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Le transporteur NTT1 est responsable pour l'import d'ATP dans les chloroplastes afin de maintenir le métabolisme en période d'activité réduite ou nulle de la photosynthèse. Cependant, le mécanisme moléculaire de ce transporteur est encore méconnu, essentiellement du à la difficulté de manipulation des protéines membranaires. Nous avons réussi à développer un protocole pour la production de ce transporteur, permettant une bon rendement de solubilisation et obtention de protéines purifiées pour des études structurales. Combinant des caractérisations biochimiques et biophysiques, nous avons pu identifier des conditions de préparation d'échantillons qui ont mené aux premiers cristaux. Afin d'étendre notre connaissance sur les transporteurs de nucléotides, nous avons également entrepris des études structurales et fonctionnelles sur AAC, le transporteur ADP/ATP des mitochondries. AAC et NTT1 appartiennent à des familles de protéines différentes mais ont des fonctions voisines. À partir de la première structure d'AAC déjà connue, nous avons recherché par des criblages in silico de nouvelles molécules se liant au transporteur de façon compétitive avec le nucléotide et pouvant ainsi inhiber le transport. Les outils de docking ont été mis en place et ont permis à partir d'une librairie de 75000 composés d'identifier 17 molécules. Ensuite, nous avons testés ces molécules expérimentalement et montré qu'une d'entre elles inhibent le transport. De plus, trois nouveaux analogues d'ADP ont également été identifiés comme inhibiteurs.

DYRK1A is the most studied member of the DYRK family of protein kinases, because is one of the human chromosoma 21 proteins for which changes in gene dosage result in neuropathological alterations. DYRKs are activated by autophosphorylation on a tyrosine residue in the activation loop, a one-off event that takes place during translation. Accordingly, DYRK1A would be constitutively active once is synthesized. However, DYRK1A is extremely sensitive to gene dosage, and thus it is predictable that not only its activity but also its actual protein amounts have to be tightly regulated by mechanisms not yet characterized. In the present study, the protein kinase NLK has been identified as a novel regulator of DYRK1A protein stability. DYRK1A interacts with NLK in physiological conditions. The interaction results in the phosphorylation of DYRK1A at multiple sites, which have been identified by mass spectrometry analysis. These phosphorylation events promote DYRK1A proteasome-dependent degradation. Moreover, DYRK1A degradation is induced by stimulating cells with Wnt1 or Wnt3a, or overexpressing elements of the Wnt signaling cascade such as the Frizzled-1 receptor or NLK activators such as HIPK2. In addition, DYRK1A interacts with and phosphorylates -catenin and TCF-4 and enhances -catenin-dependent transcriptional activity, at least by phosphorylation of -catenin. Thus, these results suggest that DYRK1A acts as a positive factor in the Wnt--catenin signaling pathway and NLK acts as a negative regulator by targeting both DYRK1A and TCF/LEF transcription factors for proteasome-mediated degradation. / DYRK1A es el miembro más estudiado de la familia de proteína quinasas DYRK, porque es una de las proteínas de la cromosoma humano 21 para la que cambios en la dosis génica dan lugar a alteraciones neuropatológicas. Las quinasas DYRK se activan por autofosforilación en un residuo tirosina localizado en el lazo de activación, un evento único que ocurre durante la traducción. Como consecuencia, DYRK1A sería constitutivamente activa una vez se ha sintetizado. Sin embargo, DYRK1A es extremadamente sensible a la dosis génica, y por tanto es predecible que no sólo su actividad, pero también los niveles de proteína han de estar estrictamente controlados por mecanismos reguladores que todavía no han sido caracterizados. En este trabajo, la proteína quinasa NLK ha sido identificada como un nuevo regulador de la estabilidad de DYRK1A. DYRK1A interacciona con NLK en condiciones fisiológicas, y la interacción tiene como resultado la fosforilación de DYRK1A en residuos serina/treonina, varios de los cuales han sido identificados por espectrometría de masas. La interacción con NLK y la subsecuente fosforilación promueven la degradación de DYRK1A vía el proteasoma. Además, la degradación de DYRK1A es inducida por estimulación de la células con Wnt1 o Wnt3a, o por sobreexpresión de miembros de la cascada de señalización de Wnt, como el receptor Frizzled-1 o de un activador de NLK como HIPK2. Finalmente, se ha demostrado que DYRK1A se une y fosforila -catenina y TCF-4. La fosforilación de, al menos, -catenina es responsable del incremento de la actividad transcripcional dependiente de esta proteína en presencia de DYRK1A. Todos estos resultados sugieren que DYRK1A actúa como un factor positivo en la vía de señalización Wnt--catenina y NLK actúa como un regulador negativo al inducir la degradación vía proteasoma no sólo de los factores de transcripción TCF/LEF sino también del modulador positivo DYRK1A.

Η θανατηφόρος δράση του βακτηρίου του άνθρακα (Bacillus anthracis), στο οποίο οφείλεται η καλούμενη ως νόσος του άνθρακα, εντοπίζεται στη συνεργό δράση τριών εκλυόμενων τοξινών του και ειδικότερα στην πρωτεολυτική δράση του θανατηφόρου παράγοντα (anthrax Lethal Factor, LF). Ο LF είναι μία μεταλλοπρωτεάση ψευδαργύρου και ισχυρή τοξίνη, η οποία απελευθερώνεται στον οργανισμό στα πρώτα στάδια προσβολής του ατόμου από το βακτήριο. Το ενεργό/καταλυτικό κέντρο του αναγνωρίζει και υδρολύει με εξαιρετική εξειδίκευση πεπτιδικά υποστρώματα ΜΚΚ κινασών, αναστέλλοντας τις διαδικασίες μεταγωγής σήματος στα κύτταρα του μολυσμένου ξενιστή επιφέροντας το θάνατό του. Από την άλλη, η εξειδικευμένη πρωτεολυτική ικανότητα του LF έναντι αυτών των κινασών, οι οποίες πρόσφατα συσχετίστηκαν με ανάπτυξη καρκινικών όγκων, ενδέχεται να αποτελέσει μια καινοτόμο θεραπευτική οδό για την αντιμετώπιση καρκινικών όγκων εν τη γενέση τους. Ωστόσο, ο μηχανισμός της αλληλεπίδρασης σε μοριακό επίπεδο και της πρωτεολυτικής διάσπασης των υποστρωμάτων του LF παραμένει μέχρι και σήμερα αδιευκρίνιστος και συνεπώς χρήζει ιδιαίτερης μελέτης. Προς αυτή την κατεύθυνση εστιάστηκε το ενδιαφέρον της διατριβής έχοντας ως πρωτογενείς στόχους την in silico μελέτη της αλληλεπίδρασης, σε μοριακό επίπεδο, του καταλυτικού κέντρου του LF με τα υποστρώματα των ΜΚΚ κινασών που υδρολύει, και την μελέτη μέσω Φασματοσκοπίας NMR της δομής και δυναμικής του ενεργού κέντρου του LF σε ελεύθερη μορφή, το οποίο ευρίσκεται στο C-τελικό άκρο του. Με την εφαρμογή τεχνικών προσομοίωσης πρόσδεσης και μοριακής δυναμικής πραγματοποιήθηκε in silico μελέτη των συμπλόκων LF-υποστρώματα, και προσδιορίστηκε ένα ευρύ φάσμα αλληλεπιδράσεων, όχι μόνο γύρω από το μεταλλικό/καταλυτικό κέντρο αλλά και σε απόσταση 20 Å στην περιοχή δέσμευσης του Zn2+, υποδεικνύοντας έτσι τους δομικούς παράγοντες που πιθανόν καθορίζουν το είδος της αλληλεπίδρασής ενζύμου με τις κινάσες που υδρολύει, παρέχοντας έτσι σημαντικές πληροφορίες για τον σχεδιασμό και την αναζήτηση βιοδραστικών μορίων με φαρμακευτικό ενδιαφέρον έναντι στον LF. Τα δεδομένα αυτά μπορούν επίσης να αξιοποιηθούν σε μελέτες δομής-δράσης με σημειακές και/ή πολλαπλές μεταλλάξεις. Με την χρήση φασματοσκοπίας NMR, πραγματοποιήθηκε μελέτη της δομής και δυναμικής του ενεργού κέντρου του LF σε ελεύθερη μορφή (apoLF672-776). Η επίλυση των τρισδιάστατων NMR δομών του apoLF672-776 έδωσαν μια εξαιρετικά σαφή εικόνα για τη δομή του ενεργού κέντρου του LF, το οποίο βρίσκεται σε συμφωνία με τις υπάρχουσες κρυσταλλικές δομές. Τα συγκεκριμένα ΝΜR δεδομένα μπορούν να αξιοποιηθούν σε μελέτες με NMR υπό το καθεστώς αλληλεπίδρασης του LF με τα πεπτιδικά υποστρώματά του και χαρακτηρισμό της δυναμικής της αλληλεπίδρασης, όπως επίσης και τον υπολογισμό της συγγένειας δέσμευσής τους. / The anthrax toxin of the bacterium Bacillus anthracis consists of three distinct proteins, one of which is the anthrax lethal factor (LF). LF is a gluzincin Zn-dependent, highly specific metalloprotease with a molecular mass of ~90 kDa that cleaves most isoforms of the family of mitogen-activated protein kinase kinases (MEKs/MKKs) close to their amino termini, resulting in the inhibition of one or more signaling pathways. Previous studies on the crystal structures of uncomplexed LF and LF complexed with the substrate MEK2 or a MKK-based synthetic peptide provided structure-activity correlations and the basis for the rational design of efficient inhibitors. However, in the crystallographic structures, the substrate peptide was not properly oriented in the active site due to the absence of the catalytic zinc atom. The primary target of the thesis was to examine in silico the LF-MEK/MKK interaction along the catalytic channel up to a distance of 20 Å from the zinc atom, using docking and molecular dynamics protocols. This residue-specific view of the enzyme-substrate interaction provides valuable information about: (i) the substrate selectivity of LF and its inactivation of MEKs/MKKs, (an issue highly important not only to anthrax infection, but also to the pathogenesis of cancer), and (ii) the discovery of new, previously unexploited, hot-spots of the LF catalytic channel that are important in the enzyme/substrate binding and interaction. Given the importance of the interaction between LF and substrate for the development of anti-anthrax agents as well as the potential treatment of nascent tumours, the analysis of the structure and dynamic properties of the LF catalytic site are essential to elucidate its enzymatic properties. The thesis interest was oriented then to the solution structure of the catalytic domain of apo LF and present data on its dynamics. The solution nuclear magnetic resonance (NMR) structure and mobility studies of the catalytic domain of apoLF672-776 reveals that the conformation of the C-terminal construct of the LF catalytic domain and the orientation of the six helical motifs are remarkably similar to the native structure, indicating the LF polypeptides catalytic site as reliable models of the enzyme active centre.

Esta tese alia dois enfoques principais dentro da Química Farmacêutica. Por um lado, busca explorar uma nova fonte de insumos naturais, cascas de Malus  domestica, com vistas a obtenção dos triterpenos ácidos ursólico (AU) e betulínico (AB); e por outro lado, estuda a relação dos derivados triterpênicos semissintéticos obtidos com a proteína-alvo (PfATP6) destacada atualmente na literatura da terapia da malária com vistas ao planejamento de novos antimaláricos. O primeiro Capítulo inclui o desenvolvimento de um método eficiente, fácil e extremamente rápido onde são combinadas as técnicas de extração por ultrassom (UAE) e análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplada a Detector de Espectroscopia de Massas (LC-MS), para identificação e doseamento dos ácidos ursólico (AU) e betulínico (BA) em extratos de cascas frescas de maçã de cinco clones das cultivares Gala e Fuji (“Baigent”, “Fuji Mishima”, “Fuji Suprema”, “Fuji Select” and “Maxi Gala”) oriundas da Região Sul do Brasil. Os parâmetros cromatográficos do método analítico incluem: ionização por eletro spray em modo positivo (ESI+), fluxo de 1,0 mL/min, em modo de eluição isocrático, consistindo de 80% acetonitrila e 20% acetato de amônio 10 mM em pH 6,0 e temperatura ambiente. O método desenvolvido foi validado e mostrou ser seletivo, sensível (LOD e LOQ de 0,087 e 0,266 μg/mL para BA, e 0,398 e 2,117 μg/ mL para UA), coeficiente de regressão linear (r >0.99), preciso, exato e robusto para os analitos de interesse. A otimização do método combinado de UAE com LC-MS permitiu concluir os procedimentos de extração e análise em tempo inferior a 4 h, uma vez que o método não requer a secagem da amostra, etapa que demanda longos tempos de processamento. Este método foi aplicado e forneceu a primeira caracterização fitoquímica dos cinco clones de maçã estudados. Os resultados demonstraram que o método combinado de UAE-LC-MS é adequado às práticas do controle de qualidade. O segundo Capítulo apresenta o estudo da interação dos ligantes semissintéticos derivados dos AU e AB, sintetizados pelo nosso grupo de pesquisa, com a proteína Ca2+-ATPase do Plasmodium falciparum (PfATP6), através do emprego da técnica de Docking Molecular. A PfATP6 é descrita como um importante alvo para novos antimaláricos como Artemisinina (ART), cujo mecanismo de ação inclui, dentre outros, a modulação da homeostasia do cálcio intracelular. Investigações conduziram à hipótese do extravasamento do cálcio, do interior do retículo sarco-endoplasmático como mecanismo plausível para ação dos derivados triterpênicos do AU e AB. Os escores de energia determinados no Docking, de cada um dos nove ligantes (derivados triterpênicos) e quatro compostos de controle (ácidos ursólico e betulínico, artemisinina (ART) e tapsigargina (TPG) foram determinados (análises realizadas em triplicata) e correlacionados com os valores de IC50, para a atividade antimalárica. Os resultados mostraram excelente correlação entre os escores de energia (com a PfATP6) e os valores de IC50, superior a 80% (r > 0,83360). O estudo fornece fortes evidências de que a PfATP6 pode constituir um alvo para os derivados pentacíclicos do estudo, bem como permitiu identificar o perfil conformacional dos ligantes e os principais resíduos do sítio de ligação (SL) da PfATP6 envolvidos nas interações; bem como, contribuiu para a melhor compreensão das propriedades envolvidas na interação do ligante com o receptor e mecanismo de ação. O terceiro Capítulo faz uso de Métodos Clássicos e Quânticos para descrever as mudanças conformacionais da proteína PfATP6. As simulações de Dinâmica Molecular do receptor na forma isolada e complexada com os ligantes foram realizadas durante 10 ns. As conformações finais obtidas para os receptores foram avaliadas em termos RMSD, efeito da presença dos ligantes no sítio de ligação e tipos de interações estabelecidas entre o ligante e o receptor. Os resultados mostraram que as proteínas PfATP6 e SERCA tendem a manter sua conformação nativa e que o modelo utilizado é adequado aos propósitos do estudo. O monitoramento dos resíduos da região citoplasmática das proteínas permitiu evidenciar o efeito alostérico da presença dos ligantes AU e ART no SL, sobre os domínios A e N, da PfATP6. Esse efeito reproduz as conformações E1 e E2, bem estabelecidas para PfATP6, na presença e ausência de Ca2+. As análises de Dinâmica Molecular corroboram os achados do Capítulo II ao evidenciarem o estabelecimento de interações de hidrogênio com os resíduos importantes do SL da PfATP6. Esses resultados fundamentam os indícios de que as bombas de Ca2+-ATPase (SERCA), possam ser de fato, um alvo para os derivados triterpênicos dos AU e AB. / This thesis combines two main focuses within Pharmaceutical Chemistry. On the one hand, it seeks to explore a new source of natural inputs, bark of Malus domestica, in order to obtain ursolic (UA) and betulinic acid (BA) triterpenes. On the other hand, it studies the relation of the semi-synthetic triterpenic derivatives obtained with the target proteins (PfATP6), currently highlighted in the literature on malaria therapy with a view to planning new antimalarial drugs. The first chapter includes the development of an efficient, easy and extremely fast method where ultrasonic extraction techniques (UAE) and high-performance liquid chromatography coupled to mass spectroscopy (LC-MS) are combined for identification and assay of ursolic acid (UA) and betulinic acid (BA) in fresh apple peel extracts from five clones of the Gala and Fuji cultivars (Baigent, Fuji Mishima, Fuji Suprema, Fuji Select and Maxi Gala ") in the Southern Region of Brazil. Chromatographic parameters of the analytical method include: electrospray ionization (ESI +), flow rate of 1.0 mL/min in isocratic elution mode, consisting of 80% acetonitrile and 20% 10 mM ammonium acetate at pH 6.0 and room temperature. The method was validated and proved to be selective, sensitive (LOD and LOQ of 0.087 and 0.266 μg/mL for BA, and 0.398 and 2.117 μg/mL for UA), linear regression coefficient (r> 0.99), accurate, robust for analytes of interest. The optimization of the combined method of UAE with LC-MS allowed to complete the procedures of extraction and analysis in less than 4 h, since the method does not require drying the sample, a stage that demands long processing times. This method was applied and provided the first phytochemical characterization of the five apple clones studied. The results demonstrated that the combined UAE-LC-MS method is suitable for quality control practices. The second chapter presents the study of the interaction of the semi-synthetic ligands derived from the UA and BA, synthesized by our research group, with the Plasmodium falciparum Ca2+-ATPase protein (PfATP6), using the Molecular Docking technique. PfATP6 is described as an important target for new antimalarials such as Artemisinin (ART), whose action mechanism includes, among others, the modulation of intracellular calcium homeostasis. Investigations led to the hypothesis of extravasation of calcium from the interior of the sarco-endoplasmic reticulum as a plausible mechanism for the action of the triterpenic derivatives of UA and BA. The Docking energy scores (binding energy) of each of the nine ligands (triterpenic derivatives) and four control compounds (ursolic and betulinic acids, artemisinin (ART) and tapsigargine (TPG)) with PfATP6, were calculated (analyses performed in triplicate) and correlated with its antimalarial IC50 value. The results showed an excellent correlation between energy scores (with PfATP6) and IC50 values, higher than 80% (r > 0.83360). The study supplies strong evidence that PfATP6 may be a target for the pentacyclic derivatives of the study, and also allowed identifying the conformational profile of the ligands and the main residues of the PfATP6 binding site (BS) involved in the interactions. It further contributed to a better understanding of the properties involved in the interaction of the ligand with the receptor and its action mechanism. The third chapter uses Classical and Quantum Methods to describe the conformational changes of the PfATP6 protein. The Molecular Dynamics simulations of the receptor in the isolated and complexed form with the ligands were performed for 10 ns. The final conformations obtained for the receptors were evaluated in RMSD terms, effect of the presence of ligands at the binding site and types of interactions established between the ligand and the receptor. The results showed that the PfATP6 and SERCA proteins tend to maintain their native conformations and that the model used is adequate for the purposes of the study. The monitoring of the residues of the cytoplasmic region of the proteins allowed evidencing the allosteric effect of the presence of UA and ART ligands in BS, on the A- and N-domains of PfATP6. This effect reproduces the well-established E1 and E2 conformations for PfATP6, in the presence and absence of Ca2+, respectively. Molecular Dynamics analyses corroborate the findings of Chapter II, by showing the possibility of establishing hydrogen interactions with the important residues of PfATP6 BS. These results support the evidence that Ca2+-ATPase (SERCA) pumps may be a target for the triterpenic derivatives of UA and BA.

Esta tese alia dois enfoques principais dentro da Química Farmacêutica. Por um lado, busca explorar uma nova fonte de insumos naturais, cascas de Malus  domestica, com vistas a obtenção dos triterpenos ácidos ursólico (AU) e betulínico (AB); e por outro lado, estuda a relação dos derivados triterpênicos semissintéticos obtidos com a proteína-alvo (PfATP6) destacada atualmente na literatura da terapia da malária com vistas ao planejamento de novos antimaláricos. O primeiro Capítulo inclui o desenvolvimento de um método eficiente, fácil e extremamente rápido onde são combinadas as técnicas de extração por ultrassom (UAE) e análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplada a Detector de Espectroscopia de Massas (LC-MS), para identificação e doseamento dos ácidos ursólico (AU) e betulínico (BA) em extratos de cascas frescas de maçã de cinco clones das cultivares Gala e Fuji (“Baigent”, “Fuji Mishima”, “Fuji Suprema”, “Fuji Select” and “Maxi Gala”) oriundas da Região Sul do Brasil. Os parâmetros cromatográficos do método analítico incluem: ionização por eletro spray em modo positivo (ESI+), fluxo de 1,0 mL/min, em modo de eluição isocrático, consistindo de 80% acetonitrila e 20% acetato de amônio 10 mM em pH 6,0 e temperatura ambiente. O método desenvolvido foi validado e mostrou ser seletivo, sensível (LOD e LOQ de 0,087 e 0,266 μg/mL para BA, e 0,398 e 2,117 μg/ mL para UA), coeficiente de regressão linear (r >0.99), preciso, exato e robusto para os analitos de interesse. A otimização do método combinado de UAE com LC-MS permitiu concluir os procedimentos de extração e análise em tempo inferior a 4 h, uma vez que o método não requer a secagem da amostra, etapa que demanda longos tempos de processamento. Este método foi aplicado e forneceu a primeira caracterização fitoquímica dos cinco clones de maçã estudados. Os resultados demonstraram que o método combinado de UAE-LC-MS é adequado às práticas do controle de qualidade. O segundo Capítulo apresenta o estudo da interação dos ligantes semissintéticos derivados dos AU e AB, sintetizados pelo nosso grupo de pesquisa, com a proteína Ca2+-ATPase do Plasmodium falciparum (PfATP6), através do emprego da técnica de Docking Molecular. A PfATP6 é descrita como um importante alvo para novos antimaláricos como Artemisinina (ART), cujo mecanismo de ação inclui, dentre outros, a modulação da homeostasia do cálcio intracelular. Investigações conduziram à hipótese do extravasamento do cálcio, do interior do retículo sarco-endoplasmático como mecanismo plausível para ação dos derivados triterpênicos do AU e AB. Os escores de energia determinados no Docking, de cada um dos nove ligantes (derivados triterpênicos) e quatro compostos de controle (ácidos ursólico e betulínico, artemisinina (ART) e tapsigargina (TPG) foram determinados (análises realizadas em triplicata) e correlacionados com os valores de IC50, para a atividade antimalárica. Os resultados mostraram excelente correlação entre os escores de energia (com a PfATP6) e os valores de IC50, superior a 80% (r > 0,83360). O estudo fornece fortes evidências de que a PfATP6 pode constituir um alvo para os derivados pentacíclicos do estudo, bem como permitiu identificar o perfil conformacional dos ligantes e os principais resíduos do sítio de ligação (SL) da PfATP6 envolvidos nas interações; bem como, contribuiu para a melhor compreensão das propriedades envolvidas na interação do ligante com o receptor e mecanismo de ação. O terceiro Capítulo faz uso de Métodos Clássicos e Quânticos para descrever as mudanças conformacionais da proteína PfATP6. As simulações de Dinâmica Molecular do receptor na forma isolada e complexada com os ligantes foram realizadas durante 10 ns. As conformações finais obtidas para os receptores foram avaliadas em termos RMSD, efeito da presença dos ligantes no sítio de ligação e tipos de interações estabelecidas entre o ligante e o receptor. Os resultados mostraram que as proteínas PfATP6 e SERCA tendem a manter sua conformação nativa e que o modelo utilizado é adequado aos propósitos do estudo. O monitoramento dos resíduos da região citoplasmática das proteínas permitiu evidenciar o efeito alostérico da presença dos ligantes AU e ART no SL, sobre os domínios A e N, da PfATP6. Esse efeito reproduz as conformações E1 e E2, bem estabelecidas para PfATP6, na presença e ausência de Ca2+. As análises de Dinâmica Molecular corroboram os achados do Capítulo II ao evidenciarem o estabelecimento de interações de hidrogênio com os resíduos importantes do SL da PfATP6. Esses resultados fundamentam os indícios de que as bombas de Ca2+-ATPase (SERCA), possam ser de fato, um alvo para os derivados triterpênicos dos AU e AB. / This thesis combines two main focuses within Pharmaceutical Chemistry. On the one hand, it seeks to explore a new source of natural inputs, bark of Malus domestica, in order to obtain ursolic (UA) and betulinic acid (BA) triterpenes. On the other hand, it studies the relation of the semi-synthetic triterpenic derivatives obtained with the target proteins (PfATP6), currently highlighted in the literature on malaria therapy with a view to planning new antimalarial drugs. The first chapter includes the development of an efficient, easy and extremely fast method where ultrasonic extraction techniques (UAE) and high-performance liquid chromatography coupled to mass spectroscopy (LC-MS) are combined for identification and assay of ursolic acid (UA) and betulinic acid (BA) in fresh apple peel extracts from five clones of the Gala and Fuji cultivars (Baigent, Fuji Mishima, Fuji Suprema, Fuji Select and Maxi Gala ") in the Southern Region of Brazil. Chromatographic parameters of the analytical method include: electrospray ionization (ESI +), flow rate of 1.0 mL/min in isocratic elution mode, consisting of 80% acetonitrile and 20% 10 mM ammonium acetate at pH 6.0 and room temperature. The method was validated and proved to be selective, sensitive (LOD and LOQ of 0.087 and 0.266 μg/mL for BA, and 0.398 and 2.117 μg/mL for UA), linear regression coefficient (r> 0.99), accurate, robust for analytes of interest. The optimization of the combined method of UAE with LC-MS allowed to complete the procedures of extraction and analysis in less than 4 h, since the method does not require drying the sample, a stage that demands long processing times. This method was applied and provided the first phytochemical characterization of the five apple clones studied. The results demonstrated that the combined UAE-LC-MS method is suitable for quality control practices. The second chapter presents the study of the interaction of the semi-synthetic ligands derived from the UA and BA, synthesized by our research group, with the Plasmodium falciparum Ca2+-ATPase protein (PfATP6), using the Molecular Docking technique. PfATP6 is described as an important target for new antimalarials such as Artemisinin (ART), whose action mechanism includes, among others, the modulation of intracellular calcium homeostasis. Investigations led to the hypothesis of extravasation of calcium from the interior of the sarco-endoplasmic reticulum as a plausible mechanism for the action of the triterpenic derivatives of UA and BA. The Docking energy scores (binding energy) of each of the nine ligands (triterpenic derivatives) and four control compounds (ursolic and betulinic acids, artemisinin (ART) and tapsigargine (TPG)) with PfATP6, were calculated (analyses performed in triplicate) and correlated with its antimalarial IC50 value. The results showed an excellent correlation between energy scores (with PfATP6) and IC50 values, higher than 80% (r > 0.83360). The study supplies strong evidence that PfATP6 may be a target for the pentacyclic derivatives of the study, and also allowed identifying the conformational profile of the ligands and the main residues of the PfATP6 binding site (BS) involved in the interactions. It further contributed to a better understanding of the properties involved in the interaction of the ligand with the receptor and its action mechanism. The third chapter uses Classical and Quantum Methods to describe the conformational changes of the PfATP6 protein. The Molecular Dynamics simulations of the receptor in the isolated and complexed form with the ligands were performed for 10 ns. The final conformations obtained for the receptors were evaluated in RMSD terms, effect of the presence of ligands at the binding site and types of interactions established between the ligand and the receptor. The results showed that the PfATP6 and SERCA proteins tend to maintain their native conformations and that the model used is adequate for the purposes of the study. The monitoring of the residues of the cytoplasmic region of the proteins allowed evidencing the allosteric effect of the presence of UA and ART ligands in BS, on the A- and N-domains of PfATP6. This effect reproduces the well-established E1 and E2 conformations for PfATP6, in the presence and absence of Ca2+, respectively. Molecular Dynamics analyses corroborate the findings of Chapter II, by showing the possibility of establishing hydrogen interactions with the important residues of PfATP6 BS. These results support the evidence that Ca2+-ATPase (SERCA) pumps may be a target for the triterpenic derivatives of UA and BA.

Submitted by Rosana Amâncio (rosana.amancio@ufcg.edu.br) on 2018-07-12T22:11:47Z No. of bitstreams: 1 ERICA RENATA NOGUEIRA SÁ CAETANO - DISSERTAÇÃO PPGCNBio 2016..pdf: 2506925 bytes, checksum: 2aee1b855d59914fe68902bb6ec5b3fe (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-12T22:11:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ERICA RENATA NOGUEIRA SÁ CAETANO - DISSERTAÇÃO PPGCNBio 2016..pdf: 2506925 bytes, checksum: 2aee1b855d59914fe68902bb6ec5b3fe (MD5) Previous issue date: 2016-07-14 / CNPq / Miraculina é uma glicoproteína que possui uma incrível propriedade de converter o sabor amargo em doce. Como a miraculina não apresenta sabor algum e tem um baixo teor calórico, esta proteína pode ser usada como adoçantes direcionados para pacientes com doenças relacionadas ao consumo excessivo de açúcar. Estudos comprovaram que membros da família de proteínas miraculinas também possuem atividade de inibidor de tripsina do tipo Kunitz, atuando como agentes naturais de defesa da planta contra pragas e predadores. Diante disso, proteínas do tipo miraculina são de grande relevância para aplicações biotecnológicas. Esse estudo teve como objetivo geral realizar a caracterização estrutural e funcional comparativa de duas miraculinas de Citrus sinensis, por meio de modelagem e docking molecular. Modelos 3D foram gerados e validados para as miraculinas CsMir1 e CsMir4, tripsina de Acryrthosiphon pisum e para os receptores de sabor doce mT1R2 e T1R3 de Mus musculus. Modelos homodiméricos foram gerados para CsMir1 e CsMir4 e modelo heterodimérico foi gerado para mT1R2-T1R3. Estudos da atividade de inibidor de tripsina foram feitos para CsMir1 e CsMir4 por interação com tripsina. Para analisar a atividade de modificação de sabor doce, foi realizada a interação das miraculinas com o receptor mT1R2-T1R3. Como resultados, os modelos dos monômeros e dímeros criados foram considerados bons modelos, válidos e confiáveis, com representações muito próximas das estruturas nativas dessas proteínas. A miraculina CsMir1, na forma monomérica ligou-se a tripsina de A. pisum e na sua forma dimérica ligou-se ao receptor heterodimérico mT1R2-T1R3 através do domínio ATD da subunidade T1R2, entretanto o potencial para as atividades de inibição de proteases e de indução ou inibição a modificação de sabor amargo/azedo em doce é menor do que para a CsMir4. A miraculina CsMir4, na sua forma monomérica ligou-se a tripsina de A. pisum, possivelmente apresentando atividade de inibição de proteases. CsMir4, na sua forma dimérica, ligou-se ao receptor heterodimérico mT1R2-T1R3, através do domínio ATD da subunidade T1R2, potencialmente apresentando atividade de indução ou inibição a modificação de sabor amargo/azedo em doce em M. musculus. / Miraculins are glycoproteins that displays a remarkable property in bitter to sweet taste conversion. As miraculin does not have any taste and has a low calorie, this protein can be used as sweeteners targeted to patients with diseases related to excessive sugar consumption. Studies have shown that members of miraculins protein family also display inhibitor activity against the Kunitz trypsin, acting as natural agents of plant defense against pests and predators. In this context, miraculin proteins are of great relevance for biotechnological applications. The aim of this research was to characterize structurally and functionally two miraculins of Citrus sinensis using in silico tools. Tridimensional models were built and validated for CsMir1 and CsMir4 miraculins, Acryrthosiphon pisum trypsin and for Mus musculus mT1R2-T1R3 receptor. Homodimeric and hetrodimeric models were generated for miraculins (CsMir1, CsMir4) and mT1R2-T1R3, respectively. Molecular docking simulations were performed to investigate the trypsin inhibitory activity and taste conversion activity of CsMir1 and CsMir4. The results showed that the predicted models were reliable and presented good quality parameters. The monomeric CsMir1 miraculin bound to A. pisum trypsin, while its dimeric form bound to ATD domain of the mT1R2-T1R3, although its potential as trypsin inhibitor and bitter/sweet taste modifier were minor than that presented by its homologous CsMir4. The dimeric form of CsMir4 bound to mT1R2-T1R3 receptor in the ATD domain, which strongly suggests bitter/sweet taste modifier activity in M. musculus.

Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-09-20T14:33:37Z No. of bitstreams: 1 TeseDSC.pdf: 4230414 bytes, checksum: d505357e4ed13e446578eb00507beec7 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-21T12:36:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseDSC.pdf: 4230414 bytes, checksum: d505357e4ed13e446578eb00507beec7 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-21T12:36:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseDSC.pdf: 4230414 bytes, checksum: d505357e4ed13e446578eb00507beec7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-21T12:36:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseDSC.pdf: 4230414 bytes, checksum: d505357e4ed13e446578eb00507beec7 (MD5) Previous issue date: 2015-06-16 / Não recebi financiamento / Malaria is an acute febrile disease caused by protozoan parasites of the genus Plasmodium, being the species P. falciparum responsible for the most severe forms and deaths caused by the disease. These parasites have developed resistance to commonly used drugs and therefore there is a need to develop new antimalarial agents. Aryltetralone lignans are compounds that show antiplasmodial activity in vitro against P. falciparum, but its mechanism of action is still not fully understood. In this work, we postulate a plausible mode of action of some aryltetralone lignans and according to the obtained results we suggest modifications to the ligands for a better biological activity. In order to achieve our objectives we first performed a search for similar chemical compounds, for which their macromolecular targets were known. From the results obtained, P. falciparum tubulin was selected as a potential target for these lignans. Since there is no experimentally determined three-dimensional structure for this protein, we performed a molecular homology modeling of P. falciparum tubulin and the structure of bovine tubulin complexed with colchicine was selected as template. The analysis of the obtained model showed that the three dimensional structure of Plasmodium tubulin is conserved in relation to the bovine tubulin with some important substitutions occurring in the colchicine binding site region: Ala250B by Ser248B, Ala316B by Cys314B and Ile318B by Met316B. Then, molecular docking of the aryltetralone lignans, colchicine and podophyllotoxin was performed in the modeled P. falciparum tubulin. The docking calculations results allowed to conclude firstly that, although the amino acid substitutions in the binding site, the colchicine binding mode in the P. falciparum tubulin is exactly the same as that already described in the literature for bovine tubulin. As for podophyllotoxin, a different binding mode from that described in the literature for bovine tubulin was obtained due to the replacement of Ala250B by Ser248B and the Val318B by Met316B. For the aryltetralone lignans studied, three different binding modes were obtained: one exhibited by compounds 1, 2 and 3, another by 4 and 6, and a third one by 5. The lignans 1, 2 and 3 are oriented in a way so that the C ring containing the dimethoxy or methylenedioxy group is positioned in the same region obtained for the ring containing the trimethoxy group in the case of colchicine and podophyllotoxin, performing a C-H...π interaction with Leu246B. Lignans 4 and 6 orient themselves with the aromatic ring C between Ala180A and Leu246B and being held in this position by C-H...π interactions. Lignan 5 is oriented with the aromatic ring C between Leu246B and Leu253B, performing C-H...π interactions with these residues, in a similar way to what was obtained with colchicine in this site. So the likely mechanism of action of the aryltetralone lignans studied here would be their binding to the same colchicine binding site in the tubulin protein of P. falciparum and thereby interrupting the divisions and other cellular functions. / A malária é uma doença febril aguda causada por protozoários parasitas pertencentes ao gênero Plasmodium, sendo a espécie P. falciparum a responsável pela maioria das formas severas e mortes pela doença. Estes parasitas desenvolveram resistência aos fármacos comumente utilizados e, portanto, existe a necessidade de se desenvolver novos agentes antimaláricos. Lignanas ariltetralônicas são compostos que apresentam atividade antiplasmodial in vitro contra o P. falciparum, porém seu mecanismo de ação ainda não é totalmente compreendido. Neste trabalho, conseguimos postular o modo de ação de algumas lignanas ariltetralônicas e, a partir dos resultados obtidos, sugerimos modificações nestes compostos de modo a obter uma melhoria na sua atividade biológica. Para isso, primeiramente foi realizada uma busca por compostos químicos semelhantes, cujos alvos macromoleculares eram conhecidos. A partir dos resultados obtidos, selecionou-se a tubulina do P. falciparum como potencial alvo para estas lignanas. Como não há estrutura tridimensional determinada experimentalmente para esta proteína, foi realizada a modelagem molecular por homologia da tubulina do P. falciparum, selecionando como molde a estrutura da tubulina bovina complexada com colchicina. A partir da análise do modelo construído, verificou-se que a estrutura tridimensional da tubulina do Plasmodium é conservada em relação à tubulina bovina e que ocorrem algumas substituições importantes na região do sítio de ligação da colchicina: Ala250B por Ser248B, Ala316B por Cys314B e Ile318B por Met316B. Em seguida, foi realizado o docking molecular das lignanas ariltetralônicas, da colchicina e da podofilotoxina na tubulina do P. falciparum. Os resultados do docking permitiram concluir primeiramente que, embora ocorram algumas substituições de aminoácidos no sítio, o modo de ligação da colchicina na tubulina do P. falciparum é exatamente o mesmo ao já descrito na literatura para a tubulina bovina. Já para a podofilotoxina, foi obtido um modo de ligação diferente do descrito na literatura para a tubulina bovina, devido à substituição da Ala250B pela Ser248B e da Val318B pela Met316B. Para as lignanas ariltetralônicas estudadas, foram obtidos três modos de ligação diferentes: um exibido pelos compostos 1, 2 e 3, outro para 4 e 6 e um terceiro modo exclusivo para 5. As lignanas 1, 2 e 3 orientam-se de modo que o anel C, que contém o grupo dimetóxi ou metilenodióxi, se posiciona na mesma região do sítio obtida para o anel contendo o grupo trimetóxi da colchicina e da podofilotoxina, realizando uma interação C–H...π com a Leu246B. As lignanas 4 e 6 orientam-se com o anel aromático C entre a Ala180A e a Leu246B, sendo mantido nesta posição por interações C–H...π. No caso da lignana 5, esta se orienta com o anel aromático C entre a Leu246B e Leu253B, realizando interações C– H...π com estes resíduos, semelhante ao que foi obtido para a colchicina neste sítio. Assim, o mecanismo provável de ação das lignanas ariltetralônicas aqui estudadas passaria pela sua ligação ao mesmo sítio de ligação da colchicina na proteína tubulina do P. falciparum e, com isso, interrompendo as divisões e outras funções celulares.

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 6645115 bytes, checksum: deca0339070b70563febd2b8fada82ec (MD5) Previous issue date: 2014-08-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Snakebites are and global endemic problem and the study of its components is important to understand and prevent them. Among its components, phospholipase A2 have been strongly studies as Lys49 myotoxins. However, understanding the molecular mechanisms of its pharmacological effects remains controversial until now. This work studied the Lys49 myotoxins pharmacological structural determinants, emphasizing cytotoxic and myotoxic effects. Protein sequence analysis as well as molecular docking with myotoxin Bn IV and VEGFR-II receptor and different anionic molecules, such as phosphate, heparin and lipopolysaccharide were performed. Sequence analyses showed defied regions within Lys49 myotoxins group, especially cationic regions. In accordance with this, molecular dockings performed in this work observed the presence of anionic non-specific sites, also a heparin recognition site. Molecular dockings between myotoxin Bn IV and VEGFR-II were satisfactory and indicated C-terminal tail as an important interactive region. Our results determine cationic regions as important for cytotoxic effects and bring a new molecular approach to the myotoxic effects, via VEGFR-II. In additional, molecular cytotoxic and myotoxic models for myotoxic Lys49 were presented / Acidentes ofídicos constituem um problema endêmico global, e o estudo de seus componentes é importante para compreender e preveni-los. Dentre seus componentes, fosfolipases A2 têm sido fortemente estudadas, bem como as miotoxinas Lys49. Contudo, o entendimento dos mecanismos moleculares que promovem seus efeitos farmacológicos permanece controverso até hoje. O presente trabalho buscou estudar os determinantes estruturais dos efeitos farmacológicos das miotoxinas Lys49, enfaticamente seus efeitos citotóxicos e miotóxicos. Foram realizados testes de análise de sequências entre tais proteínas, bem como dockings moleculares entre a miotoxina Bn IV e o VEGFR-II e diferentes moléculas aniônicas, como fosfato, heparina e lipopolissacarídeo. As análises das sequências apresentaram regiões bem definidas dentro do grupo das miotoxinas Lys49, notadamente regiões catiônicas. Em concordância com isto, os dockings moleculares realizados neste trabalho apontam para a presença de um sítio não-específico para cargas aniônicas, bem como um sítio de reconhecimento para heparina. Já os dockings moleculares entre a miotoxina Bn IV e o VEGFR-II foram satisfatórias e apontaram a cauda C-terminal como uma importante região de interação. Tais resultados determinam regiões catiônicas importantes para a realização dos efeitos citotóxicos, através do reconhecimento de fosfolipídios aniônicos, e trazem uma nova abordagem molecular para os efeitos miotóxicos, via VEGFR-II. Além disso, são apresentados modelos moleculares para os efeitos citotóxicos e miotóxicos das miotoxinas Lys49

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA14MA165.pdf: 1074930 bytes, checksum: a1f4cf772486ba3afb04c2d71220f74f (MD5) Previous issue date: 2014-08-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The management used during lactation may interfere with the performance of piglets during lactation and, consequently, in the development of animals in the following phases. With the objective to evaluate omphalitis, arthritis, diarrhea and performance during lactation, 717 piglets from 64 litters were evaluated. At birth, all piglets were placed wearings, individually weighed, dried with hydrated aluminosilicate 100% and separated into four different groups on the same female. In group 1, complete management, the navek was ligation, section and was made antisepsis, after the birth, and was made section on the enf of the tail with subsequente antisepsis on the third day of age. In group 2, without manegement, piglets were not exposed to an umbilical management and were not exposed to tail management. In group 3 (tail docking without antisepsis), the piglets had the umbilical management, the section of the tail without further antisepsis. In group 4 (without umbilical management), the piglets were not submitted to umbilical management and was made tail docking with subsequente antisepsis. At 12 days of age and at weaning, it was found in all animals, the prevalence of omphalitis. At weaning, the healing of the tail, limb lesions and individual weight were also performed. Throughout lactation, mortality and incidence of diarrhea were observed. The data were analyzed using the SAS statistical package previously submitted to the normality of residuals Shapiro-Wilk test and evaluated by logistic regression or the test of χ2. There was not statistical difference between treatments (P> 0.05) for the parameters analyzed, rate mortality, incidence of diarrhea, incidence of omphalitis, arthritis and performance during lactation. In conditions where the experiment was conducted the performance of piglets during lactation were not affected by the management techniques used during lactation / O manejo empregado no período de aleitamento pode interferir no desempenho dos leitões na fase de lactação e, como consequência, no desenvolvimento dos animais nas fases seguintes. Com o objetivo de avaliar onfalites, artrites, diarreia e desempenho de leitões no período de aleitamento, foram avaliados 717 leitões provenientes de 64 leitegadas durante a fase de lactação. Ao nascimento todos os leitões foram brincados, pesados individualmente, secados com aluminosilicato hidratado 100% e separados em quatro diferentes grupos na mesma fêmea. No grupo 1, Manejo Completo, houve ligadura, secção e antissepsia umbilical após o nascimento e secção e antissepsia do terço final da cauda ao terceiro dia de idade. No grupo 2, Sem Manejo, os leitões não foram submetidos ao manejo de ligadura, secção e antissepsia umbilical; bem como de secção e antissepsia do terço final da cauda. No grupo 3 (Sem Antissepsia da Cauda), os leitões tiveram o manejo umbilical, a secção do terço final da cauda sem antissepsia posterior. No grupo 4 (Sem Manejo Umbilical), os leitões não foram submetidos ao manejo umbilical e houve secção e antissepsia do terço final da cauda. Aos 12 dias de idade e ao desmame, verificou-se em todos os animais, a prevalência de onfalite. Ao desmame, a cicatrização da cauda, lesões no aparelho locomotor e pesagem individual também foram realizadas. Ao longo da fase de lactação, a mortalidade e incidência de diarreia foram verificadas. Os dados foram analisados pelo pacote estatístico SAS previamente submetidos ao teste de normalidade dos resíduos Shapiro-Wilk e avaliados sob regressão logística ou pelo teste do χ2. não houve diferença estatística entre os tratamentos (P> 0,05) para os parâmetros analisados, taxa de mortalidade, incidência de diarreia, prevalência de onfalite, artrite e desempenho, durante a fase de lactação. Nas condições onde o experimento foi realizado o desempenho dos leitões no período de aleitamento não foi influenciado pelas técnicas de manejo empregadas durante a fase de lactação