LE-07-Cp-05/2 vom Isolat A, LE-06-Cp-05/2 vom Isolat B), vollzogen. Die Überbewertung der Infektiosität der Oozysten durch die Betrachtung der Exzystierung konnte anhand der parallel zur DNA-Quantifizierung ermittelten Exzystierungsraten gezeigt werden. Die Exzystierungshemmung lag in jedem Versuch deutlich unter den in der real-time PCR berechneten Inaktivierungsraten. Je nach verwendeter Oozystencharge lieferte die Desinfektion mit 4 % Neopredisan®135-E Inaktivierungsraten, die zwischen 90 und 100 % bei einstündiger Einwirkzeit lagen. Mit steigender Dauer der Inkubation stieg erwartungsgemäß auch der Grad der Inaktivierung. Die Anwendung der 1 %igen Verdünnung resultierte in einer deutlich gesteigerten Exzystierungsrate gegenüber der unbehandelten Kontrolle sowie in stark variierenden Inaktivierungsraten (24 - 91,5 %). Es konnte gezeigt werden, dass mit Neopredisan®135-E unter den gewählten Inkubationsbedingungen zwar eine gute, aber keine vollständige Inaktivierung der C. parvum-Oozysten erfolgt. Eine suboptimale Wirkung zeigte sich in einer hohen Varianz der Einzelmesswerte. Die Vitalitätsraten betrugen nach einstündiger Inkubation der Oozysten bei 38°C noch 100 %, nach 24 Stunden waren diese bereits auf 5 - 23 % abgesunken. Es scheint, als würden mesophile Verhältnisse die Exzystierung der Sporozoiten anregen und bei längerer Konditionierung eine Erschöpfung des Stoffwechsels der Entwicklungsstadien herbeiführen. Die Inaktivierungsrate bei 55°C lag zwischen 96 und 100 %. Bei thermophiler Konditionierung wurde in drei von sieben Fällen, nach der Inkubation in Neopredisan®135-E nur in einer der sieben Untersuchungen ein vollständiger Vitalitätsverlust beobachtet. Die vorgestellte Methode erwies sich als gut reproduzierbar, sensitiv und schnell. Die In-vitro-Kultivierung des Erregers C. parvum ließ sich mit der real-time PCR, welche eine absolute Quantifizierung erlaubte, gut in Einklang bringen. Die Verwendung der In-vitro-Kultur als lebendes System ließ eine gewisse Variabilität der Ergebnisse zwischen einzelnen Untersuchungen erwarten, die sich aber in einem akzeptablen Bereich bewegten. Eine weitere Optimierung im Sinne einer Sensitivitätssteigerung bei akzeptabler Störanfälligkeit und Variabilität ist anzustreben.

Cryptosporidium parvum is an obligatory intracellular parasitic protist that belongs to the phylum Apicomplexa. Cryptosporidiosis is an infection for which no satisfactory efficient curative treatment is known, especially in immunocompromised individuals. Furthermore, the parasite oocysts show considerable tenacity in the environment. Therefore, new potent drugs along with a simple and reliable experimental model for evaluation of anticryptosporidial measures are urgently needed. The present studies were undertaken to establish a combined cell culture and quantitative PCR assay (cc-qPCR) to assess efficacy of pharmacological compounds against C. parvum. Human ileocecal adenocarcinoma cells (HCT-8) were selected for culture of C. parvum. Oocysts were excysted directly on confluent monolayers for infection. After 3 h of incubation the non invasive parasite remains were removed by washing. At the end of the incubation period the cells were harvested and subjected to DNA extraction. Real time PCR was performed to quantify the target parasite DNA (fragments of 70 kDa heat shock protein gene) copy numbers. Each reaction was run in triplicate. A standard curve calculated on the basis of serial dilutions of plasmid DNA or infected control culture DNA was run in each experiment. A series of oocyst suspensions were applied to cell cultures to determine the sensitivity of the cc-qPCR assay and also to generate a calibration curve to calculate the infectivity of oocysts. A dilution series of heat inactivated oocysts (70°C for 1 h) were used to determine the size of the oocyst inoculum at which complete elimination of extracellular parasite material by washing is reliably achieved. The results obtained by the assays were reproducible and the method sensitive with a detection limit of infection with 10 oocysts 48 h post infection (p.i.) and with 100 oocysts 24 h p.i. Percent effects of drugs and disinfectants were enumerated by comparing DNA copies between treated and non treated samples. The suitability of cc-qPCR for screening of pharmacological compounds was validated by confirming the in vitro efficacy of monensin (98.15% ± 1.09 at 0.144 µM) and halofuginone (98.05% ± 0.59 at 25 µM) over the entire incubation period with a dose dependent reduction of parasite multiplication demonstrated 27 h p.i. The inhibition of parasite proliferation by 0.144 µM monensin in the period from 3 h p.i (time defined to represent the initial level of parasite development before drug application) to 27 h p.i. or 45 h p.i. was 97 and 99% respectively, and by 25 µM halofuginone 99% (27 h p.i.). Hexadecylphosphocholine (miltefosine), a new anti-leishmanial compound, was tested against cryptosporidia and provided a maximum of 98% reduction of parasite multiplication at 45 h p.i. The potential activity of curcumin (extract from the herb Curcuma longa) against C. parvum was also evaluated by cc-qPCR. Curcumin appeared to be sensitive to degradation after prolonged incubation and the observed inhibition of multiplication of C. parvum was significantly increased when medium was replaced by fresh medicated medium after 12 h of exposure. The effects on parasite multiplication (>95% inhibition with IC50 value of 13 µM) and on sporozoite invasion (assessed 3 h p.i.; 65% inhibition at 200 µM) suggest that further exploration of anticryptosporidial efficacy of curcumin may be rewarding. The cc-qPCR was further optimized to analyse inactivation measures directed against oocysts of C. parvum. The suitability of the assay for assessment of inactivation measures was confirmed by the reproducible demonstration of effectiveness of cresolic disinfectants at the recommended concentration of 4% and incubation period of 2 h (Neopredisan® 135-1, Menno Chemie, Norderstedt, Germany: 99.91% ± 0.08; Aldecoc® TGE, EWABO Chemikalien GmbH & Co. KG, Wietmarschen, Germany: 99.91± 0.05) and by using thermally inactivated oocysts (complete inactivation by 56°C and 70°C for 20 min). Based on the in vitro results and previously obtained data from the chicken infection model 99.5% inactivation is proposed as a suitable threshold value that needs to be consistently exceeded by a product to be considered efficient. Application of Neopredisan® 135- 1 and Aldecoc® TGE (4% for 2h) consistently inactivated more than 99.5% of oocysts while other disinfectants that are not certified as anticoccidial products like Aldecoc® XD (EWABO Chemikalien GmbH & Co. KG, Wietmarschen, Germany) and IGAVET® FF spezial (COS OHLSEN Chemie & Gerätevertrieb GmbH, Geltorf-Esprehm, Germany) and bleach (sodium hypochlorite) did not. It can be concluded that the cc-qPCR method is suited to easily and reliably assess anticryptosporidials in vitro. The method demonstrated that miltefosine and curcumin display anticryptosporidial efficacy under the applied conditions. The cc-qPCR is a highly standardized method supposedly appropriate to replace the chicken infection model for Eimeria tenella as currently practised for certification of anticoccidial disinfectants according to the guidelines of DVG (German Veterinary Society).

Das Vorkommen von Kryptosporidien bei Kälbern in Deutschland während der ersten drei Lebenswochen, sowie der Einfluss von C. parvum, auch im Kontext von Koinfektionen auf das Erkrankungsgeschehen wurde bewertet. Um einen Überblick über die hierzulande verbreiteten Subgenotypen zu erhalten, wurden die aus Milchviehbetrieben in Deutschland gewonnenen C. parvum-Feldisolate mittels Sequenzanalysen am GP60-Lokus molekulargenetisch untersucht.

The protozoan Cryptosporidium parvum is one of the major causative pathogens of diarrhoea in young ruminants; therefore, it causes economic losses and impairs animal welfare. Besides C. parvum, there are many other non-infectious and infectious factors, such as rotavirus, Escherichia coli, and Giardia duodenalis, which may lead to diarrhoeic disease in young livestock. Often, more than one infectious agent is detected in affected animals. Little is known about the interactions bet-ween simultaneously occurring pathogens and their potential effects on the course of disease. In this review, a brief overview about pathogens associated with diarrhoea in young ruminants is presented. Furthermore, information about coinfections involving Cryptosporidium is provided.

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Le genre Cryptosporidium (Apicomplexa : Alveolata) comprend des espèces qui infectent l'intestin d'un grand nombre de vertébrés (l'homme compris). Elles sont la cause de la cryptosporidiose, maladie opportuniste émergente avec un impact considérable chez le patient immunodéficient, notamment sidéen. Ces protistes infectent aussi des sujets immunocompétents dans toutes les latitudes, en déterminant des diarrhées en général autorésolutives. Les oocystes hébergeant les sporozoïtes infectants sont éliminés avec les selles des hôtes infectés, contaminent l'environnement, sont fréquemment véhiculés par les eaux où ils gardent leur pouvoir infectieux pendant longtemps, résistant aux désinfectants usuels. Par ailleurs, étant immédiatement infectieux après leur excrétion, ils peuvent être transmis directement par contact inter-humain.<br />Sans prescription spécifique, rare dans les faits, la détection d'oocystes de Cryptosporidium n'est pas pratiquée lors de l'examen coproparasitaire conventionnel. De plus, la morphologie étant insuffisante à la distinction des espèces dans le genre, leur identification, qui fait appel à des méthodes moléculaires, est rarement pratiquée, notamment dans les pays en développement. Cependant, elle constitue le seul moyen de déterminer les sources, les voies et les mécanismes de l'infection, informations essentielles au développement de stratégies rationnelles de prévention.<br />Pour toutes ces raisons, nous avons dans un premier temps cherché à caractériser la variabilité génétique des espèces et de sub-espèces de Cryptosporidium dans différentes régions : Venezuela, Francia, Haïti e Iran. Au Venezuela, chez les 397 patients avec un statut VIH/SIDA confirmé, notre étude a révélé que l'infection par Cryptosporidium est fréquente parmi les patients infectés par le VIH vivant à Caracas, que l'infection, dont la prévalence augmente avec l'âge, s'associe fréquemment à une diarrhée (plus de 5 selles par jour) et à une perte de poids, et qu'un taux de CD4+ <100 cell/mm3 peut être considéré comme un facteur de risque prédictif de cryptosporidiose. L'étude génotypique (PCR-RFLP ciblant l'ADNr 18S de Cryptosporidium sp) a permis d'identifier les espèces isolées ; le génotypage multiloci, qui ciblait des mini- et microsatellites a autorisé une résolution à niveau infra-spécifique. Trois espèces de Cryptosporidium ont été identifiées parmi des nouveaux échantillons fécaux de patients vénézuéliens VIH+: C. hominis, C. parvum et C. canis. L'analyse avec les marqueurs mini- et microsatellites a révélé que les échantillons de C. hominis présentaient une même combinaison d'allèles. Nous avons effectué des études semblables en France, en Haiti et en Iran. Globalement, la structure génétique des populations de ces parasites montre une prédominance clonale, malgré l'existence d'un stade sexuel obligatoire dans le cycle biologique des Cryptosporidium spp. L'origine géographique et l'espèce hôte ont un rôle structurant. En Iran, trois espèces de Cryptosporidium ont été identifiées parmi les échantillons fécaux de 15 personnes et 9 animaux: C. parvum, C. hominis et C. meleagridis.<br />La seconde partie de ce travail décrit le développement d'un modèle murin immunodéprimé, représenté par des souris SCID (Severe Combined Immunodeficiency), traitées par la dexaméthasone. Ce modèle, destiné à caractériser les isolats de Cryptosporidium spp sur le plan phénotypique, a révélé des divergences marquées entre C. parvum et C. muris. Les espèces C. hominis, spécifique de l'homme, et C. molnari, de poisson, ne se sont pas développées chez la souris SCID traitée ou pas par la déxaméthasone. L'étude histopathologique a confirmé la localisation gastrique (préférentiellement fundique) de C. muris. Les souris SCID sous dexaméthasone inoculées avec C. parvum ont développé des dysplasies iléo-caecales à partir du 35ème jour post-inoculation. Chez les souris non traitées par la déxamethasone euthanasiées 57 jours après l'infection la parasitose était associée à un néoplasie intestinal de bas grade. Des néoplasies de haut grade ont été observés au niveau de l'estomac (souris sous déxaméthasone), principalement dans la zone antrale. Globalement, nos expériences ont montré que C. parvum induit des néoplasies intra-épithéliales de bas et de haut grade dans l'estomac, le duodénum, le caecum et autres régions du côlon. Un tiers de ces souris présentaient des lésions néoplasiques dans plus d'un type d'organe. Des approches immunohistochimiques et biochimiques complètent la caractérisation de ces lésions.<br />Globalement, ce travail, qui rapporte un modèle expérimental hautement reproductible de cryptosporidiose, fournit des nouvelles informations sur la diversité génétique de Cryptosporidium dans plusieurs régions du monde et sur les différences biologiques entre espèces. En particulier, ce travail démontre pour la première fois la capacité de C. parvum à induire des processus néoplasique chez l'hôte. Cette découverte majeure accroît significativement l'intérêt scientifique des Cryptosporidium spp et suggère que l'impact de ces parasites en santé humaine et animale pourrait être beaucoup plus grand que ce qu'on croî

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La multichimiorésistance est caractérisée par une résistance simultanée à des agents chimiothérapeutiques de structures diverses, induite notamment par l'efflux des substances actives hors des cellules. Les transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) sont des protéines transmembranaires impliquées dans cet efflux et qui participent à l'échec du traitement de certains cancers. Par ailleurs, ce mécanisme d'efflux a également été évoqué dans le cadre de la résistance de certains microorganismes aux antimicrobiens. Dans cette étude, nous avons conçu et synthétisé des dérivés susceptibles d'inhiber certains transporteurs ABC, en particulier, la glycoprotéine-P (Pgp) impliquée dans la multichimiorésistance des tumeurs humaines, et CpABC3, rencontré chez le parasite Cryptosporidium parvum. Dans un premier temps, nous avons synthétisé trois dérivés de type 4-alkyl-imidazo[4,5-b]pyridin-7-one, hétérocycles destinés à se fixer sur le site à ATP des transporteurs ABC. L'activité de ces composés a été évaluée vis-à-vis d'un fragment recombinant (H6-NBD1) de CpABC3, et un de ceux-ci a montré une liaison (faible) à ce fragment. Nous avons ensuite préparé dix-sept dérivés bivalents susceptibles d'inhiber la Pgp, constitués d'une molécule d'adénine (ciblant le site à ATP) reliée à la progestérone (ciblant le site aux stéroïdes) par un bras de géométrie variable. Ces dérivés ont été testés sur des lignées cellulaires K562/R7 surexprimant la Pgp, et un de ceux-ci a montré une activité supérieure à celle de la progestérone. Enfin, nous avons mis au point une synthèse de chaînes de type oligocyclohexylidène, qui sont de bons candidats pour constituer des bras espaceurs rigides