During 1999 ex-situ microcosm experiments were carried out at Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban using natural assemblages of microplankton (< 200 m in size) in a series of enrichment experiments using continuous culture techniques to determine q - the yield of chlorophyll from dissolved available inorganic nitrogen (DAH\I), during and after an enrichment event. The experiments lasted between 11 and 14 days and produced a time series of q after an enrichment of either 12 M ammonium or 12 M nitrate. Allother essential nutrients, vitamins and trace metals were added in excess so that only DAIN would limit chlorophyll synthesis. Experiments were carried out during Spring, Summer and Autumn and environmental regimes in the growth room were set-up tomimic ambient conditions at the sampling site for each season. Water samples were collected every 2 days and were analysed for chlorophylls a, b and c, chlorophyll a breakdown products, carotenoids, dissolved inorganic nutrients and particulate nitrogenand carbon. Identification and enumeration of microplankton was also undertaken. During 2 of the experiments nitrogen isotope techniques were used to determine uptake rates for nitrate and ammonium. The results indicated that the microplanktonic response to an enrichment event could be divided into 3 phases: Phase I q - a rapid uptake of DAINand the synthesis of large quantities of pigments; Phase H q - DAIN became limiting and there was a decline in q caused by nutrient limitation and an increase in grazing pressure; Phase II q - after declining q remained fairly stable. Nitrogen tied-up in autotrophicbiomass was transferred to the heterotrophs as grazing pressure and algal death increased accompanied by a calculated rise in dissolved organic nitrogen through degradation processes (assuming mass conservation of nitrogen was occurring in the microcosms),and, presumably, regenerated DAIN. There were seasonal differences in q caused by changing environmental conditions such as light, temperature and background nutrient concentrations. Seasonal changes in the community structure of microplankton collected from the sampling site could also have affected the value of q. During the Summer and Autumn Experiments ammonium enriched microcosms produced lower values of q compared to nitrate enriched microcosms but further investigation is needed to clarify the reasons for this. The method used to estimate chlorophyll or nitrogen had an effect on the value of q. Refined values of q have been produced for use in the screening model used to predict potential eutrophication in the UK.

Submitted by Maria Anália Conceição (marianaliaconceicao@gmail.com) on 2016-06-27T14:03:01Z No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-16.pdf: 1167031 bytes, checksum: f37b93c03ff1aafc658b116d6ba3bc6b (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Anália Conceição (marianaliaconceicao@gmail.com) on 2016-06-27T14:21:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-16.pdf: 1167031 bytes, checksum: f37b93c03ff1aafc658b116d6ba3bc6b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-27T14:21:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-16.pdf: 1167031 bytes, checksum: f37b93c03ff1aafc658b116d6ba3bc6b (MD5) Previous issue date: 2015 / Introdução: Modelos de estudos in vitro são considerados como padrão ouro para análises de atividades celulares que visam mimetizações da dinâmica das células in vivo, inclusive quando as amostras celulares são submetidas à compressão estática. Células quando cultivadas sob um substrato representam a estrutura natural e função dos tecidos in vivo no que diz respeito à fisiologia, forma da célula e seu ambiente. Objetivo: Avaliar a viabilidade e morte celular no modelo de compressão contínua na cultura de fibroblastos humanos derivados do ligamento periodontal. Métodos: Foram selecionados 10 pacientes, submetidos à extrações dos 4 terceiros molares inclusos por indicação ortodôntica. A amostra consistiu de 4 mm2 de tecido periodontal do terço médio das raízes. A mesma foi cultivada até a 6ª passagem e depois as células foram divididas em dois grupos: Grupo Controle (GC), com cultivo em monocamada e substrato sem aplicação de força durante 6h e Grupo Experimental (GE3 e GE4), com cultivo em monocamada e substrato com aplicação de carga de 3 e 4 g/cm2 durante 6h. Resultados: Tanto o GC quanto o GE3 e GE4, monocamada e substrato, não apresentaram diferença estatística nos valores de viabilidade celular e apoptose. Com o aumento da carga o GE4 indicou maior necrose em relação ao GC e o GE3. Conclusão: Não houve diferença na utilização de substrato de colágeno na cultura de fibroblastos periodontais em nenhum dos parâmetros avaliados, mas houve maior necrose com o aumento da carga na avaliação intragrupos. Descritores: Ligamento periodontal, Sobrevivência celular, Apoptose, Técnicas de cultura de células. / Introduction: In vitro studies of models are considered as gold standard for cell analysis activities aimed mimetics of the dynamics of cells in vivo, even when the cell samples are subjected to static compression. Cells when grown in a substrate represent the natural structure and function of tissues in vivo with respect to physiology, cell shape and its environment. Objective: To evaluate the viability and cell death in the pressure model continues the culture of fibroblasts derived from human periodontal ligament. Methods: We selected 10 patients who underwent extractions of 4 the 3rd molars included for orthodontic indication. The sample consisted of 4 mm2 of periodontal tissue of the middle third of the roots. The same was grown to the 6th passage, then the cells were divided into two groups: the Control Group (CG) with culture monolayer and the substrate without application of force for 6h and Experimental Group (EG3, EG4) with growing monolayer and substrate 3 of load application and 4 g/cm2 for 6 hours. Results: Both the CG when the EG3 and EG4, monolayer and substrate showed no statistical difference in cell viability and apoptosis values. With increasing load the EG4 indicated greater necrosis than the CG and EG3. Conclusion: There was no difference in the use of collagen substrate in the culture of periodontal fibroblasts in all evaluated parameters, but there was a higher necrosis with increasing load on the intra-group evaluation.

Orientador(a): Profª Dra. Christiane Bertachini Lombello / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, 2016. / A realização de ensaios de citotoxicidade in vitro e essencial na caracterizacao inicial da biocompatibilidade de biomateriais que visam aplicacao clinica. Pela exposicao de uma cultura celular ao contato direto, indireto ou ao extrato de determinado material de interesse e possivel caracterizar a presenca e severidade de efeito citotoxico resultante. Porem, a sensibilidade dos diferentes ensaios e variavel e influenciada por inumeros fatores, relacionados as proprias condicoes de ensaio utilizadas e parametros celulares avaliados, bem como a natureza do biomaterial em analise. Assim, o estudo comparativo desses ensaios in vitro e de suas variacoes metodologicas contribui para o melhor entendimento dos protocolos empregados atualmente, e de maior relevancia devido as questoes eticas relativas ao uso de animais em ensaios biologicos. Esse estudo buscou, portanto, analisar comparativamente a influencia de diferentes condicoes de ensaio na sensibilidade dos testes de citotoxicidade - contato direto, indireto (difusao em agar) e por extrato - segundo norma ISO 10993:5 (2009), alem de avaliar a correlacao entre os resultados desses ensaios e dos parametros de citotoxicidade utilizados. Para tal, utilizou-se linhagem celular Vero e materiais conhecidamente nao citotoxicos (papel filtro) e citotoxicos (latex) como referenciais. Os parametros celulares de morfologia, proliferacao e viabilidade foram avaliados, qualitativa e/ou quantitativamente, apos 24 h, 48 h, 72 h e 120 h de ensaio. Todos os ensaios foram eficazes na avaliacao de citotoxicidade, quando analisados os parametros celulares resultantes da interacao. Porem, para a referencia citotoxica, o efeito sobre as celulas foi distinto entre os ensaios apos 24 h de exposicao, sendo mais pronunciado no ensaio por extrato. Alem disso, o ensaio de contato direto apresentou maior variabilidade quanto a viabilidade e proliferacao celular. Verificou-se ainda, que para maiores tempos de exposicao ha reducao na viabilidade celular, inclusive para amostras nao citotoxicas, independente do ensaio. A avaliacao de citotoxicidade de representantes das tres principais classes de biomateriais - ¿À-TCP (ceramica), aco AISI 316L (metal), e gelatina reticulada (polimero), segundo mesmos ensaios, porem restritos aos tempos de 24 h e 48 h, evidenciaram a nao citotoxicidade dos dois primeiros. Porem, o ensaio por contato direto nao foi o mais adequado na avaliacao do biomaterial ceramico, devido a movimentacao da amostra, dando preferencia nesse caso aos demais ensaios. Ja para a amostra metalica, apesar da influencia de seu peso no contato direto os resultados foram representativos da ausencia de citotoxicidade. Assim, podendo ser avaliado por qualquer dos ensaios. O ensaio por extrato foi o de maior sensibilidade na deteccao do potencial citotoxico da gelatina, esse podendo ser indicado como metodo de escolha no estudo de polimeros reticulados. Como a sensibilidade entre os ensaios pode variar para um mesmo tempo de exposicao e ser influenciada pelo tipo de material em analise, principalmente quando este apresenta algum potencial citotoxico, e necessario cautela na escolha do tipo de ensaio utilizado para avaliacoes de citotoxicidade. Dessa maneira, a integracao entre resultados provenientes da avaliacao de diferentes condicoes de ensaio e parametros celulares, qualitativos e quantitativos, bem como relacionados ao comprometimento fisico/morfologico e funcional, permite maior confiabilidade na caracterizacao previa da presenca e severidade de citotoxicidade in vitro de biomateriais. / The fulfilment of in vitro cytotoxicity assays is essential for initial characterization of biocompatibility of biomaterials that are intended for clinical application. By exposure of a cell culture to direct or indirect contact with certain material of interest, or of its extract it is possible to characterize the resulting cytotoxicity effects. However, the sensitivity of the tests is variable and influenced by many factors, related to the different test conditions used and cellular parameters evaluated, as well as the nature of the biomaterial under assessment. Thus, the comparative study of these assays and its methodological variations contribute to a better understanding of the protocols currently employed. And even more relevant, in face of the ethical issues related to animal use in biological assays. Therefore, this study seeks to comparatively analyze the influence of different test conditions on the sensitivity of the cytotoxicity tests, by direct, indirect contact (agar diffusion) and for extract, according to ISO 10993: 5 (2009) and to evaluate the correlation between the results of those assays and the parameters used to detect the cytotoxicity. To this end, the study employed the Vero cell line and known non-cytotoxic (filter paper) and cytotoxic (latex) materials as reference. The parameters evaluated were cell morphology, proliferation and viability, thru qualitative and quantitative means, after 24h, 48h, 72h and 120 hours of assay duration. All assays were effective in the evaluation of cytotoxicity, resulting from the interaction. However, for the cytotoxic reference, the effect on the cells was different between assays after 24 hours of exposure and, also more pronounced for the extract assay. Besides that, the direct contact assay showed greater variability for both the cell viability and proliferation data. It was also found that for longer exposure times there is a decrease in cell viability, for all samples, including the non-cytotoxic one, and it is not influenced by the type of assay. Cytotoxicity evaluation of representatives of the three main biomaterials classes - â-TCP (ceramic), steel AISI 316L (metal), and crosslinked-gelatin (polymer) ¿ under the same conditions, yet restricted to 24h and 48h of exposure time, showed that the first two samples mentioned are non-cytotoxic. However, the direct contact assay was not the most adequate to evaluate the ceramic biomaterial, due to sample movement, preference being given in this case to the use of the other assays. For the metal, despite the influence of their weight, while in direct contact, the results where representative of the absence of cytotoxicity. Thus, all assays can be used in its evaluation. The extract assay was the most sensitive in detecting the potential cytotoxic effect of the crosslinked-gelatin, and could possibly be indicated as the method of choice when studying crosslinked polymers. Since the sensitivity between assays may vary for the same exposure time and be influenced by the type of material under analysis, especially when it presents a potential cytotoxicity; caution is required when selecting the assay for cytotoxic evaluation. Therefore, combining the results from different assay conditions and cellular parameters, qualitative and quantitative, as well as related to the physical / morphological and functional impairments, allows for greater reliability in the initial biomaterial characterization of in vitro cytotoxicity regarding their presence and severity.

A técnica do enxerto de granulação óssea tem demonstrado bons resultados na recuperação do periodonto e na melhora dos parâmetros clínicos dos dentes com comprometimento periodontal. Pouco se sabe porém, a respeito de qual tipo de tratamento de superfície radicular se faz mais condizente com o emprego dessa técnica. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a proliferação de células de granulação óssea sobre fragmentos radiculares com os seguintes tratamentos de superfície: Controle - somente raspagem, EDTA, terapia fotodinâmica (PDT- laser InGaAIP - 30mW, 30s, 45J/cm², 660nm + azul de toluidina), e ácido cítrico com tetraciclina. Todos os grupos teste receberam previamente tratamento com raspagem e alisamento com 20 golpes de cureta. Células de granulação óssea foram cultivadas em quadruplicata sobre os fragmentos por um período de 24, 48 e 72 horas. Após esse período de cultivo os fragmentos foram fixados para análise em microscópio eletrônico de varredura (MEV). Cinco campos por fragmento foram usados para a visualização e contagem de células aderidas a superfície radicular (centro, campo superior direito e esquerdo e campo inferior direito e esquerdo). A análise da calibração do examinador foi feita através de uma combinação de testes estatísticos como erro casual de Dahlberg, erro sistemático e correlação de Pearson (p<0,05). A análise da amostra foi realizada através do ANOVA de medidas repetidas complementado por Tukey, com nível de significância de 5% (p<0,05). Os resultados demostraram diferenças estatisticamente significantes, quanto ao numero de células, para as superfícies tratadas com terapia fotodinâmica no período de 72 h (p<0,05). Através de nossos resultados concluímos que o tratamento radicular com terapia fotodinâmica favorece a proliferação de células de granulação óssea humanas in vitro. / The osseous granulation graft has been demonstrating good results on the periodontal healing, resulting the improvement of clinical periodontal parameters. There are very few knowledge about what kind of dental surface would be more proper for the application of this technique. The aim of this study was to evaluate the proliferation of osseous granulation cells on human root fragments treated by different techniques as scaling and root planning (control), citric acid plus tetracycline, EDTA and photodynamic therapy (PDT InGaAIP, 45J/cm², 30mW, 30s, 660nm, toluidine blue O). All test groups were previously treated which 20 curette strikes. Osseous granulation cells was culture in quadruplicate on these fragments for 24h, 48h and 72h. After that, all fragments were fixed and prepared for analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). Aiming to counting the cells adhered on the roots, we obtained electron micrographs of 5 areas (center, upper right and left field, lower right and left field). The examiner calibration was analyzed by Dahlberg Casual Error measurement, systematic error test and Pearson correlation test (p<0.05). Statistical analysis was performed by ANOVA, followed by Tukey test, with a 5% level of significance (p<0.05). There were significant differences in cell number after 72h culture in favor of PDT group (p<0,05). We can conclude that the surface treatment of roots which PDT favor the proliferation of osseous granulation cells in vitro.

Orientador: Juliane Maria Guerreiro-Tanomaru / Resumo: Nanopartículas de prata (NPsAg) apresentam ação bactericida e biocompatibilidade, mostrando potencial para aplicações na Odontologia. Farnesol (FAR) é um álcool encontrado em óleos essencias de frutas cítricas e apresenta atividade antibacteriana/antibiofilme. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana, antibiofilme e a citotoxicidade de soluções de NPsAg e FAR, para serem utilizadas na desinfecção de canais radiculares. O estudo foi dividido em duas publicações. Na Publicação 1, a atividade antimicrobiana foi avaliada sobre Enterococcus faecalis, Candida albicans ou Pseudomonas aeruginosa, por meio da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e microbicida mínima (CMM) pelo método de microdiluição e coloração com resazurina. A avaliação da atividade sobre a biomassa dos biofilmes foi realizada por meio do ensaio de cristal violeta. A capacidade anti-adesão de biofilme foi avaliada em blocos de dentina radicular bovina após tratamento da dentina com as soluções por 3 min. Foram realizadas análises em microscopia eletrônica de varredura (MEV) e contagem de UFC mL-1 log 10. Os dados foram submetidos à análise estatística (α=0,05). No teste antibacteriano sobre células planctônicas de E. faecalis, os valores de CIM/CMM das soluções de NPsAg e FAR foram de 42,5/50μM e 0,85/1,0%, respectivamente. Para C. albicans, os valores de CIM/CMM de NPsAg e FAR foram de 27,5/37,5μM e 1,75/2,5%, respectivamente. Para P. aeruginosa, os valores de CIM/CMM de NPsAg... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Silver nanoparticles (AgNPs) have potential for applications in dentistry due to bactericidal action and biocompatibility. Farnesol (FAR) is an alcohol found in essential oils of citrus fruits and it has antibacterial/antibiofilm activity. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial, antibiofilm activities and the cytotoxicity of AgNPs and FAR solutions used as root canal disinfectant. The study was divided into two publications. In Publication 1, antimicrobial activity was evaluated against Enterococcus faecalis, Candida albicans or Pseudomonas aeruginosa, by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum microbicidal concentration (MMC) by microdilution method and rezasurin staining. The anti-biofilm activity was performed by crystal violet assay. The anti-biofilm adhesion ability was evaluated using bovine root dentine blocks after treating them with tested solutions for 3 min. Scanning electron microscopy (SEM) analysis and CFU mL-1 log 10 counting were performed. Data were statistically analyzed (α=0.05). The antibacterial test against planktonic cells of E. faecalis showed MIC/MMC values of 42.5/50μM and 0.85/1.0% for AgNPs and FAR, respectively. The values of MIC/MMC of AgNPs and FAR for C. albicans were 27.5/37.5μM and 1.75/2.5% and for P. aeruginosa were 32.5/32.5μM and 2.5/2.75%, respectively. The anti-adhesion biofilm capacity assay showed smaller amount of biofilm adhered to the substrate treated with AgNPs and FAR when compared... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Carlos Eduardo Steiner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T00:08:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cunha_KarinaSoares_M.pdf: 3290868 bytes, checksum: 62ac845d38c989b1515d635bf2bfa79b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O Mosaico pigmentar tipo Ito é uma alteração cutânea frequente, caracterizada por hipopigmentação da pele que, na maioria dos casos, segue o padrão linhas de Blaschko, geralmente associada a anomalias extracutâneas, sobretudo anomalias do Sistema Nervoso Central (SNC). Sugere-se que esse padrão decorre da presença e migração de duas linhagens celulares no período embrionário, com diferente expressão de genes associados à pigmentação, que darão origem à epiderme e ao SNC no feto. Diversos tipos de mosaicismo foram associados ao quadro e acredita-se que os casos em que não houve tal detecção se devam à limitação das células analisadas. Devido à função, origem embrionária e migração celular, possivelmente o mosaicismo seria melhor identificado em melanócitos e queratinócitos, principalmente na presença de alterações no SNC, as alterações poderiam ter envolvimento com o prognóstico neurológico. Neste estudo foi realizada análise citogenética de linfócitos e fibroblastos de 15 indivíduos com mosaico pigmentar do tipo Ito. Os objetivos incluíram padronizar a cultura de células de melanócitos e queratinócitos, visando analisar o cariótipo desses indivíduos nesses tipos celulares. O estudo citogenético nesses tipos celulares, porém, não pode ser realizado devido à dificuldade de se obter metáfases adequadas para análise. Assim, foi desenvolvido protocolo de cultura e análise citogenética em queratinócitos, o qual funcionou adequadamente em indivíduos testes, porém sem resultado semelhante nos sujeitos de pesquisa. A preparação cromossômica a partir de melanócitos, por outro lado, não se mostrou adequada. Na análise de linfócitos e fibroblastos, foram encontradas alterações cromossômicas diferentes em quatro indivíduos (26% da casuística), presentes em ambos os tipos celulares. Não foram observadas divergências nas amostras a partir de pele hipo e normopigmentadas. Essas alterações incluíram um caso de t(X;21) regular, para o qual foram realizados estudos complementares de forma a aprimorar a investigação laboratorial, sendo análise por array-CGH, FISH e estudo de inativação de X. Um caso se tratou de trissomia 18 em mosaico, nesse indivíduo não foi possível a coleta de biópsia, porém foi realizado FISH interfásico em células da mucosa oral. Houve também um caso de r(22) em mosaico, o único que apresentou diferença na proporção de células alteradas em fibroblastos e linfócitos, possivelmente por maior instabilidade in vitro de cromossomos em anel em culturas de longa duração. O último caso alterado se refere a um cromossomo marcador, também em mosaico. Os resultados obtidos foram comparados com dados da literatura prévia. Assim, apenas um caso apresentou alteração cromossômica não em mosaico, representada por uma translocação X/autossomo regular, para a qual as técnicas de estudo utilizadas não detectaram justificativa para o padrão de mosaicismo observado clinicamente / Abstract: Pigmentary mosaicism of Ito type is a skin abnormality often characterized by hypopigmentation of the skin following, in most cases, the Blaschko lines, usually associated with extracutaneous abnormalities, especially abnormalities of the central nervous system (CNS). It is suggested that this pattern arises from the presence and migration of two cell lineages in the embryonic period, with different expression of genes associated with pigmentation, which will give rise to the epidermis and the CNS in the fetus. Several types of mosaicism have been associated with this disorder. In cases in which no mosaicismo was detected, it is believed that this may be secondary to the limitation of the cells analyzed. Due to the function and embryonic cell migration, in individuals with pigmentary mosaicism, a cytogenetic mosaicism possibly would be better identified in melanocytes and keratinocytes, especially in the presence of changes in the CNS. Besides, these changes could prognose the neurological outcome. This study comprehended cytogenetic analysis of lymphocytes and fibroblasts from 15 individuals with pigmentary mosaicism of Ito type. The targets included standardize the cell culture of melanocytes and keratinocytes in order to analyze the karyotype of these individuals in these cell types. The cytogenetic study in these cell types, however, was not possible due to difficulties in obtaining adequate metaphases for analysis. Given this difficulty, another cell type (fibroblasts) was studied. In the end, chromosomal abnormalities in lymphocytes and fibroblasts were identified in four individuals. These included one case of a balanced traslocation X/21, one case of trisomy 18 mosaicism, one case of a ring 22 mosaic and one marker chromosome, also in mosaic. Considering the results of cytogenetic lymphocytes and fibroblasts, additional studies were undertaken to enhance the laboratory investigation of these cases, including array-CGH, FISH and study of X inactivation. The results were compared with previous literature data. In conclusion, we developed protocol for culture and cytogenetic analysis in keratinocytes, which worked well on test subjects, but without similar results in study subjects. The chromosome preparation from melanocytes, however, was not adequate. There were no differences in samples from different area of skin. Only one case showed different proportion of cells altered in fibroblasts and lymphocytes, possibly due to instability of ring chromosomes in long duration cultures. Finally, only one case showed no chromosomal abnormality in mosaic, represented by a regular translocation X/autosome, for which the techniques used to study detected no explanation for the pattern of mosaicism observed clinically / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Um dos principais problemas em Periodontia refere-se à redução microbiana subgengival e tornar a superfície radicular biocompatível, a qual pode ser realizada por raspagem e alisamento radicular, tratamentos químicos, laser em alta intensidade ou terapia fotodinâmica. O objetivo dessa pesquisa foi de comparar os efeitos de raízes humanas tratadas por diferentes técnicas como terapia fotodinâmica, Er:YAG, Nd:YAG, raspagem e alisamento radicular e ácido cítrico + tetraciclina, na proliferação de fibroblastos gengivais (FGH) e células de granulação óssea (GO) humanos. Para tal, foram preparados 45 fragmentos radiculares de 25 dentes extraídos por razões periodontais e que foram divididos em 6 grupos: controle com células (CC), controle com fragmento raspado (CD), laser de Er:YAG (ER - 60mJ, 10pps, varredura, distância focal 12mm, 10Hz, 10s, 2940nm), laser de Nd:YAG (ND - 0,5W, contato, 15Hz, 10s, 1640nm), terapia fotodinâmica (PDT - laser de InGaAIP - 30mW, distância focal &#x2264;1mm, 45J/cm2, 30s, 660nm + azul de toluidina O), e ácido cítrico com tetraciclina (AC). As células foram cultivadas em meio DMEM com 10% de soro fetal bovino, 1% de solução antibiótica e 0,5% de anfotericina B. Foram plaqueadas 2 x 103 células, na sexta passagem, em placas de 96 poços. Após 24h o meio foi substituído por meio condicionado pelos fragmentos tratados, com exceção do grupo controle de células (CC), que recebeu meio convencional. A viabilidade celular foi medida através do teste do MTT nos períodos de 24, 48, 72 e 96h. Os dados em forma de densidade óptica e porcentagem de crescimento foram analisados estatisticamente pelo teste ANOVA a três critérios complementado pelo teste de Tukey a um nível de significância de 5% (p<0,05). Não houve diferenças entre os grupos controle CC e CD (p>0,05). Para as células FGH em relação ao controle, houve maior estímulo após 48 e 72h no grupo PDT, após 72h no grupo ND, e após72 e 96h no grupo AC (p<0,05). Para as células GO, em relação ao controle, houve maior crescimento apenas no período de 72h para o grupo ND (p<0,05). Ao comparar os grupos experimentais e ambos os tipos celulares, após transformação em porcentagem de crescimento, houve diferença estatisticamente significante para o grupo ER nos períodos de 72 e 96h para as células FGH (p<0,05). Concluiu-se que todos os tratamentos, com exceção da raspagem e alisamento radicular, estimularam a proliferação de fibroblastos gengivais humanos e somente o tratamento com Nd:YAG estimulou a proliferação de células de granulação óssea humana. / One of the main problems in Periodontics is how to eliminate the subgingival bacteria and to convert the root surface in a biocompatible environment. These results can be achieved by scaling and root planning, chemical treatment, high energy lasers or photodynamic therapy. The aim of this study was to compare the effects of human root fragments treated by different techniques as photodynamic therapy, Er:YAG, Nd:YAG, scaling and root planning and citric acid plus tetracycline on proliferation of human gingival fibroblasts (HGF) and human osseous granulation cells (OG). Forty-five root fragments from 25 human teeth extracted by periodontal indication were divided in six groups: control with cells (CC), scaled fragment control (SC), Er:YAG laser (ER - 60mJ, 10pps, scanning, focal distance 12mm, 10Hz, 10s, 2940nm), Nd:YAG laser (ND 0.5W, contact, 15Hz, 10s, 1640nm), fhotodynamic therapy (PDT InGaAIP, 30mW, 45J/cm2,30s, 660nm, toluidine blue O), citric acid plus tetracycline (CA). The cells were grown in DMEM medium with 10% of bovine fetal serum, 1% of antibiotic solution and 0.5% amphotericin B. In 96-weIl plates 2 x 103 cells in the sixth passage were plated. After 24h the medium was replaced by medium conditioned by the treated fragments with exception of cell control group (CC) which received regular medium. Cell viability was measured by MTT test at 24, 48, 72 and 96h. Data was described in optic density and percentage of growth and was analyzed by ANOVA test complemented by Tukeys test at a significance level of 5% (p<0.05). There was no statistical differences between control groups CC and SC (p>0.05). For HGF cells in relation to control, there was a higher growth after 48h and 72h at PDT group, after 72h at ND group, after 72h and 96h at CA group (p<0.05). For OG cells in relation to control, there was a higher growth only at 72h-period at ND group (p<0.05). After transformation in percentage of growth and comparison among experimental groups and both cell types, there was a statistical significant difference at ER group at 72h and 96h-period (p<0.05). It was concluded that all treatments but scaling and root planning stimulated the proliferation of human gingival fibroblasts and only the Nd:YAG treatment stimulated the proliferation of human osseous granulation cells.

A fosfolipase A2 (PLA2) é considerada uma enzima chave no metabolismo de fosfolípides, principais constituintes das membranas celulares. Alterações da atividade da PLA2 têm sido descritas no cérebro e sangue (soro, plasma e plaquetas) de pacientes com diversas doenças neuropsiquiátricas e também em matrizes biológicas como tecido cerebral de ratos e cultura de células neuronais. A inibição da atividade da PLA2 em cultura primárias de neurônios corticais de rato resultou em neurotoxicidade, o que demonstra o papel da PLA2 em processos de sobrevivência e desenvolvimento neuronal. Neste estudo foi padronizado um ensaio radioenzimático para caracterização dos três principais subtipos da PLA2 em cultura primária de neurônios: PLA2 secretória dependente de cálcio (sPLA2), PLA2 citosólica dependente de cálcio (cPLA2) e PLA2 intracelular independente de cálcio (iPLA2). Para isso foram testadas variáveis críticas para a reação enzimática e com os resultados obtidos houve um aprimoramento do método empregado. Foi encontrada ainda, uma predominância do subtipo iPLA2 (71%) nas culturas de neurônios. Dessa forma, apresentamos um modelo in vitro para determinação da atividade dos subtipos de PLA2 que pode ser considerado uma ferramenta para compreensão dos mecanismos envolvidos nas doenças neuropsiquiátricas, nas quais a PLA2 encontra-se alterada. Além disso, a partir de modelos laboratoriais baseados em estudos com culturas de células, poderão ser evidenciados os efeitos de diversas substâncias químicas novas ou de uso tradicional, como drogas de interesse psiquiátrico, sobre os neurônios. / The phospholipase (PLA2) is considered a key enzyme in the metabolism of phospholipids, which are the main constitutes of cellular membranes. Alterations in PLA2 activity have been reported in the brain and blood cells of psychiatric patients and also in biological matrixes like rat brain tissues and cultures of neuron cells. Inhibition of PLA2 activity in primary cultures of rat neurons resulted in neurotoxicity, which demonstrates the role of PLA2 in survival processes and neuronal development. In this study, a radioenzymatic assay was standardized to detect the activity of the three main groups of PLA2, which are the calcium dependent secretory PLA2 (sPLA2), the cytosolic calcium dependent PLA2 (cPLA2) and the intracellular calcium independent PLA2 (iPLA2), in the culture of neurons. Critical variables for the enzymatic assay were tested and from the results the method used was modified. Our findings demonstrate that there is a predominance of iPLA2 subtype (71%) in cultures of rat neurons. So therefore we present an in vitro model which aims to determine the main activity of PLA2 subtypes and can be considered an investigative tool for comprehending the mechanisms involved in neuropsychiatric disorders that show alterations in PLA2 activity. Furthermore, the effects of new chemical and traditional substances, such as the drugs used in psychiatric treatments, can be evidenced in the neurons by the use of laboratorial models based on studies of neuron cultures.

Orientadores: Ângela Cristina Malheiros Luzo, Sara Teresinha Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T14:04:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AndreoliRisso_MarilisaFerruda_M.pdf: 14754073 bytes, checksum: 6e3b6aa9d09a03a1f2873ad414c83bdf (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Lesões cartilaginosas raramente curam-se espontaneamente. As atuais opções terapêuticas cirúrgicas e não são limitadas ao alívio dos sintomas, mando a necessidade de futura substituição total de joelho. Terapia baseada em células tronco adultas representa uma alternativa promissora para os procedimentos existentes. As células-tronco mesenquimais (MSC) apresentam alta plasticidade celular e podem ser obtidas de diversas fontes teciduais, opção que exige grande aporte celular expondo a necessidade de criopreservação, processo vantajoso. Contudo, protocolos convencionais estão diretamente associados a possíveis danos e mortalidade celular, sendo desencadeados por formação de cristais de gelo intracelular, toxicidade do crioprotetor adotado e desidratação celular. Este projeto tem como objetivo investigar a interferência da criopreservação com dimetilsufóxido (Me2SO-) (DMSO) na capacidade de MSCs em diferenciação em linhagens mesodermais e arranjo de fibras de colágeno produzidas na diferenciação condrogência. MSCs foram obtidas de tecido adiposo (ADSC). Em quarta passagem foram caracterizadas por citometria de fluxo e diferenciadas em linhagem mesodermais. Diferenciação comprovada por análise morfológica e expressão gênica por de RT-PCR. Genes escolhidos ADIPOQ, FABP4 e PPARG linhagem adipogênica, AGCAN, SOX9, COL1A1 e COL2A1 linhagem condrogênica e OC, OPN e COL1A1 linhagem osteogênica. Diferenciação condrogênica realizada pela técnica de micromassa. Arquitetura das fibras colágenas observada por microscopia de Geração de Segundo Harmônico (SHG) de MSCs e images analisadas pelos algoritmos Fast Fourier Transform (FFT) e Gray Level Co-occurrence Matrix (GLCM). ADSCs criopreservadas em taxa controlada de congelamente com solução criprotetora de soro fetal bovino e 10% de DMSO, mesmos ensaios realizados após descongelamento. Células descongeladas submetidas aos mesmos protocolos de caracterização. Características morfológicas obtidas por SHG expressão gênica das células frescas e criopreservadas analisadas estatisticamente. Amostras de ADSC, fresca e criopreservadas, foram capazes de se diferenciar em linhagens mesodermais. Perfil de expressão gênica da linhagem adipogênica foi semelhante ao esperado para tal processo de diferenciação, em ambas amostras, criopreservadas e frescas, estas últimas com maior expressão (p=ns). Na diferenciação para linhagem osteogênica também houve o perfil de expressão esperado para os genes estudas, sendo mais expresso no grupo criopreservado (p=ns). Apesar do fato da expressão do gene COL2A1 de linhagem condrogênica ter sido maior no grupo criopreservado, quando o perfil de expressão gênica do grupo fresco foi analisado, este mostrou-se mais consistente com o perfil esperado normal. Análise das imagens de SHG demonstraram que a arquitetura das fibras colágenas foi mais organizada (p=ns) e uniforme (p>0,0001) nas amostras frescas. O grupo criopreservado demonstrou maior entropia (p=ns) e contraste (p=0,0167), demonstrando haver maior tendência direcional das fibras de colágeno nas amostras frescas. Os resultados de expressão gênica sugerem que a criopreservação pode interferir de forma positiva na diferenciação osteogênica e negativamente nas linhagens adipogênica e condrogênica. A arquitetura da rede tridimensional de colágeno foi modulada negativamente pelo processo de criopreservação, dados esses confirmados por análise das imagens obtidas por SHG, o que poderia interferir com as propriedades físico/mecânicas características do tecido colagenoso, importante na manutenção da cartilagem articular baseada em terapia celular. O uso das imagens de SHG tornou-se uma importante ferramenta na melhor avaliação das fibras colágenas / Abstract: Cartilage defects rarely heal spontaneously. Current surgical and non-surgical therapeutic interventions are limited to symptom relief and future total knee replacement continues to be necessary. Adult stem cell based therapy could represent a promising alternative to this procedure. Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have great capacity of differentiation and can easily be obtained from various sources. Cryopreservation offers many advantages for practitioners engaged in cell-based therapies. However, conventional slow freezing, despite using cryoprotectant solution, has always been associated with damage and mortality due to intracellular ice formation, cryoprotectant toxicity, and dehydration. The aim of this work is to investigate whether the Dimethyl Sulfoxide (Me2SO-) (DMSO) cryopreservation process interferes with the MSCs capacity of differentiation to mesodermal lineages and/or with collagen fiber network architecture, produced by chondrogenic cells, comparing fresh and thawed MSCs. MSCs were obtained from adipocyte tissue (ADSCs). At the fourth passage cells were characterized as ADSCs by flow cytometry analysis and differentiation to mesodermic lineages was confirmed by morphology (light optical microscopy) and gene expression analysis (RT-PCR). The following genes were chosen ADIPOQ, FABP4 and PPARG for adipogenic lineage, AGCAN, SOX9, COL2A1 and COL1A1 for chondrogenic and OC, OPN and COL1A1 for osteogenic lineage. Chondrogenic differentiation was carried out by micromass technique. Collagen fibers architecture was observed by Second Harmonic Generation (SHG) microscopy. Images were analyzed by Fast Fourier Transform (FFT) and Gray Level Cooccurrence Matrix (GLCM) algorithms. ADSCs were cryopreserved in a controlledrate freezing device with bovine serum fetal and 10% DMSO as cryoprotectant solution. Thawed cells were submitted to the same characterization protocols. SGH morphologic features and gene expression results from thawed and fresh cells were statistically analyzed. Both, thawed and fresh ADSCs were able to differentiate into mesodermal lineages. Gene expression profile of adipogenic lineage was similar to that expected for the differentiation process in both, thawed and fresh cells, with greater expression in fresh ones (p=ns). Osteogenic lineage also demonstrated the expected gene expression profile, being more expressed in the thawed group (p=ns). Despite the fact that COL2A1 gene expression in chondrogenic lineage was greater in the thawed group, when the gene expression profile was analyzed the fresh group was more consistent with the expected normal profile. SHG images results demonstrated that collagen fibers architecture was more organized (p=ns) and uniform (p<0, 0001) in fresh samples. The thawed group showed more entropy (p=ns) and contrast (p=0, 0167) demonstrating that a directional trend in the collagen fibers was only observed in the fresh group. Gene expression results suggested that cryopreservation could interfere in a positive manner with osteogenic differentiation, and negatively on adipogenic and chondrogenic lineages. Collagen network tridimensional architecture was negatively modulated by cryopreservation, confirmed by SHG analysis, which could interfere with the desirable collagen mechanical properties, important for the maintenance of articular cartilage in cell based therapy. SHG analysis has become an important tool for better evaluate collagen fibers / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Gabriel Forato Anhê / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T19:10:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbosa_AnaPauladeLima_D.pdf: 1915868 bytes, checksum: d146b07dfcd99b2676c519233cddf2f2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O Diabetes Mellitus tipo II (DMT2) é uma doença caracterizada pela diminuição da sensibilidade à insulina e consequente prejuízo na homeostasia glicêmica. Estudos recentes mostraram que a melatonina, um hormônio produzido pela glândula pineal, melhora a tolerância à glicose e a resistência à insulina, diminui a expressão de proteínas ligadas à gliconeogênese hepática (G6Pase e PEPCK) e reduz a apoptose de células beta pancreáticas in vivo. Entretanto, ainda não estava claro se a melatonina conseguia, de fato, reverter in situ as ações lipotóxicas dos ácidos graxos saturados em células beta pancreáticas e na musculatura esquelética, e se podia diminuir a expressão dos genes reguladores da gliconeogênese hepática. Para responder a esse questionamento, utilizamos culturas celulares de insulinoma (MIN6), de músculo esquelético (miotubos de L6) e de hepatoma (HepG2). Os resultados mostraram que a melatonina reverte a resistência à insulina gerada por palmitato em miotubos de L6, mas somente em passagens baixas, não diminui a apoptose em MIN6 e não altera a expressão do G6pc, o gene que codifica a G6Pase, em HepG2 / Abstract: Type II Diabetes Mellitus (T2DM) is characterized by decrease of insulin sensitivity, resulting impairment glucose homeostasis. Recent studies have shown that melatonin, a hormone produced by the pineal gland, improves glucose tolerance and insulin resistance, reduce the expression of hepatic gluconeogenesis proteins (G6Pase and PEPCK) and diminish pancreatic beta cell apoptosis in vivo. However, it was unclear if melatonin could reverse the lipotoxic actions of saturated fatty acid in pancreatic beta cells and skeletal muscle, and if melatonin could decrease the expression of regulatory genes of hepatic gluconeogenesis in situ. To answer this question, we used cell cultures of insulinoma (MIN6), skeletal muscle (L6 myotubes) and hepatoma (HepG2). The results showed that melatonin reverses palmitate insulin resistance in L6 myotubes, but only at low passages, melatonin does not decrease apoptosis in MIN6 and does not alter the expression of G6pc, the encoding gene of G6Pase, in culture cell of HepG2 / Doutorado / Farmacologia / Doutora em Farmacologia