Introdução: As radiações ionizantes produzem efeitos na molécula do DNA e o biomonitoramento in vivo pode ser utilizado para melhor avaliar o nível de exposição interna à radiação. Os agentes genotóxicos em populações expostas geram diferentes danos ao DNA e por existir uma variabilidade genética isso acarreta sensibilidades diferentes a estes agentes. Essa variação pode ser explicada pela existência de polimorfismos genéticos envolvidos no processo de reparo, entre eles o XRCC1 e XRCC3, responsáveis por manter a integridade do genoma das células frente a danos causados pelos agentes mutagênicos, como a radiação ionizante. Objetivo: Avaliar os efeitos mutagênicos da exposição à radiação x e gama em pacientes que realizam cintilografia miocárdica e angioplastia miocárdica e relacionar os possíveis resultados positivos com os polimorfismos dos genes de reparo, XRCC1 e XRCC3. Materiais e Métodos: Foram selecionados 57 pacientes expostos à radiação gama, e 57 expostos à radiação X. A análise da instabilidade genômica foi realizada através dos testes do micronúcleo e cometa, e a genotipagem através de sonda de TaqMan, para os polimorfismos do gene de reparo XRCC1 e XRCC3. Resultados e Conclusões: Em nosso estudo, os dados encontrados demonstram que ocorre dano ao DNA, após a exposição à radiação gama (ƿ=0,026). No entanto, não observamos ocorrer influência dos diferentes genótipos em ambos polimorfismos estudados, Arg399Gln e Thr241 Met, embora a presença do genótipo mutado Met/Met, parece ter indicado menor radiossensibilidade. Apesar desta diferença não ter alcançado os níveis de significância esperados, este resultado está de acordo com dados da literatura que indicam que este genótipo poderia estar associado à capacidade de reparação do DNA. Neste mesmo grupo, não encontramos diferenças estatisticamente significativas para aberrações cromossômicas (MN e NBUDs) após a exposição, para ambos polimorfismos, exceto para o genótipo normal Arg/Arg (ƿ=0,012), que parece ter indicado maior radiossensibilidade à exposição, estando de acordo com trabalhos da literatura, os quais demostram que, este genótipo pode ser associado com a diminuição da capacidade de reparo do DNA, apresentando níveis mais altos de quebras induzidas. As evidências de radiossensibilidade celular também podem ser explicadas pela alteração da proteína resultante do polimorfismo que não corrige os danos ao DNA, podendo aumentar o acúmulo de lesões no material genético, possivelmente pelo efeito da dose, tempo e tipo de exposição da radiação. Já no grupo de pacientes expostos à radiação X, observamos que não ocorre aumento nos níveis de danos ao DNA após a exposição (ƿ=0,004) e que não existe efeito de ambos polimorfismos estudados, exceto para o genótipo mutado Met/Met que parece determinar maior radiossensibilidade (ƿ=0,041). Para este grupo, observamos que ocorre aumento nas frequências de MN (ƿ<0,001) e NBUDs (ƿ<0,001), mas que os diferentes genótipos não influenciaram diferenças para estes achados. Para os dados de aberrações cromossômicas, encontrados neste grupo, a superexposição radiológica pode ser a interpretação dos achados, já que os detectores planos dos equipamentos utilizados aumentam em torno de 65% a exposição aos pacientes, quando comparados aos antigos intensificadores de imagens. / Introduction: Ionizing radiations produce effects on the DNA molecule and biomonitoring in vivo may be used to better assess the level of internal radiation exposure. Genotoxic agents in exposed populations generate different DNA damage, and there is a genetic variation in sensitivity to these agents. This variation can be explained by the existence of genetic polymorphisms involved in the repair process, including XRCC1 and XRCC3, responsible for maintaining genome integrity of the cell by the damage caused by mutagenic agents, such as ionizing radiation. Objective: Assess the mutagenic effects of exposure to x and gamma radiation in patients undergoing myocardial scintigraphy and coronary angioplasty and relate the possible positive result with polymorphisms of repair genes, XRCC1 and XRCC3. Materials and Methods: 57 patients exposed to gamma radiation, and 57 exposed to x radiation were selected. Analysis of genomic instability was performed by the micronucleus comet assay, and genotyping using TaqMan probe for polymorphisms XRCC1 and XRCC3 repairing genes. Results and Conclusions: In our study the data found demonstrate that DNA damage occurs after exposure to gamma radiation (ƿ=0.026). However, we did not observed influence of the different genotypes for both polymorphisms, Arg399Gln and Thr241Met, although the presence of the mutated genotype Met/Met seems to be less radiosensitive. Despite this difference did not reach statistical significance, this result is in agreement with data reported in the literature indicating that this genotype might be associated with the ability of DNA repair. In this group, we found no statistically significant differences in chromosomal aberrations (MN and NBUDs) after exposure for both polymorphisms, except for the normal genotype Arg/Arg (ƿ= 0.012), that seems to have shown greater radiosensitivity exposure, which is consistent with literature studies, which demonstrate that this genotype may be associated with decreased DNA repair capacity, showing higher levels of induced breaks. Evidence of cellular radiosensitivity may also be explained by the alteration of the protein resulting from polymorphism that does not correct the DNA damage and may increase the accumulation of lesions in the genetic material, possibly the effect of the dose, time and type of radiation exposure. In the group of patients exposed to x-radiation, we observe that no increase in the levels of DNA damage after exposure (ƿ=0.004) and that there is no effect of both polymorphisms studied, except for the mutated genotype Met / Met that seems to determine higher radiosensitivity (ƿ=0.041). For this group, we observed an increase in the frequency of MN (ƿ<0.001) and NBUDs (ƿ<0.001), but the different genotypes did not influence differences for these findings. For the data of chromosomal aberrations found in this group, radiological overexposure may be the interpretation of the findings, since the flat detectors of the equipment used increase around 65% exposure to patients, when compared to the old image intensifiers.

A doença da urina do xarope do bordo (MSUD) é causada pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos U-cetoácidos de cadeia ramificada (BCKAD), promovendo o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) leucina (Leu), isoleucina (Ile) e valina (Val) e seus U-cetoácidos correspondentes (BCKA). A MSUD caracteriza-se por cetoacidose, ataxia, coma, retardo mental e psicomotor. Estudos em animais demonstraram que BCAA e BCKA estimulam a lipoperoxidação e reduzem capacidade antioxidante cerebral em ratos. Também há evidências de que o estresse oxidativo ocorra em pacientes com MSUD no diagnóstico e durante o tratamento e que devido à terapia com dieta restrita e hipoproteica eles possuam deficiência de L-carnitina (L-car), um importante composto para o metabolismo energético. Recentemente, estudos demonstraram o papel antioxidante e anti-inflamatório da L-car, através de sua ação antiperoxidativa, sequestradora de espécies reativas e efeito estabilizador de danos às membranas celulares. Considerando que a fisiopatologia da MSUD ainda é pouco compreendida e que existe um crescente número de estudos enfatizando o envolvimento do estresse oxidativo na doença, neste trabalho foi investigado o efeito in vitro e in vivo da L-car sobre o estresse oxidativo e o dano inflamatório na MSUD tendo como objetivos: A) estudar a indução ao dano oxidativo pelos metabólitos acumulados na MSUD, verificando o possível papel antioxidante da L-car sobre o dano ao DNA in vitro; B) avaliar o efeito in vivo da suplementação de 50 mg/kg/dia de L-car sobre: b.1) a indução do dano ao DNA em leucócitos de pacientes com a MSUD tratados com dieta de restrição proteica, correlacionando as concentrações dos principais metabólitos acumulados nesta doença e verificando o possível papel antioxidante da suplementação da Lcar; b.2) a concentração de citocinas pró-inflamatórias em plasma de pacientes com MSUD tratados com dieta de restrição proteica e a correlação com o estresse oxidativo; b.3) os parâmetros de dano oxidativo à biomoléculas em urina de pacientes com MSUD sob dieta de restrição proteica; C) avaliar o efeito da L-car sobre o estresse oxidativo causado pelos metabólitos acumulados na MSUD em córtex cerebral e cerebelo de ratos Wistar, através de um modelo crônico de indução química da doença. Verificou-se que a Leu e o seu - cetoácido correspondente, o ácido -cetoisocapróico (KIC), causaram danos ao DNA in vitro e L-car foi capaz de diminuir significativamente essas alterações, principalmente as causadas pelo KIC. Quando testado o efeito da suplementação de L-car sobre o dano ao DNA em pacientes MSUD, observou-se um aumento significativo de lesões ao DNA em pacientes com dieta de restrição proteica quando comparados aos controles e a terapia com L-car foi capaz de diminuir significativamente os níveis desses danos. Também foram verificadas correlações do tipo negativa entre as concentrações de L-car e os índices de dano ao DNA e do tipo positiva entre as lesões ao DNA e níveis de MDA, marcador de lipoperoxidação, explicitando uma relação entre o dano ao DNA observado nos pacientes com MSUD, estresse oxidativo e o benefício da suplementação de L-car. Também averiguou-se o efeito da terapia de L-car sobre as citocinas pró-inflamatórias interleucina 1Y (IL-1Y), interleucina 6 (IL-6) e interferon gama (INF- Z). Constatou-se aumentos significativos de IL-1Y, IL-6 e INF- Z no plasma de pacientes com MSUD antes da suplementação de L-car e uma reversão completa desses valores aos níveis dos controles para IL-1Y e INF- Z após a administração de L-car. Ainda, verificou-se que a L-car pode auxiliar na defesa celular contra a inflamação e o estresse oxidativo, observando-se uma correlação negativa entre todas citocinas testadas e as concentrações de L-car, e uma correlação positiva entre o conteúdo de MDA e níveis de IL-1Y e IL-6. Constatou-se também que as medidas de di-tirosina (dano oxidativo a proteínas) e isoprostanos (dano de lipoperoxidação) estavam aumentadas e a capacidade antioxidante total diminuída na urina de pacientes com MSUD sem terapia com L-car e a suplementação deste composto induziu efeitos benéficos sobre estes parâmetros, reduzindo os níveis de di-tirosina e isoprostanos e aumentando a capacidade antioxidante medida em urina. Foi também observado um aumento de KIC urinário após dois meses de tratamento com L-car, quando comparado com o grupo controle, demonstrando um incremento da excreção deste metabolito tóxico. Desta forma, esses resultados sugerem um efeito de reversão de dano oxidativo pela L-car e que a urina pode ser utilizada para monitorar este tipo de lesão em pacientes afetados pela MSUD. Por fim, foram analisados em córtex cerebral e cerebelo de ratos Wistar submetidos ao modelo crônico de MSUD: espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), para avaliar lipoperoxidação, conteúdo de carbonilas (dano oxidativo proteico), oxidação de diclorofluoresceína (DCF), para quantificar produção de espécies reativas teciduais, conteúdo de glutationa reduzida (GSH) que é um importante antioxidante não enzimático e a atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx) e glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD). Os resultados mostraram que a administração crônica de BCAA estimulou a lipoperoxidação, o dano oxidativo proteico, aumento de espécies reativas e diminuição das defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas, especialmente em córtex cerebral e o tratamento com L-car foi capaz de prevenir estes efeitos, exceto o dano oxidativo a proteínas. Em conjunto, estes resultados demonstram que os metabólitos acumulados na MSUD induzem dano oxidativo a biomoléculas (lipídios, proteínas e DNA), diminuem o status antioxidante e promovem aumento de processos inflamatórios. Ainda, estes dados podem contribuir para a compreensão dos mecanismos de ação dos efeitos citotóxicos dos metabólitos acumulados na MSUD e evidenciar o papel do estresse oxidativo e da inflamação na neuropatofiosiologia desta doença, além do efeito protetor da L-car sobre este processo. O estudo de antioxidantes, como a L-car, pode propor uma abordagem terapêutica adicional ao que é empregado atualmente para pacientes com MSUD, que é essencialmente dietética e, portanto, de difícil manejo. / Maple syrup urine disease (MSUD) is caused by deficiency of the activity of the mitochondrial enzyme complex branched-chain U-ketoacid dehydrogenase (BCKAD). The metabolic defect leads to accumulation of the branched chain amino acids (BCAA) leucine (Leu), isoleucine (Ile) and valine (Val) and the corresponding branched-chain U-keto acids. The clinical features of MSUD include ketoacidosis, seizures, coma, psychomotor delay and mental retardation. Treatment consists in Leu, Val and Ile restricted diet. Studies in animals have demonstrated that lipid peroxidation is stimulated by BCAA and BCKA in brain of rats and these metabolites reduce in vitro and in vivo the cerebral capacity to modulate the damage associated to increased free radical production. Also, there is evidence that oxidative stress occurs in MSUD patients at diagnosis and during treatment and that due to terapy with protein restricted diet they present L-carnitine (L-car) deficiency, an important compound for energy metabolism. Recent studies have demonstrated the antioxidant and anti-inflammatory role of L-carnitine (L-car), through its action against peroxidation in different tissues by various mechanisms, a scavenger of reactive oxygen species and the stabilizing effect of damage to cell membranes. Considering that the pathophysiology of MSUD is still poorly understood, and that there is an increasing number of studies emphasizing the oxidative stress involvement in the disease, this study investigated the in vitro and in vivo effect of L-car on oxidative stress and inflammatory damage in MSUD with the following purposes: A) to study the induction of damage by accumulated metabolites in MSUD, analyzing the possible antioxidant role of L-car on DNA damage in vitro; B) to evaluate the in vivo effect of 50 mg/kg/day of L-car supplementation about: b.1) the induction of DNA damage in leukocytes of MSUD patients treated with protein-restricted diet, correlating this damage with the concentrations of the major metabolites accumulated in this disorder and checking the possible antioxidant role of L-car supplementation; b.2) plasma inflammatory cytokines in treated MSUD patients with protein-restricted diet and the correlation with oxidative stress; b.3) oxidative damage parameters in urine of MSUD patients with protein-restricted diet supplemented with L-car; C) to investigate the BCAA effect on some oxidative stress parameters and evaluate the L-car efficacy against these possible pro-oxidant effects in cerebral cortex and cerebellum of rats submitted to a chronic chemically-induced model of MSUD. DNA damage index (DI) showed that Leu and -ketoisocaproic acid (KIC) groups was significantly higher than that of the control group, and that L-car was able to significantly prevent this damage, especially that due to KIC. Accordingly, DNA DI in MSUD patients under BCAA-restricted diet was significantly increased as compared to controls and L-car supplementation was able to significantly decrease this parameter. It was also verified a significant positive correlation between DNA DI and MDA content, a marker of lipid peroxidation. Furthermore, we found an inverse significant correlation between DI and L-car levels. These results strengthen a relationship between DNA damage observed in MSUD patients, oxidative stress and the L-car supplementation benefit. The role of L-car on plasma inflammatory cytokines interleukin-1Y (IL-1Y), interleukin-6 (IL-6) and interferon-gamma (INF- Z) was also evaluated in these patients. Significant increases of IL-1Y, IL-6, and INF- Z were observed before the treatment with L-car. Moreover, there is a negative correlation between all cytokines tested and L-car concentrations and a positive correlation among the MDA content and IL-1Y and IL-6 values after L-car supplementation. It was also demonstrated that the oxidative stress parameters di-tyrosine (oxidative protein damage) and isoprostanes (lipid peroxidation assay) were increased and the antioxidant capacity was reduced in urine of MSUD patients without L-car therapy and that the supplementation of this compound induced beneficial effects on these parameters, so reducing the di-tyrosine and isoprostanes levels and increasing the antioxidant capacity. It was also showed a significant increase in urinary KIC after 2 months of L-car treatment compared to control group, demonstrating an increased excretion of this toxic metabolite. In conclusion, these results suggest a reversion effect of the oxidative damage by L-car and that urine can be used to monitorize oxidative damage in patients affected by this disease. The following parameters were analysed in cerebral cortex and cerebellum of Wistar rats submitted to MSUD chemically-induced chronic model: thiobarbituric acid reactive species (TBA-RS), to evaluate lipid peroxidation, carbonyl content to evaluate protein oxidative damage, DCF oxidation to quantify reactive species production, reduced glutathione (GSH), an important non-enzymatic antioxidant and the activities of antioxidant enzymes catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD). The results showed that the chronic administration of BCAA was able to promote both lipid and protein oxidation, increase of reactive species production and decreased brain antioxidant defenses, especially in cerebral cortex and that L-car was able to prevent these effects, except for oxidative damage to proteins. Taken together, these results demonstrate that the metabolites accumulated in MSUD cause oxidative damage to biomolecules (lipids, proteins and DNA), decrease antioxidant status and promote increased inflammatory processes. These results may contribute to the understanding of the mechanism of action of the cytotoxic effect of the metabolites accumulated in MSUD and the role of oxidative stress and inflammation in the MSUD neuropathophysiology besides the protective effect of L-car on this process. The study of antioxidants like L-car can opens an additional therapeutic approach to that currently employed for MSUD patients, which is primarily dietary and therefore difficult to handle.

A proteína Cdc42 (Cell Division Cycle 42) é um membro da família das Rho GTPases, sinalizadores intracelulares conhecidos pelo seu papel na regulação do citoesqueleto. Essa proteína e capaz de ciclar entre um estado ativo (ligado à GTP) e um estado inativo (ligado à GDP) e essa ativação é modulada por diversas proteínas, conhecidas como GEFs (guanine nucleotide-exchange factors), GAPs (GTPase-activating proteins) e GDIs (guanine nucleotide-dissociation inhibitors). Trabalhos recentes têm demonstrado um papel de Cdc42 na apoptose e na senescência, respostas relacionadas e comumente desencadeadas por estresse genotóxico. Neste contexto este trabalho procurou identificar interações de Cdc42 com outras proteínas, que podem ou não estar envolvidas nos mecanismos de resposta ao dano do DNA. Para isso foram utilizadas as linhagens celulares HeLa e MRC-5 submetidas a tratamento com radiação ultravioleta tipo C, a fim de provocar danos no DNA. Foram realizados dois diferentes tratamentos em cada uma das linhagens com diferentes tempos de incubação pós radiação UV, visando a busca de proteínas envolvidas em uma resposta rápida ou tardia ao dano causado. Os lisados celulares desses tratamentos foram submetidos ao pull-down com proteínas recombinantes GST, GST-Cdc42WT (Selvagem) e GST-Cdc42V12 (Mutação constitutivamente ativa). As proteínas purificadas foram digeridas e submetidas à análise por espectrometria de massa e os dados obtidos foram utilizados para a construção de redes de interação proteica. Dentre as proteínas identificadas as que despertaram maior atenção foram: Proibitina-2 (PHB2) encontrada nas amostras incubadas por 48 horas pós irradiação e Cullina-4A (CUL4A) e P53, encontradas em amostra incubada por 5 minutos pós radiação. Essas proteínas possuem papéis em apoptose e reparo de DNA e foram observadas em posições muito próximas de Cdc42 nas redes de interação, fazendo delas interessantes alvos para futuras validações de interação proteica por análises experimentais distintas / The Cdc42 protein (Cell Division Cycle 42) is a member of the Rho family of GTPases, intracellular signalling molecules well known for their role in the cytoskeleton regulation. This protein cycles between an active state (GTP-bound) and an inactive state (GDP-bound) and this regulation is modulated by proteins known as GEFs, GAPs and GDIs. Recent studies demonstrated roles for Cdc42 in apoptosis and senescence, cellular responses commonly triggered by genotoxic stress. This work sought to identify Cdc42 interactions with other proteins that possibly involved in response to DNA damage mechanisms. To reach this aims we used HeLa and MRC-5 cell lines submitted to treatments with ultraviolet C radiation to induce DNA damage. Two experimental conditions were used in each cell line with different times and doses post UV irradiation in order to search for proteins involved in either rapid or delayed response to the installed DNA damage. Cell lysates obtained from these treatments were subjected to pull-down experiments using recombinant proteins GST, GST-Cdc42-WT (Wild type) and GST-Cdc42-V12 (constitutively active mutant). Purified proteins were digested by trypsin, analyzed by mass spectrometry and th obtained data were used for the construction of protein-protein interaction (PPI) networks. Among the identified proteins those that seem more relevant to the aims of this project were: Prohibitin-2 (PHB2), found in samples incubated 48 hours post irradiation; Cullin-4A (CUL4A) and P53, found in samples incubated 5 minutes after radiation. These proteins have roles in apoptosis and DNA repair and were observed in close proximity to Cdc42 in PPI networks, making them interesting targets for future validation by different experimental approaches

A doença da urina do xarope do bordo (MSUD) é causada pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos U-cetoácidos de cadeia ramificada (BCKAD), promovendo o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) leucina (Leu), isoleucina (Ile) e valina (Val) e seus U-cetoácidos correspondentes (BCKA). A MSUD caracteriza-se por cetoacidose, ataxia, coma, retardo mental e psicomotor. Estudos em animais demonstraram que BCAA e BCKA estimulam a lipoperoxidação e reduzem capacidade antioxidante cerebral em ratos. Também há evidências de que o estresse oxidativo ocorra em pacientes com MSUD no diagnóstico e durante o tratamento e que devido à terapia com dieta restrita e hipoproteica eles possuam deficiência de L-carnitina (L-car), um importante composto para o metabolismo energético. Recentemente, estudos demonstraram o papel antioxidante e anti-inflamatório da L-car, através de sua ação antiperoxidativa, sequestradora de espécies reativas e efeito estabilizador de danos às membranas celulares. Considerando que a fisiopatologia da MSUD ainda é pouco compreendida e que existe um crescente número de estudos enfatizando o envolvimento do estresse oxidativo na doença, neste trabalho foi investigado o efeito in vitro e in vivo da L-car sobre o estresse oxidativo e o dano inflamatório na MSUD tendo como objetivos: A) estudar a indução ao dano oxidativo pelos metabólitos acumulados na MSUD, verificando o possível papel antioxidante da L-car sobre o dano ao DNA in vitro; B) avaliar o efeito in vivo da suplementação de 50 mg/kg/dia de L-car sobre: b.1) a indução do dano ao DNA em leucócitos de pacientes com a MSUD tratados com dieta de restrição proteica, correlacionando as concentrações dos principais metabólitos acumulados nesta doença e verificando o possível papel antioxidante da suplementação da Lcar; b.2) a concentração de citocinas pró-inflamatórias em plasma de pacientes com MSUD tratados com dieta de restrição proteica e a correlação com o estresse oxidativo; b.3) os parâmetros de dano oxidativo à biomoléculas em urina de pacientes com MSUD sob dieta de restrição proteica; C) avaliar o efeito da L-car sobre o estresse oxidativo causado pelos metabólitos acumulados na MSUD em córtex cerebral e cerebelo de ratos Wistar, através de um modelo crônico de indução química da doença. Verificou-se que a Leu e o seu - cetoácido correspondente, o ácido -cetoisocapróico (KIC), causaram danos ao DNA in vitro e L-car foi capaz de diminuir significativamente essas alterações, principalmente as causadas pelo KIC. Quando testado o efeito da suplementação de L-car sobre o dano ao DNA em pacientes MSUD, observou-se um aumento significativo de lesões ao DNA em pacientes com dieta de restrição proteica quando comparados aos controles e a terapia com L-car foi capaz de diminuir significativamente os níveis desses danos. Também foram verificadas correlações do tipo negativa entre as concentrações de L-car e os índices de dano ao DNA e do tipo positiva entre as lesões ao DNA e níveis de MDA, marcador de lipoperoxidação, explicitando uma relação entre o dano ao DNA observado nos pacientes com MSUD, estresse oxidativo e o benefício da suplementação de L-car. Também averiguou-se o efeito da terapia de L-car sobre as citocinas pró-inflamatórias interleucina 1Y (IL-1Y), interleucina 6 (IL-6) e interferon gama (INF- Z). Constatou-se aumentos significativos de IL-1Y, IL-6 e INF- Z no plasma de pacientes com MSUD antes da suplementação de L-car e uma reversão completa desses valores aos níveis dos controles para IL-1Y e INF- Z após a administração de L-car. Ainda, verificou-se que a L-car pode auxiliar na defesa celular contra a inflamação e o estresse oxidativo, observando-se uma correlação negativa entre todas citocinas testadas e as concentrações de L-car, e uma correlação positiva entre o conteúdo de MDA e níveis de IL-1Y e IL-6. Constatou-se também que as medidas de di-tirosina (dano oxidativo a proteínas) e isoprostanos (dano de lipoperoxidação) estavam aumentadas e a capacidade antioxidante total diminuída na urina de pacientes com MSUD sem terapia com L-car e a suplementação deste composto induziu efeitos benéficos sobre estes parâmetros, reduzindo os níveis de di-tirosina e isoprostanos e aumentando a capacidade antioxidante medida em urina. Foi também observado um aumento de KIC urinário após dois meses de tratamento com L-car, quando comparado com o grupo controle, demonstrando um incremento da excreção deste metabolito tóxico. Desta forma, esses resultados sugerem um efeito de reversão de dano oxidativo pela L-car e que a urina pode ser utilizada para monitorar este tipo de lesão em pacientes afetados pela MSUD. Por fim, foram analisados em córtex cerebral e cerebelo de ratos Wistar submetidos ao modelo crônico de MSUD: espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), para avaliar lipoperoxidação, conteúdo de carbonilas (dano oxidativo proteico), oxidação de diclorofluoresceína (DCF), para quantificar produção de espécies reativas teciduais, conteúdo de glutationa reduzida (GSH) que é um importante antioxidante não enzimático e a atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx) e glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD). Os resultados mostraram que a administração crônica de BCAA estimulou a lipoperoxidação, o dano oxidativo proteico, aumento de espécies reativas e diminuição das defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas, especialmente em córtex cerebral e o tratamento com L-car foi capaz de prevenir estes efeitos, exceto o dano oxidativo a proteínas. Em conjunto, estes resultados demonstram que os metabólitos acumulados na MSUD induzem dano oxidativo a biomoléculas (lipídios, proteínas e DNA), diminuem o status antioxidante e promovem aumento de processos inflamatórios. Ainda, estes dados podem contribuir para a compreensão dos mecanismos de ação dos efeitos citotóxicos dos metabólitos acumulados na MSUD e evidenciar o papel do estresse oxidativo e da inflamação na neuropatofiosiologia desta doença, além do efeito protetor da L-car sobre este processo. O estudo de antioxidantes, como a L-car, pode propor uma abordagem terapêutica adicional ao que é empregado atualmente para pacientes com MSUD, que é essencialmente dietética e, portanto, de difícil manejo. / Maple syrup urine disease (MSUD) is caused by deficiency of the activity of the mitochondrial enzyme complex branched-chain U-ketoacid dehydrogenase (BCKAD). The metabolic defect leads to accumulation of the branched chain amino acids (BCAA) leucine (Leu), isoleucine (Ile) and valine (Val) and the corresponding branched-chain U-keto acids. The clinical features of MSUD include ketoacidosis, seizures, coma, psychomotor delay and mental retardation. Treatment consists in Leu, Val and Ile restricted diet. Studies in animals have demonstrated that lipid peroxidation is stimulated by BCAA and BCKA in brain of rats and these metabolites reduce in vitro and in vivo the cerebral capacity to modulate the damage associated to increased free radical production. Also, there is evidence that oxidative stress occurs in MSUD patients at diagnosis and during treatment and that due to terapy with protein restricted diet they present L-carnitine (L-car) deficiency, an important compound for energy metabolism. Recent studies have demonstrated the antioxidant and anti-inflammatory role of L-carnitine (L-car), through its action against peroxidation in different tissues by various mechanisms, a scavenger of reactive oxygen species and the stabilizing effect of damage to cell membranes. Considering that the pathophysiology of MSUD is still poorly understood, and that there is an increasing number of studies emphasizing the oxidative stress involvement in the disease, this study investigated the in vitro and in vivo effect of L-car on oxidative stress and inflammatory damage in MSUD with the following purposes: A) to study the induction of damage by accumulated metabolites in MSUD, analyzing the possible antioxidant role of L-car on DNA damage in vitro; B) to evaluate the in vivo effect of 50 mg/kg/day of L-car supplementation about: b.1) the induction of DNA damage in leukocytes of MSUD patients treated with protein-restricted diet, correlating this damage with the concentrations of the major metabolites accumulated in this disorder and checking the possible antioxidant role of L-car supplementation; b.2) plasma inflammatory cytokines in treated MSUD patients with protein-restricted diet and the correlation with oxidative stress; b.3) oxidative damage parameters in urine of MSUD patients with protein-restricted diet supplemented with L-car; C) to investigate the BCAA effect on some oxidative stress parameters and evaluate the L-car efficacy against these possible pro-oxidant effects in cerebral cortex and cerebellum of rats submitted to a chronic chemically-induced model of MSUD. DNA damage index (DI) showed that Leu and -ketoisocaproic acid (KIC) groups was significantly higher than that of the control group, and that L-car was able to significantly prevent this damage, especially that due to KIC. Accordingly, DNA DI in MSUD patients under BCAA-restricted diet was significantly increased as compared to controls and L-car supplementation was able to significantly decrease this parameter. It was also verified a significant positive correlation between DNA DI and MDA content, a marker of lipid peroxidation. Furthermore, we found an inverse significant correlation between DI and L-car levels. These results strengthen a relationship between DNA damage observed in MSUD patients, oxidative stress and the L-car supplementation benefit. The role of L-car on plasma inflammatory cytokines interleukin-1Y (IL-1Y), interleukin-6 (IL-6) and interferon-gamma (INF- Z) was also evaluated in these patients. Significant increases of IL-1Y, IL-6, and INF- Z were observed before the treatment with L-car. Moreover, there is a negative correlation between all cytokines tested and L-car concentrations and a positive correlation among the MDA content and IL-1Y and IL-6 values after L-car supplementation. It was also demonstrated that the oxidative stress parameters di-tyrosine (oxidative protein damage) and isoprostanes (lipid peroxidation assay) were increased and the antioxidant capacity was reduced in urine of MSUD patients without L-car therapy and that the supplementation of this compound induced beneficial effects on these parameters, so reducing the di-tyrosine and isoprostanes levels and increasing the antioxidant capacity. It was also showed a significant increase in urinary KIC after 2 months of L-car treatment compared to control group, demonstrating an increased excretion of this toxic metabolite. In conclusion, these results suggest a reversion effect of the oxidative damage by L-car and that urine can be used to monitorize oxidative damage in patients affected by this disease. The following parameters were analysed in cerebral cortex and cerebellum of Wistar rats submitted to MSUD chemically-induced chronic model: thiobarbituric acid reactive species (TBA-RS), to evaluate lipid peroxidation, carbonyl content to evaluate protein oxidative damage, DCF oxidation to quantify reactive species production, reduced glutathione (GSH), an important non-enzymatic antioxidant and the activities of antioxidant enzymes catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD). The results showed that the chronic administration of BCAA was able to promote both lipid and protein oxidation, increase of reactive species production and decreased brain antioxidant defenses, especially in cerebral cortex and that L-car was able to prevent these effects, except for oxidative damage to proteins. Taken together, these results demonstrate that the metabolites accumulated in MSUD cause oxidative damage to biomolecules (lipids, proteins and DNA), decrease antioxidant status and promote increased inflammatory processes. These results may contribute to the understanding of the mechanism of action of the cytotoxic effect of the metabolites accumulated in MSUD and the role of oxidative stress and inflammation in the MSUD neuropathophysiology besides the protective effect of L-car on this process. The study of antioxidants like L-car can opens an additional therapeutic approach to that currently employed for MSUD patients, which is primarily dietary and therefore difficult to handle.

O dano genético pode ocorrer espontaneamente sob circunstâncias metabólicas normais e pode ser potencializado em situações de deficiência dietética e exposição excessiva a mutagênicos e carcinogênicos ambientais. As deficiências de ácido fólico, vitamina B6 e vitamina B12 podem levar a um aumento nos níveis e alterações na metilação do DNA. MTHFR é a enzima chave na via de metabolização do folato e o polimorfismo MTHFR C677T conduz à redução na atividade da enzima. O objetivo deste estudo foi avaliar influências da ingestão dos micronutrientes B12, B6 e folato (B9), do polimorfismo MTHFR C677T na instabilidade genômica de indivíduos expostos ocupacionalmente a pesticidas. O estudo envolveu 69 homens e 41 mulheres (n= 110) com uma idade média 42,3 ± 13,32 anos no qual 42 (38,2%) deles apresentaram peso normal, 51 (46,4%) sobrepeso e 15 (13,6%) obesidade grau I, todos os indivíduos da amostra são fumicultores de Venâncio Aires e Santa Cruz do Sul (estado do Rio Grande do Sul, Brasil). A genotipagem do polimorfismo MTHFR C677T foi realizada pelo método PCR-RFLP. Os dados de dano de DNA foram avaliados pelos biomarcadores de exposição ocupacional ensaio cometa e micronúcleo. O status nutricional foi avaliado com base na média de 3 recordatórios de 24 horas (coletados em 3 dias não consecutivos , incluindo um final de semana em um intervalo de 4 meses). A ingestão dos micronutrientes foi estimada usando o programa nutricional Food Processor SQL 10.9. Não foram encontradas diferenças significativas entre idade e tempo de exposição a pesticidas para os parâmetros analisados. Encontramos aumento na frequência de micronúcleo de linfócitos em indivíduos com ingestão inadequada de folato e vitamina B12, apresentando diferença significativa (P = 0,030) e (P = 0,014) respectivamente quando comparados com os indivíduos com ingestão adequada. Dano de DNA não mostrou resultados significativos quando relacionados com tabagismo, anos de exposição, IMC e polimorfismo MTHFR C677T. A correlação entre dano do DNA, ingestão de folato, B6 e B12 e o polimorfismo MTHFR não apresentou significância. Em conclusão, nossos resultados indicaram que a adequação de folato para valores ≥ 320 μg /dia e vitamina B12 ≥ 2,0 μg /dia, nesta amostra exposta, estaria protegendo da ação mutagênica dos pesticidas. A dieta adequada, tanto em folato quanto em vitamina B12 poderia estar auxiliando em um reparo de DNA adequado sugerindo um fator de proteção nesses indivíduos. / Genetic damage can occur spontaneously under normal metabolic circumstances and can also be present in situations of dietary deficiency or inadequate intake of nutrients and excessive exposure to environmental mutagens. The purpose of this study was to evaluate the influence of the intake of micronutrients B12, B6 and folate and of polymorphism MTHFR C677T in the induction of DNA damage in individuals exposed to pesticides. The study involved 69 men and 41 women who were tobacco farmers in the region of Venâncio Aires (State of Rio Grande do Sul, Brasil). DNA damage was analyzed by the Comet Test and Micronucleus Test (MN); dietary intake was evaluated based on the mean of three 24-hour Diet Recall questionnaires. The nutrient intake data were computerized and estimated in the Food Processor SQL 10.9 program. The DNA damage results showed a significant increase in MN frequency in the lymphocytes of individuals who had an inadequate intake of folate and B12 (P = 0.030 and P = 0.014, respectively). No significant association was found between DNA damage and polymorphism MTHFR C677T. Correlations between DNA damage and polymorphism MTHFR C677T and nutrient intake were not significant. In conclusion, our results indicated that the adequate intake of folate (≥ 320 μg /day) and vitamin B12 (≥ 2,0 μg /day) can provide protection from the mutagenic action of pesticides. A dietary adaptation of folate and B12 can ensure adequate repair, showing that diet is a protective factor in this population.

Introdução: As radiações ionizantes produzem efeitos na molécula do DNA e o biomonitoramento in vivo pode ser utilizado para melhor avaliar o nível de exposição interna à radiação. Os agentes genotóxicos em populações expostas geram diferentes danos ao DNA e por existir uma variabilidade genética isso acarreta sensibilidades diferentes a estes agentes. Essa variação pode ser explicada pela existência de polimorfismos genéticos envolvidos no processo de reparo, entre eles o XRCC1 e XRCC3, responsáveis por manter a integridade do genoma das células frente a danos causados pelos agentes mutagênicos, como a radiação ionizante. Objetivo: Avaliar os efeitos mutagênicos da exposição à radiação x e gama em pacientes que realizam cintilografia miocárdica e angioplastia miocárdica e relacionar os possíveis resultados positivos com os polimorfismos dos genes de reparo, XRCC1 e XRCC3. Materiais e Métodos: Foram selecionados 57 pacientes expostos à radiação gama, e 57 expostos à radiação X. A análise da instabilidade genômica foi realizada através dos testes do micronúcleo e cometa, e a genotipagem através de sonda de TaqMan, para os polimorfismos do gene de reparo XRCC1 e XRCC3. Resultados e Conclusões: Em nosso estudo, os dados encontrados demonstram que ocorre dano ao DNA, após a exposição à radiação gama (ƿ=0,026). No entanto, não observamos ocorrer influência dos diferentes genótipos em ambos polimorfismos estudados, Arg399Gln e Thr241 Met, embora a presença do genótipo mutado Met/Met, parece ter indicado menor radiossensibilidade. Apesar desta diferença não ter alcançado os níveis de significância esperados, este resultado está de acordo com dados da literatura que indicam que este genótipo poderia estar associado à capacidade de reparação do DNA. Neste mesmo grupo, não encontramos diferenças estatisticamente significativas para aberrações cromossômicas (MN e NBUDs) após a exposição, para ambos polimorfismos, exceto para o genótipo normal Arg/Arg (ƿ=0,012), que parece ter indicado maior radiossensibilidade à exposição, estando de acordo com trabalhos da literatura, os quais demostram que, este genótipo pode ser associado com a diminuição da capacidade de reparo do DNA, apresentando níveis mais altos de quebras induzidas. As evidências de radiossensibilidade celular também podem ser explicadas pela alteração da proteína resultante do polimorfismo que não corrige os danos ao DNA, podendo aumentar o acúmulo de lesões no material genético, possivelmente pelo efeito da dose, tempo e tipo de exposição da radiação. Já no grupo de pacientes expostos à radiação X, observamos que não ocorre aumento nos níveis de danos ao DNA após a exposição (ƿ=0,004) e que não existe efeito de ambos polimorfismos estudados, exceto para o genótipo mutado Met/Met que parece determinar maior radiossensibilidade (ƿ=0,041). Para este grupo, observamos que ocorre aumento nas frequências de MN (ƿ<0,001) e NBUDs (ƿ<0,001), mas que os diferentes genótipos não influenciaram diferenças para estes achados. Para os dados de aberrações cromossômicas, encontrados neste grupo, a superexposição radiológica pode ser a interpretação dos achados, já que os detectores planos dos equipamentos utilizados aumentam em torno de 65% a exposição aos pacientes, quando comparados aos antigos intensificadores de imagens. / Introduction: Ionizing radiations produce effects on the DNA molecule and biomonitoring in vivo may be used to better assess the level of internal radiation exposure. Genotoxic agents in exposed populations generate different DNA damage, and there is a genetic variation in sensitivity to these agents. This variation can be explained by the existence of genetic polymorphisms involved in the repair process, including XRCC1 and XRCC3, responsible for maintaining genome integrity of the cell by the damage caused by mutagenic agents, such as ionizing radiation. Objective: Assess the mutagenic effects of exposure to x and gamma radiation in patients undergoing myocardial scintigraphy and coronary angioplasty and relate the possible positive result with polymorphisms of repair genes, XRCC1 and XRCC3. Materials and Methods: 57 patients exposed to gamma radiation, and 57 exposed to x radiation were selected. Analysis of genomic instability was performed by the micronucleus comet assay, and genotyping using TaqMan probe for polymorphisms XRCC1 and XRCC3 repairing genes. Results and Conclusions: In our study the data found demonstrate that DNA damage occurs after exposure to gamma radiation (ƿ=0.026). However, we did not observed influence of the different genotypes for both polymorphisms, Arg399Gln and Thr241Met, although the presence of the mutated genotype Met/Met seems to be less radiosensitive. Despite this difference did not reach statistical significance, this result is in agreement with data reported in the literature indicating that this genotype might be associated with the ability of DNA repair. In this group, we found no statistically significant differences in chromosomal aberrations (MN and NBUDs) after exposure for both polymorphisms, except for the normal genotype Arg/Arg (ƿ= 0.012), that seems to have shown greater radiosensitivity exposure, which is consistent with literature studies, which demonstrate that this genotype may be associated with decreased DNA repair capacity, showing higher levels of induced breaks. Evidence of cellular radiosensitivity may also be explained by the alteration of the protein resulting from polymorphism that does not correct the DNA damage and may increase the accumulation of lesions in the genetic material, possibly the effect of the dose, time and type of radiation exposure. In the group of patients exposed to x-radiation, we observe that no increase in the levels of DNA damage after exposure (ƿ=0.004) and that there is no effect of both polymorphisms studied, except for the mutated genotype Met / Met that seems to determine higher radiosensitivity (ƿ=0.041). For this group, we observed an increase in the frequency of MN (ƿ<0.001) and NBUDs (ƿ<0.001), but the different genotypes did not influence differences for these findings. For the data of chromosomal aberrations found in this group, radiological overexposure may be the interpretation of the findings, since the flat detectors of the equipment used increase around 65% exposure to patients, when compared to the old image intensifiers.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:54:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vitor renato.pdf: 768606 bytes, checksum: adbc3adac1d4f5dee180dddd0e941803 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Crajiru is a shrub of the family Bignoniaceae found throughout the Amazon. Its scientific name is Arrabidaea chica B. Verl. and is popularly known as carajuru, pariri, cipó cruz, calajouru, karajurana, krawiru. It has anti-inflammatory, healing, anti-anemic, and anti-hemorrhagic properties. The variety used was the AC1, for being the most commonly found and used by the population. Was made an extractive solution 7.5 % from AC1, and its extract was prepared in a Spray Drier. With dry extract we realized the biological tests. The Comparative Thin Layer Chromatography (CTLC) and total tannins test was realized with the extractive solution and dry extract to verify the presence of quercetin and gallic acid, and tannins, respectively. To analyze the cytotoxicity we made the hemolisys test, using mice blood, the Alamar Blue and Trypan Blue assays using NIH-3T3, in different extract concentrations to determinate the IC50. The antioxidant activity tests (DPPH scavenging assay and NIH-3T3 cellular antioxidant activity) was made. We choose the NIH-3T3 Comet assay to analyze the genotoxicity. We detected the chromosome and mitotic apparatus damages induced by A. chica extract using the Micronucleus assay. The TLC showed probable presence of quercetin in lows concentrations in both extractive solution and dry extract, however, we could not detect gallic acid. Was detected 1.5 g% and 1.3 g% of tannins in extractive solution and dry extract, respectively. The dry extract was not significantly cytotoxic nor hemolytic on the realized tests and induced proliferation on NIH-3T3. We didn t find any antioxidant activity and there was not significant damage on fibroblasts DNA on Comet assay. We performed the micronucleus test to analyze the presence of Micronucleated Polyichromatic Erythrocytes (PCEMN s) which ranged from 14 to 18 in 24 h and 48h of exposition, while the positive control showed 322 and 288 PCEMN s in the same treatment period. The analysis on TLC and total tannins tests showed equivalents results from extractive solution and dry extract, indicating that dry extract used in in vitro and in vivo tests didn t change its composition during the spray drying process. / O crajiru é um arbusto da família Bignoniaceae encontrado em toda a Amazônia. Seu nome científico é Arrabidaea chica B. Verl. e também é conhecido popularmente como carajuru, pariri, cipó cruz, calajouru, karajurana, krawiru, dentre outros. Possui propriedades antiinflamatórias, cicatrizantes, antianêmicas e anti-hemorrágicas. A variedade utilizada neste trabalho foi a AC1, por ser a mais encontrada e utilizada pela população. Foi elaborada uma solução extrativa 7,5% da AC1 e obtido seu extrato seco por aspersão ( Spray Drier ). A partir do extrato seco foram realizados os testes biológicos. As análises em Cromatografia em Camada Delgada Comparativa e Teor de Taninos Totais foram realizados com a solução extrativa e com o extrato seco para averiguar a presença de quercetina e ácido gálico, e taninos, respectivamente. Para avaliar a citotoxicidade do extrato, foi realizado o teste de hemólise em eritrócitos de camundongos, o ensaio do Alamar Blue e o teste de exclusão por Azul de Tripan em NIH-3T3, em diferentes concentrações do extrato para a determinação da CI50. Testes de atividade antioxidante (DPPH e atividade antioxidante celular em NIH-3T3) foram realizados. O teste genotóxico de escolha foi o teste do cometa em NIH-3T3. O teste do micronúcleo foi usado para detectar danos induzidos pelo extrato aos cromossomos ou ao aparato mitótico de eritroblastos por análise sangue da medula óssea do fêmur de camundongos. A análise por CCDC detectou provável presença de quercetina em concentrações mínimas tanto na solução extrativa quanto no extrato seco, porém não foi possível a detecção de ácido gálico. Taninos foram encontrados na concentração de 1,5 g% na solução extrativa e 1,3 g% no extrato seco. O extrato seco não apresentou significativa atividade hemolítica nem citotóxica em nenhum dos testes realizados, sendo observado um aumento da proliferação dos fibroblastos murinos. A avaliação antioxidante do extrato aquoso também não demonstrou atividade. Não foi observado dano significante ao DNA de fibroblastos pelo teste do cometa e a presença de eritrócitos policromáticos micronucleados (PCEMNs) no extrato seco avaliado através do teste do micronúcleo variou de 14 a 18 PCEMNs em 24 h e 48 h de exposição, enquanto que o controle positivo apresentou 322 e 288 PCEMN s nos respectivos horários. Os resultados das análises por CCDC e Taninos totais realizados na solução extrativa e no extrato foram semelhantes, indicando que, provavelmente, o extrato seco utilizado nos testes in vitro e in vivo não perdeu seus componentes durante o processo de secagem por aspersão.

A via de sinalização da GTPase RhoA atua em diversos processos celulares. Para avaliar o comportamento de RhoA, após estresse causado por radiação ultravioleta, foram gerados clones mutantes que expressam RhoA em seu estado constitutivamente ativo e dominante negativo. Após exposição das linhagens à radiação ultravioleta, observou-se uma maior sensibilidade e um maior tempo de recuperação das linhagens quando a atividade de RhoA é reduzida. Estes prejuízos no reparo prejudicaram a proliferação e sobrevivência celular quando da deficiência na atividade de RhoA. Em linhagens deficientes na via de NER, percebemos que estas linhagens possuem uma capacidade ainda mais reduzida de reparo quando a atividade de RhoA é inibida. / The RhoA GTPase signaling pathway acts on many cellular processes. To evaluate this possible RhoA function after stress caused by ultraviolet radiation, mutant clones expressing RhoA in its constitutively active or dominant negative forms were generated. After exposure of the cells to ultraviolet radiation, cell lines showed a higher sensitivity and a delayed recovery capacity when the RhoA activity is reduced. The impaired repair reduced the cells proliferation and survival under RhoA deficiency. In cell lines deficient in NER pathway, we notice that these cell lines, have a further reduced ability to repair damaged DNA under RhoA inhibition.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Epilepsy is a neurological disease that affects around 1% of world population, with neurobiological, neurochemical, cognitive and psychological consequences. Despite the good prognosis, the high number of epilepsy patients who have refractory seizures to medicine, reflects lack of a better understanding about excitotoxic disorders characteristic of the disease. So, the aim of the study was to investigate if there is an association between apoptotic markers and inflammation pathway in epileptic subjects and those without the disease. Blood samples were collected from subjects with epilepsy and were measured protein carbonyl, tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interferon gamma (IFN-لا), acetylcholinesterase (AChE), caspases (CASP8 and CASP3) and picogreen (PG). The results showed an increase in all analyzed biochemistry parameters from epilepsy subjects when compared to healthy, suggesting that there is a relation between this disease with apoptotic and inflammatory markers. Furthermore, there was a positive correlation between TNF-α with CASP 8 and 3. IFN-لا was just correlated with caspase 3. The correlation between analyzed parameters with seizure severity and antiepileptic drugs (AEDs) treatment was not significant, indicating that medicine administration and symptoms improve did not influence obtained results. So, our results suggest that epileptic seizures can induce the creation of a vicious circle between neuroinflammation and cell death, resulting in DNA damage in epilepsy patients. Furthermore, we suggest that AEDs acting in TNF-α or IFN-لا pathway could represent an adjunctive therapy in epilepsy patients treatment. / A epilepsia é uma doença neurológica que afeta em torno de 1% da população mundial, tendo consequências no âmbito neurobiológico, neuroquímico, cognitivo e psicológico. Apesar do bom prognóstico, o elevado número de pacientes com epilepsia, que apresentam convulsões refratárias aos medicamentos, reflete a falta de um melhor entendimento dos distúrbios excitotóxicos característicos desta doença. A partir disto, o objetivo deste estudo foi investigar se existe uma associação entre os marcadores apoptóticos e a via inflamatória em indivíduos epilépticos e naqueles sem a doença. Amostras de sangue foram coletadas de pacientes com epilepsia e posteriormente foram analisados os níveis de proteína carbonil, fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interferon gama (INF-لا), acetilcolinesterase (AChE), caspases (CASP8 e CASP3) e picogreen (PG). Os resultados mostraram um aumento em todos os parâmetros bioquímicos analisados no sangue de pacientes com epilepsia quando comparado aos controles. Além disso, foi observada uma correlação positiva entre TNF-α com as caspases (8 e 3). O IFN-لا correlacionou-se apenas com os níveis da caspase 3. A correlação entre os parâmetros analisados com a gravidade das crises epilépticas e o tratamento com fármacos antiepilépticos (FAEs) não foi significativa, indicando que a administração de medicamentos para controle das crises e melhora dos sintomas não influenciou nos resultados obtidos. Dessa forma, os nossos dados sugerem que as crises epilépticas podem induzir a geração de um ciclo vicioso entre neuroinflamação e apoptose celular, induzindo ao estresse oxidativo e resultando no dano ao DNA nos pacientes com epilepsia. Além disso, nós sugerimos que o uso de FAEs que atuem na via do TNF-α ou IFN-لا poderia representar uma terapia complementar no tratamento dos pacientes epilépticos.

O complexo Mre11 (Mre11/Rad50/Nbs1) é uma componente chave da resposta celular ao dano ao DNA em humanos e recentes observações sugerem que estas proteínas são em parte responsáveis pela interface ente o ensoreamento do dano ao DNA, seu reparo e as funções das proteínas envolvidas nos pontos de checagem do ciclo celular. Em Aspergillus nidulans, a partir de um screening para o isolamento de letais sintéticos na ausência de dineína, o gene sldIRAD50 foi clonado como um desses letais sintéticos através da complementação do fenótipo de deficiência de conidiação do mutante. Foi identificada uma transversão G-C na posição 2509 (Ala-692-Pro) no mutante sldI1444 a qual está presente na região de dobradiça da proteína. Essa mutação causa sensibilidade a vários agentes mutagênicos. Uma linhagem mutante sldIRAD50::pyrG foi construída a qual apresentou também vários defeitos na reposta celular ao dano ao DNA incluindo sensibilidade a várias drogas mutagênicas, defeito no ponto de checagem de replicação do DNA e na viabilidade dos ascosporos. Além disso, o gene sldIRAD50 interage geneticamente com bimEAPC1 para o controle do spindle pole checkpoint durante a segregação cromossômica sugerindo um novo papel para o complexo Mre11. Em atuação paralela com o complexo Mre11, duas proteínas quinases ditas apicais, ATM e ATR coordenam a transdução do sinal do dano ao DNA para proteínas efetoras do reparo. A proteína ATM está mutada na síndrome de instabilidade cromossômica herdada Ataxia Telangiectasia. Para a caracterização do homologo de ATM em A. nidulans AtmA, uma linhagem mutante atmAATM foi isolada. Esse mutante apresentou falha na reposta ao dano ao DNA, como seus homólogos em vários outros organismos mostrando defeitos no ponto de checagem intrafase S e G2/M, além de sensibilidade a camptothecin e bleomicina. Ainda, o extrato protéico bruto desse mutante não foi capaz de fosforilar o homologo de NBS1 em A. nidulans, ScaA. Além das conhecidas funções de ATM na resposta ao dano ao DNA, foi verificado que o mutante atmAATM apresentou uma acelerada cinética de divisão nuclear e severos defeitos no estabelecimento e manutenção do eixo de crescimento polarizado, evidenciando uma função ainda não descrita para ATM no crescimento polar. Provavelmente, AtmA regula a função e/ou localização de proteínas chaves para a formação do eixo de polarização. Diante disso, para investigar as vias metabólicas que são controladas por esse gene, o perfil transcricional do mutante atmAATM, em comparação com a linhagem selvagem foi verificado em diferentes condições de crescimento. Os resultados indicaram um importante papel da via das pentoses fosfato na proliferação celular monitorada pela AtmA. Além disso, foram identificados vários genes com a expressão do mRNA diminuída envolvidos no crescimento polarizado, na síntese de ácido fosfatídico e de ergosterol e no tráfico intracelular, secreção e transporte vesicular. Buscando identificar genes que participam da resposta celular ao dano ao DNA causado pela droga anti topoisomerase I, camptothecin, foram utilizados filtros de macroarray de A. nidulans contendo 2787 genes deste organismo para monitorar a expressão gênica da linhagem selvagem e do mutante uvsBATR, num experimento de indução com CPT por 30, 60 e 120 minutos. Os resultados revelaram um total de 1512 e 1700 genes modulados na linhagem selvagem e uvsBATR respectivamente, em pelo menos um ponto experimental. Seis desses genes que apresentaram aumento da expressão de mRNA na linhagem selvagem e diminuição da linhagem uvsBATR foram caracterizados: fhdA (que codifica para uma proteína com domínio fork-head associated), tprA (uma proteína hipotética que apresenta o domínio tetratrico peptide repeat), mshA (um homólogo MutS6 envolvido em mismatch repair), phbA (um homólogo da prohibitina), uvsCRAD51 e cshA (homólogo da proteína CSB envolvida no reparo por excisão de nucleotídeos e ligada a Síndrome de Cockayne). A indução transcricional desses genes na presença de CPT requer a função de uvsBATR. Estes genes foram deletados e surpreendentemente apenas uvsCRAD51 apresentou sensibilidade a CPT, enquanto os outros mostraram sensibilidade a outros agentes que causam dano ao DNA e estresse oxidativo. Além disso, com exceção de uvsCRAD51, a deleção desses genes leva a supressão parcial da sensibilidade a menadiona e paraquat do mutante uvsBATR. Esses resultados indicaram um comportamento heterogêneo de sensibilidade durante o crescimento na presença de agentes que causam dano direto ou indireto ao DNA, evidenciando que o perfil transcricional não é determinante para predizer a função de um gene na proteção da célula a determinada droga que causa dano ao DNA. / The Mre11 protein complex (Mre11/Rad50/Nbs1) has emerged as a central component in the human cellular DNA damage response, and recent observations suggest that these proteins are at least partially responsible for the linking of DNA damage detection to DNA repair and cell cycle checkpoint functions. In Aspergillus nidulans, the sldI1444D mutant was isolated in a screen for dynein synthetic lethals. The sldIRAD50 gene was cloned by complementation of the sporulation deficiency phenotype of this mutant. A transversion G-C at the position 2509 (Ala-692-Proamino acid change) in the sldI1444D mutant causes sensitivity to several DNAdamaging agents. The mutation sldI1 occurs at the CXXC hinge domain of Rad50. An inactivation strain sldIRAD50::pyrG was constructed. Besides sensitivity to a number of DNA-damaging agents, this deletion strain was also impaired in the DNA replication checkpoint response and in ascospore viability. Also, sldIRAD50::pyrG geneticaly interacted with bimEAPC1, acting in the spindle pole checkpoint control during segregation, suggesting a new possible role of Mre11 complex. In parallel to the Mre11 complex, two apical quinases ATM and ATR respond to DNA damage and transduce the signal to effector proteins. In humans, mutations in ATM cause the devastating neurodegenerative disease Ataxia Telangiectasia. Here we characterized the homolog of ATM (AtmA) in the filamentous fungus A. nidulans. The deletion strain atmA presented defects in the DNA damage response as previously shown in other model organisms including intra S-phase and G2/M checkpoint defects, sensitivity to camptothecin and bleomycin. Also, the crude extract from the mutant strain did not phosphorylate the NBS1 homologue ScaA. In addition to its expected role in the DNA damage response, the atmA mutant showed increased nuclear division kinetics and severe defects in polarized hyphal growth, indicating a novel feature for the ATM gene. Probably, AtmA regulates the function and/or localization of landmark proteins required for the formation of a polarity axis. We extended these studies by investigating which pathways are controlled by AtmA during proliferation and polar growth by comparatively determining the transcriptional profile of A. nidulans wild type and atmA mutant strains in different growth conditions. Our results indicated an important role of the pentose phosphate pathway in the fungal proliferation during endogenous DNA damage and polar growth monitored by the AtmA kinase. Furthermore, we identified several genes that have decreased mRNA expression in the atmA mutant that are involved in the formation of polarized hyphae and control of polar growth; in the biosynthesis of phosphatidic acid and ergosterol; and intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport. In order to identify genes that responded to the DNA damage mediated by the anti- toposomerase I drug, camptothecin, we used an A. nidulans macroarray carrying sequences of 2,787 genes from this fungus to monitor gene expression of both wild-type and uvsBATR in a time-point experiment where mycelium was exposed to 60, 90 and 120 minutes to the drug. The results revealed a total of 1,512 and 1,700 genes in the wild-type and uvsBATR deletion mutant strain that displayed statistically significant difference in at least one experimental time-point. We characterized six genes that have increased mRNA expression in the presence of CPT in the wild-type strain relative to the uvsBATR mutant strain: fhdA (encoding a fork head associated domain protein), tprA (encoding a hypothetical protein that contains a tetratrico peptide repeat), mshA (encoding a MutS homologue involved in mismatch repair), phbA (encoding a prohibitin homologue), uvsCRAD51 (the homologue of the RAD51 gene), and cshA (encoding a homologue of the excision repair protein ERCC-6 [Cockaynes syndrome protein]). The induced transcript levels of these genes in the presence of CPT required uvsBATR. These genes were deleted, and surprisingly, only the uvsCRAD51 mutant strain was sensitive to CPT; however, the others displayed sensitivity to a range of DNA-damaging and oxidative stress agents. Moreover, with the exception of UvsC, deletion of each of these genes partially suppressed the sensitivity of the uvsB strain to menadione and paraquat. These results indicated a very complex and heterogeneous sensitivity behavior during growth in the presence of agents that directly or indirectly cause DNA damage and the transcriptional response to DNAdamaging agents does not necessarily identify the genes that protect against these agents.