Submitted by RICARDO UTSUNOMIA (utricardo@ibb.unesp.br) on 2016-09-21T19:55:11Z No. of bitstreams: 1 Tese Ricardo Utsunomia.pdf: 3423315 bytes, checksum: 526ac1e1d49d5b6df6ec0602e8c6f842 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-09-22T16:36:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 utsunomia_r_dr_bot.pdf: 3423315 bytes, checksum: 526ac1e1d49d5b6df6ec0602e8c6f842 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-22T16:36:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 utsunomia_r_dr_bot.pdf: 3423315 bytes, checksum: 526ac1e1d49d5b6df6ec0602e8c6f842 (MD5) Previous issue date: 2016-02-19 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / No presente estudo, duas populações da espécie de peixe Moenkhausia sanctaefilomenae, uma coletada no rio Batalha, Bauru-SP (bacia do rio Tietê) e outra coletada no rio Novo, Ocauçu-SP (bacia do rio Paranapanema), foram analisadas através de técnicas citogenéticas básicas e moleculares. Além disso, o sequenciamento na plataforma Illumina HiSeq2000 de ambos os genomas e de uma variante do cromossomo B microdissecado também foram realizados. Os resultados obtidos revelaram que todos os indivíduos da população do rio Batalha apresentam de 0 a 6 cromossomos B por célula, enquanto os indivíduos da população do rio Novo não mostram elementos supranumerários. Deve-se destacar que os cromossomos B encontrados nos indivíduos do rio Batalha podem ser divididos em 2 variantes, sendo uma eucromática (B1) e altamente frequente na população, e outra heterocromática (B2) e com uma baixa prevalência. A hibridação in situ fluorescente (FISH) de DNAs repetitivos evidenciou que ambas as variantes apresentam clusters de DNAr 18S, histona H3 e satDNAs MS3 e MS7, com diferenças apenas na abundância do DNAr 18S. A análise das sequências presentes nos cromossomos B revelam que a variante B1 é mais antiga que a variante B2, embora ambas pareçam ter derivado de um mesmo cromossomo. Além disso, a seleção parece estar relaxada em ambas as variantes para o gene de histona H3. Para um melhor conhecimento do conteúdo genômico do cromossomo B, uma biblioteca microdissecada da variante B1 foi sequenciada e os dados obtidos revelam um intenso acúmulo de elementos transponíveis neste cromossomo supranumerário, além de possíveis genes de cópia única, que estão presentes em diferentes grupos de ligação no genoma de Astyanax mexicanus. Estes resultados serão utilizados como base para estudos evolutivos e funcionais deste sistema de cromossomo B. A integralização de abordagens cromossômicas e moleculares foi utilizada na tentativa de melhor compreender questões relacionadas à biologia evolutiva de cromossomos supranumerários em peixes Neotropicais. / In the present study, two populations of the fish species Moenkhausia sanctaefilomenae, one collected at the Batalha river, Bauru-SP (Tietê river basin) and the other collected at the Novo river, Ocauçu-SP (Paranapanema river basin), were analyzed through classical and molecular cytogenetic techniques. Besides, Illumina HiSeq2000 sequencing was performed for both genomes and for one microdissected B-variant. Results obtained revealed that all the individuals from the Batalha river show from 0 to 6 B chromosomes per cell, while the specimens from Novo river did not show any supernumerary chromosomes. One must note that the B chromosomes found in the Batalha river might be classified into 2 variants, one euchromatic (B1) and present in all the population, and another heterochromatic (B2) with lower prevalence. Fluorescence in situ hybridization (FISH) using repetitive DNA probes revealed that both B-types showed 18S rDNA, H3 histone and MS3 and MS7 satDNAs. Interestingly, the only between-variant difference was the abundance of 18S rDNA. Sequence analysis revealed that the B1 variant is older than B2, although both variants seem to be derived from the same autosomal pair. Notably, selection seems to be relaxed for H3.3 histone genes located on the B chromosomes. For a better knowledge about the genomic content of B chromosomes, a microdissected library of B1 variant was sequenced and data obtained revealed an intense accumulation of transposable elements in this supernumerary, in addition to single copy genes, that are present in different linkage groups of Astyanax mexicanus genome. These results will be used for future evolutionary and functional studies about B chromosomes. The combined approach of chromosomal and molecular methods was used to better understand evolutionary issues of supernumerary chromosomes in Neotropical fish. / FAPESP: 2013/00953-8

Orientador: Fausto Foresti / Resumo: No presente estudo, duas populações da espécie de peixe Moenkhausia sanctaefilomenae, uma coletada no rio Batalha, Bauru-SP (bacia do rio Tietê) e outra coletada no rio Novo, Ocauçu-SP (bacia do rio Paranapanema), foram analisadas através de técnicas citogenéticas básicas e moleculares. Além disso, o sequenciamento na plataforma Illumina HiSeq2000 de ambos os genomas e de uma variante do cromossomo B microdissecado também foram realizados. Os resultados obtidos revelaram que todos os indivíduos da população do rio Batalha apresentam de 0 a 6 cromossomos B por célula, enquanto os indivíduos da população do rio Novo não mostram elementos supranumerários. Deve-se destacar que os cromossomos B encontrados nos indivíduos do rio Batalha podem ser divididos em 2 variantes, sendo uma eucromática (B1) e altamente frequente na população, e outra heterocromática (B2) e com uma baixa prevalência. A hibridação in situ fluorescente (FISH) de DNAs repetitivos evidenciou que ambas as variantes apresentam clusters de DNAr 18S, histona H3 e satDNAs MS3 e MS7, com diferenças apenas na abundância do DNAr 18S. A análise das sequências presentes nos cromossomos B revelam que a variante B1 é mais antiga que a variante B2, embora ambas pareçam ter derivado de um mesmo cromossomo. Além disso, a seleção parece estar relaxada em ambas as variantes para o gene de histona H3. Para um melhor conhecimento do conteúdo genômico do cromossomo B, uma biblioteca microdissecada da variante B1 foi sequenciada e o... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5293_1.pdf: 1975066 bytes, checksum: ad92cf6b4cc6656b99745a7ba874fe4e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / A subfamília Aurantoideae (Rutaceae) está representada por cerca de 200 espécies, destacando-se àquelas pertencentes ao gênero Citrus, pela sua importância econômica. Do ponto de vista citogenético, o padrão de bandas heterocromáticas de Citrus e gêneros relacionados é o parâmetro mais importante para comparação entre espécies, por ser bastante variável. Embora essas bandas sejam ricas em GC, o que é demonstrado pela coloração com cromomicina A3 (CMA), a natureza dessas bandas ainda é desconhecida. Neste trabalho foi realizada uma análise comparada da distribuição das bandas CMA, dos sítios de DNAr 5S e 45S e de uma seqüência satélite isolada de Citrus sinensis nos cromossomos de representantes de alguns gêneros, através da hibridização in situ fluorescente (FISH), visando compreender a evolução da heterocromatina dentro da subfamília. Os resultados mostraram que os sítios de DNAr 5S ocorrem quase sempre muito proximamente ligados aos sítios de DNAr 45S, sugerindo que a conservação dessa ligação foi mantida por pressão de seleção. Um aspecto importante dessa associação é que a posição cromossômica dos sítios de DNAr 5S e 45S variou entre as espécies sem alterar a orientação cromossômica destes, indicando a ocorrência de diversos rearranjos cromossômicos. Por outro lado, o DNA satélite rico em GC isolado de C. sinensis, hibridizou na maioria dos blocos heterocromáticos das três espécies investigadas de Citrus, em Fortunella obovata e em Poncirus trifoliata, sugerindo que essa seqüência seja um dos principais componentes das bandas CMA observadas em Citrus e gêneros próximos. Contudo, essa seqüência não hibridizou em Murraya paniculata, uma espécie mais afastada de Citrus, mas com padrão de bandas heterocromáticas similar a este. Portanto, seqüências satélites diferentes podem ter sido amplificadas em grupos distintos de espécies de Aurantioideae, gerando padrões de bandas similares. Esses dados indicam que padrões de bandas similares não indicam necessariamente homeologia cromossômica

Orientador: Fausto Foresti / Resumo: Um dos tipos mais abundantes de DNA repetitivo, o DNA satélite, apresenta importantes aspectos estruturais e evolutivos, como o acúmulo diferencial entre espécies próximas e taxas de evolução molecular variadas. O satelitoma, identificado como o conjunto total de DNAs satélites (satDNA) de determinado organismo, permite uma investigação mais aprofundada em abundância e riqueza desses elementos repetitivos entre espécies, mas ainda é de conhecimento restrito entre espécies de peixes. Mapeamentos prévios de DNA repetitivo no gênero Gymnotus evidenciaram uma ampla diversificação na distribuição dessas sequências no genoma do grupo, todavia é restrita a porção de DNA repetitivo reportado pela limitação de metodologias passadas. Dessa forma, a associação recente de plataformas de Sequenciamento de Próxima Geração (NGS) com análises de bioinformática proporcionam um acesso mais refinado ao genoma, permitindo a anotação de um maior número de elementos repetitivos nos componentes desse grupo. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar a evolução do DNA satélite e a distribuição física de famílias de satDNAs em espécies de peixe elétrico do gênero Gymnotus, a partir da construção do satelitoma dos grupos. Os genomas das espécies dos principais clados de Gymnotus foram acessados e a metodologia de filtragem pela plataforma RepeatExplorer e satMiner permitiu a identificação do satelitoma em cada um dos grupos abordados, caracterizando massivamente as famílias de satDNAs dentro ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: One of the most relevant types of repetitive DNA, the satellite DNA, has important structural and evolutionary aspects, such as differential accumulation between close species and diverse molecular evolution rates. The satellitome, identified as the total set of satellite DNAs (satDNA) of a given organism, allows further investigation into the abundance and richness of these elements between species, but is still of limited knowledge among fish species. Previous studies of repetitive DNA mapping in the Gymnotidae fish family showed a wide diversification in the distribution of these sequences in the genome of the group. Since past methodologies have been limited in reporting this portion of repetitive DNA, there is still too much to know regarding these elements. Notably, the recent association of Next Generation Sequencing (NGS) platforms with bioinformatics analysis provides a more refined access to the genome, allowing annotation of a greater number of repetitive elements. Thus, the aim of the present study was to investigate the evolution of satellite DNA and the physical distribution of satDNA families in Gymnotus, through the construction of the satellitome of the groups. The genomes of the species from the main Gymnotus clades were accessed and the RepeatExplorer filtering methodology allowed the identification of the satellitome in each of the groups analyzed, massively characterizing the families of satDNAs within each species complex in Gymnotus, highlighting the pr... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Nos bancos de dados de T. cruzi há cerca de 3.750 ESTs de amastigotas e tripomastigotas, seqüenciadas a partir das extremidades 5\' ou 3\' de clones de cDNA. A metodologia ORESTES (Open Reading Frame Expressed Sequence Tags) possibilita obter seqüências transcritas parciais derivadas majoritariamente da porção central dos mRNAs, favorecendo a descoberta de novos genes. Neste trabalho, caracterizamos ORESTES de formas infectantes amastigotas e tripomastigotas da cepa humana VL10 (ATVL). A metodologia foi padronizada com formas epimastigotas da cepa CL Brener (ECL), monitorando-se nas preparações de mRNA a contaminação por DNA e a integridade dos transcritos. Populações de cDNA foram obtidas utilizando-se diferentes iniciadores aleatórios. O mesmo iniciador foi empregado nas etapas de RT e PCR, realizada em condições de baixa estringência. Obtivemos 776 e 1522 ORESTES de ECL e ATVL, respectivamente. Após análise com o programa PHRED, aceitaram-se 745 ORESTES de ECL e 1476 de ATVL. As ORESTES apresentaram um tamanho médio de 680 pb e um conteúdo de G+C de 53%. O agrupamento com CAP3 gerou 463 agrupamentos de ECL (360 singletons e 103 contigs) e 454 de ATVL (337 singletons e 117 contigs). A anotação foi feita utilizando-se o programa BLAST contra o banco nr do NCBI. Na biblioteca de ATVL observamos um número elevado de seqüências de RNA ribossômico (27%), amplificadas preferencialmente por dois iniciadores. Para ECL, a contaminação por rRNA foi de 3,6%. Para cerca de 50% das ORESTES de ATVL (n= 729) foi encontrada similaridade em bancos de dados de proteínas. Destas, 316 apresentaram similaridade com proteínas putativas conhecidas e 413 foram anotadas como proteínas hipotéticas e hipotéticas conservadas. Para 87 ORESTES de ATVL (5,9%) não foi observada nenhuma similaridade. 628 ORESTES de ECL (84%) apresentaram similaridade com proteínas depositadas em bancos públicos, ao passo que nenhuma similaridade foi encontrada para 18 cDNAs (2,4%). Ensaios de Southern blot confirmaram a presença de 4 ORESTES no match analisadas nos genomas das duas cepas. Não puderam ser atribuídas a processos biológicos conhecidos 39% e 68% das seqüências dos contigs de ECL e ATVL, respectivamente. Nos processos de Proteólise e Peptidólise, estão incluídas 11% das ORESTES de ECL e 0,3% das ORESTES de ATVL. Outras diferenças funcionais putativas foram observadas. A abundância diferencial dos transcritos de algumas ORESTES foi analisada por northern blot nos estágios evolutivos das cepas. Southern blot do contig ATVL95 originou um padrão de hibridização com múltiplas bandas, característico de seqüências repetitivas. Este contig corresponde ao transcrito do DNA satélite de 195 pb (195 SAT), uma seqüência repetitiva que perfaz cerca de 10% do genoma de T. cruzi e cuja transcrição é controversa na literatura. A transcrição do 195 SAT foi comprovada por experimentos de + northern blot e por RT-PCR. Transcritos de 195 SAT foram detectados nas frações de RNA de poliA+ e poliA-. Esses transcritos não conteriam a seqüência SL, presente nos mRNAs de tripanossomatídios. e poliA Utilizando oligonucleotídios complementares às duas fitas de 195 SAT concluímos que ambas são transcritas. Embora esteja claro que 195 SAT é transcrito, sua função biológica permanece desconhecida. / In T. cruzi databases, aproximately 3.750 ESTs of amastigotes and trypomastigotes, sequenced from the 3´ or 5´ ends cDNA clones can be found in T. cruzi databases. The ORESTES (Open Reading Frame Expressed Sequence Tags) methodology generates partial transcribed sequences derived mainly from the central portions of mRNAs, favoring the discovery of new genes. In this work, we have characterized ORESTES sequences from the infective amastigote and trypomastigote forms of the human strain VL10 (ATVL). The methodology was standardized with epimastigotes of the CL Brener strain (ECL), monitoring in the mRNA population DNA contamination and the integrity of the transcripts. cDNA populations were obtained using different arbitrarily selected, nondegenerate primers. The same primer was used in the RT and PCR steps, performed under low-stringency conditions. We obtained 776 and 1522 ORESTES of ECL and ATVL, respectively. After analysis with PHRED program, 745 ORESTES of ECL and 1476 of ATVL were accepted for further characterization. ORESTES showed a medium size of 680 bp and a G+C content of 53%. Clustering with CAP3 generated 463 unique sequences of ECL (360 singletons and 103 contigs) and 454 of ATVL (337 singletons and 117 contigs). The annotation was made with BLAST program against the NCBI nr database. In the ATVL library we observed an elevated number of ribosomal RNA sequences (27%), amplified mainly by two primers. In the ECL library, rRNA contamination was about 3.6%. Approximately 50% of the ATVL sequences (n= 729) were found in protein databases. From these, 316 showed similarity with putative known proteins and 413 were annotated as hypothetical proteins and hypothetical conserved proteins. No hit was observed for 87 ORESTES of ATVL (5.9%). 628 ORESTES of ECL (84%) showed similarity with proteins in public databases, while for 18 cDNAs (2.4%) no similarity was found. Southern blot assays confirmed the presence of four no match analyzed ORESTES in the genomes of the two strains. No known biological process could be assigned to 39% and 68% of the sequences of ECL and ATVL contigs, respectively. In Proteolysis and Peptidolysis processes 11% and 0.3% of ECL and ATVL ORESTES were allocated, respectively. Additional putative functional differences were observed. The differential abundance of transcripts of some ORESTES was analyzed by northern blot assays in the developmental stages of the strains. Southern blot of the contig ATVL95 originated a hybridization pattern with multiple bands, characteristic of repetitive sequences. This contig corresponds to the transcript of the 195 bp satellite DNA (195 SAT), a repetitive sequence that accounts for 10% of the T. cruzi genome and whose transcription is controversial in the literature. The transcription of the 195 SAT was evidenced by northern blot and RT-PCR experiments. Transcripts of 195 SAT were detected in polyA+ and poly- RNA fractions. These transcripts apparently do not contain the SL sequence, present in trypanosomatid mRNAs. By using oligonucleotides complementary to the two strands of 195 SAT, we concluded that both strands are transcribed. Although it is clear that 195 SAT is transcribed, its biological function remains unknown.

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Helena Pistune.pdf: 2191433 bytes, checksum: d64e158aacb1b4070276bdafd47d03ce (MD5) Previous issue date: 2010-03-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The origin, maintenance and frequency of B chromosomes present in some population of Astyanax have been arousing interest of cytogeneticists groups about a possible beneficial or deleterious effect for the species. These chromosomes generally shows intra and interindividual numerical variation. The aim of this work was to perform a cytogenetical analysis on the origin and molecular differentiation of the B chromosomes of Astyanax scabripinnis from “Das Pedras” stream, Campos do Jordão, SP. The analysis showed a diploid number of 50 chromosomes, karyotypic formula 6m, 22sm, 10st and 12a, besides the intra and interindividual variation of a B macrochromosome. The heterochromatic B macrochromosome shows shape and size similar to the major pair of the A complement (1st metacentric pair). In spermatogonial metaphase was possible to observe three great metacentric chromosomes in cells with 2n=51 chromosomes. However, was observed in pachitene cells with 26 chromosomical elements only one great bivalent, showing that the B chromosome performs arm-to-arm pairing. In situ localization with a B chromosome probe showed this element entirely marked, in addittion to small pericentromerics and terminal sites in the A chromosomes complement, among them, the 24th pair. Besides, the As51 probe showed localization in the major part of the B chromosome, and also 14 autossomical sites. Between the As51 sites there is an interstitial marking in the long arm of the 24th acrocentric pair. On the other hand, the localization of the repetitive sequences Cot-1 DNA, obtained from individuals without B chromosome, showed signals on the pericentromeric and terminal regions of almost all chromosomes, including the B chromosome and the 24th pair. No rDNA site was observed on B chromosome. This data corroborate the hypothesis of the origin of B chromosome through the formation of an isochromosome of the 24th acrocentric pair. Even, the cytogenetical analysis in meiotic cells shows that the B chromosome performs arm-to-arm pairing, a mechanism that can contribute to the transposition of sequences, rising thus the molecular differentiation of the B chromosome in relation to the A complement. Therefore, this work contributes to a better comprehension of the molecular nature of the B chromosome in A. scabripinnis, as well as its origin and evolutionary trends. / A origem, manutenção e frequência dos cromossomos B presentes em algumas populações de Astyanax têm despertado interesse de grupos de citogeneticistas sobre um possível efeito benéfico ou deletério para a espécie. Estes cromossomos geralmente apresentam variações numéricas intra e interindividuais. O objetivo deste trabalho foi realizar uma análise citogenética da origem e diversificação molecular do cromossomo B de Astyanax scabripinnis, proveniente do córrego das Pedras, Campos do Jordão-SP. As análises mostraram um número diplóide de 50 cromossomos, fórmula cariotípica: 6m, 22sm, 10st e 12a, além da variação intra e interindividual de um macrocromossomo B. O macrocromosomo B heterocromático tem forma e tamanho similar ao maior par do complemento A (1o par metacêntrico). Em metáfase espermatogonial foi possível observar três metacêntricos grandes em células com 2n=51 cromossomos. Já em paquíteno com 26 elementos cromossômicos foi observado apenas um bivalente grande, evidenciando que o cromossomo B realiza pareamento braço a braço. A localização in situ da sonda cromossomo B evidenciou este elemento totalmente marcado, além de pequenos sítios pericentroméricos e terminais nos cromossomos do complemento A, entre eles o par 24. Já a sonda As51 mostrou localização na maior parte do cromossomo B, além de 14 sítios autossômicos. Entre os sítios As51 está uma marcação intersticial do braço longo do par acrocêntrico 24. Por sua vez, a localização das sequências repetitivas Cot-1 DNA, obtidas de exemplares sem cromossomo B, mostraram sinais nas regiões pericentroméricas e terminais de quase todos os cromossomos, incluindo o cromossomo B e o par 24. Nenhum sítio de rDNA foi observado no cromossomo B. Esses dados corroboram a hipótese da origem do cromossomo B a partir da formação de isocromossomo do par acrocêntrico 24. Ainda, a análise citogenética em meiose evidencia que o cromossomo B realiza pareamento braço a braço, mecanismo que pode contribuir para a transposição de sequências, auxiliando assim a diversificação molecular do cromossomo B em relação ao complemento A. Dessa forma, este trabalho contribui para uma melhor compreensão da natureza molecular do cromossomo B em A. scabripinnis, bem como de sua origem e suas tendências evolutivas.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-28Bitstream added on 2015-04-09T12:47:33Z : No. of bitstreams: 1 000813716.pdf: 1267239 bytes, checksum: b9d0dbcd86ebbf022255e43380560c6c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As espécies da subordem Heteroptera possuem cromossomos holocinéticos, variação do número cromossômico, meiose invertida e aquiasmática nos cromossomos sexuais e acúmulo de heterocromatina predominantemente nas extremidades cromossômicas. Das 30 espécies analisadas das infraordens Pentatomomorpha e Cimicomorpha, foram observadas variações nos números cromossômicos e cariótipos assimétricos, sobretudo em Reduviidae. O bandamento C-CMA3/DAPI também mostrou que há variabilidade na distribuição de bandas heterocromáticas entre autossomos e alossomos, contudo, a localização da heterocromatina predominou nos terminais cromossômicos. Os sítios de DNAr 18S foram localizados principalmente nas regiões terminais, com tendência à distribuição entre os autossomos nos Pentatomomorpha, enquanto que nas espécies de Cimicomorpha houve uma maior variação entre autossomos e alossomos. Para um estudo mais aprofundado sobre a origem e a organização de famílias de DNA repetitivo, foi escolhida Triatoma infestans como modelo. Este estudo mostrou as duas sequências de DNA satélite ricas em AT que predominam nas regiões terminais dos cromossomos, são compostas por motivos curtos com 79 bp e 33 bp de comprimento, que foram originadas possivelmente de elementos transponíveis gigantes conhecidos como Polintons. As comparações citogenéticas de todas as amostras estudadas neste trabalho mostraram algumas tendências, tais como a predominância do sistema sexual XY/XX, a localização preferencial da heterocromatina e dos sítios de DNAr 18S nas regiões terminais dos cromossomos e a ocorrência de cromossomos holocinéticos. Contudo, as variações na organização e assimetria dos cariótipos observadas de cada grupo mostram uma relativa dinâmica nos genomas desses heterópteros / The species of the suborder Heteroptera have holokinetic chromosomes, variation in chromosome number, inverted/achiasmatic meiosis in the sex chromosomes and accumulation of heterochromatin predominantly in chromosome ends. In the 30 species analyzed of the infraorders Pentatomomorpha and Cimicomorpha, variations in chromosome numbers and asymmetrical karyotypes were observed, especially in Reduviidae. The C-CMA3/DAPI banding also showed that there is variability in the distribution of heterochromatic bands between autosomes and alossomos, however, the predominant location of heterochromatin were in the chromosome terminals. The 18S rDNA sites were located mainly in the terminal regions, with a tendency to distributed among the autosomes in Pentatomomorpha, whereas in species Cimicomorpha there was greater variation between autosomes and alossomos. To a more detailed study of the origin and organization of families of repetitive DNA, Triatoma infestans was chosen as a model. This study showed the two sequences of AT-rich satellite DNA that predominate on the ends of chromosomes, are composed of short motifs with 79 bp and 33 bp, which were possibly originated from transposable elements known as giant Polintons. Cytogenetic comparisons of all samples studied in this work showed some trends, such as the predominance of the sexual system XY/XX, the preferred location of heterochromatin and 18S rDNA sites on the ends of chromosomes and the occurrence of holokinetic chromosomes. However, changes in the organization and asymmetry of karyotypes observed in each group show a relative dynamic in the genomes of these heteropteran

Orientador: André Luís Laforga Vanzela / Banca: César Martins / Banca: Marielle Cristina Schneider / Banca: Mary Massumi Itoyama / Banca: Patrícia Pasquali Parise Maltempi / Resumo: As espécies da subordem Heteroptera possuem cromossomos holocinéticos, variação do número cromossômico, meiose invertida e aquiasmática nos cromossomos sexuais e acúmulo de heterocromatina predominantemente nas extremidades cromossômicas. Das 30 espécies analisadas das infraordens Pentatomomorpha e Cimicomorpha, foram observadas variações nos números cromossômicos e cariótipos assimétricos, sobretudo em Reduviidae. O bandamento C-CMA3/DAPI também mostrou que há variabilidade na distribuição de bandas heterocromáticas entre autossomos e alossomos, contudo, a localização da heterocromatina predominou nos terminais cromossômicos. Os sítios de DNAr 18S foram localizados principalmente nas regiões terminais, com tendência à distribuição entre os autossomos nos Pentatomomorpha, enquanto que nas espécies de Cimicomorpha houve uma maior variação entre autossomos e alossomos. Para um estudo mais aprofundado sobre a origem e a organização de famílias de DNA repetitivo, foi escolhida Triatoma infestans como modelo. Este estudo mostrou as duas sequências de DNA satélite ricas em AT que predominam nas regiões terminais dos cromossomos, são compostas por motivos curtos com 79 bp e 33 bp de comprimento, que foram originadas possivelmente de elementos transponíveis gigantes conhecidos como Polintons. As comparações citogenéticas de todas as amostras estudadas neste trabalho mostraram algumas tendências, tais como a predominância do sistema sexual XY/XX, a localização preferencial da heterocromatina e dos sítios de DNAr 18S nas regiões terminais dos cromossomos e a ocorrência de cromossomos holocinéticos. Contudo, as variações na organização e assimetria dos cariótipos observadas de cada grupo mostram uma relativa dinâmica nos genomas desses heterópteros / Abstract: The species of the suborder Heteroptera have holokinetic chromosomes, variation in chromosome number, inverted/achiasmatic meiosis in the sex chromosomes and accumulation of heterochromatin predominantly in chromosome ends. In the 30 species analyzed of the infraorders Pentatomomorpha and Cimicomorpha, variations in chromosome numbers and asymmetrical karyotypes were observed, especially in Reduviidae. The C-CMA3/DAPI banding also showed that there is variability in the distribution of heterochromatic bands between autosomes and alossomos, however, the predominant location of heterochromatin were in the chromosome terminals. The 18S rDNA sites were located mainly in the terminal regions, with a tendency to distributed among the autosomes in Pentatomomorpha, whereas in species Cimicomorpha there was greater variation between autosomes and alossomos. To a more detailed study of the origin and organization of families of repetitive DNA, Triatoma infestans was chosen as a model. This study showed the two sequences of AT-rich satellite DNA that predominate on the ends of chromosomes, are composed of short motifs with 79 bp and 33 bp, which were possibly originated from transposable elements known as giant Polintons. Cytogenetic comparisons of all samples studied in this work showed some trends, such as the predominance of the sexual system XY/XX, the preferred location of heterochromatin and 18S rDNA sites on the ends of chromosomes and the occurrence of holokinetic chromosomes. However, changes in the organization and asymmetry of karyotypes observed in each group show a relative dynamic in the genomes of these heteropteran / Doutor

Orientador: Luciana Bolsoni Lourenço Morandini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T00:03:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nascimento_Juliana_M.pdf: 2159511 bytes, checksum: 592ca4a405512c2a06472a0c276eb206 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Os primeiros resultados citogenéticos obtidos para a espécie Physalaemus ephippifer, atualmente alocada no grupo P. cuvieri, mostraram um interessante heteromorfismo cromossômico ligado ao sexo. As 14 fêmeas analisadas presentaram um par cromossômico 8 heteromórfico, enquanto nos 7 machos analisados esse par era homomórfico. A diferença entre os cromossomos das fêmeas era devida à presença de um segmento adicional, composto por uma NOR e uma banda heterocromática a ela adjacente, localizado na região terminal do braço curto de apenas um desses homólogos, denominado de morfo 8b. Apesar desse importante achado, o uso de técnicas citogenéticas convencionais nessa e em outras espécies do grupo P. cuvieri não foram suficientes para esclarecer os mecanismos envolvidos na evolução cromossômica, já que poucos caracteres citogenéticos informativos foram evidenciados e também uma grande variação em relação às NORs foi encontrada. Com a intenção de buscar novos marcadores citogenéticos que auxiliem no estudo dos cromossomos sexuais de P. ephippifer e que colaborem na análise citogenética desse grupo de Physalaemus, foram estudadas sequências de DNA repetitivo isoladas desta espécie. Para tanto, o DNA genômico extraído de duas fêmeas de P. ephippifer, provenientes de Belém (Pará), foi digerido com a enzima de restrição BamHI e os fragmentos gerados foram separados por eletroforese em gel de agarose. Fragmentos posteriormente denominados de Pep194, Pep165 e Pep320 isolados a partir desse gel, foram clonados, sequenciados e localizados in situ no cariótipo de P. ephippifer. A seqüência Pep320 mostrou correspondência parcial com o fragmento EU343727.1 isolado de P. cuvieri, cuja sequência está disponível no GenBank. Apesar desses fragmentos não apresentarem similaridade entre si, as sequências Pep165 e Pep320 foram mapeadas no mesmo sítio cromossômico, correspondente à banda pericentromérica do braço curto do cromossomo 3. Esse resultado levanta um questionamento, ainda não respondido, acerca da organização molecular dessas sequências, que podem estar arranjadas em clusters independentes ou representar partes de uma mesma unidade repetitiva. A sequência Pep194 foi mapeada em regiões coincidentes com as NORs, localizadas no braço longo dos cromossomos identificados como Z e W, e no braço curto do cromossomo W. Apesar deste resultado, a análise da sequência Pep194 não apresentou nenhuma similaridade com regiões codificadoras do DNAr nucleolar, nem mesmo com regiões intergênicas associadas a elas já descritas. Tal sequência apresentou interessante arranjo interno, sendo composta de duas repetições diretas terminais, cada uma com 63 pb, sendo ambas flanqueadoras deuma região interna de 68 pb. Para melhor investigar a organização desta sequência no genoma de P. ephippifer, foram analisados produtos resultantes da amplificação por PCR de segmentos do DNA genômico, efetuada com o auxílio de primers construídos especificamente para se anelarem em regiões internas do segmento isolado. Os resultados obtidos por essa análise evidenciaram a presença de uma unidade repetitiva de 131 pb, que representa parte do fragmento Pep194, diferindo desse por não apresentar uma das regiões de 63 pb. No entanto, não é possível descartar a co-existência de uma unidade repetitiva de 194 pb, não detectada nessas análises. Em paralelo a esses experimentos, sequências pertencentes a elementos retrotransponíveis Rex1 foram isoladas do genoma de P. ephippifer por PCR, clonadas, sequenciadas e mapeadas por FISH em uma região heterocromática pericentromérica do braço curto do cromossomo 3. A análise das sequências desses fragmentos comprovou serem correspondentes a parte da sequência codificadora da enzima transcriptase reversa do elemento Rex1. A fim de verificar a presença desse elemento em outras espécies de Physalaemus, os mesmos primers utilizados nos experimentos com P. ephippifer, foram usados para a amplificação de sequências a partir de amostras do DNA genômico de P. albifrons, P. albonotatus, P. henselli e P. spiniger. A sequência isolada de P. albonotatus apresentou uma deleção interna de cerca de 220 pb quando comparada com as sequências correspondentes, aqui descritas ou disponíveis no GenBank. Isso permite sugerir que, embora derivado de um elemento Rex1, esse segmento provavelmente deixou de ser um elemento de transposição ativo. Embora esse seja o primeiro trabalho que descreve a ocorrência de Rex1 em anuros, a presença desse elemento parece comum, pelo menos no gênero Physalaemus. Além de apresentar similaridade com o segmento de Rex1 e com os fragmentos Pep165 e Pep320, a banda heterocromática pericentromérica de 3p é também o sítio de ocorrência de DNAr 5S. Tal região, reconhecida como DAPI-positiva na presente análise, permite clara distinção entre os cromossomos 3 e 4 de P. ephippifer, frequentemente confundidos se analisados apenas em relação à sua morfologia. As quatro sequências repetitivas aqui isoladas apresentaram-se eficientes marcadores citogenéticos e poderão ser utilizadas para futuros estudos comparativos entre espécies do gênero Physalaemus. / Abstract: Previous cytogenetic studies of Physalaemus ephippifer, a species currently allocated to the group P. cuvieri, showed an interesting female-specific chromosome heteromorphism. In 14 females of P. ephippifer, chromosome pair 8 was heteromorphic with regard to the occurrence of an NOR anda terminal C-band. Such heteromorphism was not found in the seven analyzed male specimens. These findings suggest that the chromosomes of pair 8 may be sex chromosomes in P. ephippifer, characterizing a ZZ ?/ ZW ? sex-determination system in this species. Despite these important data, conventional cytogenetic techniques performed in this and other species of the Physalaemus group were not sufficient to clarify the processes involved in the karyological divergence in this anuran group. Aiming to look for new cytogenetic markers that may help in the study of P. ephippifer sex chromosomes and in the cytogenetic analysis of this group of Physalaemus, we studied repetitive DNA sequences isolated from P. ephippifer. Genomic DNA extracted from two females of P. ephippifer from Belém (Pará) was digested with the restriction enzyme BamHI. The restriction fragments were separated by electrophoresis in agarose gel. DNA fragments, which were ultimately named Pep194, Pep165, and Pep320, were isolated from the gel, cloned, sequenced, and localized in situ in the karyotype of P. ephippifer. The sequence Pep320 was very similar to the fragment EU343727.1 isolated from P. cuvieri. Although Pep320 and Pep165 were totally different in nucleotide sequence, they were mapped on the same chromosome site, which corresponded to the pericentromeric C-band in the short arm of chromosome 3. This raises doubts about the molecular organization of these sequences, which can be arranged in independent clusters, but can also represent partial regions of the same repeat unit. The sequence Pep194 was mapped in regions that coincided with the NORs, located in the long arm of Z and W chromosomes and in the short arm of the W chromosome. However, the Pep194 sequence had no similarity with the coding regions of the nucleolar rDNA or with intergenic spacers associated to them. The restriction fragment Pep194 had an interesting internal arrangement, being composed of two terminal direct repeats, each with 63 bp, flanking an internal region of 68 bp. To further investigate the organization of this sequence in the genome of P. ephippifer, we amplified some Pep194 segments from genomic DNA by PCR using specific primers designed to anneal in inner / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Shirlei Maria Recco Pimentel, Luciana Bolsoni Lourenço / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T06:02:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vittorazzi_StenioEder_D.pdf: 3469046 bytes, checksum: 548f412477dbed97bd45f19e26cea793 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Os genomas dos eucariotos são ricos em sequências repetitivas, as quais compreendem sequências dispersas e em tandem. Entre as sequências em tandem, incluem-se os DNA satélites, os DNA ribossomais e cópias parálogas. Os DNA satélites são os principais constituintes da heterocromatina constitutiva e os genes ribossomais transcrevem os RNAr para compor os ribossomos, que dividem-se em duas famílias, DNAr 45S e 5S. Em um mesmo organismo, diferentes tipos de DNAr 5S já foram reconhecidos, mostrando a existência de uma diversidade quanto a esse tipo de sequência. No anuro Physalaemus cuvieri, uma forma de DNA satélite denominada PcP190 foi caracterizada e teve sua origem atribuída a uma derivação do DNAr 5S em uma espécie ancestral. Em diferentes populações de P. cuvieri estudadas previamente com as ferramentas da citogenética convencional, uma acentuada variação interpopulacional nos cromossomos portadores da NOR pôde ser observada, e nas demais espécies do grupo de P. cuvieri, peculiaridades interespecíficas foram evidenciadas, porém, os cariótipos entre essas espécies são muito semelhantes. O objetivo nessa tese foi ampliar o estudo citogenético de espécies do grupo de P. cuvieri que possuíam carência na descrição cromossômica, como P. kroyeri e P. cicada. Objetivou-se também analisar o DNA satélite PcP190 em nível cromossômico e molecular, assim como estudar a organização molecular e a diversidade de sequências do DNAr 5S no genoma das espécies de Physalaemus e espécies de gêneros relacionados. Com os resultados da pesquisa, três capítulos são apresentados, sendo eles: (i) "Long-time evolution and highly dynamic satellite DNA in leptodactylid and hylodid frogs", o qual mostra que o DNA satélite PcP190 é amplamente conservado e pode ser reconhecido em representantes de duas famílias de anuros, Leptodactylidae e Hylodidae; além disso, mostra também que essas sequências são altamente dinâmicas nos cromossomos das espécies do grupo de P. cuvieri. (ii) "Diversidade do DNAr 5S em Leiuperinae (Anura)", os resultados mostram que no genoma desses anuros existe uma diversidade dessa classe de família multigênica maior do que proposto até então, e que essas sequências do DNAr 5S permanecem conservadas desde a divergência evolutiva entre os Actinopterigio e Sarcopterigio. (iii) "Cariótipo e mapeamento de DNA repetitivo em Physalaemus kroyeri e P. cicada (Anura Leptodactylidae)", onde é apresentado que a banda 5p de P. kroyeri tem se mostrado um bom marcador cromossômico para as espécies do grupo de P. cuvieri, o que indica se tratar de uma sinapomorfia cromossômica. Contrariamente, a ausência dessa banda 5p em P. cicada não fornece evidência para a inclusão de P. cicada no grupo de P. cuvieri ou em qualquer outro grupo de espécies / Abstract: The genomes of eukaryotic organisms are rich in repetitive DNA sequences, which can be dispersed or arrayed in tandem. The tandem repeat sequences include the satellite DNA, the ribosomal DNA, and paralogous copies. Satellite DNA is the main component of constitutive heterochromatin, while the ribosomal genes encode the rRNAs that make up the ribosomes; they are divided into two families, the 45S and 5S rRNA. Different types of 5S rDNA have been identified in a single organism, proving that there is diversity in this type of DNA sequence. In the anuran Physalaemus cuvieri, a satellite DNA family called PcP190 has been identified, which is thought to have derived from the 5S rDNA of an ancestor species. In different populations of P. cuvieri that were previously studied with conventional cytogenetic tools, an accentuated interpopulational variation among chromosomes harboring the NOR was observed, while in other species of the P. cuvieri group, interspecific traits were found. However, the karyotypes in these species are very similar. The aim of this thesis was to expand the cytogenetic studies on P. cuvieri species that needed further chromosomal description, such as P. kroyeri and P. cicada. Another objective was to analyze the PcP190 satellite DNA at the chromosomal and molecular level, as well as to study the molecular organization and the diversity of 5S rDNA sequences in the genomes of the Physalaemus species and other species of related genera. We present three chapters as a result of this research: (i) "Long-time evolution and highly dynamic satellite DNA in frogs," which demonstrates that the PcP190 satellite DNA is widely conserved and was recognized in representatives of two anurans families, Leptodactylidae and Hylodidae. Moreover, it also demonstrates that these sequences are highly dynamic within the chromosomes of the P. cuvieri species group. (ii) "5S rDNA in Leiuperinae (Anura): new insights on its evolution." The results show that in the genomes of these anurans there is wider diversity among this multigenic family than previously assumed and that these 5S rDNA sequences have remained conserved since the evolutionary divergence of Actinopterygii and Sarcopterygii. (iii) "Karyotype and repetitive DNA mapping of the Physalaemus kroyeri and P. cicada (Anura Leptodactylidae)," which demonstrates that the 5p chromosomal band of P. kroyeri is a good chromosomal marker for species from the P. cuvieri group, indicating that it is a chromosomal synapomorphy. Conversely, the absence of this 5p band in P. cicada does not provide evidence for the inclusion of this species in the P. cuvieri group or any other species group / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural