Estudo anterior de nosso grupo demonstrou que superfície de titânio (Ti) com nanotopografia obtida por condicionamento com H2SO4/H2O2 e funcionalizada com GDF-5 por simples adsorção promove o aumento da mineralização de culturas primárias de células osteogênicas. O presente estudo teve como objetivos avaliar: 1) os efeitos da pós-adsorção de proteínas principais do plasma- albumina, fibrinogênio e fibronectina, em superfícies de Ti controle e com nanotopografia, funcionalizadas com GDF-5 a 200 ng/mL por simples adsorção, sobre a formação de matriz mineralizada in vitro; 2) parâmetros moleculares e fenotípicos característicos da aquisição do fenótipo osteogênico in vitro sobre superfícies de Ti funcionalizadas com GDF-5 por simples adsorção ou por filmes LbL; 3) parâmetros de formação óssea adjacente a implantes de Ti com nanotopografia funcionalizada com GDF-5 pelos dois métodos, em modelo de tíbia de coelhos. Os resultados mostraram que a pós-adsorção de proteínas plasmáticas não afetou o potencial osteogênico in vitro, com exceção para o efeito inibidor da albumina, quando pós-adsorvida isoladamente. Tanto a superfície de Ti como o método de funcionalização de GDF-5 afetaram, quantitativamente, as formações de matriz mineralizada, com a maior diferenciação osteogênica para Ti com nanotopografia funcionalizada com GDF-5 por simples adsorção e a menor, para os filmes LbL, independentemente das superfícies sobre as quais eles eram montados. A atividade de ALP foi maior em culturas sobre nanotopografia de Ti, incluindo aquelas funcionalizadas com GDF-5, cujos valores, no entanto, não corresponderam, necessariamente, à maior atividade osteogênica. Apesar disso, todos os grupos exibiram expressão de marcadores de diferenciação osteoblástica, com sobre-expressão de osteopontina e osteocalcina para culturas sobre LbL. As análises microtomográfica, histológica e histomorfométrica não revelaram diferenças qualitativas e quantitativas in vivo entre nanotopografias de Ti funcionalizadas ou não com GDF-5, ainda que uma tendência à maior formação óssea tenha sido observada para as superfícies funcionalizadas e, entre essas, para os filmes LbL. Considerados conjuntamente, os resultados do presente estudo contribuem para o melhor entendimento das respostas de osteoblastos e do tecido ósseo quando se propõe a estratégia de funcionalização de superfícies de Ti com GDF-5 visando à otimização da osseointegração. / It has been demonstrated that a nanostructured titanium (Ti) surface obtained by treatment with H2SO4/H2O2 and functionalized with GDF-5 by simple adsorption promotes the enhancement of mineralized matrix formation in osteogenic cell cultures. This study aimed to evaluate: 1) the effects of post-adsorption of major plasma proteins, i.e. albumin, fibrinogen and fibronectin, on control and nanostructured Ti surfaces, functionalized with 200 ng/mL GDF-5 by simple adsorption, on mineralized matrix formation by calvarial osteogenic cell cultures; 2) molecular and phenotypic parameters characteristics of the acquisition of the osteogenic phenotype in vitro on Ti surfaces functionalized with GDF-5 by either simple adsorption or layer by layer (LbL) films; 3) parameters of bone formation adjacent to Ti implants with a nanostructured surface functionalized with GDF-5 by the two methods described in item 2, in a rabbit tibia model. The results showed that the post-adsorption of plasma proteins did not affect the osteogenic potential of cultures, except for the inhibitory effect of albumin when post-adsorbed alone. Either the Ti surface topography or the method for GDF-5 functionalization quantitatively affected mineralized matrix formation, with the higher osteogenic differentiation for nanostructured Ti functionalized with GDF-5 by simple adsorption and the lower one for LbL films, irrespective of the Ti surface topography on which they were mounted. ALP activity was higher for cultures grown on nanostructured Ti, including those functionalized with GDF-5, whose values, however, did not necessarily correspond to the higher osteogenic activity. Despite that, all groups expressed osteoblast differentiation markers, with a remarkable increase in osteopontin and osteocalcin mRNA levels for cultures grown on LbL films. The microtomographic, histologic and histomorphometric analyses revealed no qualitative or quantitative differences in vivo among the nanostructured Ti implants, yet a tendency for enhanced bone formation was observed for the functionalized surfaces and, between them, for the LbL films. Taken together, the results of the present in vitro and in vivo studies contribute to a better understanding of osteoblast and bone tissue responses to the functionalization of Ti surfaces with GDF-5 aiming to optimize osseointegration.

Lodos de esgoto são resíduos do tratamento do esgoto doméstico, considerados ricos em macronutrientes e matéria orgânica, podendo também apresentar contaminação por substâncias químicas e patógenos. Sua utilização na agricultura é uma das alternativas interessantes para sua disposição final. Entretanto, a presença de contaminantes, dentre eles microrganismos patogênicos podem limitar e orientar sua aplicação. Os vírus entéricos, dentre os quais se inclui o gênero Enterovirus, são potenciais contaminantes microbianos presentes no lodo de esgoto. Esses organismos são capazes de sobreviver por meses em águas e solos e sua presença no ambiente pode trazer prejuízos à saúde da população exposta aos mesmos. O objetivo do presente estudo foi de analisar a ocorrência de Enterovirus em amostras de lodo de esgoto de seis diferentes ETEs do Estado de São Paulo, avaliar o desempenho do método analítico para a detecção desses organismos e verificar se as concentrações médias obtidas atendem à legislação. Foram coletadas um total de 35 amostras no período de fevereiro de 2009 a dezembro de 2009. As análises dos Enterovirus foram realizadas pelo ensaio de plaqueamento em cultura de células RD segundo método EPA /625/R-092/013. Os resultados obtidos foram que Enterovirus estiveram presentes em 83 por cento das amostras analisadas, com concentrações que variaram de não detectado (ND) a 12,50 UFP/gST. As taxas de recuperação obtidas variaram de 0,20 por cento a 68,50 por cento . Conclui-se que das amostras analisadas 31 por cento atendem o estabelecido pela Resolução CONAMA 375/2006 / Sewage Sludge is a waste generated from wastewater treatment and is considered besides rich in macronutrients and organic matter, contaminated with pathogen and chemical substances. The usage of sludge in agriculture has been considered an interesting option. Nevertheless, the presence of contaminates such as pathogenic organisms can lead to usage limitations. Enteric viruses in wich are included enterovirus genera, a potential sludge contaminants. These organisms are able to survive for months in water and soil and their presence can bring public health concerns. The aim of this study was to analyse the occurrence of Enterovirus in samples of sewage sludge from six sewage plant treatment located in São Paulo State, to assess the method performance (recovery rate) in detecting these organisms and to verify the results obtained meet the standard established by the law. A total of 35 samples were collected spanning February to December 2009. The analyses were carried out according to method EPA/625/R-092/013. Enterovirus were present in 83 per cent of samples examined with concentration varied from not detected (ND) to 12.5 PFU/gTS. The recovery rate varied from 0,2 per cent to 68,50¨ per cent . This study showed that 31 per cent of analyzed samples met the standard established by Resolução CONAMA 375/2006

Orientador: Flávia Cristina Rodrigues-Lisoni / Coorientador: Sonia Maria Oliani / Banca: Sandra Helena Poliselli Farsky / Banca: Wilson Araujo da Silva Júnior / Banca: Joice Matos Biselli Périco / Banca: Marilia de Freitas Calmon Saiki / Resumo: O câncer cervical é uma das principais neoplasias ginecológicas em todo o mundo. O microambiente tumoral influencia no processo tumorigênico. Nas diferentes fases da tumorigênese as inflamações crônicas estão envolvidas. Assim, a proteína anti-inflamatória anexina A1 (ANXA1), que é expressa pelas células tumorais, tem sido relacionada ao processo tumorigênico. Diante dessas considerações, o objetivo do presente trabalho foi investigar a ação do peptídeo mimético da proteína ANXA1 em células de carcinoma de colo de útero. As metodologias utilizadas foram Análise de proliferação, migração, viabilidade e apoptose celular, além da modulação da expressão de genes relacionados à inflamação por PCR quantitativa. No primeiro modelo, foi utilizado o Meio Condicionado da linhagem HUVEC (endotélio) (HMC) para realizar o cultivo celular junto as linhagens HaCat (normal) e HeLa (câncer). Nossos resultados mostram que as células de câncer cervical apresentam diminuição da proliferação, enquanto na morfologia, migração, viabilidade e apoptose celular não foram observadas mudanças. A análise dos genes, MMP2 e MMP9 mostrou aumento de expressão, enquanto os genes COX2, EP3 e EP4 diminuição, após estímulo com HMC. No segundo modelo, foi realizada comparação de duas linhagens tumorigênicas (HeLa e SiHa) com a linhagem HaCaT. A ANXA1 aumentou a expressão de EP4 e MMP9 e diminuiu a proliferação celular e a apoptose. Nesse contexto sugerimos que o peptídeo pode modular mecanismos celulares e... / Abstract: Cervical cancer is one of the main gynaecological cancers around the world. The tumor microenvironment influences in the tumor process. In the different tumour phases the chronic inflammations are associated. Thus, the anti-inflammatory protein annexin A1 (ANXA1), which is expressed by tumour cells, has been linked to the tumourigenesis. In view of this, the aim of the present work was to investigate the ANXA1 mimetic peptide action in the uterus carcinoma cells. The methodologies used were cellular proliferation, migration, viability and apoptosis assay, besides the gene expression modulation of genes related to inflammatory pathways by quantitative PCR. In the first model was used the conditioned medium of HUVEC cells (endothelium) (HMC) to performed the co-culture with HaCaT cell line (normal) and HeLa cell line (cancer). Our results showed that the cervical cancer cells had a decrease in proliferation, while changes in cellular morphology, migration, viability and apoptosis were not observed. The analysis of the MMP2 and MMP9 genes showed an upregulation, while the COX2, EP3 and EP4 presented a downregulation, after the HMC stimulus. In the second model was performed a comparison between two tumor cell lines (HeLa and SiHa) with the HaCaT cell line. The ANXA1 upregulated EP4 and MMP9 and decreased the cellular proliferation and apoptosis. That way, we suggest that the peptide may modulate cellular and molecular mechanisms in the cervical carcinogenesis, however its use as a possible therapeutic alternative should be better explored / Doutor

Orientador: Karen Cristiane Martinez de Moraes / Banca: Camila Andrea de Oliveira / Banca: Dânia Elisa Christofoletti Mazzeo Morales / Resumo: O carcinoma hepatocelular (CHC) ocupa o 5º lugar entre os cânceres mais comum no mundo. No geral, cânceres apresentam alto risco de recorrência na forma de doença metastática. A identificação e caracterização funcional de genes associados à invasão e metástase é crucial para o desenvolvimento de novas terapias orientada contra esse processo. A proteína celular associada a migração e angiogênese (AAMP), está amplamente distribuída em muitos tipos de células com potencial migratório. Associado a isso, vários estudos apontam o papel crucial do metabolismo lipídico na iniciação das metástases. Estudos demonstram que os microRNAs (miRNAs) têm um papel central no controle das funções básicas das células. Um miRNA de grande interesse para este trabalho é o miRNA-149-3p. Em trabalhos realizados anteriormente pelo grupo de pesquisa, foi demonstrado que em células tumorais pulmonares (A549) esse miRNA foi apontado como um elemento de destaque no controle dos processos celulares de migração, pelo controle da proteína celular associada a migração e angiogênese (AAMP). Tendo em vista as doenças hepáticas, cabe avaliar os efeitos do miRNA-149-3p, considerando a existência de alvos putativos a esse miRNA, que se correlacionam diretamente com o metabolismo energético, buscando analisar pontos da via onde ocorre modulação ocasionada por este miRNA. Para as análises optou-se por trabalhar com as células SK-HEP-1 (linhagem metastática) e HEP-G2 (linhagem metabolizadora). Segundo as análises, de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Hepatocellular carcinoma (CHC) ranks 5th among the most common cancers in the world. In general, cancers are at high risk of recurrence in the form of metastatic disease. The identification and functional characterization of genes associated with invasion and metastasis is crucial for the development of new therapies targeted against this process. Cellular protein associated with migration and angiogenesis (AAMP), is widely distributed in many cell types with migratory potential. Associated with this, several studies point to the crucial role of lipid metabolism in the initiation of metastases. Studies have shown that microRNAs (miRNAs) play a central role in the control of basic cell functions. A miRNA of great interest for this work is miRNA-149-3p. In previous studies by the research group, it was demonstrated that in lung tumor cells (A549) this miRNA was indicated as a prominent element in the control of cellular migration processes, by the cellular protein control associated with migration and angiogenesis (AAMP). Considering the hepatic diseases, the effects of miRNA-149-3p can be evaluated, considering the existence of putative targets for this miRNA, which correlate directly with the energetic metabolism, seeking to analyze points of the pathway where the miRNA modulation occurs. For the analyzes we opted to work with the SK-HEP-1 (metastatic line) and HEP-G2 (metabolizing line) cells. According to the analyzes, it has been shown that for both SK-HEP-1 and HEP-G2 the... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-23Bitstream added on 2014-06-13T18:09:48Z : No. of bitstreams: 1 moraes_jdd_me_arafcf.pdf: 2965279 bytes, checksum: e4b88e85e5a2c07402cdd99a87bdd614 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Diversos antioxidantes demonstram considerável efeito na prevenção do câncer por reduzir o estresse oxidativo causado por uma ampla variedade de ataques: biológicos, químicos e físicos, dentre os quais a radiação solar ultravioleta (UV) é o estresse físico ambiental descrito entre os mais freqüentes ataques que ocorrem sobre a pele, o qual está associado no desenvolvimento na maioria das doenças, incluindo o câncer. Vários componentes da dieta podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com fármacos convencionais para prevenir doenças. Ainda, a busca por metodologias alternativas à experimentação com animais para o teste de eficácia de formas cosméticas de uso tópico é devido à pressão pública existente neste sentido, introduzida principalmente pela Comunidade Européia (93/95/EC). O presente estudo teve por objetivo avaliar a atividade do ácido alfa– lipóico em cultura de células, além do estudo de estabilidade de emulsões O/A e seu comportamento reológico. Para isto, foram utilizadas culturas de células como modelo experimental, na tentativa de desenvolver um método alternativo à experimentação com animais que poderá ser utilizado pela indústria cosmética. Foram utilizadas culturas de células HepG2 (metabolizadoras de xenobióticos) e cultura de células HaCaT (queratinócitos) / Several antioxidants show significant effect in preventing cancer by reducing oxidative stress caused by a wide variety of attacks: biological, chemical and physical agents, amongst which the sun's ultraviolet (UV) is the most physical stress environment described among the most frequent attacks that occur on the skin, which is associated with development in most diseases, including cancer. Several dietary components can be used alone or in combination with conventional drugs to prevent disease. Still, the search for alternative methods to animal testing to test the efficacy of topical cosmetic forms is due to public pressure that exists in this sense, introduced mainly by the European Union (93/95/EC). This study aims to assess the activity of alpha-lipoic acid in cultured cells, in addition to studying the stability of O / W emulsions and their rheological behavior. For this, cell cultures are used as experimental models in an attempt to develop an alternative method to animal testing that may be used by the cosmetics industry. Will be used HepG2 cell cultures (xenobiotic metabolizing) and cell culture of HaCaT (keratinocytes)

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-08-21T13:15:00Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3928860 bytes, checksum: 8dedb83b8bd341b4e04fc3b3fb3dabcf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-21T13:15:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3928860 bytes, checksum: 8dedb83b8bd341b4e04fc3b3fb3dabcf (MD5) Previous issue date: 2017-03-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O estudo da matéria ativa tem atraído grande interesse na atualidade. Em especial, a chamada matéria “ativa viva” vem sendo largamente estudada em razão dos padrões e/ou interações que são responsáveis por orientar e coordenar diversos processos, tais como, a cicatrização de feridas, a formação de tumores, a aglomeração de bactérias/células, entre outros. Todos estes esforços visam compreender tais fenômenos emergentes e auto-organizados que poderão ser usados na prevenção e no combate de diversos males, no desenvolvimento de novos materiais, processos de produção de energia e transporte de ma- téria.O presente projeto de pesquisa teve como objetivo caracterizar quantitativamente a migração coletiva de células MDCK in vitro. Ele foi dividido em duas frentes de trabalho: a primeira consistiu em produzir e estudar amostras de células MDCK cultivadas com diversas densidades. A segunda frente de trabalho consistiu em simular alguns modelos teóricos, como o proposto por Vicsek et al. [1] e algumas de suas variações, afim de com- preender alguns dos resultados obtidos experimentalmente. A partir deste trabalho foi possível mostrar que células MDCK em cultura podem exibir uma caminhada anômala, levando a um regime de difusão que passa por estágio subdifusivos e superdifusivos, em alguns casos esta mudança ocorria em mais de uma vez. Além disso, podemos observar que em algumas densidades as velocidades das células só se correlacionam para pequenas distâncias, uma vez que elas tendem a formar aglomerados com poucas células, em sua grande maioria duas células. A partir de modelos simples foi possível obter alguns resultados semelhantes aos experimentais, como por exemplo, uma distribuição de velocidade tipo q-weibull, com correlação de velocidade somente entre vizinhos próximos. / The study of active matter has attracted great interest in the present time. In particular, the so-called “living active” matter has been widely studied because of the patterns and/or interactions that are responsible for guiding and coordinating various processes, such as wound healing, tumor formation and aggregation of bacteria/cells, among others. All these efforts are aimed at understanding such emerging and self-organized phenomena that can be used in the prevention and combat of various pathologies, in the development of new materials or processes of energy production and transport of matter.The present research project aimed to quantitatively characterize the collective migration of in vitro MDCK cells. It was divided into two work fronts: the first consisted of producing and studying samples of MDCK cells cultured at various densities. The second work front was to simulate some theoretical models, such as that proposed by Vicsek et al. [1], and some of its variations, to understand part of the results obtained experimentally.From this work was possible to show that MDCK cells in culture can exhibit an anomalous motility, leading to a diffusion regime that undergoes subdifusive and superdiffusive stages and that in some cases, inter changed between then more than once. Furthermore, we can observe that in some densities the cell velocities only correlate to small distances, since they tend to form agglomerates with few cells, mostly two cells. From simple models it was possible to obtain some results similar to the experimental ones. For example, q-Weibull speed distributions, with velocity correlations only between close neighbors were generated.

O oócito e as células do cumulus apresentam uma comunicação bi-direcional através de projeções que atravessam a zona pelúcida, sendo fundamental no transporte de aminoácidos para o crescimento e maturação oocitária. O oócito regula diversas funções das células do cumulus que o rodeiam e é o responsável por mantê-las diferenciadas das demais. Desta forma, estas células têm se mostrado de grande utilidade para pesquisa, pois podem manter o estado menos indiferenciado in vitro, semelhantes às fases iniciais de desenvolvimento folicular e, portanto, ideais para estudos que visam entender melhor o processo de diferenciação celular durante a foliculogênese, bem como as interações hormonais que ocorrem neste período. Diversos trabalhos têm sugerido a ação sinérgica do FSH e do IGF-1 na esteroidogênese, através da estimulação das mesmas vias metabólicas, porém com grande variabilidade dos resultados entre as espécies. Neste trabalho, as células do cumulus foram coletadas durante o procedimento de FIV na Clínica Proser, e posteriormente cultivadas em meio DMEM modificado, na concentração final de 5x104 células/poço. Para ambos experimentos as células foram cultivadas em incubadora por 24h antes dos tratamentos específicos de cada grupo. Para o transporte de [14C]MeAIB foram feitos 3 grupos: 1) grupo controle; 2) grupo FSH; 3) grupo IGF-1+FSH. Todos os grupos foram cultivados por 24h em meio DMEM, sendo acrescido 25ng/mL de IGF-1 ao grupo IGF-1+FSH. Posteriormente, as células foram incubadas à 37ºC por 45 min em meio HBSS acrescido de 0,2 μCi/mL de [14C]MeAIB por amostra. Foi adicionado ao meio de incubação 75 mIU/ml de FSH nos grupos FSH e IGF-1+FSH. A reação foi encerrada com colocação das placas em gelo e o meio foi retirado da placa e congelado. As células foram lavadas com HBSS à 4ºC e 0,5 mL/poço de água foi adicionado antes de serem congeladas à -20°C. Para a contagem do radioativo, as células foram descongeladas, sonicadas e centrifugadas à 800g por 10min. Alíquotas de 100 μL foram retiradas de todas as amostras (meio interno e externo) e colocadas em 1,5mL de liquido de cintilação para a mensuração da radioatividade em espectrômetro de cintilação líquida LKB beta modelo 1215. A dosagem de proteína das amostras foi realizada segundo o método de Lowry. Os resultados foram expressos pela relação entre radioatividade das células e a radioatividade do meio de incubação. Para a dosagem de 17ß-estradiol as células foram cultivadas nas mesmas condições conforme o experimento anterior. Após 24 horas de cultivo, as células foram divididas em quatro grupos: 1)grupo controle: somente o meio de cultivo; 2) grupo FSH: foi adicionado 75mUI de FSH ao meio; 3) grupo IGF-1: foi adicionado na concentração de 25ng IGF-1/mL ao meio; 4) grupo FSH+IGF-1: foi adicionado FSH (75mUI/mL) e IGF-1 (25ng/mL) ao meio. Ao final de 24h de cultivo, o meio foi congelado à -20ºC. O meio foi diluído na proporção 1:10 no meio tampão do kit. Posteriormente, a mensuração do 17ß-estradiol foi feita por Elisa, utilizando-se o kit comercial 17ß-estradiol EIA kit. Foram utilizados os seguintes itens para correlação com os parâmetros experimentais: a idade e o número de oócitos MII que foram submetidos à ICSI. Para a análise estatística foram feitos os testes: ANOVA de uma via seguido de pósteste de Bonferroni, Shapiro-Wilk para avaliação da distribuição dos dados, Kruskal-Wallis e coefeciente de correlação de Pearson’s. As diferenças foram consideradas significativas quando P<0,05. Foi encontrado uma forte correlação negativa entre o número de oócitos MII e o transporte de [14C]MeAIB (n=5; P=0,03). Não foi encontrado correlação entre o transporte de [14C]MeAIB com a idade das pacientes, sendo o valore de P> 0,05. A incubação com FSH (75 mUI/mL) e o cultivo com IGF-1 (25ng/mL) durante 24h não estimularam o transporte de [14C]MeAIB nas células do cumulus humanas (n=5; P=0,620). O cultivo com a adição de FSH, IGF-1 ou ambos por 24h não aumentou a secreção de 17ß-estradiol (pg/mL) no meio de cultura, comparado ao grupo controle (n= 7; P = 0,855). Em relação à concentração de 17ßestradiol nas células do cumulus não tratadas, não foi encontrado nenhuma correlação entre os parâmetros avaliados de idade e número de oócitos MII (n=7) P> 0,05. Podemos concluir que o sistema A de transporte de aminoácidos está presente em células do cumulus humanas, sendo que a taxa basal é inversamente proporcional ao número de oócitos MII coletados. Provavelmente, o IGF-1 não ocasiona um aumento direto na expressão do FSHR, uma vez que quando adicionado ao meio de cutivo não estimulou os parâmetros analizados comparados aos grupos com somente FSH. Além disso, quando adicionado IGF-1 sozinho ao meio de cultura das células do cumulus, nenhuma alteração na produção de 17ß-estradiol foi observada, sugerindo que o IGF-1 não tenha um efeito direto na esteroidogênese destas células. Portanto, embora existam diversos trabalhos que tem auxiliado na compreensão da interação entre o IGF-1 e o FSH na diferenciação celular durante a foliculogênese, ainda faltam pontos cruciais neste processo em células humanas. Da mesma forma, são necessários mais estudos que caracterizem as células do cumulus, bem como a sua interação com o oócito, para que possamos aplicar estes conhecimentos com a finalidade de melhorar as taxas de MIV oocitária. / Oocyte and the cumulus cells have a bi-directional communication through projections that cross the zona pellucida, being fundamental for the transport of amino acids necessary for gamete growth and maturation. Oocyte plays a dominant role in establishing the heterogeneity of the granulosa cells found in preovulatory follicles by preventing the differentiation of the cumulus granulosa cells. Thus, culturing cumulus cells from preovulatory follicles is a suitable approach to study granulosa cell differentiation as well as the hormonal interactions that occur in folliculogenesis. Several studies have suggested the synergic action of FSH and IGF-1 in steroidogenesis, through the stimulation of the same metabolic pathways, but with great variability of results among species. We evaluate the basal transport and the transport stimulated by FSH [14C]MeAIB in human cumulus cells, observing whether the addition of IGF-I to the culture medium alters this parameter. Cumulus cells were collected during the IVF procedures at Proser Assisted Reproduction Center, and cultured in modified DMEM, at a final concentration of 5x104 cells/well. For both experiments, cells were cultured in an incubator for 24h before the specific treatment of each experimental group. For the transport of [14C]MeAIB 3 groups were made: 1) control group; 2) FSH group; 3) IGF-1 + FSH group. All groups were further cultured for 24h. Twenty five mg/mL of IGF-1 were added to the to the culture medium of the IGF-1 + FSH group. Cells were incubated at 37°C for 45 min in HBSS medium plus 0,2 μCi/mL of [14C] MeAIB per sample, wherein FSH and FSH + IGF-1 groups had 75 mIU/mL of FSH added to the incubation medium. The reaction was terminated by placing the plates on ice and the medium was removed from the plate and freezed. Cells were washed with HBSS at 4°C and 0.5 mL/well of water were added before being frozen at -20°C. For radioactive counting, cells were thawed, sonicated and centrifuged at 800g for 10min. Aliquots of 100 uL were taken from all samples (internal and external medium) and placed in 1.5 mL of scintillation liquid for measurement of radioactivity in a liquid scintillation spectrometer LKB beta 1215 model. Protein dosage of the samples was performed according to the method of Lowry. Results were expressed by the ratio between the radioactivity of cells and the radioactivity of the incubation medium. For the 17ß-estradiol dosage, cells were cultured under the same conditions as the previous experiment. After 24 hours of culture, the cells were divided into four groups: control group = only the culture medium; FSH group = it was added 75mUI of FSH to the medium; IGF-1 group = it was added IGF-1 at a concentration of 25ng/mL to the medium; FSH + IGF-1 group = it was added FSH (75mUI/mL) and IGF-1 (25ng/mL) to the medium. After of 24 hours of cultivation, the medium was frozen at -20°C. The medium was diluted in a 1:10 ratio in the kit buffer medium. Afterwards, measurement of 17ß-estradiol was made by ELISA using a 17ß-estradiol EIA commercial kit. The following items were used for correlation with the experimental parameters: the age of the patients and the number of MII oocytes that underwent ICSI. For statistical analysis two tests were used: One-way ANOVA followed by Bonferroni post-test, Shapiro-Wilk for evaluation of data distribution, Kruskal-Wallis and Pearson's correlation coefficient. Differences were considered significant when P <0.05. A strong negative correlation was found between the number of MII oocytes and the transport of [14C]MeAIB (n = 5; p = 0.03). No correlation was observed between the transport of [14C]MeAIB and the age of patients (P>0.05). The incubation with FSH (75 mIU/mL) and the cultivation with IGF-1 (25ng/mL) for 24 hours did not stimulate the transport of [14C]MeAIB in human cumulus cells (n = 5; P = 0.620). The culture with the addition of FSH, IGF-1, or both for 24 hours did not increase the secretion of 17ß-estradiol (pg/mL) in the culture medium compared to the control group (n = 7; P = 0.855). Regarding the 17ß-estradiol concentration in the untreated cumulus cells, it was not found any correlation between the evaluated parameters of age and number of MII oocytes (n = 7) P>0.05. We conclude that the A system amino acid transport is present in human cumulus cells, and that the basal rate is inversely proportional to the number of MII collected oocytes. Probably, IGF-1 does not cause a direct increase in FSHR expression, once when added to the culture medium it did not stimulate the parameters analyzed compared to the groups with FSH alone. Moreover, when IGF-1 is added alone to the culture medium of cumulus cells, no change in 17ß-estradiol production was observed, suggesting that IGF-1 has not a direct effect on these cells steroidogenesis. Therefore, although there are several studies that have assisted in understanding the interaction between IGF-1 and FSH in cell differentiation during folliculogenesis, there are still crucial unknown points in this process in human cells. Likewise, more studies are needed to characterize the cumulus cells, as well as their interaction with the oocyte, so we can apply this knowledge to improve oocyte IVM rates.

Submitted by Maria Anália Conceição (marianaliaconceicao@gmail.com) on 2016-06-27T14:03:01Z No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-16.pdf: 1167031 bytes, checksum: f37b93c03ff1aafc658b116d6ba3bc6b (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Anália Conceição (marianaliaconceicao@gmail.com) on 2016-06-27T14:21:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-16.pdf: 1167031 bytes, checksum: f37b93c03ff1aafc658b116d6ba3bc6b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-27T14:21:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-16.pdf: 1167031 bytes, checksum: f37b93c03ff1aafc658b116d6ba3bc6b (MD5) Previous issue date: 2015 / Introdução: Modelos de estudos in vitro são considerados como padrão ouro para análises de atividades celulares que visam mimetizações da dinâmica das células in vivo, inclusive quando as amostras celulares são submetidas à compressão estática. Células quando cultivadas sob um substrato representam a estrutura natural e função dos tecidos in vivo no que diz respeito à fisiologia, forma da célula e seu ambiente. Objetivo: Avaliar a viabilidade e morte celular no modelo de compressão contínua na cultura de fibroblastos humanos derivados do ligamento periodontal. Métodos: Foram selecionados 10 pacientes, submetidos à extrações dos 4 terceiros molares inclusos por indicação ortodôntica. A amostra consistiu de 4 mm2 de tecido periodontal do terço médio das raízes. A mesma foi cultivada até a 6ª passagem e depois as células foram divididas em dois grupos: Grupo Controle (GC), com cultivo em monocamada e substrato sem aplicação de força durante 6h e Grupo Experimental (GE3 e GE4), com cultivo em monocamada e substrato com aplicação de carga de 3 e 4 g/cm2 durante 6h. Resultados: Tanto o GC quanto o GE3 e GE4, monocamada e substrato, não apresentaram diferença estatística nos valores de viabilidade celular e apoptose. Com o aumento da carga o GE4 indicou maior necrose em relação ao GC e o GE3. Conclusão: Não houve diferença na utilização de substrato de colágeno na cultura de fibroblastos periodontais em nenhum dos parâmetros avaliados, mas houve maior necrose com o aumento da carga na avaliação intragrupos. Descritores: Ligamento periodontal, Sobrevivência celular, Apoptose, Técnicas de cultura de células. / Introduction: In vitro studies of models are considered as gold standard for cell analysis activities aimed mimetics of the dynamics of cells in vivo, even when the cell samples are subjected to static compression. Cells when grown in a substrate represent the natural structure and function of tissues in vivo with respect to physiology, cell shape and its environment. Objective: To evaluate the viability and cell death in the pressure model continues the culture of fibroblasts derived from human periodontal ligament. Methods: We selected 10 patients who underwent extractions of 4 the 3rd molars included for orthodontic indication. The sample consisted of 4 mm2 of periodontal tissue of the middle third of the roots. The same was grown to the 6th passage, then the cells were divided into two groups: the Control Group (CG) with culture monolayer and the substrate without application of force for 6h and Experimental Group (EG3, EG4) with growing monolayer and substrate 3 of load application and 4 g/cm2 for 6 hours. Results: Both the CG when the EG3 and EG4, monolayer and substrate showed no statistical difference in cell viability and apoptosis values. With increasing load the EG4 indicated greater necrosis than the CG and EG3. Conclusion: There was no difference in the use of collagen substrate in the culture of periodontal fibroblasts in all evaluated parameters, but there was a higher necrosis with increasing load on the intra-group evaluation.

Orientadora: Profa. Dra. Christiane Bertachini Lombello / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, 2015. / A engenharia de tecidos visa cultivar celulas sobre substratos tridimensionais, para implantacao no organismo, restaurando desta forma partes danificadas. Os materiais utilizados como substratos devem apresentar caracteristicas propicias ao cultivo celular. Na cultura de celulas e necessario o estabelecimento de certas condicoes, como o modo de suplementacao do meio de cultura. Sendo assim, este estudo avaliou sistemas de cultura autologo (coagulo e soro do plasma rico em plaquetas) e xenogeno (gelatina e soro fetal bovino), como substratos e suplementos para a cultura de celulas. O plasma rico em plaquetas (PRP) apos ativacao da cascata de coagulacao apresenta uma estrutura tridimensional, o coagulo. Com a retracao do coagulo, ocorre a liberacao do soro do PRP. A gelatina e uma substancia com capacidade de gelificacao. Para manutencao de sua estrutura, a gelatina foi reticulada com glutaraldeido. A caracterizacao do substrato de gelatina e a liberacao de glutaraldeido foram avaliadas por espectroscopia. Foram realizadas avaliacoes do intumescimento e da degradacao do coagulo e da gelatina por 24 horas e cinco dias, respectivamente. A analise da ultraestrutura dos substratos foi realizada por microscopia eletronica de varredura (MEV). O diametro das fibras do coagulo e a rugosidade superficial da gelatina tambem foram examinados. Para as analises biologicas foram utilizadas celulas Vero. Nas culturas com o coagulo, o meio foi suplementado com 10% do soro do PRP e as culturas com gelatina tiveram o meio suplementado com 10% de SFB. A avaliacao da citotoxicidade foi realizada atraves do teste do extrato e de contato direto das celulas com os substratos. Nas analises do comportamento celular com os substratos, as celulas foram inoculadas sobre o coagulo e a gelatina. As culturas foram mantidas a 37¿C com 5% CO2. As avaliacoes por espectroscopia da gelatina nao identificaram alteracao da estrutura primaria e a presenca do agente reticulador. Os substratos do coagulo e da gelatina exibiram intumescimentos superiores a 200% e ambos demonstraram boa estabilidade, nao apresentando uma degradacao significativa no periodo de cinco dias. A ultraestrutura do coagulo e formada por uma rede irregular de fibras de diferentes diametros, com um valor medio de 0,210}0,097 ¿Êm. A gelatina apresentou uma estrutura densa e plana, exibindo uma micro-rugosidade de 0,11}0,02 ¿Êm. As avaliacoes da citotoxicidade confirmaram que os sistemas de cultura nao foram toxicos para as celulas Vero, exibindo valores de viabilidade celular superiores a 90%. Na analise da interacao celular com os substratos foi verificado que as celulas aderiram e se espalharam sobre os materiais. As celulas presentes na gelatina exibiram maior area superficial (866,32}390,53 ¿Êm) do que as celulas aderidas no coagulo (425,53}245,21 ¿Êm), indicando maior interacao com o substrato. Portanto, os resultados sugerem que ambos os sistemas de cultura sao promissores para utilizacao em engenharia de tecido. Todavia o sistema autologo apresenta a vantagem de ser proprio do organismo. / Tissue engineering aims to grow cells on three dimensional substrates for implantation in the body, restoring damaged parts. The materials used as substrates must have favorable characteristics to the cell culture. In cell culture, it is necessary to establish certain conditions, such as supplementation of the culture medium. Thus, this study evaluated autologous culture systems (clot and serum platelet-rich plasma) and xenogeneic (gelatin and fetal bovine serum) as substrates and supplements for cell culture. The platelet-rich plasma (PRP) upon activation of the coagulation cascade has a three dimensional structure, the fibrin clot. With clot retraction, the serum PRP is released. Gelatin is a substance with gelling capacity. To maintain its structure, gelatin was crosslinked with glutaraldehyde. Characterization of the gelatin substrate and the release glutaraldehyde were assessed by spectroscopy. For the characterization of the substrates were performed assessments of swelling and degradation for 24 hours and five days, respectively. The analysis of the ultrastructure of the substrates was performed by scanning electron microscopy (SEM). The diameter of the clot fiber and the surface roughness of gelatin were also examined. For biological testing, Vero cells were used. In cultures with the clot the medium was supplemented with 10% serum from PRP and gelatin medium were supplemented with 10% FBS. Assessment of cytotoxicity was performed using the test extract and direct contact of the cells with the substrates. In cellular behavior analysis with the substrates, the cells were inoculated onto the clot and gelatin. Cultures were maintained at 37°C with 5% CO2. The evaluations of gelatin by spectroscopy have not identified change in the primary structure and the presence of the crosslinking agent. The substrates of the clot and gelatin exhibited swellings higher than 200% and both demonstrated good stability, showing no significant degradation over a five day period. The ultrastructure of the clot is formed by an irregular network of fibers of different diameters, with an average value of 0.210±0.097 ìm. The gelatin presented a dense and planar structure, showing a micro-roughness of 0.11±0.02 ìm. The evaluation of cytotoxicity confirmed that culture systems were not toxic to Vero cells, exhibiting cell viability higher than 90%. In the analysis of cell interaction with the substrates, was found that the cells adhered and spread on the materials. Cells present in the gelatin exhibited a greater surface area (866.32±390.53 ìm) than the cells adhered in the clot (425.53±245.21 ìm), indicating a greater interaction with the substrate. Therefore, the results suggest that both culture systems are promising for use in tissue engineering. However autologous system has the advantage of being the body itself.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-29Bitstream added on 2014-06-13T19:23:22Z : No. of bitstreams: 1 andrade_dp_dr_sjc.pdf: 981103 bytes, checksum: 368bc6b13475a5629a9213ad35edf3ea (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Titânio (Ti) é um dos melhores biomateriais para a confecção de implantes cirúrgicos, porém, estudos com novas ligas de Ti e variações da topografia visam otimizar os resultados da osseointegração. O objetivo deste estudo in vitro foi avaliar a biocompatibilidade de amostras densas e porosas da liga titânio- 35nióbio submetidas ou não ao tratamento biomimético, comparadas a amostras de Ti puro grau 2. As amostras foram divididas em 6 grupos (G): a) G1- Ti denso; b) G2 - Ti poroso; c) G3 – Ti poroso tratado; d) G4 - Ti-35Nb denso; e) G5 - Ti-35Nb poroso; f) G6 - Ti-35Nb poroso tratado. Células osteogênicas obtidas da calvária de ratos recémnascidos foram plaqueadas sobre as amostras e a adesão celular foi avaliada após 4 e 24 horas, enquanto a proliferação celular foi avaliada em 1, 3, 7 e 10 dias. A viabilidade foi avaliada em 1, 3, 7 e 10 dias. Para os demais testes as células foram cultivadas por 7, 10 e 14 dias. Após 14 dias, as culturas foram coradas com vermelho de Alizarina S para detecção dos nódulos de mineralização. As amostras foram caracterizadas por espectroscopia por dispersão de energia (EDS), difração de raio X (DRX), análise metalográfica e de rugosidade. Os dados da análise metalográfica foram submetidos ao teste de Kruskal Wallis e os dados das análises celulares foram comparados pelos testes Kruskal Wallis, Mann-Whitney e T-Student, (p<0,05). O EDS demonstrou a presença de íons sódio, fósforo, magnésio e cálcio nas amostras tratadas de ambos os grupos. O DRX demonstrou a presença dos metais titânio e nióbio na liga teste. A análise metalográfica demonstrou que as amostras porosas apresentavam poros interligados, com morfologia variada e a análise pelo rugosímetro demonstrou... / Titanium (Ti) is one of the best biomaterials for surgical implants fabrication. Studies with new titanium alloys and varied surface topographies seek for improved osseointegration results. The aim of the present in vitro study was to evaluate dense and porous titanium- 35 niobium alloys, submitted or not to biomimetic treatment in comparison to degree 2 pure titanium specimens. Specimens were divided into 6 groups (G): a) G1 – dense Ti; b) G2 – porous Ti; c) G3 – treated porous Ti; d) G4 – dense Ti-35Nb; e) G5 – porous Ti-35Nb and f) G6 – treated porous Ti-35Nb. Osteogenic cells from newborn rats calvarium were plated over the samples and cell adhesion assessed after 4 and 24 hours. Cell proliferation and viability were assessed at 1, 3, 7 and 10 days. Cells were cultured for 7, 10 and 14 days for further testings. Cell cultures were stained with Alizarin Red S after 14 days for mineralization nodules detection. Specimens were characterized by means of Energy Dispersion Spectrophotometry (EDS), X-Ray Diffraction (XRD), metallographic and profilometer analyses. Metallographic data were submitted to Kruskal Wallis, while cell analyses were assessed with Kruskal Wallis, Mann-Whitney and T-Student tests (P<0.05). EDS results detected the presence of sodium, phosphor, magnesium and calcium ions in treated specimens from both groups. XRD showed the presence of titanium and niobium for the test alloy. Metallographic analysis revealed interconnected pores and varied morphology within the porous specimens. Greater rugosity was detected by the profilometer analysis within the dense alloy specimens. In vitro tests revealed similar biocompatibility of Ti- 35Nb and degree 2 pure Ti. Porosity did not interfere, but in some scenarios improved alloy biocompatibility. The biomimetic treatment favor greater production... (Complete abstract click electronic access below)