Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introducao: Um dos objetivos da Medicina e superar os danos causados ao organismo por doencas, senilidade e traumas, restabelecendo um equilibrio normo-funcional. Nas perdas teciduais, inumeros autores afirmam que o substituto gideal h e o proprio tecido saudavel, de mesma origem ou o tecido produzido por Engenharia Tecidual (ET). Porem, ainda sao necessarias muitas pesquisas para a utilizacao in vivo. Objetivo: Avaliar tres suplementos hemoderivados, empregados em meios de cultivo, quanto a proliferacao celular e o dano celular de celulas-tronco de origem dentaria. Metodos: Foram realizados cinco experimentos a partir de dentes terceiros molares em desenvolvimento. Apos a digestao enzimatica, as celulas-tronco adultas foram cultivadas em quatro diferentes meios de cultivo. Meio I, isento de suplemento hemoderivado; meio II, suplementado com FBS (heterologo); meio III, suplementado com soro humano homologo; meio IV, suplementado com soro humano autologo. Essas culturas foram analisadas comparativamente quanto a proliferacao celular, submetidas a testes com marcadores Von Kossa e Alizarina Vermelha durante quatro semanas (avaliadas semanalmente) e a cada duas semanas quanto as unidades formadoras de colonias (UFCs). No 28o dia as quatro culturas foram submetidas ao teste do gcometa h, analisando-se possivel dano no DNA celular. Os resultados foram submetidos a analise estatistica de Variancia de Friedman, estabelecendo-se significancia para (p) . a 5%. Resultados: O meio de cultivo IV atingiu uma proliferacao celular superior ao Meio I, demonstrando um resultado significante (p*=0,0074). O meio de cultivo II, mostrou proliferacao superior ao meio I e desenvolvimento semelhante ao meio III, porem nenhum demonstrou significancia em relacao ao meio IV. Os resultados do teste do cometa evidenciaram um menor dano celular nas culturas do meio IV em relacao ao meio II e meio III. As UFCs foram numerosas nos meios IV e III respectivamente, havendo maior indice de mineralizacao no meio IV do que nos meios II e III. Conclusao: O meio de cultivo suplementado com hemoderivado autologo favoreceu significativamente a proliferacao celular. O hemoderivado humano mostrou-se viavel como suplemento nas culturas de celulas-tronco dentarias humanas. / Introduction: One among many aims of medicine is to overcome injuries inflicted to the organism by diseases, aging and trauma, re-establishing the usual functions. About tissues losses, several authors claim that the ideal replacement is the healthy tissue itself, originated from the same source or developed by Tissue Engineering (TE). However, much research is needed before in vivo application. Objective: To evaluate three different kinds of sera supplies used in stem cell culture media, as to cellular proliferation and cellular injuries on dental stem cell. Methods: Five experiments were made utilizing incompletely developed third molar teeth. After enzymatic digestion, the adult stem cells were cultivated in four different kinds of culture media. Medium I, serum free (SF); medium II, supplied with FBS (heterologous serum- HeS); medium III, supplied with homologous human serum (homologous serum- HoS) and medium IV, supplied with autologous human serum (autologous serum . AuHS).These cultures were analyzed comparatively as to cellular proliferation; they were submitted Von Kossa (VK) and Alizarin Red (AR) markers tests for four weeks (checked weekly), and each two weeks checked for Colonies Forming Unities (CFUs). On the 28th day, all four cultures were submitted to comet assay, and were inspected for possible cellular DNA injuries. The results underwent a non-parametric statistical Friedman fs variance test, with significance (p) . 5%. Results: Culture medium IV reached a cellular proliferation rate higher than medium I, showing a significant result (p*=0,0074). Culture medium II presented a superior proliferation result than medium I, and similar to medium III, although neither of them presented significant result when compared to medium IV. The comet assay fs results showed minor cellular DNA injury in the medium IV cultures, when compared to medium II and III cultures. The CFUs were numerous in the media IV and III cultures, respectively, and there was higher mineralization rate in the medium IV than in the media II and III. Conclusion: The culture medium supplied with AuHS significantly improved cellular proliferation. Human sera proved to be a viable supply to human dental stem cell culture. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-06Bitstream added on 2014-06-13T19:43:57Z : No. of bitstreams: 1 lanza_crm_dr_arafo.pdf: 5945078 bytes, checksum: 092aa2094ca72bbfeb2e0b5301a1b69e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este estudo avaliou a difusão transdentinária e a toxicidade de sistemas adesivos autocondicionantes de diferentes valores de pH sobre células odontoblastóides MDPC-23. Sessenta discos de dentina (0,4 mm de espessura) foram obtidos de terceiros molares humanos hígidos e divididos em 6 grupos após a mensuração de sua condutância hidráulica pelo Flodec. Os discos foram montados em câmaras pulpares in vitro, onde 30.000 células foram plantadas no seu lado pulpar (área dentina exposta 0,28 cm2) e mantidas em cultura por 48 h. Após este período, os sistemas adesivos Clearfil SE Bond, Clearfil Protect Bond, Adper Prompt e Xeno III foram aplicados no lado oclusal dos discos. O sistema adesivo Single Bond foi usado como controle positivo e a solução tampão fosfato como controle negativo. A citotoxicidade foi avaliada após 24 horas pelo teste MTT e a morfologia celular por MEV. A difusão transdentinária foi qualificada por CG/EM. Os valores de MTT para os sistemas autocondicionantes, analisados pelos testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney, foram estatisticamente diferentes do grupo controle negativo. Houve redução da viabilidade celular de 47,8%; 46,5%; 42,1% e 28,0% para o Clearfil SE Bond, Xeno III, Clearfil Protect Bond e Adper Prompt L-Pop, respectivamente. A redução da viabilidade celular foi inferior ao Single Bond (53,1%) para todos os sistemas. A análise por CG/MS identificou o HEMA como principal componente químico difundido pela dentina. Foi possível concluir que todos os sistemas adesivos autocondicionantes avaliados apresentaram difusão transdentinária resultando em redução do metabolismo celular, a qual não foi relacionada a sua capacidade de dissolução da smear layer e desmineralização da dentina subjancente. / This study evaluated the transdentinal diffusion and cytotoxicity of self-etching adhesive systems with different pH on the odontoblast cell line MDPC-23. Sixty dentin disks were cut from the crowns of extracted human permanent molar teeth with 0.4 mm thickness and were divided into 6 groups of similar hydraulic conductance (Flodec). The dentin disks were placed in an in vitro pulp chamber and 30.000 cells were planted on their pulpal side (area of exposed dentin 0.28 cm2). After 48 hours, the adhesive systems Clearfil SE Bond, Clearfil Protect Bond, Adper Prompt or Xeno III were applied on the occlusal side and light-cured for 10s. Single Bond was used as positive and phosphate buffer solution (PBS) as negative control group. The cytotoxicity was measured by MTT assay and cell characteristics were assessed by SEM, after 24 h. The transdentinal diffusion was qualified by GC/MS. Kruskall-Wallis and Mann-Whitney tests demonstrated a significant difference among the adhesives and PBS (p<0.05). The cellular viability reduction promoted by the self-etching systems was lower than that of Single Bond (53,1%). Cell metabolism was reduced in 47,8%; 46,5%; 42,1% and 28,0% for Clearfil SE Bond, Xeno III, Clearfil Protect Bond and Adper Prompt, respectively. HEMA was identified as the main diffused component. It was concluded that all investigated self-etching adhesives demonstrated transdentinal diffusion resulting in reduction of the cellular metabolism, which was not related to their capacity to dissolve the smear layer and demineralize the underlying dentin.

Orientador: Josemeri Hebling / Banca: Roberval de Almeida Cruz / Banca: José Carlos Pereira / Banca: Elisa Maria Aparecida Giro / Banca: Carlos Alberto dos Santos Cruz / Resumo: Este estudo avaliou a difusão transdentinária e a toxicidade de sistemas adesivos autocondicionantes de diferentes valores de pH sobre células odontoblastóides MDPC-23. Sessenta discos de dentina (0,4 mm de espessura) foram obtidos de terceiros molares humanos hígidos e divididos em 6 grupos após a mensuração de sua condutância hidráulica pelo Flodec. Os discos foram montados em câmaras pulpares in vitro, onde 30.000 células foram plantadas no seu lado pulpar (área dentina exposta 0,28 cm2) e mantidas em cultura por 48 h. Após este período, os sistemas adesivos Clearfil SE Bond, Clearfil Protect Bond, Adper Prompt e Xeno III foram aplicados no lado oclusal dos discos. O sistema adesivo Single Bond foi usado como controle positivo e a solução tampão fosfato como controle negativo. A citotoxicidade foi avaliada após 24 horas pelo teste MTT e a morfologia celular por MEV. A difusão transdentinária foi qualificada por CG/EM. Os valores de MTT para os sistemas autocondicionantes, analisados pelos testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney, foram estatisticamente diferentes do grupo controle negativo. Houve redução da viabilidade celular de 47,8%; 46,5%; 42,1% e 28,0% para o Clearfil SE Bond, Xeno III, Clearfil Protect Bond e Adper Prompt L-Pop, respectivamente. A redução da viabilidade celular foi inferior ao Single Bond (53,1%) para todos os sistemas. A análise por CG/MS identificou o HEMA como principal componente químico difundido pela dentina. Foi possível concluir que todos os sistemas adesivos autocondicionantes avaliados apresentaram difusão transdentinária resultando em redução do metabolismo celular, a qual não foi relacionada a sua capacidade de dissolução da smear layer e desmineralização da dentina subjancente. / Abstract: This study evaluated the transdentinal diffusion and cytotoxicity of self-etching adhesive systems with different pH on the odontoblast cell line MDPC-23. Sixty dentin disks were cut from the crowns of extracted human permanent molar teeth with 0.4 mm thickness and were divided into 6 groups of similar hydraulic conductance (Flodec). The dentin disks were placed in an in vitro pulp chamber and 30.000 cells were planted on their pulpal side (area of exposed dentin 0.28 cm2). After 48 hours, the adhesive systems Clearfil SE Bond, Clearfil Protect Bond, Adper Prompt or Xeno III were applied on the occlusal side and light-cured for 10s. Single Bond was used as positive and phosphate buffer solution (PBS) as negative control group. The cytotoxicity was measured by MTT assay and cell characteristics were assessed by SEM, after 24 h. The transdentinal diffusion was qualified by GC/MS. Kruskall-Wallis and Mann-Whitney tests demonstrated a significant difference among the adhesives and PBS (p<0.05). The cellular viability reduction promoted by the self-etching systems was lower than that of Single Bond (53,1%). Cell metabolism was reduced in 47,8%; 46,5%; 42,1% and 28,0% for Clearfil SE Bond, Xeno III, Clearfil Protect Bond and Adper Prompt, respectively. HEMA was identified as the main diffused component. It was concluded that all investigated self-etching adhesives demonstrated transdentinal diffusion resulting in reduction of the cellular metabolism, which was not related to their capacity to dissolve the smear layer and demineralize the underlying dentin. / Doutor

Orientador: Tereza Cristina Cardoso / Coorientadora: Katia Denise Saraica Bresciani / Banca: Roberto Gameiro de Carvalho / Banca: Ana Carolina Borsanelli / Banca: Andréa Fontes Garcia / Banca: Jamila Cristina Baptistella / Resumo: O Brasil é o segundo maior produtor mundial de carne bovina. Entretanto diversas patologias podem acometer o rebanho bovino e causar significativas perdas econômicas. Diante deste cenário, a infecção por Herpesvirus bovino 5 (BHV5) possui grande importância epidemiológica neste setor, sendo o BHV5 conhecido pelo desenvolvimento de meningoencefalite. Esse vírus possui como características a rápida replicação lítica em cultura de células e a capacidade de estabelecer latência nos gânglios sensoriais do hospedeiro. Assim, essa cepa viral está relacionada à habilidade do BHV5 de invadir, replicar-se no sistema nervoso central (SNC) e causar enfermidade neurológica. É de conhecimento científico que infecções virais estimulam ou inibem a resposta imunológica com objetivo de impedir a replicação e disseminação viral. Entretanto, pouco se sabe sobre o desenvolvimento da resposta imunológica do BHV5 no curso da infecção aguda ou latente. Assim, muitos conceitos sobre a patogênese do BHV5 acabam sendo extrapolados do Herpesvirus bovino 1 (BHV1). Diante deste contexto, faz-se necessário a busca pelo conhecimento da relação entre os vírus e as células de defesa do hospedeiro. Esses achados irão contribuir para um melhor entendimento da patogênese da doença, bem como para o possível desenvolvimento de vacinas mais específicas e eficazes. / Abstract: Brazil is the second largest producer of beef in the world. However several pathologies can affect the bovine herd and cause significant economic losses. In view of this scenario, bovine herpesvirus 5 infection (BHV5) is of great epidemiological importance in this sector, and BHV5 is known for the development of meningoencephalitis. This virus is characterized by rapid lytic replication in cell culture and the ability to establish latency in host sensory ganglia. Thus, this viral strain is related to the ability of BHV5 to invade, replicate in the central nervous system (CNS) and cause neurological disease. It is scientifically known that viral infections stimulate or inhibit the immune response in order to prevent viral replication and dissemination. However little is known about the development of the BHV5 immune response in the course of acute or latent infection. Thus, many concepts about the pathogenesis of BHV5 end up being extrapolated from bovine herpesvirus 1 (BHV1). In this context, it is necessary to search for knowledge about the relationship between viruses and host defense cells. These findings will contribute to a better understanding of the pathogenesis of the disease, as well as to the development of more specific and effective vaccines. / Doutor

INTRODUÇÃO: A imunoterapia baseada em células dendríticas derivadas de monócitos (MoDCs) constitui uma estratégia promissora para o tratamento de indivíduos infectados pelo HIV. Devido à sua notória plasticidade, populações heterogêneas de MoDCs podem ser obtidas in vitro, dependendo das condições da cultura. Consequentemente, a capacidade dessas células em secretar citocinas e expressar moléculas que participam do processo de apresentação antigênica (MHC, moléculas de adesão e coestimuladoras) é variável, podendo interferir no perfil e eficácia da resposta imune induzida pela terapia. Em nosso laboratório foi desenvolvido um protocolo clínico de vacinação terapêutica baseada em MoDCs e HIV autólogo inativado para o tratamento de indivíduos cronicamente infectados pelo HIV, não expostos à terapia antirretroviral. Deste modo tornou-se oportuna uma investigação in vitro mais aprofundada sobre a produção viral e as características das MoDCs utilizadas como produto vacinal. OBJETIVOS: Caracterizar o produto vacinal constituído por vírus autólogo e MoDCs de indivíduos infectados pelo HIV utilizados em imunoterapia, com relação a aspectos fenotípicos e funcionais. MÉTODOS: Foram incluídos no estudo 17 indivíduos cronicamente infectados pelo HIV, participantes de um estudo clínico de fase I/II de imunoterapia com MoDCs. Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram obtidas a partir de leucaférese e parte do material foi utilizada para isolamento e expansão de HIV em sistema de cultura autólogo ou alogênico. Outra parte das PBMCs foi utilizada como fonte de monócitos para diferenciação em MoDCs imaturas que foram pulsadas ou não com o HIV quimicamente inativado pelo aldrithiol-2 (HIV-AT-2), denominadas respectivamente MoDCs HIV-AT-2 e MoDCs maduras, e posteriormente ativadas com citocinas pró-inflamatórias. MoDCs foram avaliadas fenotípica e funcionalmente quanto à expressão de moléculas de superfície, capacidade fagocítica, potencial migratório, produção de citocinas e habilidade em gerar resposta celular in vitro, avaliada por meio da capacidade em induzir proliferação, produção de citocinas e atividade citotóxica em linfócitos T autólogos. RESULTADOS: O rendimento de partículas virais foi mais elevado quando a expansão do HIV foi realizada em sistema alogênico em comparação ao sistema autólogo. Após estímulo para maturação, tanto MoDCs maduras quanto MoDCs HIV-AT-2 apresentaram aumento na expressão de moléculas de coestimulação, ativação e migração, comparado às MoDCs imaturas. Com relação à caracterização funcional, observamos que MoDCs foram capazes de fagocitar partículas de dextran-FITC, exibiram baixo potencial migratório e baixa produção de citocina polarizante para Th1. Ainda, observamos reduzida atividade citotóxica induzida tanto por MoDCs HIV-AT-2 quanto por MoDCs maduras. Por outro lado, MoDCs HIV-AT-2 promoveram proliferação de linfócitos T autólogos e maior polifuncionalidade em células TCD4+ e TCD8+ em comparação às MoDCs maduras. CONCLUSÃO: A produção de vírus autólogo através de sistema alogênico resulta em maior rendimento viral e potencial imunogênico. O produto vacinal composto por MoDCs HIV-AT-2 é capaz de induzir resposta polifuncional antígeno especifica in vitro / INTRODUCTION: Immunotherapy based on monocyte-derived dendritic cells (MDDCs) is a promising strategy for the treatment of HIV-infected individuals. Due their plasticity, using different combinations of cytokines cocktail in vitro it is possible to obtain a heterogeneous MDDCs population. Consequently the capacity of these cells to secrete cytokines and express molecules that participate in antigen presentation varies (MHC, adhesion and costimulatory molecules) and can interfere in the profile and efficacy of the immune response induced by this therapy. A clinical trial was conducted in our laboratory to evaluate a immunotherapy based on dendritic cells sensitized with autologous inactivated HIV for the treatment of antiretroviral naive chronically HIV-infected individuals. Therefore, it was a good opportunity to study deeply the virus production and expansion in vitro and to characterize MDDCs used as a vaccine. OBJECTIVE. To characterize MDDCs in context of their phenotype and function as well as investigating viral production and expansion in autologous and allogenic systems. METHODS: 17 patients underwent apheresis before vaccination and their peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were used for autologous virus production and expansion of the virus was carried out in both autologous and allogenic systems. Monocytes were differentiated into immature MDDCs that were pulsed/or not with autologous chemically (aldrithiol-2) inactivated HIV particles (HIV-AT-2). These pulsed (HIV-AT-2 MDDCs) and non-pulsed (mature MDDCs) cells were then activated by proinflammatory cytokines. Phenotypic (cell surface marker) and functional analysis (phagocytosis, transmigration and cytokines production) of MDDCs and their priming and stimulation of lymphocyte (proliferation, polyfunctionality and cytotoxicity) was performed using flow cytometry. RESULTS. Viral yield was higher when expanded in allogenic compared to autologous system. After stimulation with proinflammatory cytokines, both HIV-AT-2 MDDCs and mature MDDCs presented increased costimulation expression, activation and migratory molecules compared to immature MDDCs. Regarding to functional characterization, we observed that MDDCs were able to phagocytize FITC-Dextran and exhibitted a low migratory potential and low production of Th1 polarizing response cytokines. Moreover we observed reduced cytotoxic activity induced by HIV-AT-2 MDDCs and mature MDDCs. On the other hand we also observed that HIV-AT-2 MDDCs were capable of inducing proliferation and polyfunctionality of autologous CD4+ and CD8+ T-lymphocytes compared to mature MDDCs. CONCLUSION. Allogenic system was found to be more efficient in increased viral yield in relation to autologous system. Besides, virus expanded in allogenic system showed a more immunogenic profile. Vaccine product (HIV-AT-2 MDDCs) was able to induce antigen specific polyfunctional response

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-04-20T12:55:10Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Patrícia Correia de Siqueira - 2014.pdf: 1536081 bytes, checksum: 16162d6f2185a664f1f75daf7492fb8c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-04-20T12:58:41Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Patrícia Correia de Siqueira - 2014.pdf: 1536081 bytes, checksum: 16162d6f2185a664f1f75daf7492fb8c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-20T12:58:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Patrícia Correia de Siqueira - 2014.pdf: 1536081 bytes, checksum: 16162d6f2185a664f1f75daf7492fb8c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-02-03 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / The aim of this study was to evaluate and compare the cytotoxicity of two glass ionomer cements (GIC), a conventional (GC Gold Label 1 – GC Corporation) and a resin modified (Vitrebond – 3M ESPE), both indicated for lining, with and without addition of silver nanoparticles (NAg). The NAg were incorporated at the materials in two different concentrations by weight: 0.1% and 0.2%. Specimens with standardized dimensions (4 x 2 mm) were prepared, and for preparing liquid extracts of the cements, the specimens were immersed in 400 μL of culture medium and incubated at 37°C and 5% CO2 for 48 hours. The extracts obtained were incubated in contact with cells for 48 hours. As negative and positive controls were used respectively culture medium and solution of NAg at 0.78% by weight. To evaluate cellular viability, MTT and Trypan Blue assays were used. Data were subjected to statistical analysis with ANOVA and Tukey (α=0.05). Significant decrease in cell viability was observed in all groups of Vitrebond (p˂0.001) compared to negative control. There were no statistically significant differences between the groups of this cement with and without NAg (p˃0.05). For GC Gold Label 1, no statistically significant differences were observed in cell viability between any of the groups compared with the negative control (p>0.05). There was also no difference between the groups with and without NAg (p>0.05). The positive control showed significant reduction in cell viability (p˂0.001). It is concluded that the NAg did not influence on cytotoxicity of GICs evaluated. / O objetivo do presente trabalho foi avaliar e comparar a citotoxicidade de dois cimentos de ionômero de vidro (CIV) indicados para forramento, sendo um convencional (GC Gold Label 1 – GC Corporation) e um modificado por resina (Vitrebond – 3M ESPE), com e sem adição de nanopartículas de prata (NAg). As NAg foram incorporadas aos materiais durante sua manipulação em duas concentrações em massa: 0,1% e 0,2%. Espécimes com dimensões padronizadas (4 x 2 mm), com e sem NAg, foram confeccionados, e para o preparo de extratos líquidos dos cimentos, os espécimes foram imersos em 400 μL de meio de cultura e incubados em estufa a 37ºC e 5% de CO2 por 48 horas. Os extratos obtidos foram incubados em contato com as células por 48 horas em estufa. Como controles negativo e positivo foram usados, respectivamente, meio de cultura e solução de NAg a 0,78% em massa. Dois testes para realizar a avaliação da viabilidade celular foram utilizados: o ensaio colorimétrico do MTT e o ensaio de Azul de Tripano. Os dados obtidos foram tabulados e submetidos à análise estatística com ANOVA e Tukey (α=0,05). Foi observada redução significativa na viabilidade celular em todos os grupos do Vitrebond (p˂0,001), em comparação ao controle negativo. Não foram observadas diferenças estaticamente significantes entre os grupos desse cimento com NAg e o grupo sem NAg (p˃0,05). Para o GC Gold Label 1, não foram observadas diferenças estaticamente significantes da viabilidade celular entre os grupos experimentais em comparação ao controle negativo (p>0,05). Também não houve diferença significante entre os grupos com NAg e sem NAg (p>0,05). No controle positivo observou-se redução significante da viabilidade celular (p˂0,001). Pela metodologia empregada, concluiu-se que as NAg não influenciaram na citotoxicidade dos CIVs avaliados.

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa progressiva de evolução rápida, caracterizada pela perda seletiva dos neurônios motores (NM) superiores e inferiores. Recentemente, as células gliais centrais (astrócito, microglia e oligodendrócito) mostraram-se tóxicas aos NM, porém os detalhes moleculares não estão completamente elucidados. Em relação às células gliais periféricas, alterações eletrofisiológicas no nervo ciático do modelo animal da ELA na idade pré-sintomática foram reportadas pelo nosso grupo e os achados de denervação precoce tanto no modelo animal quanto em pacientes sugerem a participação das células de Schwann (CS) na morte neuronal retrógrada na ELA, teoria conhecida como dying back. Nesse contexto, as CS mostraram-se capazes de induzir a retração axonal e a denervação das junções neuromusculares, eventos precoces na doença, ocorrendo possivelmente na fase présintomática. O objetivo deste trabalho foi verificar a influência das CS do modelo experimental na fase pré-sintomática e do paciente com evolução recente da forma esporádica da ELA, na sobrevida e no tamanho dos prolongamentos dos NM in vitro e entender a natureza molecular do fenômeno. Culturas de CS altamente purificadas foram obtidas a partir do nervo ciático do camundongo modelo animal e do nervo periférico de pacientes com ELA. Os NM da medula espinal de camundongos neonatos foram co-cultivados com as CS. A neurodegeneração foi avaliada pela presença do marcador Fluoro-Jade C (FJC). Os NM também foram tratados com o meio condicionado das culturas de CS do modelo animal ou dos pacientes com ELA. Os motoneurônios tiveram os seus prolongamentos contados e a morte neuronal foi identificada pela presença do FJC. Diversos fatores neurotróficos foram quantificados no meio condicionado das culturas de CS pela técnica de ELISA. A reação em cadeia da polimerase quantitativa (do inglês, quantitative polymerase chain reaction - qPCR) foi realizada para detectar alterações nas CS e no nervo periférico que pudessem estar relacionadas com disfunção na unidade CS/NM. Os resultados mostraram que os NM cultivados na ausência das CS mostraram-se mais susceptíveis à morte. Os NM cocultivados com as CS ELA mostraram maior número de perfis neurodegenerativos em comparação com os NM co-cultivados com as CS controle. Após o tratamento com o meio condicionado das CS ELA, os NM mostraram redução no tamanho dos prolongamentos e aumento do número de células em neurodegeneração em comparação com o grupo controle. Quantidades reduzidas dos fatores neurotróficos foram encontradas no meio condicionado das culturas de CS ELA. Alterações na expressão gênica das CS e no nervo periférico evidenciaram disfunções na unidade CS/NM que podem estar contribuindo para o processo neurodegenerativo visto na ELA. Conclui-se que a falência nos mecanismos de neuroproteção pelas CS ELA é um importante mecanismo implicado na morte neuronal, com grande potencial terapêutico / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive neurodegenerative disease characterized by the selective loss of upper and lower motor neurons (MN). Recently, central glia (astrocytes, microglias and olygodendrocytes) were toxic to the MN, but the molecular aspects have not fully described. In relation to the peripheral glia, electrophysiological changes in the sciatic nerve of ALS animal model in the presymptomatic stage have been reported by our group and early denervation findings in both animal models and patients suggests the participation of Schwann cells (SC) in the retrograde neuronal death of ALS , theory known as dying back. In this context, the SC proved to be able to induce axonal retraction and denervation of the neuromuscular junctions, early events in the disease, possibly occurring in the pre-symptomatic phase. The aim of this thesis was to investigate the influence of SC of pre-symptomatic experimental model and from patient with recent evolution of ALS sporadic form, in the survival and axonal length of MN in vitro and understand the molecular nature of the phenomenon. Highly purified SC cultures were obtained from the sciatic nerve of the animal model and from ALS patient\'s peripheral nerve. MN from the newborn mouse spinal cord were co-cultured with SC and the neurodegeneration was assessed by the presence of the marker Fluoro-Jade C (FJC). MN were also treated with conditioned medium from cultures of SC of the animal model or ALS patients. MN had their neuronal length measured and neuronal degeneration was identified by the presence of the FJC. Several neurotrophic factors were measured in conditioned medium of mice and ALS patient\'s SC cultures by ELISA. The chain reaction quantitative polymerase (qPCR) was performed to detect changes in the SC and peripheral nerve that could be related with dysfunction in the functional unit SC/MN. The MN co-cultured with ALS SC showed a greater number of neurodegenerative profiles compared with MN cocultured with control SC. After treatment with ALS SC conditioned medium, MN showed a reduction in the neuronal length and increased number of cells in neurodegeneration compared with the control group. Lower levels of neurotrophic factors were found in the conditioned medium of ALS SC cultures. Changes in the gene expression of SC and peripheral nerve showed dysfunctions in SC/MN unit, which may be contributing to the neurodegenerative process seen in ALS. In conclusion, the failure of neuroprotection by ALS SC is an important mechanism implicated in the MN cell death, with great therapeutic potential

O objetivo deste trabalho foi comparar os efeitos de diferentes densidades de energia e irradiâncias do Laser de Baixa Intensidade (LBI), variando em função do tempo de irradiação e potência, na viabilidade e proliferação de fibroblastos derivados da polpa de dentes decíduos humanos (HPF). HPF foram cultivados em DMEM e usados entre a 4ª e 8ª passagem. Os grupos foram divididos de acordo com diferentes densidades de energia, variando: Tempo de irradiação - Grupo I Ia (1,2 J/cm2 - 5 mW - 10 s), Ib (2,5 J/cm2 - 5 mW - 20 s), Ic (3,7 J/cm2 - 5 mW - 30 s), Id (5,0 J/cm2 - 5 mW - 40 s), e Ie (6,2 J/cm2 - 5 mW - 50 s); ou potência - Grupo II IIa (1,2 J/cm2 - 5 mW - 10 s), IIb (2,5 J/cm2 - 10 mW - 10 s), IIc (3,7 J/cm2 - 15 mW - 10 s), IId (5,0 J/cm2 - 20 mW - 10 s), e IIe (6,2 J/cm2 - 25 mW - 10 s). Células não irradiadas - cultivadas em condições nutricionais regulares - 10% Soro Fetal Bovino (SFB) (If e IIf) e células não irradiadas - cultivadas em déficit nutricional - 1% SFB (Ig e IIg), foram consideradas controles positivos e negativos, respectivamente. A viabilidade e proliferação celular foram avaliadas, repesctivamente, pelas técnicas MTT e Cristal violeta (CV), nos períodos de 24, 48 e 72 horas após a irradiação. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística por ANOVA 2 critérios, seguido pelo teste de Tukey (P<0,05). No ensaio MTT, os controles negativos, Ig e IIg, apresentaram significativamente menor viabilidade em relação aos correspondentes grupos experimentais: IIa e IIb, 24 horas após a irradiação; Ia, Ib, Ie, If e IIf no período de 48 horas; e Ib-If, assim como, IIa-IIf após 72 horas. Nos diferentes períodos de avaliação do ensaio CV, todos os grupos, exceto Ie, IIe e If, exibiram significativamente maior proliferação em comparação aos respectivos controles negativos. Dentro de um mesmo grupo nos diferentes períodos, os grupos If e IIe apresentaram menor viabilidade durante o período de 24 horas em comparação ao período de 72 horas pelo ensaio MTT. Na avaliação intragrupos, o ensaio CV revelou menor proliferação no período de 24 horas em comparação aos períodos de 48 e 72 horas, independente do grupo avaliado. Os diferentes protocolos de irradiação, grupos I e II, não apresentaram diferença estatisticamente significativa na viabilidade e proliferação celular entre densidades de energia iguais com irradiâncias diferentes durante os períodos avaliados. De acordo com os resultados obtidos, as diferentes densidades de energia e irradiâncias propostas não prejudicaram a viabilidade e proliferação de fibroblastos pulpares de dentes decíduos humanos. A variação do protocolo de irradiação LBI, em função do tempo ou da potência, não interferiram nas respostas celulares após a aplicação da mesma densidade de energia com irradiâncias diferentes. / The aim of this study was to compare the effects of Low-level laser (LLL) with different energy densities and irradiances, varying according to the irradiation time and power, on cell viability and proliferation of pulp fibloblasts from human primary teeth (HPF). HPF were culture in DMEM and used between 4th and 8th passages. Groups were divided according to different energy densities, varying: Time of irradiation Ia (1.2 J/cm2 - 5 mW - 10 s), Ib (2.5 J/cm2 - 5 mW - 20 s), Ic (3.7 J/cm2 - 5 mW - 30 s), Id (5.0 J/cm2 - 5 mW - 40 s), and Ie (6.2 J/cm2 - 5 mW - 50 s); or output power - Grupo II IIa (1.2 J/cm2 - 5 mW - 10 s), IIb (2.5 J/cm2 - 10 mW - 10 s), IIc (3.7 J/cm2 - 15 mW - 10 s), IId (5.0 J/cm2 - 20 mW - 10 s), e IIe (6.2 J/cm2 - 25 mW - 10 s). Non-irradiated cells - grown in regular nutritional conditions - 10% Fetal Bovine Serum (FSB) (If and IIf) and non-irradiated cells - grown in nutritional deficit - 1% FBS (Ig and IIg) were considered positive and negative controls, respectively. Cell viability and proliferation were respectively assessed through MTT and Crystal violet (CV) assays at 24, 48 and 72h after irradiation. Data were submitted to statistical analysis by ANOVA 2 criteria, followed by Tukey test (P<0.05). In the MTT assay, the negative controls, Ig and IIg, showed significantly lower viability in relation to the corresponding groups: IIa and IIb 24 hours after irradiation; Ia, Ib, Ie, If and IIf at 48 hours period; and Ib-If, as IIa-IIf, after 72 hours. At different periods of evaluation of CV assay, all groups, except Ie, IIe and If, exhibited significantly higher proliferation compared to the respective negative controls. Within the same group at different periods, groups If and IIe showed lower viability during 24 hours compared to 72 hours period by MTT assay. In the intragroup evaluation, CV assay revealed lower proliferation at 24 hours compared to 48 and 72 hours periods, regardless of the evaluated group. Different irradiation protocols, groups I and II, showed no statistically significant differences on cell viability and proliferation among equals energy densities with different irradiances at the evaluated periods. According to these findings, different LLL energy densities and irradiances proposed did not impair viability and proliferation of pulp fibloblasts from human primary teeth. The variation of the LLL irradiation protocol, by the time or power, did not interfere in cellular responses after the application of the same energy density with different irradiances.

A via AKT/PI3K apresenta-se geralmente alterada nos diversos tipos de cânceres humanos e a alteração dos componentes desta via ocorre através da ativação de oncogenes ou inativação de genes supressores tumorais levando a transformações celulares que podem promover a tumorigênese. No câncer de mama a via AKT/PI3K pode ser ativada por Erb-B2, receptores dos fatores de crescimento de insulina (IGF), receptores de estrógeno e perda da expressão do gene PTEN. mTOR (proteína alvo da rapamicina em mamíferos) é uma serina treonina quinase, membro da via AKT/PI3K que se encontra envolvida em múltiplas funções biológicas como controle da tradução, transcrição, degradação protéica e biogênese ribossomal. A ativação desta proteína resulta na fosforilação e ativação de seus principais substratos 4EBP1 e S6K1, requeridos para a biossíntese ribossomal e tradução de RNAms importantes para controle e progressão no ciclo celular. A rapamicina é uma droga com propriedades fungicidas, imunossupressoras e anticancerígenas que atua na inibição de mTOR afetando a expressão de genes envolvidos no metabolismo e síntese protéica. No nosso estudo avaliamos os elementos da via do AKT através de análise imunoistoquímica em fatias de tumores mantidos em cultura de órgão antes e depois do tratamento com rapamicina. A cultura de órgão mantém uma interação entre o epitélio mamário e estroma podendo-se preservar o microambiente que reconstitui o comportamento da célula tumoral. Nesta análise imunoistoquímica observamos uma diminuição significativa de 4EBP1 nas fatias dos tumores tratados com rapamicina em relação aos casos controles. Além disso, fizemos uma avaliação da mudança no perfil da expressão gênica nestas fatias tumorais sub-divididas em Erb-B2 positivos e negativos através da análise por microarray e observamos que a maioria dos genes afetados estavam envolvidos com as funções de transcrição e tradução celulares. Para confirmarmos os resultados obtidos por microarray fizemos uma análise por RT-PCR dos genes WWOX, EXT1 e GTF2E2 em amostras independentes e escolhidos aleatoriamente, conseguindo validá-los em 60% dos casos. Conclusão: A cultura de órgão representa um método simples para determinação dos efeitos da rapamicina. Utilizamos uma estratégia de análise do perfil gênico e novas proteínas que poderiam servir como possíveis marcadores de resposta aos inibidores da proteína mTOR foram identificadas / The AKT/ PI3K pathway are frequently disturbed in many human cancers and the alteration of the components of this pathway occurs through activation of oncogenes or inactivation of tumor suppresors leading to cellular transformation that can promove tumorigenesis. In breast cancer the AKT/PI3K pathway can be activated by ERb-B2, the insulin like growth factor (IGF), estrogen receptors and PTEN loss. mTOR (mammalian target of rapamycin) is a serine threonine kinase, member of the AKT/PI3K pathway, which is involved in multiple biologic functions such as transcription, translation, protein degradation and ribosome biogenesis. The activation of this protein results in phosphorilation and activation of S6K1 and 4EBP1, two downstream signaling elements that are required for ribosomal biosynthesis and mRNAs translation, which is important for cell cycle control and progression. Rapamycin is a potent fungicide, immunossupressive and anticancer agent that inhibits mTOR affecting the expression of genes involved in metabolism and protein synthesis. In the present study we examined some elements of AKT pathway by immunohistochemistry analysis in samples of breast cancer mantained in organ culture before and after treatment with rapamycin. The organ culture maintain an interaction between the mammary epithelium and stroma preserving the micro-environment and restoring the tumor cell behavior. In this immunohistochemistry analysis we noticed a significative decrease of 4EBP1 in the samples of tumors treated with rapamycin compared with the control cases. Besides this, we determined the variation of gene expression profile through microarray analysis in these samples subdivided in positive and negative Erb-B2 and we have identified that most part of the affected genes were mainly involved in cellular transcription and translation.To confirm the results obtained through microarray technique, we have performed the RT-PCR analysis of WWOX, EXT1, GTF2E2 genes and we were able to validate them in 60% of our cases. Conclusion: The organ culture represents a simple method to determine the effects of rapamycin. Using a strategic analysis of the gene profile, news proteins that possibly could be used as markers to the mTOR inhibitors were identifyied

Orientador: Fernanda Miori Pascon / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-26T01:46:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Joaquim_NataliaMartins_M.pdf: 1245977 bytes, checksum: c5a3811c7ba1d723505963537d831210 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Endodontia em dentes decíduos é um procedimento de suma importância para manter a integridade e saúde dos dentes e tecidos de suporte. Sendo assim, o uso de materiais obturadores de canais radiculares que apresente o máximo de propriedades desejáveis é indispensável. O objetivo do presente estudo foi analisar a citotoxicidade de diferentes materiais obturadores em fibroblastos do ligamento periodontal humano (PDL) e em células osteoblásticas de osteossarcoma humano (Saos-2). Os fibroblastos foram cultivados em meio de cultura (meio Eagle modificado por Dulbeco - DMEM) suplementado com 1% soro fetal bovino (FBS) e antibióticos. Os osteoblastos foram cultivados em meio de cultura McCoy¿s suplementado com 15% FBS e antibióticos. Próximos de atingir a confluência, as células foram plaqueadas na concentração de 7x103 células por poço e foram expostas aos seguintes materiais, conforme os grupos: G1- Meio de cultura sem material obturador (controle negativo), G2- Dimetiilsulfóxido (DMSO) (controle positivo), G3- Calen®, G4- Calen® associada ao Óxido de Zinco, G5- Calen® associada ao Iodofórmio, G6- Óxido de zinco e eugenol (OZE), G7- Vitapex® e G8- UltraCal®XS. A manipulação dos materiais foi realizada em condições assépticas. A citotoxicidade dos materiais obturadores foi analisada em intervalos de tempos (8, 24 e 48 horas) pelo método de redução MTS e classificado como não citotóxico, citotoxicidade leve, moderada e grave. O grupo controle negativo foi composto apenas por células, sem o uso de material obturador. A análise morfológica das células foi realizada por meio da microscopia de fluorescência. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância dois fatores e ao teste Tukey para comparação entre os grupos, com nível de significância 5%. As imagens obtidas por meio da microscopia de fluorescência foram analisadas de forma descritiva. Os resultados mostraram que para os fibroblastos, Calen®(85,91±10,01), Calen® associada ao Óxido de Zinco (85,91±8,16) e Calen® associada ao Iodofórmio (83,96±13,95) diferiram do controle negativo (100±0) e positivo (19.72±5,70) após 8 horas de exposição. Para os osteoblastos, Calen® associada ao Óxido de Zinco (75,87±19,16), Calen® associada ao Iodofórmio (75,5±12,40) e o OZE (68,71±22,19) foram os únicos grupos que em 8 horas diferiram do controle negativo (100±0) e positivo (22,18±6,77). Pode-se concluir que todos os materiais avaliados, para fibroblastos do ligamento periodontal humano, não foram citotóxicos ao longo do tempo. No entanto, Calen® associada ao Iodofórmio apresentou toxicidade leve em 48 horas para os osteoblastos. Vitapex® foi o material que apresentou menor toxicidade celular nos osteoblastos em 8 e 48 horas, comparando-se os outros materiais avaliados. Calen® associado ao Óxido de zinco, Calen® associado ao Iodofórmio e OZE foram capazes de modificar a morfologia dos fibroblastos, mas para os osteoblastos não foram observadas alterações morfológicas / Abstract: Endodontics in primary teeth is an important procedure to maintain the integrity and health of the teeth and supporting tissues. Using a root canal filling material that shows desirable properties is indispensable. The aim of the present study was to evaluate the root filling materials cytotoxicity on periodontal ligament fibroblasts (PDL) and osteoblastic human osteosarcoma cells (Saos-2). Fibroblasts were cultured in culture medium (Dulbeco modified Eagle medium - DMEM) supplemented with 1% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics. The osteoblasts were cultured in McCoy's culture medium supplemented with 15% FBS and antibiotics. Next to reach confluence, the cells were plated at a concentration of 7x103 cells per well and were exposed to materials, according to the groups: G1 - culture medium without filling material (negative control); G2- Dimethyl sulfoxide (DMSO) (positive control); G3 ¿ Calen®; G4 - Calen® associated with Zinc Oxide; G5 - Calen® associated with Iodoform; G6 ¿ Zinc Oxide and eugenol (ZOE); G7 - Vitapex®; G8 - UltraCal® XS. The materials were prepared under aseptic conditions. Cytotoxicity was evaluated by cell viability at time intervals (8, 24 and 48 h) by MTS assay and rated as non-cytotoxic, mild, moderate and severe cytotoxicity. The negative control group was composed only of cells without the use of filling material. Cells morphological were observed by fluorescence microscopy. Data were submitted to two-way analysis of variance with post-hoc comparisons base on Tukey's multiple comparisons, with the significance level fixed at 5%. The images obtained at fluorescence microscopy were evaluated using descriptive analysis. The results showed that for fibroblasts, Calen®(85.91±10.01), Calen® associated with Zinc Oxide (85.91±8.16) e Calen® associated with Iodoform (83.96±13.95) was differ from the negative control (100±0) and positive (19.72±5.70), at 8 h. For osteoblasts, Calen® associated with Zinc Oxide (75.87±19.16), Calen® associated with Iodoform (75.5±12.40) and ZOE (68.71±22.19) differed from negative control (100±0) and positive (22.18±6.77) in 8 h. It can be concluded that all materials were non- cytotoxic to human fibroblasts cells over time. However, Calen® + Iodoform showed higher cytotoxicity to osteoblasts at 48 h. Vitapex® was the material that showed the less cell cytotoxicity in osteoblasts at 8 and 48 h, compared to the other materials tested. Calen® associated with Zinc Oxide, Calen® associated with Iodoform and ZOE was able to modify the morphology of fibroblasts, but osteoblasts but no morphologic alterations were observed / Mestrado / Odontopediatria / Mestra em Odontologia